專利名稱：用于表達mphosph1或depdc1多肽的癌癥的肽疫苗的制作方法
技術領域：
本申請要求2006年10月17日提交的美國臨時申請號60/852，575的權益，將其全部內容通過提述并入本文。本發明涉及生物科學領域，更具體地說，涉及癌癥治療領域。特別是，本發明涉及可充當及其有效的癌癥疫苗的新肽，還涉及用于治療和預防的腫瘤的含此類肽的藥物。
背景技術：
已經證明了⑶8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別呈遞在I類MHC分子上的、源自腫瘤相關抗原(TAA)的表位肽，并且使腫瘤細胞溶解。自從作為首個TAA實例的MAGE家族的發現以來，已經使用免疫學方法發現了許多其它TAA(Boon T. (1993)Int J Cancer54:177-80. ；Boon T.等，(1996)J Exp Medl83:725-9. ；van der BruggenP 等，(1991)Science254:1643-7. ；Brichard V 等，(1993)J Exp Medl78:489-95.；Kawakami Y等，(1994)J Exp Medl80:347-52.)。它們中的ー些目前正在臨床開發中被當作免疫治療的祀標。迄今為止發現的TAA包括MAGE (van der Bruggen P等，(1991)Science254:1643-7.)、gplOO (Kawakami Y 等，(1994)J Exp Medl80:347-52.)、SART(Shichijo S等，(1998) J Exp Med 187:277-88.)、和NY-ESCM (Chen Y. T.等，(1997)Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94:1914-8.)。另ー方面，已經證明，某些已顯示在腫瘤細胞中以某種程度特異性地過表達的基因產物被識別為誘導細胞免疫應答的靶標。這些基因產物包括 p53(Umano Y等，(2001) Br J Cancer, 84:1052-7. )、HER2/neu (Tanaka H等，(2001) BrJ Cancer, 84:94-9.)、CEA (Nukaya I 等，(1999) Int. J. Cancer80, 92-7.)等等。盡管關于TAA的基礎和臨床研究取得了顯著進展(Rosenberg SA等，(1998)Nature Med, 4:321-7. ；Mukherji B.等，(1995)Proc Natl Acad Sci USA, 92:8078-82. ；HuX等，(1996) Cancer Res, 56:2479-83.)，然而目前可用的適合于癌癥治療的候選TAA數非常有限。在癌細胞中大量表達并且其表達限定于癌細胞的TAA將有望成為免疫治療靶標的候選。HLA-A24和HLA-A0201均是日本人和白人的群體中普通的HLA等位基因(Date
Y等,(1996)Tissue Antigens47:93-101. ；Kondo A 等,(1995)JImmunol155:4307-12.；Kubo RT 等，(1994)J Immunol 152:3913-24. ; Imanishi 等，Proceeding of the eleventhInternational Histocompatibility Workshop and Conference Oxford UniversityPress,Oxford, 1065(1992) !Williams F 等，(1997)Tissue Antigen49:129-33.)。 因此，由這些HLA等位基因呈遞的癌癥的抗原肽可能在日本人和白人患者的癌癥治療中有特定效用。另外，已知曝露于高濃度的肽通常可導致低親和カCTL的體外誘導，在抗原呈遞細胞(APC)上生成高水平的特異性肽/MHC復合物，這些復合物能夠有效活化所述CTL (Alexander-Miller 等，(1996) Proc Natl Acad Sci USA93:4102-7.)。近來由于cDNA微陣列技術的發展，構建與正常細胞比較的惡性細胞的基因表達綜合譜已經成為了可能(Okabe, H.等，(2001) Cancer Res. , 61, 2129-37. ；LinYM.等，(2002)Oncogene, 21;4120-8. ；Hasegawa S.等，(2002)Cancer Res62:7012-7.)。這種手段使人們能夠了解癌細胞的復雜性質和癌發生的機制，并能更容易地鑒定出腫瘤中表達失調的基因(Bienz M.等，(2000) Celll03，311-20.)。在已被鑒定為在癌癥中上調的轉錄物中，MPH0SPH1 (M 期憐蛋白 I (M-phase phosphoproteinl) ;GenBank 登錄號 NM_016195 ;SEQ ID Nos. I, 2)和 DEPDCl (含 DEP 結構域的蛋白 I (DEP domain containing I) ；GenBank登錄號BM683578)是新近發現的。參見W02004/031413、W02006/085684和W02007/013, 665，將它們的全部內容通過提述并入本文。人們已經描述了 DEroci的兩種不同轉錄變體，即DEPDC1V1 (SEQ ID No. 3，4)和 DEPDC1V2 (SEQ ID No:5，6)。已經證明了這些基因在所分析病例的不同癌組織的腫瘤細胞中特異性地上調(見下文)；然而，Northern印跡分析證明這些基因產物不存在于正常生命器官中(參見PCT/JP2006/302684)。由于源自MPH0SPH1和
DEPDCl的免疫原性肽可能可以用來殺傷表達這些抗原的腫瘤細胞，所以發明人對這些基因特別有興趣。由于細胞毒性藥物諸如M-VAC經常引起嚴重副作用，所以顯然基于充分了解的作用機制精心選擇新的靶分子對于開發將不良副作用風險最小化的有效抗癌藥物是重要的。為了這個目的，發明人先前對多種癌癥和正常人組織進行了表達譜分析，并且發現了在癌癥中特異性過表達的多種基因(LinYM,等，Oncogene. 2002Junl3; 21:4120-8.；Kitahara O,等，Cancer Res. 200 IMay I; 61: 3544-9. ； Suzuki C,等，CancerRes.2003Novl;63:7038-41. ;Ashida S,Cancer Res.2004SepI;64:5963-72.；Ochi K,等，Int J Oncol. 2004Mar; 24 (3) :647-55. ；Kaneta Y,等，Int JOncol.2003Sep;23:681-91. ；Obama K, Hepatology. 2005Jun;41:1339-48. ；Kato T,等，Cancer Res. 2005JulI;65:5638-46. ；Kitahara 0，等，Neoplasia. 2002Jul_Aug;4:295-303. ； Saito-Hisaminato A 等，DNA Res2002, 9:35-45.)。其中，MPH0SPH1 (內部編號 C2093)和DEroci (內部編號B5860N)是經鑒定在多種癌癥中過表達的基因。特別地，MPH0SPH1被鑒定為在膀胱癌(bladder cancer)、乳腺癌(breast cancer)、宮頸癌(cervical cancer) >膽管細胞癌(cholangincellular carcinoma)、CML、結腸直腸癌(colorectal cancer) >胃癌(gastric cancer)、NSCLC、淋巴瘤(lymphoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、腎癌(renal carcinoma)、軟組織腫瘤(soft tissue tumor)中過表達。類似地，DEPDCl被鑒定為在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、SCLC、軟組織腫瘤中過表達。MPH0SPH1早先被鑒定為在G2/M過渡時被特異性磷酸化的蛋白質之一，并且被表征為正端導向的驅動蛋白相關蛋白(plus-end-directed kinesin related protein)(Abaza A等，J Biol Chem2003，278:27844-52.)。更具體地說，先前已經有文獻記載MPHOSPH I 是一種正端導向的分子馬達(plus-end-directed molecular motor),它在胞質分裂中扮演重要角色，并且在HeLa細胞中在分裂后期至分裂末期的過程中在紡錘體的中間區積累(AbazaA 等，J Biol Chem2003, 278:27844-52 ;Kamimoto T 等，J BiolChem2001，276:37520-8)。MPHOSPHlcDNA編碼ー種1780個氨基酸的蛋白質，該蛋白質由三個結構域構成NH2-驅動蛋白馬達結構域(NH2_kinasin motor domain)、中心卷曲螺旋-莖結構域(central coiled coil-stalk domain)、和 C-球形尾部結構域(C-globulartail domain)。同時，這些數據提示MPH0SPH1是NH2型驅動蛋白相關蛋白。關于DETOC1，尚不清楚它的功能。這種蛋白質中包含的DEP結構域同樣存在于Disheve 11 ed> Egl-IO 和 Pleckstrin 中。果妮(Drosophila) Dishevelled 中的 DEP 結構域在拯救平面極性缺陷(planar polarity defect)和誘導JNK信號傳導中扮演重要角色；然而，它在人類中的功能尚不清楚。但是，如PCT/JP2006/302684所披露的，DEPDClsiRNA能夠抑制癌細胞的生長。這些結果證明DEroci在大多數癌細胞的生長中發揮重要作用。

發明內容
如上所述，已經確定MPH0SPH1 (M期磷蛋白I)和DEroci (含DEP結構域的蛋白I)在多種癌癥中上調。更具體地，利用以全基因組cDNA微陣列進行的基因表達譜分析(gene expression profiling)鑒定了這些基因。如上文所討論的，已經證明了 MPH0SPH1和DEPDCl的表達在多種腫瘤細胞中特異性地上調，包括肺癌和膀胱癌。如表I中所述，證明了MPH0SPH1的表達在31例膀胱癌的30例中，36例乳腺癌的8例中，全部18例宮頸癌中，17例膽管細胞癌的5例中，31例CML的25例中，11例結腸直腸癌的6例中，14例胃癌的6例中，全部5例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨肉瘤的6例中，22例前列腺癌的7例中，18例腎癌的10例中和21例軟組織腫瘤的15例中有效升高(validly elevated)。同吋，如表I中所述，證明了 DEroCl的表達在25例膀胱癌的23例中，在13例乳腺癌的6例中，全部12例宮頸癌中，全部6例膽管細胞癌中，4例CML的3例中，4例結腸直腸癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，14例骨肉瘤的10例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31例軟組織瘤的22例中有效升高。本發明基于，至少部分地基于對這些基因的基因產物(MPH0SPH1和DEroCl)的特異性表位肽的鑒定，所述特異性表位肽能夠誘導對相應分子有特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。如下文將詳細討論的，使用源自MPH0SPH1或DETOCl的HLA_A*2402和HLA-A*0201結合性候選肽刺激健康供體的外周血單核細胞(PBMC)。然后建立了針對用各種候選肽沖擊(pulse)過的HLA-A24或HLA-A2陽性靶細胞具有特定細胞毒性的CTL克隆和/或細胞系。這些結果證實這些肽是HLA-A24或HLA-A2限定性表位肽(HLA_A24orHLA_A2restricted epitope peptides),其能夠誘導針對表達 MPH0SPH1 或 DEF1DCl 的細胞的強效且特異性的免疫應答。因此，本發明提供用于治療或預防與MPH0SPH1和/或DEroCl的過表達相關的疾病，例如癌癥。這些方法包括向需要的受試者施用本發明的MPH0SPH1和/或DEroCl多肽。這類肽的施用導致抗腫瘤免疫性的誘導。因此，本發明提供用于誘導受試者體內抗腫瘤免疫性的方法，這類方法包括向患者施用MPH0SPH1和/或DEroCl多肽的步驟；本發明還提供用于治療或預防與MPH0SPH1和/或DEroCl的過表達相關的疾病(例如癌癥)的藥物組合物，所述組合物包括MPH0SPH1和/或DEroCl多肽。示例性癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、和軟組織腫瘤。
