專利名稱：通過三官能雙特異性抗體破壞表達低至中等水平的腫瘤相關靶抗原的腫瘤細胞的制作方法
通過三官能雙特異性抗體破壞表達低至中等水平的腫瘤相關靶抗原的腫瘤細胞本申請是申請日為2007年2月15日、標題為“通過三官能雙特異性抗體破壞表達低至中等水平的腫瘤相關靶抗原的腫瘤細胞”的中國專利申請N0.200780012777.8的分案申請。本發明涉及三官能雙特異性抗體用于制備預防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應用。在免疫治療過程中通過單特異性單克隆抗體治療腫瘤中的一個迄今尚未解決的問題是對具有低至中等表達水平的腫瘤靶抗原的腫瘤細胞破壞的功效不足性。一個具體的實例是對具有低至中等表達水平的靶抗原Her2/neU的乳腺癌的治療；另一個具體的實例是對具有低表達水平的CD20腫瘤抗原的非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴白血病的治療。轉移性乳腺癌是幾乎總是致死性的疾病。從轉移的第一次表現起的平均存活時間在17到20個月范圍內。許多內分泌、細胞毒性和生物學試劑已經表現出減輕的功效，但是不存在一致的護理標準，并且治療通常引起實質上的副作用。表皮生長因子(EGF)家族成員Her2/neu在大約25-30%的乳腺癌患者的腫瘤標本中過量表達，并且其歸因于更具攻擊性的腫瘤生長和更壞的預后。EGF 受體家族包括 4 個成員:EGFR(ERBBl)，Her2/neu(ERBB2)，ERBB3 和 ERBB4。EGFR和Her2/neu已被作為治療靶點進行集中研究。靶向EGFR和Her2/neu的其余的細胞結構域的抗體以及抑制細胞內受體信號傳導的小分子化合物已經用于臨床應用，并且已經表現出臨床功效。然而，它們 的抗腫瘤作用通常不如臨床前研究預測的那樣強，并且優選與化學治療結合。Herceptin 是廣泛用于乳腺癌治療的公認的單克隆抗體；然而，Herceptin 只
可以成功地用于在他們的腫瘤細胞上具有至少2+/FISH+(其通過所謂的HercepTest 和陽性FISH-分析驗證)或3+的靶抗原Her2/neu表達水平的患者。一些研究已經表明，為了獲得統計學顯著的存活，具有Her2/neU的額外基因擴增(通過陽性FISH檢測反映)的靶抗原Her2/neu的相對高的表達密度是必需的。臨床前體外實驗還表明Herceptin 對腫瘤細胞的有效破壞只在腫瘤細胞表達高水平的靶抗原Her2/neu時是明顯的。這些限制是只有大約25-30 %的患有在他們的腫瘤上表達高水平的Her2/neu(用Dako HercepTest得分2+/FISH+或3+)的轉移性乳腺癌的患者可以有效地使用Herceptin 進行治療的原因。在Perez和同事的研究中，使用免疫組織化學(IHC)評估，35%的乳腺癌患者得分為 Her21+, 14%為 2+,和 13%為 3+(Perez EA 等:Her2testingin patients with breastcancer:poor correlation between weak positivity byimmunohistochemistry andgene amplification by fluorescence in situhybridization(在患有乳腺癌的患者中的Her2檢測:通過免疫組織化學的弱陽性和通過原位雜交熒光的基因擴增之間的弱相關性).Mayo ClinProc (Mayo 臨床進展)2002 ；77:148-154)。Kiewe, P.等:“Phase I trial of the trifunctional anti~Her2 xant1-CD3antibody ertumaxomab in metastatic breast cancer (三官倉泛抗_Her2x抗_CD3抗體ertumaxomab在轉移性乳腺癌中的I期試驗)” ;Journal ofClinical Oncology (臨床腫瘤學雜志)，第23卷，編號16S，2005年6月I日(ASC0摘要2205-06-01)描述了靶向Her2/neU和CD3的完整雙特異性單克隆抗體的應用。這種抗體用于治療轉移性乳腺癌的I期試驗中。為了研究通過這種抗-Herf/neu x抗-⑶3抗體引起的任何副作用，和為了加快招募必要數目的17名患者，檢測了具有HercepTest 得分1+(25% ),2+(12,5% )和3+(62,5% )的患者。在這一初步的結果分析中在15名可評價的患者中有4名觀察到抗腫瘤反應。然而，落入HercepTest 得分1+內的這些患者沒有一名表現出抗腫瘤反應。完全沒有給出關于這些反應者的Her2/neU表達狀態的信息。另外，在這種I期研究的設計時，只有ertumaxomab消除表達高水平(3+得分)的Her2/neu的細胞系(例如，Sk-Br-3)的實驗數據是可用的。如同在所有典型的I期試驗中，Kiewe等的I期試驗設計成研究所述三官能抗體ertumaxomab的安全性和耐受性。在這一試驗中的次級變量是抗腫瘤活性和不同免疫學參數的測量。為了加快對本研究的患者招募，關于在患者腫瘤細胞上的Her2/neu的表達不加以限制。這是可能的，原因在于本研究的主要目的是安全性和耐受性，而Her2/neU在腫瘤細胞上的表達水平完全不重要。 