本發明屬于煙草制備技術領域，具體一種枯草芽孢桿菌xp菌株在降解煙草制品中蛋白質方面的應用。

背景技術：

枯草芽孢桿菌是芽胞桿菌屬的一種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，可利用蛋白質、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，在遺傳學研究中應用廣泛。此外，枯草芽孢桿菌菌體自身可合成α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在降解復雜大分子化合物方面具有良好的應用前景，因此近年來枯草芽孢桿菌逐漸成為被關注和研究的熱點。

煙葉發酵又稱為煙葉醇化，其實質是在一定溫度和濕度條件下，促使煙葉理化特性發生深刻變化的過程，即將不利于煙葉品質的大分子物質組分（包括蛋白質、淀粉、果膠等）降解轉化成有利于提升煙葉品質的小分子組分（還原糖、氨基酸等），進而達到克服新煙不良品質，改良和提高煙葉內在質量與外觀質量的目的。

煙葉醇化是卷煙工業提高產品質量的一種初加工方法，也是卷煙加工中極為重要的一個環節。煙草醇化或者發酵方法一般分為人工醇化和自然醇化兩種。人工醇化速度快，周期短，但醇化效果差；自然醇化是將煙葉按一定要求堆放在儲備倉庫內，在自然條件下進行的醇化，時間一般為1~3年。自然醇化雖然效果較好，但也存在一些不足，如：1）醇化過程中，煙葉容易滋生蟲害；2）由于溫度、濕度的變化，煙葉容易產生霉變；3）醇化周期較長，易造成庫存煙葉的積壓與大量資金的占用。

蛋白質是煙葉中的重要化學成分，其含量的高低與煙草品質密切相關。蛋白質含量過高對于煙草制品的抽吸品質是不利的，在燃吸時會產生如同燃燒羽毛的臭味，同時還會產生辛辣、苦澀的感覺，嚴重制約煙葉整體品質的提高。在煙葉醇化過程中，煙葉中的蛋白質在蛋白酶的催化下降解為短肽，游離氨基酸等，而氨基酸可與還原糖等發生持續的非酶棕色化反應（即美拉德反應），生成多種致香物質以及致香前體物質，從而改善煙葉香氣和吸味品質。

由于國內烤煙蛋白質含量普遍偏高，加上煙草品質需求的快速提升，因而純粹依賴自然醇化過程中煙葉自身酶類的水解作用遠不能滿足卷煙工業對于高品質煙葉原料的需求。已有研究表明，通過特定微生物制劑或者酶制劑應用，可一定程度改進現有的煙葉醇化技術，加速降解煙葉中的蛋白質等大分子物質，從而加快煙葉醇化進程，縮短煙葉醇化周期，對卷煙企業提高卷煙品質、節約生產成本、提高經濟效益具有廣泛而現實的意義。但是由于現有研究仍然較為有限，技術效果也存在一定差異，因而開發新的能夠降低煙草制品中蛋白質含量的微生物制劑仍然具有十分重要的應用意義。

技術實現要素：

通過特定的枯草芽孢桿菌xp菌株的選擇，本發明目的在于提供枯草芽孢桿菌xp菌株在降解煙草制品中蛋白質方面的新應用，從而獲得較為穩定降低煙草中蛋白質含量的技術效果，進而加快煙葉的醇化進程，縮短醇化周期。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

枯草芽孢桿菌在降解煙草制品中蛋白質方面的應用，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌xp菌株，其分類命名為Bacillus subtilis. xp，該菌株現保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏地址為：湖北省武漢市武昌區珞珈山路16 號（武漢大學），保藏日期為：2011 年12 月9 日，保藏編號為CCTCC No ：M 2011452。

所述枯草芽孢桿菌在降解煙草制品中蛋白質方面的應用，其用于降解煙草制品中蛋白質時，首先制備成菌劑，然后以煙草制品0.5~1.0%的質量比例（優選0.7%）均勻噴灑于煙草制品表面，最后在28~30℃、55~65%濕度條件下，貯藏醇化30~40d；

所述菌劑，具體為采用LB液體培養基制備的OD₆₀₀=1.0~5.0的懸浮培養液；

所述煙草制品，具體可為新鮮采摘的或經烘烤、晾曬、發酵后的不同品種、不同產地的全株煙草或部分組織器官，更進一步而言，具體例如為烤煙葉片。

總體而言，本發明通過特定枯草芽孢桿菌菌株的選擇，在將其擴增制備成菌劑后，應用于煙草制品時，可有效降低煙草制品中蛋白質含量，提高其評吸效果，提升煙草等級，在確保醇化效果同時進而加快煙葉醇化進程。由于本發明可在短時間內，以較低成本和較高效率較好改善煙草的吸食品質，加上其操作流程較為簡便，因而使得本申請在卷煙制備領域表現出較好的應用價值和應用前景。