S卩，本申請包括以下實施方案，和它們的任意組合。[I] ー種具有細胞毒性T細胞誘導能力的分離的肽，其中所述肽源自SEQ IDN0:2、4和6的氨基酸序列。[2]—種少于約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:7、8或12的氨基酸序列的肽組成的群組；或ー種具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ ID N0:7、8和12的氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。[3]項[2]的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中從N-末端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。[4]項[2]的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中C-末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
[5]—種少于約15個氨基酸的分離的肽，其選自由包含SEQ ID N0:9、10、ll、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、253、254 和 255 的氨基酸序列的肽組成的群組；或ー種具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中所述肽包含選自SEQ ID N0:9、10、
11、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、253、254 和 255 的氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。[6]項[5]的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中從N-末端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[7]項[5]的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中C-末端氨基酸是纈氨酸或
亮氨酸。[8] ー種載體，其中的DNA編碼[1]-[7]中任ー項的肽。[9] 一種用于治療或預防與SEQ ID NO: I、3和/或5所示基因的過表達相關的疾病的藥物組合物，所述組合物包含ー種或多種[1]_[7]中任ー項的肽。[10]項[9]的藥物組合物，其中所述疾病是癌癥。[11]項[10]的藥物組合物，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。[12] ー種外來體(exosome),其表面上呈現(present)包含[1]_[7]中任ー項的肽以及HLA抗原的復合物。[13]項[12]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A24。[14]項[13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。[15]項[12]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2。[16]項[13]的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。[17] 一種誘導具有高的細胞毒性T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，包括將抗原呈遞細胞與[1]_[7]中任一項的肽接觸的步驟。[18] ー種通過將T細胞與[1]_[7]中任一項的肽接觸來誘導細胞毒性T細胞的方法。[19] 一種誘導具有高的細胞毒性T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括將下述基因轉移至抗原呈遞細胞的步驟，所述基因包含編碼[1]_[7]中任一項的肽的多核苷酸。
[20] 一種分離的細胞毒性T細胞，所述細胞是通過將T細胞與權利要求1-7中任一項的肽接觸而被誘導的，或者所述細胞是用下述核酸轉導的，所述核酸編碼在HLA-A24或HLA-A2的背景下與權利要求1-7中任一項的肽結合的TCR亞基多肽。[21] ー種抗原呈遞細胞，所述細胞包含HLA抗原與[1]-[7]中任一項的肽之間形成的復合物。[22]項[21]的抗原呈遞細胞，所述細胞是通過項[17]的方法誘導的。[23] 一種用于抑制表達SEQ ID NO: 1、3和/或5的基因的細胞增殖的疫苗，其中所述疫苗包含[1]_[7]中任ー項的肽作為活性成分。[24]項[23]的疫苗，其中所述細胞是癌細胞。[25]項[24]的疫苗，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞
癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。[26]項[23]的疫苗，配制成用于向HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2的受試者施用。[27] —種治療或預防受試者中與SEQ ID NO: 1、3和/或5所示基因的過表達相關的疾病的方法，包括向所述受試者施用疫苗，所述疫苗包含ー種或多種[1]_[7]中任ー項的肽、所述肽的免疫學活性片段、或編碼所述肽或其免疫學活性片段的多核苷酸。[28]項[27]的方法，其中所述疾病是癌癥。[29]項[28]的方法，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。或者,本發明還涉及誘導細胞毒性T細胞的方法,包括將T細胞與通過項[19]的方法產生的抗原呈遞細胞接觸的步驟。在結合附圖和實施例閱讀以下詳述后，本發明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應該理解無論是前述的發明內容還是下文的詳述均為本發明的優選實施方案，而非對本發明或本發明的其它可供選擇的實施方案的限制。附圖簡述[圖I]圖IA描述的是用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定法的結果，所述結果進而證實MPH0SPHl-A24-9-278(SEQ ID NO: 7)是IFN-Y的強カ生產者。根據下文實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，與對照相比，4號孔中用MPH0SPH1-A24-9-278刺激的細胞顯示了可識別用肽沖擊過的(peptide pulsed)的祀細胞的強カIFN-Y產生。圖IB描述的是在有限稀釋(MPH0SPH1-A24-9-278CTL克隆)之后用于篩選CTL克隆的IFN-Y ELISP0T測定法的結果。擴增(expand)陽性孔中的細胞并且進行有限稀釋。如所示結果所證實，建立了與針對未用肽沖擊的靶相比針對肽沖擊的靶具有較高的特異性CTL活性的CTL克隆。[圖2]圖2A描述的是用于篩選表位肽細胞毒性的IFN-Y ELISP0T測定法結果，所述結果進而證實MPH0SPH1-A24-10-278(SEQ ID N0:8)是IFN-y的強カ生產者。根據下文實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，與對照相比，8號孔中用MPH0SPH1-A24-10-278刺激的細胞顯示了強的IFN-Y產生。圖2B描述的是在有限稀釋(MPH0SPH1-A24-10-278CTL克隆)之后篩選CTL克隆的IFN- y ELI SPOT測定法的結果。擴增陽性孔中的細胞并且進行有限稀釋。如所示結果所證實的，建立了與針對未用肽沖擊過的靶相比，針對經MPH0SPH1-A24-10-278沖擊的靶具有較高特異性CTL活性的CTL克隆。[圖3]圖3A描述用MPH0SPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)刺激的CTL克隆的建立。這種CTL克隆展示出高度的針對用MPH0SPH1-A24-9-278沖擊的靶細胞(A24LCL)的特異性CTL活性，但是針對未用肽沖擊的相同的靶細胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。圖3B描述用MPH0SPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO: 8)刺激的CTL克隆的建立。這種CTL克隆展示出高度的針對用MPH0SPH1-A24-10-278沖擊的靶細胞的特異性CTL活性，而該克隆針對未用肽沖擊的相同靶細胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。R表示應答物CTL克隆。
S表示刺激物用肽沖擊過的A24-LCL (IxlO4/孔)。[圖4]圖4 描述 MPH0SPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO: 7)在具有 HLA-A24 的靶細胞表面的表達。使用由MPH0SPH1-A24-9-278激發產生的CTL克隆作為效應細胞，測定了針對用全長MPH0SPH1基因和HLA-A*2402分子二者共同轉染的C0S7的特異性CTL活性。制備用全長MPH0SPH1轉染但不用HLA-A*2402轉染的C0S7和用HLA_A*2402轉染但不用全長MPH0SPH1轉染的C0S7作為對照。CTL克隆針對用MPH0SPH1和HLA-A24 二者共同轉染的C0S7展示出高度的特異性CTL活性。然而，該克隆針對未用MPH0SPH1或HLA-A24 (neither MPH0SPH1nor HLA-A24)轉染的C0S7未顯示顯著特異性CTL活性。R表示應答物CTL克隆。S表示刺激物C0S7轉染子(1x104/孔)。[圖5]圖5描述的是針對內源表達MPH0SPH1的膀胱癌細胞系的CTL活性。用MPH0SPH1-A24-9-278肽誘導建立的CTL克隆識別內源表達MPH0SPH1的腫瘤細胞。HT1376、RT-4和J82細胞分別內源表達MPH0SPH1。CTL克隆針對具有HLA_A*2402基因型的HT1376顯示了 IFN-Y的產生，但是針對非HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未顯示應答。[圖6]圖6描述的是使用MPH0SPH1-A24-9-278肽進行的體內免疫原性分析。在第0天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA綴合的肽。在第14天，收集接種過的小鼠的脾細胞并用作應答細胞(responder cell)，并且使用1x104個用MPH0SPH1-A24-9-278肽沖擊過的RLmalel細胞作為刺激細胞(stimulator cell)來進行IFN-Y ELI SPOT測定。標明了姆只小鼠的點形成計數(spot forming counts) (SFC);為五只小鼠(Anil Ani5)接種表位肽，為三只小鼠(negafnega3)注射模擬物IFA乳劑作為陰性對照。[圖7]圖7描述的是篩選表位肽的IFN- y ELISP0T測定的結果，該結果進而證實 MPH0SPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO: 9)、MPH0SPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10)和MPH0SPH1-A2-10-1714(SEQ ID NO: 11)具有強カ的IFNi產生活性。