三官能抗體抗_HER2x抗-Q)3ertumaxomnab似乎只在與得分2+和3+ —致的過表達Her2/neu的患者中有效的發現完全不令人吃驚，也如同使用如Herceptin 的抗體進行的其它研究表現出只對以中等(2+/FISH+)到高水平(3+)表達Her2/neu的患者有效。例如，Gatzemeier等，Anals of Oncology (腫瘤學分析)15:19-27, 2004 提供了如曲妥單抗的抗體的確只對在3+或2+/FISH+之內的Her2/neu表達的患者提供臨床益處的證據。類似地，Micromet公司(Micromet, Inc.)于2006年10月2日公布了關于使用adecatumumab的2次II期試驗的數據，所述adecatumumab是一種針對乳腺癌和前列腺癌中的表皮細胞黏附分子EpCAM的抗體。只有在他們的腫瘤組織上表達高水平的EpCAM的患者表現出進展時間的顯著延長，而具有低EpCAM表達的患者沒有表現出顯著的受益。強調的是adecatumumab可以為患有高度過量表達的EpCAM的乳腺癌的患者提供治療選擇。對于具有低EpCAM過量表達的患者完全沒有發現有效性。非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴白血病(CLL)是最普遍的惡性病之一。在美國NHL是第五最常見的惡性病，年發病率為18-20/100，000個體。直到20世紀90年代中期，NHL的發病率每年增加5-10%1,但是從那時起保持恒定。2CLL是西方國家中最常見的白血病，年發病率為3-4/100，000個體。除了在使用抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗(特別與化學治療結合)的B-細胞淋巴瘤治療中的有希望的結果之外，患者最終復發。9’35因此，存在對于進一步的治療選擇的需求。目前，除了在正式批準單克隆抗體如利妥昔單抗和alemtuzumab后獲得的治療中的主要改進的事實之外，無痛性NHL和CLL都是不可治愈的疾病。μ盡管抗體單一治療尚未高度成功，特別在CLL中，單克隆抗體與標準化學治療方案的結合顯著改善了患者的結果。7’8然而，患者最終復發，9并且新的治療策略經歷令人失望的尋找。許多新藥候選諸如完全人源化的抗-⑶20抗體或靶向其它抗原(例如，⑶19，⑶22，⑶23，⑶80或HLA-DR)的抗體目前正處于集中的研究中。lcl’n除了尋找新的靶點，提高抗體治療的另一途徑是開發雙特異性抗體。已經開發和檢測了許多雙特異性形式，例如，在細胞雜交瘤(quadroma)細胞中產生的全長抗體,化學交聯的F(ab)2片段，單鏈抗體，12和雙抗體。13已經檢測了這些抗體中的一些用于治療人淋巴瘤。然而，除了有希望的體外功效之外，這些分子僅表現出有限的臨床益處。14_16針對B-細胞-特異性抗原如⑶19或⑶20的雙特異性抗體在最近10-15年內已經處于廣泛的研究中，但是迄今為止獲得只表現出中等反應的有限的臨床數據14’36’37。此外，復雜的和效率低的制備過程使其難以生產充足量的抗體用于臨床應用。雙特異性抗體(bsAb)是通過重新定向針對腫瘤細胞的效應細胞而進行例如惡性細胞的免疫學治療的工具。然而，bsAbs正常僅重新定向和激活單一種類的效應細胞，SP，T-細胞，NK-細胞，Fe Y RI+，或Fca RI+細胞，因此限制了它們的功效。已經描述了所有這些現有技術抗體只在腫瘤-相關抗原以中等至高水平在所述腫瘤細胞表面上表達時有效地治療腫瘤。增強抗體的免疫學效應子功能反映了一種提高基于抗體的癌癥治療功效的途徑。本作者已經描述了具有提高的效應子功能的三官能雙特異性抗體，例如，在Zeidler，等.(18), Riesenberg 等.(22), Ruf&Lindhofer (20)或 Heiss 等.(21)的公布中描述，所述三官能雙特異性抗體不僅用其兩個結合臂識別腫瘤細胞和T淋巴細胞，而且通過它們的Fe區域結合Fe Y -受體陽性佐細胞。然而，這些抗體到目前為止也沒有已知有效用于治療以低水平表達腫瘤-相關抗原如Her2/neu或⑶20的腫瘤細 胞。上文關于Her2/neu，EpCAM和⑶20解釋的限制也對其它腫瘤-相關的抗原如，例如，G250，⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R和CEA有效。總結而言，到本發明的優先權日期之前可用的所有實驗數據只提供了對具有腫瘤抗原的中等至高過量表達的患者顯著有益的證據。因此，存在對于提高這樣的抗體的抗腫瘤活性的需求，所述抗體還可以殺死，例如，Her2/neu低表達腫瘤細胞(使用Dako HercepTest 得分例如為1+)或以至多500，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的中等水平表達Her2/neu并且使用Dako HercepTest 得分為2+但是FISH陰性，或⑶20低表達腫瘤細胞，或以某種水平并且在涵蓋約1，000-350, 000，特別地5，000-150，000腫瘤相關抗原/腫瘤細胞的范圍內表達上文詳細描述的腫瘤相關抗原中的一種或多種，特別是⑶20和EpCAM的這樣的腫瘤細胞。已經發現上述問題由從具有下述特征的三官能雙特異性抗體選擇的促進不同種類的免疫細胞的協作的抗體而解決:(a)結合T細胞；(b)結合在腫瘤細胞上的至少一種腫瘤-相關抗原，所述抗原選自由Her2/neu,CD20，EpCAM, G250,⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R 和 CEA 組成的組；(c)通過它們的Fe-部分結合Fe Y -受體I型和/或III型陽性細胞；所述抗體用于制備用來預防和治療腫瘤疾病的藥物組合物，其中在所述腫瘤疾病中，所述腫瘤-相關抗原在所述腫瘤細胞上以下述量表達:.對于Her2/neu,以約5，000-約150，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量，或
