專利名稱：紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法及其在卷煙中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種煙用微生物香料的復合提取和應用，具體涉及一種紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法及其在卷煙中的應用。
背景技術：
紫丁香蘑(Lepista nuda),又稱裸口蘑，紫晶蘑，俗稱米湯蘑，屬擔子苗綱(Basidiomycetes)傘菌目口蘑科(Tricholomataceae)香蘑屬(Lepista)真菌，其子實體菌柄呈紫丁香色，具有非常濃郁香氣，在中國主要分布于吉林、黑龍江、遼寧、湖北、山西、青 海、福建等省。紫丁香蘑在歐洲是一種與松茸、牛肝菌齊名的珍稀食藥用菌，其中富含多種 抗菌抑菌及抗氧化成分，可防止血管硬化，并可用于腎臟病、膽石、糖尿病、肝硬化等疾病的治療。目前紫丁香蘑主要應用于食用和藥用上，對其水提物和醇提物的充分利用還未做深入研究，并且，紫丁香蘑揮發油和提取物在卷煙中作為香料原料的應用尚未見報道。菌絲體是食用菌的營養器官。相當于綠色植物的根、莖、葉。它生長在基質中，分解基質，吸收營養，能從基質中吸收水分、無機鹽和有機養分，以滿足其生長發育的需要。菌絲體主要功能是從死亡的有機質中分解、吸收、轉運養分，以滿足菌絲增殖和子實體生長發育的需要，在食用菌生產中，菌絲體充分生長是獲得豐收的物質基礎。長期以來，植物一直是天然煙用香料的主要來源。但由于香料植物的產量受季節、氣候、病害等因素的影響較大，以致原料供應不穩定。尤其是近年來，天然香料的需求急劇增大，使得香料植物資源日漸枯竭，其價格也日益高漲，因此，尋找價廉、資源豐富、供應穩定的產香原料成為目前煙用香料開發研究的迫切需求。紫丁香蘑等珍稀食藥用菌含有一系列多樣性極為豐富的香味化合物，有望成為天然煙用香料的新來源。然而近年來，市場對紫丁香蘑的需求不斷增加，野生資源逐漸枯竭，而人工栽培產量小且不穩定，因此在香料行業中的應用并不多見。菌絲體深層發酵(Submerged Fermentation, SmF)技術是一種快速獲取擔子菌原料的生物技術，其生產周期短，更適合大規模工業生產。從發酵產物中提取煙用香料，不僅產量穩定，而且成本低廉。近年來，歐美等國已從法律上承認發酵生產獲得的香料也屬于天然香料的范疇，因而這方面的研究受到廣泛重視。目前，尚未見將紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物用于煙用添加劑的報道。

發明內容
針對現有技術的上述不足，本發明要解決的技術問題是提供一種紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法及其在卷煙中的應用。采用液體深層發酵技術獲得紫丁香蘑菌絲體，作為提取物的原料來源，再用不同提取方法和處理步驟從紫丁香蘑菌絲體中依次得到提取物及其在卷煙中的應用。為解決上述技術問題，本發明所設計的一種紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法，該提取方法步驟包括
I)將紫丁香蘑按體積比5 15%接種于發酵培養基，在溫度25 30°C，通氣量為O. 8 I. OdmVmin,轉速10(Tl50r/min條件下，培養3 5d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；2)將步驟I)中紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，3)將步驟2)中淺紅色透明油狀物溶解到8(Γ100倍量重量的65 75%乙醇中，得到淺紅色透明一級提取物。4)將步驟2)中淺紅色透明油狀物過濾，分離得到濾液和濾渣；向濾渣加入5 15倍量重量的水進行回流提取f3h后過濾，合并兩次提取的濾液，濃縮至密度為O. 8^1. 2g/mL的溶液，攪拌中加入4飛倍量重量9(Γ95%的乙醇，靜置3飛h，過濾，得到淺棕色液體二級提取物，其pH值為6. 5^7. O ；
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進一步地，所述步驟I)將紫丁香蘑按體積比5 10%接種于發酵培養基，在溫度25 28°C，通氣量為O. 8 I. OdmVmin,轉速10(Tl20r/min條件下，培養3 5d。更優選方案為將紫丁香蘑按體積比8%接種于發酵培養基，在溫度26°C，通氣量為I. 0dm3/min，轉速120r/min條件下，培養4d。再進一步地，所述I)中發酵培養基的配方為馬鈴薯20(T250g，加入水1000ml，100°c蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加5 8g麩皮，食用蔗糖15 30g，硫酸錳Γ2. 5g，硫酸鎂 f2. 5g。上述紫丁香蘑菌絲體提取物在卷煙中的應用，將提取物按照煙絲重量的O. 001