根據下文所列實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自MPH0SHP1的那些肽的CTL。所示為得到的具有可檢測的特異性CTL活性的CTL。具體而言，圖7A證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-9-282刺激的I號和5號孔中的細胞顯示了足以識別用肽沖擊的靶細胞的強カ的IFN- Y產生。圖7B證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-9-638刺激的8號孔中的細胞顯示了足以識別用肽沖擊過的靶細胞的強力的IFN-Y產生。圖7C證實與對照相比用MPH0SPH1-A2-10-1714刺激的4號孔中的細胞顯示了可識別用肽沖擊過的靶細胞的強カ的IFN-Y產生。[圖8]圖 8 描述的是用 MPH0SPH1-A02-9-282、(SEQ ID NO: 9) MPH0SPH1-A02-9-638 (SEQID NO: 10)和 MPH0SPH1-A02-10-1714 (SEQ ID NO: 11)刺激的 CTL 細胞系的建立。擴增陽性孔中的細胞，并且如所述結果所示，建立了這樣的CTL細胞系，所述細胞系針對用MPH0SPH1-A02-9-282沖擊的革巴(A)、用MPH0SPH1-A02-9-638沖擊的革巴(B)或用MPH0SPH1-A02-10-1714沖擊的靶(C)具有更高的特異性CTL活性(相比于針對未用肽沖擊 的靶的活性)。R表示應答物CTL細胞系。S表示刺激物用肽沖擊過的T2 (IxlO4個/孔)。[圖9]圖9A描述在有限稀釋(MPH0SPH1-A2-9-282CTL克隆)之后用于篩選CTL克隆的IFN-Y ELISP0T測定的結果。擴增陽性孔中的細胞并且進行有限稀釋。如所述結果所示，建立了這樣的CTL克隆，所述CTL克隆針對用MPH0SPHl-A2-9-282(SEQ ID N0:9)沖擊的靶的特異性CTL活性高于針對未用肽沖擊的靶的活性。圖9B描述的是用MPH0SPH1-A02-9-282刺激的CTL克隆的建立。所述CTL克隆針對用MPH0SPH1-A2-9-282沖擊的靶細胞(T2)展示出高度的特異性CTL活性，但是針對未用肽沖擊的相同靶細胞(T2)無顯著CTL活性。R表示應答物CTL克隆。S表示刺激物用肽沖擊過的T2 (IxlO4/孔)。[

圖10]圖IOA描述的是用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定的結果，該結果進而證實DEPDCl-A24-9-294(SEQ ID NO: 12)是強的IFN-Y生產者。根據下文所列實施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了針對源自DEroCl的那些肽的CTL。所示為得到的表現出可檢測的特異性CTL活性的CTL。用DEroCl-A24-9-294刺激的10號孔中的細胞與對照相比顯示了可識別用肽沖擊過的靶細胞的強的IFN-Y生產。圖IOB描述的是在有限稀釋之后(DEroCl-A24-9-294CTL克隆)篩選CTL克隆的IFN- y EU SPOT測定的結果。擴增陽性孔中的細胞并且進行有限稀釋。如所述結果所示，建立了這樣的CTL克隆，所述CTL克隆針對用DEroCl-A24-9-294沖擊的靶的特異性CTL活性高于針對未用肽沖擊過的靶的活性。[圖11]圖11描述的是用DEPDCl-A24-9-294(SEQ ID NO: 12)刺激的CTL克隆的建立。所述CTL克隆顯示出高度的針對用DEroCl-A24-9-294沖擊過的靶細胞(A24LCL)的特異性CTL活性，而針對未用肽沖擊的相同靶細胞(A24LCL)未顯示顯著CTL活性。R 表示應答物DEPDC-A24-9-294CTL 克隆。
S表示刺激物用肽沖擊的A24-LCL (IxlO4個/孔)。[圖12]圖12 描述的是具有 HLA-A24 的靶細胞表面上 DEPDC1-A24-9-294(SEQID NO: 12)的表達。使用由DEH)Cl-A24-9-294激發產生的CTL克隆作為效應細胞，測定了針對用全長DEPDCl基因和HLA-A*2402分子二者共同轉染的C0S7的特異性CTL活性。制備了用全長DEPDCl轉染但不用HLA-A*2402轉染的C0S7和用HLA_A*2402轉染但不用全長DETOCl轉染的C0S7作為對照。建立的CTL克隆針對用DEroCl和HLA-A24 二者共同轉染的C0S7展示出高度的特異性CTL活性。然而，該克隆針對未用DEroCl或HLA-A24轉染的C0S7未顯示顯著的特異性CTL活性。R 表示應答物DEP-A24-9-294CTL 克隆。 S表示刺激物C0S7轉染子(IxlO4個/孔)。[圖13]圖13描述的是針對內源表達DEroCl的膀胱癌細胞系的CTL活性。用DEPDC1-A24-9-294 妝誘導的建立的 CTL 克隆(established CTL clone induced withDEPDCl-A24-9-294p印tide)識別內源表達DEPDCl的腫瘤細胞。HT1376、RT-4和J82細胞分別內源表達DETOC1。所述CTL克隆針對具有HLA-A*2402基因型的HT1376顯示了 IFN-Y的產生，但是針對非HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未顯示應答。[圖14]圖14描述的是使用DEroCl-A24-9_29肽進行的體內免疫原性分析。在第0天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA綴合的肽。在第14天，收集接種過的小鼠的脾細胞并用作應答細胞，并且使用IxlO4個用DEroCl-A24-9-294肽沖擊過的RLmalel細胞作為刺激細胞來進行IFN-Y ELISP0T測定。標明了每只小鼠的點形成計數(SFC);為五只小鼠(Anil^AniS)接種表位肽，為兩只小鼠(negal和nega2)注射模擬物IFA乳劑作為陰性對照。[圖15]圖15描述了用于篩選表位肽的IFN-Y ELISP0T測定中DEPDC1-A02-10-644、-10-575、-10-506、-10-765、-10-395、-10-224、-9-297、-10-296 和-10-302 的強カ IFN-y 產生。以“材料和方法”中描述的方式生成了針對源自DEroCl的那些肽的CTL。與對照相比，用DEroCl-A02-10-644刺激的4號和7號孔中的細胞，用DEroCl-A02-10_575刺激的2號孔中的細胞，用DEroCl-A02-10-506刺激的7號孔中的細胞，用DEroCl-A02-10_765刺激的I號孔中的細胞和用DEroCl-A02-10-395刺激的I號孔中的細胞，用DEroCl-A02-10_224刺激的I號和2號孔中的細胞，用DEroCl-A02-9-297刺激的4號孔中的細胞，用DEPDC1-A02-10-296刺激的3號和4號孔中的細胞和用DEroCl-A02-10_302刺激的2號、3號、5號和7號孔中的細胞顯不了強力的IFN-Y產生。[圖16]圖16描述的是用DEPDC1-A02-10-296肽生成的CTL細胞系的IFN- y產生。通過DEroCl-A02-10-296肽激發產生的建立的CTL細胞系具有強カ的IFN-Y產生活性。該圖顯示，針對用肽刺激的靶細胞產生了 IFN-Y，但是針對未用肽刺激的靶細胞未顯示IFN-Y產生。使用的靶細胞是在細胞表面表達HLA-A2分子的T2細胞。
[圖17]圖17描述的是針對內源表達DEroCl和HLA-A2分子的靶的CTL活性。上方圖中顯示的是，用DEroCl-A02-10-296肽產生的、建立的CTL細胞系，針對內源表達DETOC1V2和HLA-A2的靶細胞具有IFN-Y產生活性。使用DEroCl-A02-10_296肽的情況在下方圖中顯示。制備了用DEPDC1V1-9-674或DEP-9-462肽刺激的、僅表達DEPDC1V2和僅表達HLA-A2的靶細胞，作為陰性對照。靶細胞是從穩定表達HLA-A2或模擬物(mock)的HEK293轉染子制備的。[圖18]圖18描述的是病例2中的抗原表達。在病例2中，MPH0SPH1和DETOCl均強カ表達。因此，接種了源自MPH0SPH1和DEroCl的兩類表位肽。[圖19]圖19描述的是對病例2中膀胱癌局部復發的臨床評估。根據RECIST標準評估病例2為SD0[圖20]圖20描述的是病例3中的抗原表達。在病例3中，DEPDCl強カ表達。因此，我們僅接種了源自DEroci的表位肽。[圖21]圖21描述的是對病例3中轉移性肺右葉的臨床評估。在接種之后進展速度被降低。特別的是，腫瘤大小在第三個療程之后減小。[圖22]圖22描述的是對病例3中轉移性肺左葉的臨床評估。進展速度在接種之后被降低。特別的是，腫瘤大小在第三個療程之后減小。[圖23]圖23描述的是病例3中的抗腫瘤效果。在接種之后轉移性腫瘤的進展速度被降低。[圖24]圖24描述的是病例3中的特異性CTL應答。在接種之后強烈地表現特異性CTL應答。[圖25]圖25描述的是病例4中的抗原表達。在病例4中，MPH0SPH1和DETOCl被表達。因此，接種了源自MPH0SPH1和DEroCl的兩種表位肽。[圖26]圖26描述的是對病例4中膀胱癌局部復發的臨床評估。在第一接種療程之后，根據RECIST標準腫瘤大小降低了 20%。發明詳述除非另有特定的說明，本說明書中使用的術語“ー個(a)”或“ー種(an)”和“該/所述(the)”是指至少ー個或至少ー種。除非另有定義，本說明書中使用的所有技術和科學術語的意思與本發明所屬技術領域普通技術人員所通常理解的意思相同。
新的TAA的鑒定，特別是對誘導強カ且特異性的抗腫瘤免疫應答的那些TAA的鑒定，為人們進ー步開發肽接種策略在多種類型的癌癥中的臨床應用提供了保證(Boon T等，(1996) J Exp Medl83:725-9. ；van der Bruggen P等，(1991) Science254:1643-7.；Brichard V 等，(1993)J Exp Medl78:489-95. ；Kawakami Y 等，(1994)J ExpMedl80:347-52. ； Shichi jo S等，(1998) J ExpMedl87:277-88. ；Chen YT 等，(1997) Proc.Natl. Acd. Sci. USA, 94:1914-8. ；Harris CC, (1996)J Natl Cancer Inst88:1442-55.；Butterfield LH 等，(1999)Cancer Res59:3134-42. ；Vissers JL 等，(1999)CancerRes59:5554-9. ；van der Burg SH 等，(1996) J. Immunol 156:3308-14. ；Tanaka F等，(1997)Cancer Res57:4465-8. ；Fujie T等，(1999) Int J Cancer80:169-72. ；KikuchiM 等，(1999)Int J Cancer81:459-66. ；0iso M 等，(1999)Int J Cancer81:387-94.)。如上所述，人們先前使用cDNA微陣列技術確定了 MPH0SPH1 (M期磷蛋白I ;GenBank登錄號 NM_016195 ;SEQ ID Nos. I, 2)和 DEPDCl (含 DEP 結構域的蛋白 I ;GenBank 登錄號BM683578)，更具體而言是它的兩種變體 DEroClVl (SEQ ID Nos. 3, 4)和 DEPDC1V2 (SEQID No. 5，6)在多種癌癥中過表達。MPH0SPH1先前被鑒定為G2/M過渡時被特異性磷酸化的蛋白質之一，并且被表征為正端導向的驅動蛋白相關蛋白(Abaza A等，J Biol Chem2003, 278:27844-52.)。更具體地，先前已經有文獻記載MPH0SPH1是ー種正端導向的分子馬達，在胞質分裂中扮演重要角色，并且在HeLa細胞中在分裂后期至分裂末期的過程中在紡錘體的中間區積累(Abaza A等，J Biol Chem2003, 278:27844-52;Kamimoto T等，JBiol Chem2001, 276:37520-8.)。MPHOSPHlcDNA 編碼ー種 1780 個氨基酸的蛋白質，所述蛋白質由三個結構域構成NH2-驅動蛋白馬達結構域(NH2_kinasin motor domain),中心卷曲螺旋-莖結構域，和C-球形尾部結構域。