.在檢測為FISH陰性的腫瘤細胞中，對于Her2/neu，以約至多500，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量，或.對于⑶20，以約1,000-約350，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量，或.對于 EpCAM, G250，蛋白聚糖，GD2, GD3, MHC II，EGF-R 和 CEA,以約 I, 000-約350，000，優選地至多約300，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量。在本發明的一個實施方案中，所有所述的腫瘤抗原都以約5，000到約150，000腫
瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量在腫瘤細胞上表達。本發明還提供關于預防和治療腫瘤疾病而治療人或動物的方法，其通過將包含人或動物的腫瘤細胞的機體或含有所述腫瘤細胞的這些機體的部分的與藥學有效量的三官能雙特異性抗體接觸，所述三官能雙特異性抗體具有下述特征:(a)結合T細胞；(b)結合在腫瘤細胞上的至少一種腫瘤-相關抗原，所述抗原選自由Her2/neu,CD20，EpCAM, G250,⑶3，⑶2，蛋白聚糖，MHC II，EGF-R 和 CEA 組成的組；(c)通過它們的Fe-部分結合Fe Y-受體I型和/或III型陽性細胞；其中所述腫瘤-相關抗原在所述腫瘤細胞上以下述量表達: 對于Her2/neu,以約5，000-約150，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量,或.在檢測為FISH陰性的腫瘤細胞中，對于Her2/neu，以約至多500，000腫瘤-相
關抗原/腫瘤細胞的量，或.對于⑶20，以約1，000-約350，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量，或.對于 EpCAM, G250，蛋白聚糖，GD2, GD3, MHC II，EGF-R 和 CEA,以約 I, 000-約350，000，優選地至多約300，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量。所述將所述三官能雙特異性抗體與患者的腫瘤細胞接觸是通過將所述三官能雙特異性抗體以任何可接受的劑型如下文所述口服或者腸胃外施用到人或動物體內而進行。假定要治療包括免疫系統細胞的腫瘤疾病如白血病或淋巴瘤，所述接觸還可以離體進行。參考見例如US 7，018，632或US 5，985，276，其通過引用完全結合于此。將含有自體腫瘤細胞的物質用本文所述的三官能雙特異性抗體溫育，持續10分鐘到10小時期間的短期溫育，優選地達到5小時，或還如關于短期溫育所述的時間期間的長期溫育，以致所述自體腫 瘤細胞負載它們的抗體。隨后，加入患者的血細胞，優選外周血的單核細胞(PBMC)，然后將這一混合物溫育長時間，諸如I到14天。備選地，將所述自體腫瘤細胞直接與所述三官能雙特異性抗體和與患者的血細胞，優選外周血單核細胞接觸。以這種方式，已經離體實現了針對所述腫瘤的許多免疫細胞的“激活”。后來，將這些細胞重新輸注到患者中。長期的溫育還導致抗體的內在化和降解。如上述，上文引用的美國專利充分描述了這些方法；然而，專家完全沒有提供成功的合理預期，所述成功是指治療包括關于上述腫瘤-相關抗原具有約5，000到約150，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的表達的腫瘤細胞的腫瘤疾病也可以是可行的。所述方法可以以同種異源或自體形式無需另外健康供體PBMCs而實施。顯著地，腫瘤細胞，特別是B細胞的耗盡不依賴于用細胞因子(例如，IL-2，GM-SCF)對效應細胞的任何預先或共激活，這是本領域所述的其它雙特異性或單特異性抗體的典型的缺點。本發明的優選實施方案在從屬權利要求以及在下述描述和附上的實驗數據、附圖和表格中描述。本發明人可以令人吃驚地表明已經在本領域描述過的三官能雙特異性抗體可以有效地用于靶向在腫瘤細胞上的特別選擇的腫瘤-相關靶抗原，所述腫瘤-相關靶抗原以只是低到中等的水平在所述腫瘤細胞上表達。特別優選的是Her2/neu，EpCAM和CD20腫瘤-相關抗原作為靶抗原。所述腫瘤-相關抗原以不同水平在腫瘤細胞上表達，其取決于在所述腫瘤細胞上表達的腫瘤-相關抗原的類型，和在Her2/neU情形中所述腫瘤抗原是否得到擴增。已經發現，在Her2/neu的情形中，如果它們的腫瘤以約5000到約150，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量在腫瘤細胞上表達Her2/neu,那么患者可以成功地用所述三官能雙特異性抗體進行治療。