O.10%的比例進行加香或者加料。作為優選方案，其特征在于所述提取物為一級提取物和二級提取物任選一種或兩種。對紫丁香蘑菌絲體發酵混合料液一級提取物進行了分析測定，具體結果如下一級提取物為揮發油，用美國Agilent公司產(6890N/5975C)氣相質譜聯用儀進行分析，分析條件如下色譜柱DB-WAX毛細管柱(30mX250MmX0. 25μπι);載氣He ;流量1. OmL/min ;分流比4 I ;進樣量lyL;升溫程序進樣口溫度220°C，起始溫度40°C，停留3min，以10°C/min升至250°C，最后停留12 min。EI電離能量70eV ;離子源溫度250°C;質譜接口溫度280°C ;掃描質量范圍40 500 m/z。采用NIST05檢索譜庫法定性，結果發現其主要成分有I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮、大茴香醛、苯甲醛、糠醛、苯丙醇、芳樟醇、橙花叔醇、莪術烯、亞油酸、棕櫚酸等。
I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮是紫丁香蘑的特有香味成分，賦予其獨特的風味。從分析結果看，揮發油中還含有較高含量的致香化學成分，如苯甲醛賦予煙氣苦杏仁和櫻桃樣的甜香味；大茴香醛具有木香和杏仁香香氣，可改善煙氣吃味；糠醛則賦予煙草以堅果香味；苯甲醇、苯乙醇可使煙氣增加花香香氣，其中苯乙醇可增加卷煙香味的原熟和津醇的吸味。棕櫚酸、亞油酸等長鏈的脂肪酸對煙氣的香味沒有特別明顯的直接作用，但是可以調節煙草的酸堿度，使吸味醇和，增加煙氣甜味和豐滿度，降低刺激性，還可以增加煙氣的濃度，從而間接影響煙氣的香味，在煙氣中起著重要的平衡作用。這些成分與I-辛烯-3-醇、I-辛烯-3-酮構成了一級提取物的特征香氣。
二級提取物為水提液，經過常規檢測手段分析，發現該提取物通過醇沉作用，基本上不含有蛋白質、果膠、多糖等，而這些大分子類的蛋白質、果膠和多糖在卷煙中燃燒后，會產生不同程度的刺激性，從而對卷煙的吸味產生負面的作用。本發明的優點是本發明方法簡單，實施容易，并且能夠做到對紫丁香蘑菌絲體發酵混合料液中有效成分的完全提取，經過組合應用到卷煙中，產生不同的加香加料效果，成本低廉，使用方便。
具體實施例方式下面列舉一部分實施例對本發明的有關技術問題作進一步詳細的描述，有必要在此指出以下具體實施例只是對本發明的進一步說明，不代表對本發明保護范圍的限制。其他人根據本發明做出的一些非本質的修改和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例I
首先按照發酵培養基的配方為馬鈴薯200g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加5g麩皮，食用蔗糖15g，硫酸錳I. 0g，硫酸鎂I. 0g。然后將紫丁香蘑按體積比8%接種于發酵培養基，在溫度26°C，通氣量為I. 0dm3/min，轉速120r/min條件下，培養4d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；再按照《中國藥典》2005年版的標準將紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，將淺紅色透明油狀物溶解到100倍量重量的70%乙醇中，得到淺紅色透明一級提取物。實施例2首先按照發酵培養基的配方為馬鈴薯250g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加8g麩皮,食用鹿糖30g,硫酸猛2. 5g,硫酸鎂2. 5g。然后將紫丁香蘑按體積比10%接種于發酵培養基，在溫度28°C，通氣量為1.0dm3/min，轉速150r/min條件下，培養3d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；再按照《中國藥典》2005年版的標準將紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，將淺紅色透明油狀物過濾，分離得到濾液和濾渣；向濾渣加入10倍量重量的水進行回流提取2h后過濾，合并兩次提取的濾液，濃縮至密度為I. Og/mL的溶液，攪拌中加入6倍量重量95%的乙醇，靜置3飛h，過濾，得到淺棕色液體二級提取物，其pH值為 7. O。實施例3首先按照發酵培養基的配方為馬鈴薯220g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加6g麩皮，食用蔗糖20g，硫酸錳2. 0g，硫酸鎂I. 0g。然后將紫丁香蘑按體積比9%接種于發酵培養基，在溫度27°C，通氣量為0. 9dm3/min,轉速IlOr/min條件下，培養5d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；再按照《中國藥典》2005年版的標準將紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，將一部分淺紅色透明油狀物溶解到100倍量重量的75%乙醇中，得到淺紅色透明一級提取物。