這些數據提示MPH0SPH1是NH2型驅動蛋白相關蛋白。DEF1DCl 蛋白的功能尚不清楚。在 Dishevelled、Egl-IO 和 Pleckstrin 中發現了這種蛋白質中包括的DEP結構域。具體而言，果蠅Dishevelled中的DEP結構域在平面極性缺陷的拯救和JNK信號傳導的誘導中扮演重要角色；然而，它在人類中的功能尚不清楚。但是，如PCT/JP2006/302684中所公開的，DEPDCl (內部編號B5860N)具有由12和11個外顯子組成的兩種不同的轉錄變體，分別對應于DEroClVl和V2。注意到Vl第8外顯子中的可選變異，并發現其它剰余的外顯子為兩種變體所共有。V2變體沒有Vl的第8外顯子，但是在最后一個外顯子內產生相同的終止密碼子。B5860NV1和B5860NV2變體的全長cDNA序列分別由5318和4466個核苷酸組成。這些變體的ORF始于各自的第I外顯子內。最終，Vl和V2轉錄物分別編碼811個和527個氨基酸。siRNA抑制了癌細胞的生長。這些結果證實DEroci在大多數癌細胞的生長中發揮重要作用。如PCT/JP2006/302684中所公開的，MPH0SPH1和DEI3DCl在膀胱癌中過表達，但是在正常組織中顯示最低表達(minimal expression)。此外,發現這些基因具有與細胞增埴相關的重要功能。在本發明中，證明了源自MPH0SPH1或DEroCl的肽是限定于HLA-A24和HLA-A2的TAA表位，HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白人群體中常見的HLA等位基因。具體而言，利用它們對HLA-A24和HLA-A2的結合親和力，鑒定了源自MPH0SPH1或DEPDCl的HLA-A24和HLA-A2結合肽的候選物。在通過裝載有這些肽的樹突細胞(DC)體外刺激 T 細胞之后，成功地使用 MPH0SPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO: 7))、MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQ ID NO: 8))、MPH0SPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQ IDN0:9))、MPH0SPH1-A2-9-638(RLAIFKDLV(SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV (SEQ ID NO: 11))、DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO: 12))、DEPDCl-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ ID NO: 240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ IDNO: 241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO: 243))、DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO :244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO :249), DEPDC1-A02-10-224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO: 253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQID NO:226)), DEPDCl-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQ ID NO: 254))、DEPDQ-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO: 255))、DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO:192)),DEPDCl-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ ID NO: 195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQID NO : 197) ) 、DEPDC1_A2_9_5 6 3 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO :209)),DEPDC1-A2-9-653(CVLCCAEEV(SEQ ID N0:225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQIDN0:228))和 DEPDCl-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO:230))建立了 CTL。這些 CTL 針對用肽沖擊過的A24LCL和T2細胞展現出強力的細胞毒活性。此外，源自這些細胞的CTL 克隆還分別展現出針對表達MPH0SPH1或DEroCl的HLA-A24或HLA-A2陽性細胞的特異性細胞毒性。然而，這些CTL克隆針對僅表達這些肽(包括HLA-A24、HLA-A2、MPH0SPH1和DEPDCI)中的一種的細胞不表現細胞毒活性。這些結果合起來提示MPH0SPH1和DEroCl作為癌細胞的 TAA 是有用的，并且 MPH0SPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL(SEQ ID N0:7))、MPH0SPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQ ID NO: 8))、MPH0SPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQID NO: 9)) , MPH0SPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11))、DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO: 12)), DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ ID NO: 240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ ID NO: 241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO: 243))、DEPDC1-A02-10-76
5(KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244))、DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10-224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO: 253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQID NO:226)), DEPDCl-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQ ID NO: 254))、DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO: 255))、DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO:192)),DEPDCl-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ ID NO: 195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQID NO :197)) , DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO : 209)),DEPDC1-A2-9-653(CVLCCAEEV(SEQ ID NO: 225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQIDNO:228))和 DEPDCl-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO:230))是限定于HLA-A24 或HLA-A2的各TAA的表位肽。由于這些抗原在大多數癌癥中過表達，并且與腫瘤細胞增殖相關，它們作為針對癌癥的免疫治療靶是有用的。示例性癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。因此，本發明進ー步提供治療或預防受試者中與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病例如癌癥的方法，這樣的方法包括向需要的患者施用免疫原性肽的步驟，所述肽小于約40個氨基酸，經常小于約20個氨基酸，通常小于約15個氨基酸，并且具有SEQ IDN0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列。或者，所述免疫原性肽可以由SEQ ID NOs: 7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或 255 的序列構成，其中
取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個(例如，多至5個)氨基酸，條件是所得變體肽保留所述免疫原性(即，誘導對表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞例如癌癥有特異性的CTL的能力)。取代、缺失或添加的殘基數通常是5個氨基酸或更少，優選4個氨基酸或更少，更優選3個氨基酸或更少，甚至更優選一個或兩個氨基酸。預期的癌癥包括，但不限干，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。已知變體肽(即氨基酸序列經修飾的肽，所述修飾是通過對原始氨基酸序列進行ー個、兩個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加來進行的)保留原始生物學活性(MarkDF 等，(1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6. ；Zoller MJ and Smith M, (1982)Nucleic Acids Res 10:6487-500. ；Dalbadie-McFarland G等，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13.) o在本發明的上下文中，優選氨基酸修飾導致對原始氨基酸側鏈性質的保留(該過程被稱為保守氨基酸取代)。氨基酸側鏈性質的實例包括疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及共同具有以下官能團或特征的側鏈脂族側鏈(G、A、V、L、I、P);含羥基側鏈(S、T、Y);含硫原子的側鏈(C、M);含羧酸和酰胺的側鏈(D、N、E、Q);含堿側鏈(base containing side-chain) (R、K、H);和含芳基側鏈(aromatic containing side-chain) (H、F、Y、W)。注意，圓括號內的字母表示氨基酸的單字母編碼。在優選的實施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚體)或十肽(10聚體)。