這些患者將依據DAKO HercepTest 得分為I+。將1+的上限歸類為對應于約100，000或110，000也可是正確的。最重要地，得分必須歸類為與“中等表達”相反的“低表達”。還已經發現表達達到500，000分子的Her2/neu腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞并且其依據DAKO HercepTest 歸類為2+的患者可以成功地進行治療，即使他們歸類為FISH陰性。迄今為止，只有那些患者可以被成功地治療，所述患者具有依據DAKO HercepTest 得分為2+的Her2/neu值，表達達到500，000Her2/neu腫瘤抗原/腫瘤細胞卻是FISH陽性的。具有2+的Her2/neu值的FISH陰性患者不能被成功地治療。在患有表達⑶20的腫瘤的患者中，已經吃驚地發現他們可以被成功地治療，即使⑶20的表達是以約1000到約350，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量。另外，具有以約1000到約350，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量表達EpCAM，G250，蛋白聚糖，⑶2，⑶3，MHC II，EGF-R和CEA的患者 可以成功地用本文所述的三官能雙特異性抗體進行治療。在Her2/neu的情形中，所述腫瘤-相關抗原在腫瘤細胞上表達，優選地以至少約10，000,約20，000,約50，000或約80，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量，并且優選地以約110，000，約120，000或約130，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的最大值進行表達。對于具有用DAKO HercepTest 得分為2+的Her2/neu值(中等表達)的患者，腫瘤-相關抗原在所述腫瘤細胞上的優選的表達是以至多500，000或至多450，000，400，000，350，000，或 300，000 的量，并且具有約 100，000，大于約 110，000，大于約 150，000，約200，000,或約250，000的下限而進行。在具有CD20腫瘤抗原表達的腫瘤細胞中，每個腫瘤細胞CD20分子的數目在約1000到約350,000范圍內而不同，優選地至多約310，00或300，000，這取決于B細胞惡性的類型和在體內的位點。每個腫瘤細胞CD20分子的數目可以特別地從約5000，約10，000，約 50，000，到約 100，000，150，000，200，000，250，000，達到 300，000 而不同。這種情形對于在權利要求1中列出的所有其它腫瘤抗原EpCAM，G250，蛋白聚糖，⑶2，⑶3，MHC II，EGF-R和CEA是類似的。應該注意到，在來源于單一確定的腫瘤實體的不同腫瘤細胞上，腫瘤-相關抗原的表達水平可以在下限和上限表達值之間的范圍內。必須理解，所有這些附圖是平均值，其取決于惡性的類型，患者的類型，腫瘤的發展等。很重要地注意到，本發明人所選擇的腫瘤-相關靶抗原僅以低到中等表達水平永久并且穩定地在所述腫瘤細胞上表達。然而，其它類型的可誘導的抗原，如熱激蛋白和MIC分子MIC A和MIC B，其都在熱激啟動子元件的控制之下，在生命過程中在誘導之后以增加的水平進行表達，腫瘤-相關抗原如Her2/neu和CD20的表達速率通常是恒定的和穩定的。由本發明人選擇的腫瘤-相關抗原與特定的腫瘤相關或者對特定的腫瘤特異。EpCAM典型地與腺癌相關，Her2/neu與乳腺癌相關而且與結腸、肺、胃、胰腺和卵巢癌相關，CD20與B細胞淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴白血病相關，G250與腎癌相關，蛋白聚糖、⑶3和⑶2與黑素瘤相關，MHC II與B細胞淋巴瘤相關，并且EGF-R和CEA與上皮腫瘤相關。用于本發明的三官能雙特異性抗體(簡寫為trAb)完全是已知的。例如，參考見US-6, 551，592，其內容通過引用完全結合于此。同樣對于DE-A-19649223和DE-A-19710495也是真實的，其也通過引用與它們相對應的美國專利文獻一起結合于此。用于本發明的抗體可以以任何可接受的劑型如膠囊、片劑、水性混懸液、溶液等而口服施用。所述抗體及其衍生物還可以腸胃外施用。這通過下述施用途徑:皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鼻內、局部、鞘內、肝內、腫瘤內、損傷內、和顱內注射或輸注技術進行。通常，所述抗體將提供為靜脈內注射或輸注。本發明的抗體可以單獨或與藥用載體一起施用，藥用載體包括可接受的佐劑、載體(vehicles)和賦形劑(excipients)。所有這些是本領域的技術人員所熟悉的。有效劑量將取決于許多因素，并且它很好地處于熟練醫師的能力范圍內，以按照不同的參數如體重、治療目的、最高耐受劑量、所用的具體制劑、施用途徑、患者的反應等而調整給與給定的患者的劑量。依據本發明所用的trAbs優選地以每次輸注約5_約1000 μ g,更優選地約10-約300μ g，約10-約100μ g，或約10-約50μ g的量進行施用。最佳的量可以由熟練的技術人員通過實驗方法確定。更優選地，所述三官能抗體以約0.05-約15 μ g/kg,更優選地約