附圖說明

圖1為本發明菌液制劑噴灑后作用時間對煙葉醇化中蛋白質降解率的影響。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分實驗背景情況簡要介紹如下。

實驗材料：

供試煙葉：2015年河南許昌C3F，由河南中煙工業有限責任公司提供；

下述實施例中所采用的枯草芽孢桿菌xp菌株，其分類命名為Bacillus subtilis. xp，該菌株現保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No ：M 2011452；由于該菌株為申請人自行篩選獲得，且已在其他專利中有所公開，因而屬于可公開獲得的微生物資源，本申請屬于該菌株的新用途專利申請；

實驗試劑：

LB液體培養基，常規配制并滅菌（121℃保溫15 min）即可，具體配方為：每1000 mL 去離子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液調pH=7.0；

主要實驗設備：

UV-2550紫外分光光度計，為Shimadzu公司產品。

實施例

為將枯草芽孢桿菌xp菌株用于降解煙草制品中蛋白質，首先需將該菌株進行適當擴增培養，制備成含有一定數量的活性菌劑才能加以應用，菌劑的具體制備方法如下所述。

（1）菌種活化，利用接種環挑取斜面培養基（配方同LB液體培養基，僅另外添加15g/L瓊脂粉）上菌種，置于LB液體培養基中懸浮培養，30℃培養12h進行菌種活化；

（2）菌種擴增，將步驟（1）中菌種活化后菌液轉接至LB液體培養液中，35℃搖床培養至OD₆₀₀=3.5左右，懸浮均勻后即可作為降解煙草制品用菌劑。

將上述菌劑具體用于降解煙草制品中蛋白質時，按煙草制品0.7%的質量比例均勻噴灑與煙草制品表面，然后在30℃、55~65%濕度條件下貯藏醇化30~40d左右即可。

為確定具體降解蛋白質效果，具體以片狀（3cm×3cm）煙葉（去除煙梗的煙葉）作為煙草制品進行了醇化處理，同時設置空白對照組（CK）（按煙草0.7%的質量比例噴施蒸餾水，與處理組一起進行醇化處理），每組處理煙葉質量均為200 g，噴施后貯藏60 d，定期（每5 d）取樣，對煙葉中蛋白質降解率進行測定并進行感官質量評價。

蛋白質降解率測定

按照《YC/T 249-2008 煙草及煙草制品 蛋白質的測定 連續流動法》中的要求，在處理的不同時間段分別取處理組和空白對照組適量煙葉樣品，對其蛋白質含量進行測定，與樣品貯藏處理前蛋白質含量進行比對，計算不同貯藏處理時間時的蛋白質降解率。

測定結果如圖1所示。

從圖1可以看出，隨著處理時間增加，空白對照組中煙葉樣品的蛋白質含量并無明顯變化；而經菌劑處理后，處理組中煙葉樣品的蛋白質含量發生明顯變化，并且隨著處理時間延長，蛋白質降解率持續增高，當貯藏醇化處理30天時，煙葉中蛋白質降解率可達最高值25%。

在不同貯藏醇化時間段內，取適量煙葉切絲，常規制備卷煙樣品，恒溫恒濕平衡后，由專業評委對煙支的香氣質（A）、香氣量（B）、濃度（C）、柔細度（D）、余味（E）、雜氣（F）、刺激性（G）等指標進行評定，每項指標均按9分制打分，感官評吸總分（T）=（A+B）× 2.3 + C × 1.5 + D + E + F + G。

具體評價結果如下表1所示。

表1 處理后煙葉感官質量變化：

注：T（感官總分）=（A＋B）×2.3＋C×1.5＋D＋E＋F＋G；CK為噴灑等量蒸餾水貯藏0天的對照煙葉（需要說明的是，貯藏60天后的評吸結果與此數據大致相同，故此省略）。

對上表數據分析可以看出，與樣品初始狀態相比，經菌劑處理后，隨著貯藏醇化時間延長，煙草制品的感官質量可以得到持續性的改善。但結合改善效果的提升率、前述蛋白質降解率測定結果及時間效益而言，經菌劑處理后，貯藏醇化30天時是較為適宜。