本發明進ー步提供對受試者中與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病(例如癌癥)誘導抗腫瘤免疫性的方法，這樣的方法包括向需要的受試者施用本發明的免疫原性肽，即具有 SEQ ID N0:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列或其變體(即，包括I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加)的肽，的步驟。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。在本發明的上下文中，受試者優選是哺乳動物。示例性哺乳動物包括，但不限干，例如，人、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛(COW)。在本發明中，可以藉由體內或回體(ex vivo)方案向受試者施用所述肽。此外，本發明還提供使用九肽或十肽制造用于治療或預防與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病(例如癌癥)的免疫原性組合物的用途，所述九肽或十肽選自下組具有SEQ IDN0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254和255的氨基酸序列(及其變體)的肽。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。對MPH0SPH 卜 A24-9-278 (IYNEYIYDL(SEQ ID NO : 7))、MPH0SPH 卜 A24-10-278 (IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8))、MPH0SPH卜A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ IDNO :9))、MPH0SPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO: 10))、MPH0SPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11)) , DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQ ID NO:12))、DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQ ID NO: 192))、DEPDC1-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQID NO: 195)) , DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL(SEQ ID NO : I 9 7)),DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL(SEQ ID NO: 209))、DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV(SEQID NO :225)) , DEPDCl-A2-10-674 (FLMDhHQEIL(SEQ ID NO :228)),DEPDC1-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ ID NO:230))DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ IDNO:240)),DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241))、DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL(SEQ ID NO:243))、DEPDC1-A02-10_765(KQFQkEYPLI(SEQ ID NO:244))、DEPDC1_A02_10-395(IMGGSCHNLI(SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10_224(NMANtSKRGV(SEQ ID NO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQ ID NO:226))、DEPDC1-A02-10_296(YELFvNILGL(SEQ IDNO:254))和 DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO:255))的同源性分析顯示它們不與源自任何已知的人基因產物的肽具有顯著同源性。因此，顯著降低了針對這些分子的免疫治療產生未知的或不期望的免疫應答的可能性。關于HLA抗原，本文所示數據證實使用A-24型或A_2型抗原(據稱在日本人中高 表達)有利于獲得有效的結果。使用諸如A-2402和A-0201等亞型是更優選的。通常，在臨床上，預先調查需要治療的患者的HLA抗原類型，進而能夠選擇對患者抗原具有高結合親和力水平或具有通過抗原呈遞而誘導細胞毒性T細胞(CTL)的能力的適合的肽。此外，為了獲得具有高結合親和力和CTL誘導能力的肽，可以基于天然存在的MPH0SPH1和DEroCl部分肽進行I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加。在本文中，術語“幾個”意指5個或更少，更優選3個或更少。此外，除了天然呈現的肽，由于呈現的肽序列與HLA抗原結合的規律性是已知的(Kubo RT,等，(1994) J. Tmmuno I. , 152, 3913-24. ； Rammen see HG，等，(1995)Immunogenetics. 41:178-228. ；KondoA,等，(1995) J. Immunol. 155:4307-12.),所以可以基于這種規律性對本發明的免疫原性肽進行修飾。例如，可優選使用這樣的具有高HLA-24結合親和カ的肽，其中將N末端起的第二個氨基酸用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代。同樣，C-末端氨基酸被取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽也可優選使用。另ー方面，可以優選使用具有高HLA-A2結合親和カ并且N末端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸取代的肽，以及C末端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸的肽。此外，可以向所述肽的N末端和/或C末端添加I至2個氨基酸。然而，當所述肽序列與具有其它不同功能的內源或外源蛋白質的部分氨基酸序列相同時，可能引發副作用，諸如針對具體物質的自身免疫病或變應性癥狀等。因此，優選避免所述免疫原性序列與已知蛋白質的氨基酸序列匹配的情況。這種情況可以通過使用可用數據庫進行同源性捜索來避免。如果同源性捜索確認自然界中不存在I個、2個或幾個氨基酸不同的肽(peptides in whicnl，2or several different amino acids donot exist in nature)，那么可以避免上述氨基酸序列被修飾(例如增加HLA抗原的結合親和カ和/或增加CTL誘導能力的修飾)的危險(the danger that modificationsof the above-mentionea amino acid sequence tnat,ior example，increase thebinding affinity with HLA antigens, and/or increase the CTL inducibility can beavoided)。
盡管預期如上所述對HLA抗原具有高結合親和力的肽可作為高效的癌癥疫苗，但是對于候選肽——它們是以高結合親和カ的存在作為指標選擇的——而言，必須考察它們CTL誘導能力是否確實存在CTL誘導能力。CTL誘導能力可以通過常規方法加以確認通過誘導攜帯人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如，B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞)，或更具體地說，源自人外周血單個核白細胞的樹突細胞，并且，在用感興趣的肽刺激之后，與CD8陽性細胞混合，再測量針對所述靶細胞的細胞毒活性。作為反應體系，可以使用制備為表達人HLA抗原的轉基因動物(例如，在BenMohamed L,等，(2000) Hum. Immunol.；61 (8) : 764_79Related Articles, Books, Linkout.中描述的那些)。例如，可以用51Cr 等對靶細胞進行放射標記，并且可以根據從靶細胞釋放的放射性來計算細胞毒活性。或者可以這樣檢查，通過測量在攜帯固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下由CTL產生并釋放的IFN- y，并且使用抗IFN- y單克隆抗體使培養基上的抑制區可視化。如上所述對肽的CTL誘導能力的檢查結果發現，對HLA抗原具有高結合親和力的那些肽不一定具有高誘導能力。然而，選自下述肽的九肽或十肽顯示出特別高的CTL誘導能力，所述肽具有 IYNEHYDL(SEQ ID NO: 7)、IYNEyIYDLF (SEQ ID NO :8), YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)、RLAIFKDLV (SEQ ID NO: 10), TMSSsKLSNV(SEQ ID NO: 11)、EYYELFVNI (SEQID NO: 12)、LLQPHLERV (SEQ ID NO: 192)、LLMRMISRM (SEQ ID NO: 195)、LLTFEYYEL (SEQID NO: 197)、RLCKSTIEL (SEQ ID NO: 209)、CVLCCAEEV (SEQ ID NO: 225)、FLMDhHQEIL (SEQID NO:228)、ILVVcGYITV (SEQ ID NO: 230)、DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ IDNO:240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQ ID NO:241))、DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQ ID NO:243))、DEPDC1-A02-10_765(KQFQkEYPLI(SEQ ID NO:244))、DEPDC1_A02-