0.5-5 μ g/kg和約0.5-2 μ g/kg體重的量使用。施用的次數可以由醫師依據患者的需要，特別是疾病的嚴重性，患者的反應，所用的劑量和本領域已知的其它各種因素而選擇。優選地，選擇的所述三官能抗體為抗-⑶3X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-CD4X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-CD5X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-CD6X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-⑶8抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-⑶2X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-CD28X抗-腫瘤-相關抗原抗體和/或抗-CD44X抗-腫瘤-相關抗原抗體，其中特別優選使用抗-CD3x抗-腫瘤-相關抗原抗體。特別優選作為所述抗-腫瘤-相關抗原的是Her2/neu, EpCAM或⑶20抗原,特別優選地與所述三官能抗體的抗-⑶3結合臂組合。通過使用本發明的三官能抗體,通過所述trAb的Fe-部分與Fe-受體陽性細胞的結合而激活所述Fe-受體陽性細胞。因此，細胞因子和/或共刺激性抗原的表達得到起始或增加。然后，通過所述共刺激性抗原和/或細胞因子將T細胞生理激活所需要的至少第二次激活信號轉移到所述T細胞中。這種激活通過激活標記的上調、腫瘤細胞的殺死和通過T細胞的增殖而指示。通過trAb激活所述Fe受 體-陽性細胞分別取決于抗體重鏈片段的亞類或亞類的組合。如體外實驗所證明，例如，小鼠_IgG2a/大鼠IgG2b亞類組合的trAbs能夠結合,并且同時激活，Fe受體-陽性細胞，分別導致共刺激性抗原如⑶40、⑶80或⑶86在這些細胞表面上的上調或新形成(表達)，而小鼠IgGl/大鼠IgG2b亞類組合的雙特異性抗體能夠結合 Fe 受體陽性細胞((I)Haagen 等，J.1mmunology (免疫學雜志)，1995,154:1852-1860)，但是明顯地不能將這些細胞激活到相當的程度((2)Gast等,Cancer Immunol.1mmunother.(癌癥免疫學免疫治療)，1995，40:390)。因此，在所述trAbFc-區的小鼠IgG2a/大鼠IgG2b同種型組合是特別優選的。然而，這對于在本描述中引用的所有其它同種型組合也是如此，以致它們可以用于本發明的其它優選的實施方案中。盡管trAb用一個結合臂(例如，抗-CD3)同時結合并且激活T細胞，來自與所述trAb的Fe部分結合的Fe受體-陽性細胞結合的共刺激性信號可以轉移到T細胞，即，僅是通過trAb的一個結合臂的T細胞激活和來自Fe受體-陽性細胞的共刺激性信號同時轉移到T細胞的組合導致有效的T細胞激活。在誘導抗-腫瘤免疫性中的另一個重要方面是已經被所述trAb靶向的佐細胞(單核細胞、巨噬細胞、NK細胞或樹突細胞)對腫瘤成分的可能的吞噬作用、加工和呈遞。通過抗原呈遞的這種經典機制，腫瘤-特異性⑶4-以及⑶8-陽性細胞都可以生成。此外，在T/B細胞協作的情形中，腫瘤特異的CD4細胞在體液免疫反應的誘導中起重要作用。三官能雙特異性抗體能夠用一個結合臂結合T細胞的T細胞受體復合物，并且用第二結合臂結合在所述腫瘤細胞上的所述腫瘤-相關抗原。由此，它們激活T細胞，其通過釋放細胞因子或通過細胞程序性死亡-介導的機制而破壞腫瘤細胞。此外，似乎存在這樣的可能性，即，在通過三官能抗體激活的情形中，通過它們的受體識別腫瘤特異性抗原的T細胞可以被重新激活，由此導致長 期持續的抗腫瘤免疫性。在這方面特別重要的是所述三官能雙特異性抗體的完整的Fe部分調控與佐細胞如單核細胞/巨噬細胞和樹突細胞的結合，并且引起它們自我發展細胞毒性和/或伴隨著將重要的共刺激性信號轉移到T細胞。明顯地，以這種方式，可以誘導針對目前尚是未知的腫瘤特異性肽的T細胞反應。通過以trAbs和與所述trAb的Fe部分結合的佐細胞對這樣的T細胞的同時共刺激將具有可能的無反應性的腫瘤特異性T細胞重新定向于腫瘤細胞，可以消除腫瘤特異性細胞毒性T細胞(CTLs)的無反應性狀態，即，在患者中存在的針對所述腫瘤的預先存在的T細胞耐受性可以通過trAbs的方式消除，并且因此，除了對腫瘤細胞的直接破壞之外，可以誘導長期持續的抗腫瘤免疫性。優選地，依據本發明所用的抗體能夠重新激活存于無反應性狀態的腫瘤特異性T細胞。此外，它們能夠誘導腫瘤-反應性成分-結合抗體，并且因此誘導體液免疫反應。與T細胞的結合優選地通過⑶3，⑶2，⑶4，⑶5，⑶6，⑶8，⑶28，和/或⑶44發生。Fe受體-陽性細胞具有至少一個Fe Y受體I或III。可以依據本發明使用的抗體能夠結合單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、“天然殺傷”細胞(NK細胞)和/或激活的嗜中性粒細胞，其是Fe Y受體I和/或II1-陽性的細胞。