再另一部分將淺紅色透明油狀物過濾，分離得到濾液和濾渣；向濾渣加入15倍量重量的水進行回流提取3h后過濾，合并兩次提取的濾液，濃縮至密度為I. 2g/mL的溶液，攪拌中加入5倍量重量93%的乙醇，靜置4h，過濾，得到淺棕色液體二級提取物，其pH值為6.8。實施例4首先按照發酵培養基的配方為馬鈴薯200g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加5g麩皮，食用蔗糖15g，硫酸錳I. 0g，硫酸鎂2. 5g。然后將紫丁香蘑按體積比5%接種于發酵培養基，在溫度25°C，通氣量為O. 8dm3/min，轉速IOOr/min條件下，培養3d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；再按照《中國藥典》2005年版的標準將紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，將一部分淺紅色 透明油狀物溶解到80倍量重量的65%乙醇中，得到淺紅色透明一級提取物。再另一部分將淺紅色透明油狀物過濾，分離得到濾液和濾渣；向濾渣加入5倍量重量的水進行回流提取3h后過濾，合并兩次提取的濾液，濃縮至密度為O. 8g/mL的溶液，攪拌中加入4倍量重量90%的乙醇，靜置3h，過濾，得到淺棕色液體二級提取物，其pH值為6. 5。實施例5本發明采用提取物不同組合進行加香加料，并對樣品卷煙進行了評吸對比實驗，添加方案見表I。添加實施例1、2為提取物的單獨添加方案I和2，實施例3、4的提取物為組合方案3和4，其添加比例為提取物與煙絲重量之比值。本添加方案中只是列舉不同的組合方式，在同一種方案中，還可根據具體的煙絲配方進行添加量的調節。表I、提取物的組合添加方案
權利要求
1.一種紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法，該提取方法步驟包括 1)將紫丁香蘑按體積比5 15%接種于發酵培養基，在溫度25 30°C， 通氣量為O. 8 I. OdmVmin,轉速10(Tl50r/min條件下，培養3飛d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物； 2)將步驟I)中紫丁香蘑菌絲體發酵混合物進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物； 3)將步驟2)中淺紅色透明油狀物溶解到8(Γ100倍量重量的65 75%乙醇中，得到淺紅色透明一級提取物； 4)將步驟2)中淺紅色透明油狀物過濾，分離得到濾液和濾渣；向濾渣加入5 15倍量重量的水進行回流提取f 3h后過濾，合并兩次提取的濾液，濃縮至密度為O. 8^1. 2g/mL的溶液，攪拌中加入4飛倍量重量9(Γ95%的乙醇，靜置3飛h，過濾，得到淺棕色液體二級提取物，其pH值為6. 5 7. O。
2.根據權利要求I所述的紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法，其特征在于所述步驟I)將紫丁香蘑按體積比5 10%接種于發酵培養基，在溫度25 28°C，通氣量為O.8 I. 0dm3/min，轉速 10(Tl20r/min 條件下，培養 3 5d。
3.根據權利要求I或2所述的紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法，其特征在于所述I)中發酵培養基的配方為馬鈴薯20(T250g，加入水1000ml，100°C蒸煮20分鐘，雙層紗布過濾馬鈴薯蒸煮液，添加5 8g麩皮，食用蔗糖15 30g，硫酸錳f2. 5g，硫酸鎂Γ2. 5g。
4.一種根據權利要求I所得紫丁香蘑菌絲體提取物在卷煙中的應用，其特征在于將提取物按照煙絲重量的O. 001 O. 10%的比例進行加香或者加料。
5.根據權利要求4所述的紫丁香蘑菌絲體提取物在卷煙中的應用，其特征在于所述提取物為一級提取物和二級提取物任選一種或兩種。
全文摘要
本發明公開了一種紫丁香蘑深層發酵的菌絲體提取物的提取方法及其提取物在卷煙中的應用。該方法首先將紫丁香蘑按體積比5~15%接種于發酵培養基，培養3~5d，進行深層發酵獲得紫丁香蘑菌絲體發酵混合物；然后進行水蒸汽蒸餾提取揮發油至完全，得到淺紅色透明油狀物，然后不同方法得到一級提取物和二級提取物。再根據實際的需求將提取物按照煙絲重量的0.001~0.10%的比例進行加香或者加料。本發明方法簡單，實施容易，并且能夠做到對紫丁香蘑菌絲體發酵混合料液中有效成分的完全提取，經過組合應用到卷煙中，產生不同的加香加料效果，成本低廉，使用方便。
文檔編號A24B15/20GK102823937SQ201210295820
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者郭國寧, 劉冰, 張耀華, 岳海波 申請人:湖北中煙工業有限責任公司, 武漢市黃鶴樓科技園有限公司