10-395(IMGGSCHNLI(SEQ ID NO:249)、DEPDC1-A02-10_224(NMANtSKRGV(SEQ ID N0:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQ ID NO:226))、DEPDC1-A02-10_296(YELFvNILGL(SEQ IDNO:254))和 DEPDC1-A02-10-301(NILG1LQPHL(SEQ ID NO:255))所示的氨基酸序列。如上所述，本發明提供具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，即具有SEQ ID NOs:7,8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或255的氨基酸序列或其變體(S卩，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸)的那些月太。因此，優選的是，所述由 SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255或其變體中所示的9個或10個氨基酸構成的氨基酸序列不匹配于另ー內源蛋白相關的氨基酸序列。具體而言，在N末端起的第二個氨基酸處取代為亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸取代，在C末端氨基酸處取代為纈氨酸或亮氨酸的氨基酸取代，和在N末端和/或C末端處添加I至2個氨基酸的氨基酸添加是優選變體的實例。本領域技術人員將認識到除了氨基酸取代和添加，所述肽的免疫學活性片段也可以在本發明的方法中使用。用于測定活性片段的方法是本領域熟知的。通過用這些經修飾的肽進行刺激而獲得的CTL克隆能夠識別原來的肽并且引起表達所述原始肽的細胞的損害。本發明的肽能夠使用公知的技術制備。例如，可以使用重組DNA技術或化學合成以合成方法制備所述肽。本發明的肽可以個別地合成或作為更長的包含兩個或多個肽的多肽合成。本發明的肽優選是分離的，即，基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白及其片段。本發明的肽可以含有修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化；只要所述修飾不破壞如本文所述的肽的生物學活性，即與HLA抗原結合并誘導CTL的能力。其它修飾包括摻入例如可以用于增加肽的血清半衰期的D-氨基酸或其它氨基酸模擬物。本發明的肽可以作為組合制備，所述組合包括兩個或更多個本發明的肽，用作與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病例如癌癥所用的疫苗，這樣的疫苗在體內誘導CTL0預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。所述肽可以是雞尾酒混合物(cocktail)或者可以使用標準技術使其彼此綴合(conjugate)。例如,可以將所述肽表達成單ー多肽序列。組合中的肽可以是相同的或不同的。通過施用本發明的肽，使所述肽以高密度呈現于抗原呈遞細胞的HLA抗原上，進而誘導CTL，所述CTL特異性地針對所展示的肽和HLA抗原之間形成的復合物起反應。或者，可以用本發明的肽來刺激表面具有固定化的本發明的肽的抗原呈遞細胞，所述抗原呈遞細胞是通過從受試者取出樹突細胞來獲得的。向對應的(respective)受試者再施用這些細胞可誘導CTL,并且由此能夠增加對革巴細胞的進攻性。更具體地，本發明提供用于治療和/或預防與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病(例如癌癥)的増殖、轉移等的藥物，所述藥物包括一種或多種本發明的肽。本發明的肽在治療與MPH0SPH1和/或DEroCl相關的疾病(例如癌癥)方面尤其有用。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。本發明的肽可以作為通過常規配制方法配制好的藥物組合物直接向受試者施用。在這類情況下，除了本發明的肽，可以適當地包括通常用于藥物的載體(carrier)、賦形劑等，不對此進行具體限制。本發明的免疫原性組合物可以用于治療和預防與MPH0SPH1和/或DEroci相關的疾病例如癌癥。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。包含一種或多種本發明的肽作為活性成分、用于治療和/或預防與MPH0SPH1和/或DEroci過表達相關的疾病例如癌癥的免疫原性組合物，可以進一歩包括佐劑以有效建立細胞免疫。或者，它們可以與其它活性成分一起施用，諸如抗癌劑。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。合適的劑型包括顆粒。合適的佐劑在文獻中有述(Johnson AG. (1994)Clin. Microbiol. Rev. , 7:277-89.) 示例性佐劑包括，但不限于，磷酸鋁、氫氧化鋁和明礬。此外，可以方便地使用脂質體制劑、其中將藥物與幾微米直徑的珠子結合的顆粒制劑、和其中將脂質與所述肽結合的制劑。施用的方法可以是ロ服(oral)、真皮內(intradermal)、皮下(subcutaneous)、靜脈內(intravenous)注射等，并且可以包括系統施用或對靶向的腫瘤附近的局部施用。本發明的肽的劑量可以根據所治療的疾病、患者的年齡、體重、施用方法等進行適當調整。盡管劑量通常為0. OOlmg至lOOOmg，優選0. Olmg至IOOmg,更優選0. Img至IOmg,優選姆幾天至幾個月施用一次,但是本領域技術人員能夠容易地選擇適當的劑量和施用方法，因為對這些參數的選擇和優化完全屬于常規技木。本發明進一歩提供稱作外來體(exosome)的胞內泡囊，其表面提呈由本發明的肽和HLA抗原形成的復合物。外來體可以通過，例如，使用在國際公布的日文翻譯公布特表平
11-510507號和特表2000-512161號中詳細描述的方法來制備，并且優選使用從治療和/或預防的目標受試者獲得的抗原呈遞細胞制備。本發明的外來體可以作為癌癥疫苗接種，類似于本發明的肽。所用HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者匹配。例如，在日本人群體中，HLA-A24或HLA-A2，尤其是HLA-A2402或HLA-A0201，通常是適合的。在一些實施方案中，本發明的疫苗組合物包括致敏(prime)細胞毒性T淋巴細胞的成分。已經確定脂質是能夠在體內使CTL針對病毒抗原致敏的作用物。例如，可以將棕櫚酸殘基附接于賴氨酸殘基的e-和a-氨基，再與本發明的免疫原性肽連接。然后所述脂質化的肽(lapidated peptide)可以直接施用、在微團或顆粒中施用、并入脂質體中施用、或在佐劑中乳化施用。作為脂質致敏CTL應答的另ー實例，大腸桿菌脂蛋白諸如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine) (P3CSS)當共價附接于適當的肽時可以用于致敏CTL(參見,例如,Deres K，等，(1989)Nature342:561-4.)。本發明的免疫原性組合物還可包括編碼ー種或多種本文公開的免疫原性肽的 核酸。參見，例如，Wolff JA 等，(1990) Science247:1465-8 ;美國專利第 5, 580, 859 ；5，589，466 ;5，804，566 ;5，739，118 ;5，736，524 ;5，679，647 號;和 TO98/04720。基于 DNA 遞送技術的實例包括“裸DNA”、協助(bupivicaine、聚合物、肽介導的)遞送、陽離子脂質復合物、和顆粒介導的遞送(“基因槍”)或壓カ介導的遞送(參見，例如，美國專利第5，922，687號)。本發明的免疫原性肽也可以通過病毒載體或細菌載體來表達。合適的表達載體的實例包括減毒的病毒宿主，諸如痘苗或禽痘。這種方法涉及痘苗病毒的使用，例如，用作表達編碼所述肽的核苷酸的載體。當引入宿主時，所述重組痘苗病毒表達所述免疫原性肽，并且由此引發免疫應答。可用于免疫方案的痘苗載體和方法在美國專利第4，722，848號中描述。另一合適載體是 BCG(卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。BCG 載體在 Stover CK,等，(1991) Nature351:456-60中描述。可用于治療施用或免疫的多種其它載體，例如，腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒炭疽毒素載體等是本領域已知的。參見，例如，Shata MT，等，(2000) Mol. Med. Today6:66-71 ；Shedlock DJ and Weiner DB.,等，(2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806 ;和 Hipp JD,等，(2000) In Vivol4:571-85。本發明還提供使用一種或多種本發明的肽誘導抗原呈遞細胞的方法。所述抗原呈遞細胞可以這樣誘導，通過從外周血單核細胞誘導樹突細胞，再用一種或多種本發明的肽在體外、回體或在體內接觸(刺激)它們。當向受試者施用本發明的肽時，受試者體內誘導生成固定有本發明的肽的抗原呈遞細胞。或者，可以在將本發明的肽固定至抗原呈遞細胞之后，將所述細胞作為疫苗施用于受試者。例如，回體的施用可以包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細胞，和b:將步驟a的抗原呈遞細胞與本發明的肽接觸。可以將通過步驟b獲得的抗原呈遞細胞作為疫苗施用給受試者。本發明還提供用于誘導具有高水平的細胞毒性T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，其中所述方法包括在體外向抗原呈遞細胞轉移基因的步驟，所述基因由編碼ー種或多種本發明的肽的多核苷酸構成。引入的基因可以是DNA或RNA的形式。關于引入的方法，沒有特殊的限制，本領域常規進行的多種方法，諸如脂質轉染法、電穿孔和磷酸鈣方法可以適用。更具體地，轉染可以如Reeves ME,等，(1996) Cancer Res.，56:5672-7.；Butterfield LH,等，(1998) J. Immunol. , 161:5607-13. ；Boczkowski D,等，(1996) J. Exp.Med.，184:465-72.;國際公布的日文翻譯公布特表2000-509281號中所述來進行。通過將基因轉移至抗原呈遞細胞中，基因在所述細胞中進行轉錄、翻譯等，然后由I類或II類MHC加工獲得的蛋白，再通過呈遞途徑以呈遞部分肽。本發明進一歩提供使用一種或多種本發明的肽誘導CTL的方法。當本發明的肽被施用給受試者時，受試者體內誘導出CTL，由此增強靶向表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞例如癌細胞的免疫系統的強度。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、 淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。或者，本發明的肽可以在回體的治療方法的背景下使用，其中用一種或多種本發明的肽在體外接觸(刺激)源自受試者的抗原呈遞細胞和CD8陽性細胞或外周血單個核白細胞，然后，在誘導CTL之后，將細胞返回受試者。例如，所述方法可以包括以下步驟a:從受試者收集抗原呈遞細胞，b:將步驟a的抗原呈遞細胞與本發明的肽接觸，c:將步驟b的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合并且進行共培養從而誘導細胞毒性T細胞，和d:從步驟c的共培養物收集OT8+T細胞。步驟d獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗向受試者施用。本發明進一歩提供使用本發明的肽產生活化的細胞毒性T細胞的方法。例如，所述方法可以包括以下步驟a:從受試者收集T細胞，和b:將T細胞與以下肽接觸。(I)選自下組的小于約15個氨基酸的分離的肽具有SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、
12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 和 255 的氨基酸
序列的肽。(2)具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中所述肽具有選自SEQ IDN0s:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 和 255 的
氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了 I個、2個或幾個氨基酸。本發明還提供使用本發明的肽產生APC的方法，所述APC具有誘導活化T細胞的能力。例如，所述方法可以包括將抗原呈遞細胞與所述肽接觸以產生在表面呈遞所述肽和HLA抗原的抗原呈遞細胞的步驟。在本發明的上下文中，“活化的細胞毒性T細胞”誘導IFN-Y產生、IFN-Y釋放和腫瘤細胞的死亡。本發明進一歩提供使用本發明的肽誘導的分離的細胞毒性T細胞。所述細胞毒性T細胞是通過用呈遞ー種或多種本發明的肽的抗原呈遞細胞進行刺激而被誘導的，優選源自作為治療和/或預防的靶的受試者，并且可以單獨施用或與其它藥物組合施用，所述其它藥物包括一種或多種本發明的肽或具有抗腫瘤活性的外來體。獲得的細胞毒性T細胞特異性地針對呈遞本發明的肽、或優選呈遞與誘導所用的肽相同的肽的細胞起作用。靶細胞可以是內源表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞，或是用MPH0SPH1和/或DETOCl基因轉染的細胞。由于本發明的肽的刺激而在細胞表面呈遞這些肽的細胞也可成為攻擊的靶。本發明還提供呈遞HLA抗原與一種或多種本發明的肽形成的復合物的抗原呈遞細胞。這些抗原呈遞細胞是通過與本發明的肽或編碼這些肽的核苷酸接觸而獲得的，優選源自作為治療和/或預防的靶的受試者，并且能夠作為疫苗單獨施用或與其它藥物組合施用，所述其它藥物包括本發明的肽、外來體或細胞毒性T細胞。本發明還提供組合物和使用該組合物的方法，所述組合物包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)亞基的多肽的核酸。TCR亞基能夠形成TCR，TCR賦予T細胞對呈遞MPH0SPH1或DEroci的腫瘤細胞的特異性。通過使用本領域已知的方法，可以鑒定用ー種或多種本發明的肽誘導的CTL的TCR亞基a鏈和0鏈的核酸(W02007/032255和Morgan等，JImmunol, 171，3288(2003))。衍生的TCR優選以高親和カ(avidity)結合展示MPH0SPH1或DEPDCl肽的靶細胞，并且任選地在體內和體外介導對呈遞MPH0SPH1或DETOCl肽的靶細胞的有效殺傷。
可以將編碼TCR亞基的核酸納入合適的載體例如逆轉錄病毒載體。這些載體是本領域熟知的。通常可以將所述核酸或包含它們的載體轉移至T細胞中，所述T細胞優選來自患者。有利地，本發明提供現成組合物(off-the-shelf composition),利用該組合物能夠快速地修飾患者自身的T細胞(或另一哺乳動物的T細胞)以迅速且簡單地產生具有卓越的癌細胞殺傷性質的修飾T細胞。同樣，本發明提供通過用核酸轉導來制備的CTL，所述核酸編碼與MPH0SPH1或DEPDCl 肽(例如在 HLA-A24 或 HLA-A2 的背景下，SEQ ID N0s:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254 或 255)結合的 TCR 亞基多肽。經轉導的CTL能夠在體內歸巢于(home to)癌細胞，并且通過已知的體外培養方法擴增(例如,Kawakami等，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。可以使用本發明的T細胞來形成可用于在需要治療或保護的患者中治療或預防癌癥的免疫原性組合物(W02006/031221)。在本發明的上下文中，術語“疫苗”(也稱為免疫原性組合物)指當接種入動物中時誘導抗腫瘤免疫性或抑制癌癥的物質。根據本發明，提出具有SEQ ID N0:7、8或12的氨基酸序列的多肽是HLA-A24限定性表位肽(restricted epitope peptide),并且提出具有SEQ ID N0:9、10、ll、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列的多肽是HLA-A2限定性表位肽，所述限定性表位肽可以誘導針對表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞例如表達MPH0SPH1和/或DEI3DCl的癌細胞的強カ且特異性的免疫應答。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。因此，本發明還包括使用具有 SEQ ID N0:7、8、9、10、ll、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列或其變體(即，包括I個、2個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加)的多肽誘導抗腫瘤免疫的方法。概括而言，抗腫瘤免疫包括以下列為例的免疫應答-針對包含表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞的腫瘤的細胞毒性淋巴細胞的誘導，-識別包含表達MPH0SPH1和/或DEroCl的細胞的腫瘤的抗體的誘導，和
-抗腫瘤細胞因子產生的誘導。因此，當某種肽在接種至動物中時誘導這些免疫應答中的任何ー種，則判定所述肽具有誘導抗腫瘤免疫的效果。肽對抗腫瘤免疫的誘導可以通過在體內或體外觀察宿主中免疫系統對所述肽的應答來檢測。例如，用于檢測細胞毒性T淋巴細胞的誘導的方法是公知的。進入活體的外來物質通過抗原呈遞細胞(APCs)的作用被呈遞給T細胞和B細胞。以抗原特異性方式響應于由APC呈遞的抗原的T細胞由于所述抗原的刺激而分化成細胞毒性T細胞(也稱為細胞毒性T淋巴細胞或CTL)，然后増殖；這種過程在本文稱為T細胞的“活化”。因此，由特定肽造成的CTL誘導，可以通過將所述肽由APC呈遞給T細胞并且檢測對CTL的誘導來加以評估。此外，APC具有活化⑶4+T細胞、⑶8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和NK細胞的效果。由于CD4+T細胞在抗腫瘤免疫中也很重要，可以利用這些細胞的活化作用作為指示(indicator)來評估所述肽的抗腫瘤免疫誘導作用。使用樹突細胞(DC)作為APC來評估CTL誘導作用的方法是本領域熟知的。DC是 在APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC。在這種方法中，最初將受試多肽與DC接觸，然后將這種DC與T細胞接觸。在與DC接觸之后檢測到對感興趣的細胞具有細胞毒性作用的T細胞，表明受試多肽具有誘導細胞毒性T細胞的活性。針對腫瘤的CTL活性可以，例如，使用51Cr-標記的腫瘤細胞的裂解作為指示來檢測。或者，公知使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指示項來評估腫瘤細胞的損害程度。此外，也可以通過測量在攜帯固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下由CTL產生并釋放的IFN-Y來檢測，所述測量通過用抗IFN- y抗體使IFN- y顯現來進行，諸如ELISP0T測定法。除了 DC之外，外周血單個核細胞(PBMCs)也可用作APC。據報道通過在GM-CSF和IL-4存在下培養PBMC使其對CTL的誘導增強。類似地，已經證明CTL可通過在鑰孔血藍蛋白(KLH)和IL-7存在下培養PBMC來誘導。通過這些方法確認具有CTL誘導活性的受試多肽是具有DC活化作用并且繼而具有CTL誘導活性的多肽。因此，誘導針對腫瘤細胞的CTL的多肽可用作針對與MPH0SPH1和/或DEroci過表達相關的疾病(例如癌癥)的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得了誘導針對與MPH0SPH1和/或DEroCl相關的疾病(例如癌癥)的CTL的能力的APC可用作針對所述疾病的疫苗。此外，由于APC呈遞多肽抗原而獲得了細胞毒性的CTL也可用作針對與MPH0SPH1和/或DEroCl相關的疾病(例如癌癥)的疫苗。這些利用APC和CTL所致的抗腫瘤免疫，用于治療與MPH0SPH1和/或DEroCl相關的疾病(例如癌癥)的治療方法，稱作細胞免疫療法。預期的癌癥包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤。通常，在將多肽用于細胞免疫療法時，可以通過組合多種具有不同結構的多肽并且將它們與DC接觸來増加CTL誘導的效率。因此，當用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型片段的混合物是有利的。多肽對抗腫瘤免疫的誘導可以通過觀察抗腫瘤抗體產生的誘導來進ー步確認。例如，當在用多肽免疫的實驗動物中誘導產生了抗所述多肽的抗體，并且腫瘤細胞的生長、增殖和/或轉移受到這些抗體的抑制吋，則確定所述多肽可誘導抗腫瘤免疫性。抗腫瘤免疫性可以通過施用本發明的疫苗來誘導，并且抗腫瘤免疫的誘導可用于治療和預防與MPH0SPH1和/或DEroCl過表達相關的疾病，例如癌癥。與MPH0SPH1和/或DEPDCl過表達相關的疾病(例如癌癥)的發病的治療或預防可以包括抑制表達MPH0SPH1和/或DEroci的細胞(例如癌細胞)的生長，使這些細胞退化(involution)，和抑制這些細胞例如癌細胞的發生。患有與MPH0SPH1和/或DEroCl相關疾病(例如癌癥)的個體的病死率的降低，血液中疾病標志物(marker)的減少，伴隨疾病的可檢測癥狀的減輕等也包括在疾病(例如癌癥)的治療或預防中。這些治療和預防效果優選在統計學上是顯著的，例如，在5%或更低的顯著水平觀察，其中將針對MPH0SPH1和/或DEroCl相關疾病(例如癌癥)的疫苗的治療或預防效果與未施用疫苗的對照相比。例如,斯氏t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗或ANOVA可以用于測定統計學顯著性。由于(in that)本發明提供用于治療或預防與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達相關的疾病(例如癌癥)的方法，可以向患有所述疾病或有風險發生(或易患)所述疾病的受試者預防性或治療性地施用所述治療化合物或組合物。這樣的受試者可以使用標準臨床方法來鑒定。在本發明的上下文中，預防施用發生在明顯的疾病臨床癥狀顯現之前，由此預防疾病或病癥或者延遲它的發展。在醫學領域背景下，術語“預防”包括降低疾病病死率或發病率負荷(burden)的任何活性。預防可以發生在初級、次級和三級預防水平。初級預 防避免疾病的發生，而次級和三級水平的預防包括以預防疾病進展和癥狀出現為目的的活動，以及通過恢復功能和減少疾病相關的并發癥來降低已患疾病影響的活動。在本發明的上下文中，術語“有效的(efficacious) ”指治療導致受試者中癌癥大小、普遍性(prevalence)或轉移潛力的降低。當預防性施用治療吋，“有效的”意思是治療延遲或防止非癌(non cancer)的發生或減輕癌癥的臨床癥狀。對癌癥的評估可以使用標準臨床規程進行。另外，治療的有效性可以聯合任何用于診斷或治療癌癥的已知方法來測定。例如，癌癥可以通過組織病理學診斷或通過鑒定癥狀性異常來診斷。上述具有免疫學活性的肽，或編碼這樣的肽的多核苷酸或載體，可以與佐劑組合。佐劑指當與具有免疫學活性的肽一起(或相繼)施用時，使針對所述肽的免疫應答增強的化合物。合適的佐劑的實例包括霍亂毒素、沙門菌毒素(salmonella toxin)、明礬等，但是不限于此。另外，本發明的疫苗可以適當地與藥學可接受載體組合。這些載體的實例是無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養液(culture fluid)等。另外，疫苗可以按照需要含有穩定劑、懸劑、防腐剤、表面活性劑等。所述疫苗可以系統施用或局部施用。疫苗施用可以通過單次施用進行或通過多次施用加強(boost)。當使用APC或CTL作為本發明的疫苗吋，與MPH0SPH1和/或DETOCl過表達相關的疾病例如癌癥可以例如通過回體方法來治療或預防。更具體地，收集接受治療或預防的受試者的PBMC，在體外與本發明的肽接觸。在誘導APC或CTL之后，可以將細胞施用給受試者。APC也可以通過以回體方式將編碼所述肽的載體引入PBMC來誘導。體外誘導的APC或CTL在施用之前可以加以克隆。通過克隆并培養具有高度的靶細胞破壞活性的細胞，可以更有效地實施細胞免疫療法。另外，以這種方式分離的APC和CTL可以用于這樣的細胞免疫療法，該細胞免疫療法不僅可針對細胞所來源的個體，還可以針對其它個體中相似類型的疾病。在以下實施例中將描述本發明的多個方面，這些實施例g在說明本發明并幫助本領域普通技術人員進行和使用本發明。所述實施例不意在以任何方式另外限制本發明的范圍。 盡管在實施或試驗本發明時可以使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但是下文將描述幾種合適的方法和材料。
實施例接下來，通過以下實施例來示例(并非限制)本發明。然而，本文描述的材料和方法等僅為說明本發明的幾個方面，而不意欲以任何形式限制本發明的范圍。同樣，在本發明的實施或檢驗中可以使用與本文所述類似或等同的方法和材料等。實施例I材料和方法細朐系