可以依據本發明使用的抗體導致作為共刺激性抗原的⑶40，⑶80，⑶86，ICAM-1,和/或LFA-3的表達的起始或增加，或/和Fe受體-陽性細胞對細胞因子的分泌。優選地，所述細胞因子是 IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IFN-Y 和 / 或 TNF-α。優選地，與T細胞的結合通過所述T細胞的T細胞受體復合物而發生。優選地，所述三官能雙特異性抗體是異源完整的大鼠/小鼠雙特異性抗體。通過可以依據本發明使用的trAbs的方式，針對所述腫瘤細胞，T細胞被激活并且重新定向。優選的有效的異源三官能雙特異性抗體選自下述同種型組合中的一種或多種:大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2a大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2b，大鼠-1gG2b/小鼠-1gG3 ；大鼠-1gG2b/人-1gGl,大鼠-1gG2b/人 _IgG2，大鼠_IgG2b/人IgG3 [東方人同種異型G3m(st)=結合蛋白質A],大鼠-1gG2b/人-1gG4 ；

大鼠-1gG2b/大鼠-1gG2c ；小鼠_IgG2a/人-1gG3 [白種人同種異型G3m(b+g)=不與蛋白質A結合，在下文顯示為*]小鼠-1gG2a/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]人 _IgG3* [CH2-CH3]小鼠-1gG2a/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*_ [CH2-CH3]小鼠-1gG2a/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*.[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl/大鼠-[VH-CHl, VL-CL]人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人 _IgG4/ 大鼠-[VH-CH1， VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人_IgG4[CH2的N-端區域]-人-1gG3*[CH2的C-端區域:>aa位置251]-人-1gG3*[CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部-CH2-CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG2_ [鉸合部-CH2-CH3]大鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG3_[鉸合部-CH2-CH3，東方人同種異型]大鼠-1gG2b/ 小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部-CH2-CH3]人-1gGl/人-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]人 _IgG3*_[CH2-CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人_IgG4[CH2 的 N-端區域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG4[CH2 的 N-端區域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人_IgG2[CH2 的 N-端區域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG2[CH2 的 N-端區域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3*_[CH2-CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2_CH3]人-1gG2/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG2_ [鉸合部]-人 _IgG3*_ [CH2-CH3]人-1gG4/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2_CH3]人-1gG4/人-[VH-CHl，VL-CLj-A _IgG4_[鉸合部]-人 _IgG4[CH2 的 N-端區域]-人-1gG3*[CH2 的 C-端區域:>aa 位置 251]-人 _IgG3*[CH3]
小鼠-1gG2b/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人 _IgGl_[鉸合部]-人-1gG3*-[CH2CH3]小鼠-1gG2b/人-[VH-CH1，VL-CL]-人 _IgGl_[鉸合部]-人 _IgG3* [CH2-CH3]小鼠-1gG2b/小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人-1gGl-[鉸合部]-人 _IgG3* -[CH2-CH3]小鼠-[VH-CHl，VL-CL]-人_IgG4/ 大鼠-[VH-CHl, VL-CL]-人 _IgG4_[鉸合部]-人-1gG4-[CH2]_ 人-1gG3 * -[CH3]人-1gGl/大鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]人-1gGl/小鼠-[VH-CH1，VL-CL]_ 人-1gGl-[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]人-1gG 4 / 人- [VH-CHl，V L - C L ]-人-1 g G 4 -[鉸合部]-人-1gG4- [CH2]-人-1gG3*_ [CH3]優選地，依據本發明有用的抗體是單克隆的、嵌合的、重組的、合成的、半合成的或化學修飾的完整抗體，其具有例如Fv、Fab、scFv、或F(ab)2片段。優選地，使用人源的抗體或其衍生物或片段，或者被修飾成適用于人的那些(所謂的“人源化抗體”)(參見例如，Shalaby等，J.Exp.Med.(實驗醫學雜志)175(1992)，217 ；Mocikat 等，Transplantation (移植)57 (1994)，405)。上文提及的不同類型抗體和抗體片段的制備是熟練的技術人員公知的。單克隆抗體，優選地哺乳動物來源，例如，人、大鼠、小鼠、兔或山羊的單克隆抗體的制備可以使用常規方法進行，如例如在K6hl er und Milstein (Nature (自然)256(1975), 495),在 Harlow 和Lane (Antibodies, ALaboratory Manual (1988)(抗體，實驗室手冊(1988)), Cold SpringHarbor (冷泉港))或在 Galfr6 (Meth.Enzymol.(酶學方法)73 (1981)，3)或在 DE 19531346中所述的那些方法。通過依據熟練的技術人員已知的技術的重組DNA技術的方式制備抗體也是可能的(參見，Kurucz 等，J.1mmunol.(免疫學雜志)154 (1995)，4576 ;Ho I linger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國國家科學院學報)90 (1993)，6444)。具有兩種不同的特異性的抗體，即所謂的雙特異性抗體的制備可以一方面利用重組DNA技術進行，另一方面還可以通過所謂的雜交雜交瘤融合技術進行(參見例如，Milstein等，Nature (自然)305 (1983)，537)。這種技術包括將每種產生具有一種需要的特異性的抗體的雜交瘤細胞系融合，和鑒定并且分離產生具有兩種特異性的抗體的重組細胞系。使用權利要求1中定義的三官能雙特異性抗體解決了本發明潛在的問題。在下文中，更詳細地描述表現出兩種特異性的抗體的制備。落入本發明中的三官能雙特異性抗體屬于現有技術，并且描述這樣的制備方法的參考文獻通過引用完全結合于此。三官能雙特異性抗體由兩個抗體半分子組成(每個具有H和L免疫球蛋白鏈)，其每個抗體半分子表現出特異性，并且具有如同行使公知的效應子功能的正常抗體的Fe部分。它們優選地使用細胞雜交瘤技術制備。這種制備方法在DE-A-44 19 399中示例。為了完全公開，這一文獻通過引用完全結合，并且結合其關于雙特異性抗體的定義。應該理解，還有其它的制備方法是有用的，只要它們形成依據本發明所需要的按照上述定義的三官能雙特異性抗體。trAb與Fcy-RI的結合表現出關于最佳抗腫瘤功效的兩種實質性的優點:(I)Fc Y-R1-陽性細胞具有通過ADCC消除腫瘤細胞的能力，并且因此能夠通過所述trAbs協同地有助于細胞毒性T細胞針對所述腫瘤細胞的抗腫瘤效果。(2) Fe Y R1-陽性細胞(諸如單核細胞/巨噬細胞/樹突細胞)能夠提供與T細胞的抗原呈遞相似的重要的共刺激性信號，并且由此防止T細胞無反應性。此外，由于trAb-介導的T細胞與佐細胞和腫瘤細胞的相互作用，甚至具有識別腫瘤-特異性肽(通過在所述腫瘤細胞上的MHC抗原呈遞)的T細胞受體的T細胞可以被刺激成需要的副產物。在這種情形(constellation)中，對于正確激活T細胞所必需的共-刺激將由所述佐細胞(諸如單核細胞)提供。因此，除了直接的T細胞受體-不依賴型trAb-介導的腫瘤破壞，本發明的抗體還應該能夠激活并生成腫瘤-特異的T細胞，其在trAb降解后繼續在患者內巡視(patrol)。這意味著，與基因-治療方法(例如，通過將共-刺激性抗原如B-7結合到腫瘤細胞中)相似，患者的腫瘤耐受性可以被三官能雙特異性抗體消除。下述實驗數據表明本文所述的trAbs可以令人吃驚地高度有效地用于破壞只具有低到中等表達水平的祀抗原，特別優選Her2/neu和CD20祀抗原的腫瘤細胞。發現關于高有效性的原因在于前述的所述三官能抗體的作用模式。所述作用模式顯著不同于單特異性抗體。用于本發明的三官能抗體能夠通過它們的抗-T細胞結合臂和它們的Fe部分靶向并且同時激活不同類型的免疫細胞。這些免疫細胞的典型的實例是T淋巴細胞和具有Fe Y -受體I型(CD64)和III型(CD16)的佐細胞。當所述第一結合臂結合在腫瘤細胞上的靶抗原如Her2/neu或⑶20時，所述第二結合臂結合例如在T淋巴細胞上的⑶3 (圖4)。關于怎樣定量腫瘤抗原表達水平的方法是本領域已知的。