A24LCL細胞(HLA-A24/24)、人的類B淋巴母細胞細胞系(humanB-Iymphoblastoid cell line)、T2 細胞和 C0S7 購自 ATCC。詵擇源自MPH0S0H1和DEPDCl的狀的候詵物使用結合預測軟件"BIMAS" (bimas. dcrt. nih. gov/cgi_bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC,等,(1994)J Immunol. ;152 (I):163-75. ；KuzushimaK,等，(2001) Blood. ;98(6) :1872-81.)預測了 與 HLA_A*2402 和 HLA_A*0201 分子結合的源自MPH0S0H1或DEroCl的9聚肽或10聚肽。這些肽依照標準固相合成方法由Sigma (Sapporo, Japan)合成，并且通過反相HPLC純化。肽的純度(>90% )和身份分別通過分析型HPLC和質譜測定。將肽以20mg/ml溶解在ニ甲亞砜(DMSO)中并且貯藏在-80°C。體外CTL誘導使用源自單核細胞的樹突細胞(DC)作為抗原呈遞細胞(APC)來誘導針對HLA上呈現的肽的CTL應答。DC是如其它文獻中所述在體外生成的(Nukaya I等，(1999)Int. J. Cancer80, 92-7. , Tsai V 等，(1997) J. Immunol 158:1796-802.)。簡言之，用Ficoll-Paque (Pharmacia)溶液從正常志愿者(HLA_A*2402 和/或 HLA_A*0201)分離外周血單個核細胞(PBMC),通過粘附于塑料組織培養瓶(Becton Dickinson)對所述外周血單個核細胞進行分離，從而將它們富集成單核細胞級分。將富集的單核細胞群體在1000U/mlGM-CSF(Genzyme)和 1000U/ml IL-4(Genzyme)存在下在含 2%熱滅活自體血清(AS)的AIM-V(Invitrogen)中培養。培養7天之后，將生成細胞因子的DC在AM-V中用20mcg/ml合成肽在3mcg/ml ^ 2-微球蛋白存在下于20°C沖擊4小吋。然后將這些肽沖擊過的DC用MMC(30mcg/ml，進行30分鐘)滅活，并且以1:20比例與自體⑶8+T細胞混合，其中所述自體CD8+T 細胞是通過用 Dynabeads M-450CD8 (Dynal)和 DETACHa BEAD (Dynal)的陽性選擇獲得的。這些培養物放入(set up in)48孔平板(Corning)中;姆孔在0. 5ml AIM-V/2% AS中含有I. 5xl04個經肽沖擊的DC、3xl05個CD8+T細胞和10ng/ml IL-7 (Genzyme)。三天之后，對這些培養物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度為20IU/ml。在第7天和第14天，進ー步用經肽沖擊的自體DC再次刺激所述T細胞。毎次均通過與上文所述相同的方法制備DC。在第21天，在第3輪肽沖擊之后，用經肽沖擊的A24LCL細胞或T2細胞來測試CTL。CTL擴增流稈使用類似于RiddellSR,等(Walter EA等，(1995)N Engl J Med 333:1038-44.；Riddel SR,等，(1996) Nature Med. 2:216-23.)所述的方法在培養中擴增CTL。將總共5xl04個CTL在40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下重懸在通過MMC滅活的含兩種人類B淋巴母細胞細胞系的25ml AIM-V/5% AS中。培養開始后的次日，向培養物添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天用含30IU/ml IL-2的新鮮AIM-V/5% AS為培養物補料。CTL克降的律立在96孔圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中稀釋至姆孔具有0. 3、I和3個CTL。將CTL與7xl04個細胞/孔的兩種人類B淋巴母細胞細胞系、30ng/ml抗⑶3抗體和125U/ml IL-2 一起在總共150mcl/孔的含5% AS的AM-V中培養。10天之后向培養基添加50mcl/孔的IL-2，從而使IL-2終濃度達到125U/ml。在第14天測試CTL的CTL活性，并且使用與上述相同的方法擴增CTL克隆。特異件CTL活件為了檢驗特異性CTL活性，進行了 IFN-Y ELISP0T測定和IFN-yELISA。 簡言之，制備了經肽沖擊的A24-LCL或T2細胞(IxlO4/孔)作為刺激細胞。使用48孔中培養的細胞或有限稀釋后的CTL克隆作為應答細胞。按照生產流程(undermanufacture procedure)進行 IFN-Y ELISP0T 測定和 ELISA。
_8] 細胞培養和轉染建立了用Epstein Bar 病毒轉化的 HLA-A24B-LCL (A24LCL)。Jiyoye、EB_3、C0S7、HT1376、RT-4和J82購自美國典型培養物保藏中心(Rockville, MD)。將A24LCL、Jiyoye和EB-3維持在含10%胎牛血清(GEMINI Bio-Products)和I %抗生素溶液(Sigma)的RPMI1640中。將C0S7、HT1376、RT-4和J82維持在適合的培養基和抗生素中。C0S7和HEK的轉染使用FUGENE6 (Roche)進行。HEK-A2細胞，作為表達HLA_A*0201分子的穩定克隆，通過pcDNA6. 2-HLA-A2質粒轉染建立，并且通過有限稀釋方法在5mcg/ml Blastcidin S存在下分離。表位肽在BALB/c小鼠中的免疫原件為了誘導肽特異性CTL，使用每只小鼠IOOml疫苗混合物來提供免疫，所述混合物含有50mcl (IOOmcg)的HLA-A24限定性肽和50mcl IFA。在第0天將所述疫苗皮下注射至右脅進行第一次免疫，并且在第7天注射至左脅進行第二次免疫。在第14天，使用經接種小鼠的脾細胞，不加以任何體外刺激，作為應答細胞，并且以使用或未使用肽沖擊的RLmalel細胞作為刺激細胞，進行IFN-Y ELISP0T測定。癌癥中MPH0SPH1和DEPDCl的表汰增強使用cDNA微陣列從多種癌癥獲得的全局基因表達譜數據(global geneexpression profile data)揭不了 MPH0SPH1 (GenBank 登錄號 NM_016195 ;SEQ ID No. I)和 DEPDCl (GenBank 登錄號 BM683578)(具有兩種變體 DEPDC1V1 (SEQ ID Nos. 3)和DEPDC1V2 (SEQ ID No. 5))的表達升高。與相應的正常組織相比，MPH0SPH1的表達在31例膀胱癌的30例中，36例乳腺癌的8例中，全部18例宮頸癌中，17例膽管細胞癌的5例中，31例CML的25例中，11例結腸直腸癌的6例中，14例胃癌的6例中，全部5例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨肉瘤的6例中，22例前列腺癌的7例中，18例腎癌的10例中和21例軟組織腫瘤的15例中有效升高。與相應的正常組織相比，DEPDCl的表達在25例膀胱癌的23例中，在13例乳腺癌的6例中，全部12例宮頸癌中，全部6例膽管細胞癌中，4例CML的3例中，4例結腸直腸癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，14例骨肉瘤的10例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31例軟組織瘤的22例中有效升高(表 I)。[表 I]在癌組織中觀察到MPH0SPH1或DEroCl與正常對應組織相比的存在上調的情況的比例
權利要求
1.ー種分離的肽，其由選自SEQ ID N0:9、10和11的氨基酸序列組成；或ー種具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中所述肽由選自SEQ ID N0:9、10和11的氨基酸序列組成，在所述氨基酸序列中取代、缺失或添加了 I個或2個氨基酸。
2.權利要求I的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中SEQID N0:9U0或11的氨基酸序列的自N-末端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸。
3.權利要求I的具有細胞毒性T細胞誘導能力的肽，其中SEQID N0:9U0或11的氨基酸序列的C-末端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸。
4.ー種載體，其中的DNA編碼權利要求1-3中任ー項的肽。
5.一種用于治療或預防與SEQ ID NO: I的基因的過表達相關的癌癥的藥物組合物，所述組合物包含至少ー種權利要求I的肽。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細 胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
7.—種外來體，所述外來體在其表面上呈現包含權利要求I的肽以及HLA抗原的復合物。
8.權利要求7的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
9.權利要求8的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。
10.一種誘導具有高的細胞毒性T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的體外方法，包括下述步驟 (a)將抗原呈遞細胞與權利要求I的肽接觸，或 (b)將包含編碼權利要求I的肽的多核苷酸的基因轉移至抗原呈遞細胞。
11.ー種誘導細胞毒性T細胞的體外方法，所述方法是通過將T細胞與權利要求I的肽接觸。
12.—種誘導細胞毒性T細胞的體外方法，包括下述步驟 (i)使抗原呈遞細胞與權利要求I的肽接觸，和 ( )將步驟(i)的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合并將它們共培養。
13.一種分離的細胞毒性T細胞，所述細胞是通過權利要求11或12的方法誘導的，或者所述細胞是被如下所述的核酸轉導的，該核酸編碼在HLA-A2的背景下與權利要求1-3中任一項的肽結合的TCR亞基多肽。
14.ー種抗原呈遞細胞，所述細胞包含HLA抗原與權利要求I的肽形成的復合物。
15.權利要求14的抗原呈遞細胞，所述細胞是通過權利要求10的方法誘導的。
16.一種用于抑制表達SEQ ID NO: I的基因的癌細胞增殖的疫苗，其中所述疫苗包含權利要求I的肽作為活性成分。
17.權利要求16的疫苗，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
18.權利要求16的疫苗,配制成用于向HLA抗原是HLA-A2的受試者施用。
19.至少ー種權利要求I的肽或編碼所述肽的多核苷酸在制備用于治療或預防與SEQID NO: I的基因的過表達相關的癌癥的藥用疫苗組合物中的用途。
20.權利要求19的用途，其中所述癌癥選自下組膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細胞癌、CML、結腸直腸癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
全文摘要
本發明涉及“用于表達MPHOSPH1或DEPDC1多肽的癌癥的肽疫苗”，提供具有如SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255中所示氨基酸序列的肽，以及具有取代、缺失或添加1個、2個或幾個氨基酸的上述氨基酸序列的肽，其中所述肽具有細胞毒性T細胞誘導能力。本發明還提供用于治療或預防與MPHOSPH1和/或DEPDC1過表達相關的疾病例如癌癥的藥物，所述藥物含有這些肽作為活性成分。本發明的肽也可用作疫苗。
文檔編號C12N15/12GK102850434SQ20121030521
公開日2013年1月2日 申請日期2007年10月16日 優先權日2006年10月17日
發明者藤岡知昭, 中村佑輔, 角田卓也, 大澤龍司, 志田綠 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司