例如，免疫細胞化學方法，如例如，ELISA檢測、定量流式細胞術、組織染色方法和細胞離心涂片器(cytospin)分析。關于在腫瘤細胞上的腫瘤-相關靶抗原的表達的定量確定方法的典型的實例是免疫組織化學方法，如由丹麥Glostrup DAKO開發的HercepTest ，H:允許定量確定Her2/neu在腫瘤組織上的表達水平。參考見由DAKO關于DAKO細胞瘤自動染色編號K5207 (CytomationAutostainer Code ηο.Κ5207),第一版,所述的HercepTest ，其由通過引用完全結合于此的公布號 111781-001 和 K5207/EFG/A0S/13.10.04 鑒定。對于 Her2/neu，提供了一種評估系統，其包括4個步驟，0，I+, 2+，3+，是指在腫瘤細胞表面上的表達的靶抗原的近似數目。依據這一系統，將在靶細胞表面上具有低于20，000Her2/neu分子的表達的細胞分類為陰性的；將具有大于約20, 000并且至多約100，000-110,000(至多最大值150, 000)分子的表達的細胞分類為1+(低表達)，具有至多約500，000分子的表達的細胞分類為2+(中等表達)，并且將具有在約2.000，000到10.000，000分子的表達的細胞分類為3+(高表達)。依據本發明，已經發現針對Her2/neU的三官能雙特異性抗體可以用于治療患有依據HercepTest 分類為Her2/neu 1+和2+(如果后者另外檢測為FISH陰性)的腫瘤細胞的患者。所謂的FISH檢測是本領域公知的。“FISH”意指“原位熒光雜交”，并且是可以用來檢測和定位特異的DNA序列在染色體上的存在或不存在的細胞遺傳學技術。該方法本身在本領域內是充分確定和公知的。參考見，例如，Laudadio J, Quigley DI, Tubbs R,Wolff DJ.HER2testing:a rev iew ofdetection methodologies and their clinicalperformance (HER2檢測:檢測方法和它們的臨床表現的綜述)，其通過參考完全結合于此。FISH陰性檢測結果意指Herf/neu基因未得到擴增；Her2/neU基因的數目是在正常的生理范圍內。然而，在15到20%的所有的乳房癌中，Her2/neu基因得到擴增。這種擴增的檢測已經被確定為對于乳腺癌治療是至關重要的。在所述Her2/neU基因得到擴增的情形中，FISH分析將是陽性的，并且例如在用曲妥單抗治療的那些案例中可能是成功的。另一方面，過量表達Her2/neU但是FISH陰性的患者不能使用如曲妥單抗的抗體進行有效的治療。因此，具 有達到500，000的Her2/neu表達但是FISH陰性的患者也可以用本文所述的三官能雙特異性抗體成功地治療不得不被視為是乳腺癌治療中的重要的進步。許多小組還研究⑶20在B細胞惡性病上的表達。Ginaldi等，(J.Clin.Pathol.(臨床病理學雜志)，51:364,1998)通過使用Quantum簡單細胞微珠試劑盒(Quantum Simply Cellularrnicrobeadskit, Sigma (西格瑪)，圣路易斯,密蘇里州，美國)而評估⑶20在不同B細胞惡性病上的表達。他們發現，例如，對于B-CLL，平均值為65，000⑶20分子/白血病細胞，并且對于套細胞(mantel cell)淋巴瘤，為123，000⑶20分子/細胞。在多毛細胞白血病的情形中，該研究確定平均值為312，000CD20分子/細胞。Huh等，(Am J Clin Pathol (美國臨床病理學雜志)116 =437,2001)使用比較方法進一步研究了對于B細胞惡性病CD20在不同位點如外周血和骨髓的不同的表達。此處，在骨髓標本中，每個細胞的⑶20分子的數目在B-CLL中(平均4，067 ;范圍222-46，395)是最低的，在濾泡淋巴瘤中(平均22，240 ;范圍3，689-39，643)、套細胞淋巴瘤中(平均29,770 ;范圍2,785-97,727)較高，并且在多毛細胞白血病中(平均31,563 ;范圍
1,607-72, 540)中最高。相反，在外周血中，⑶20分子數目/細胞通常對于例如B-CLL更高，其中平均數是9，051，在563-31，507范圍內。綜上，在B細胞惡性病的情形中，⑶20分子數目/細胞從約1000到300，000而不同，取決于B細胞惡性病的類型以及在機體內的位點，并且達到約350，000的最大值。在下述實施例中，并且參考所包含的附圖和圖表，更詳細地描述本發明。第一個實施例關于商標為Rexoimm (INN-名為ertumaxomab)的可獲得的三官能抗體和被Rexomui/靶向的腫瘤-相關抗原Her2/neu舉例說明本發明。第二個實施例針對命名為Β 20的三官能雙特異性抗體(也叫作FBTA05)，其通過⑶3結合T細胞，并且識別⑶20為腫瘤抗原。這些實施例提供了令人信服的證據證明本發明可以關于在權利要求1和貫穿本說明書中具體描述的所有其它腫瘤-相關抗原而使用。所有這些腫瘤-相關抗原可以以這樣低的數量存在于腫瘤細胞的表面上，以致它們幾乎不能通過常規所用的基于抗體的免疫治療而進行治療。本發明的附圖和圖表聯系實施例1和2解釋如下。

圖1:A_F，細胞系Lox，HCT-8和SKBR3的Her2/neu表達模式譜，其通過流式細胞術測量具有不同的抗Her2抗體。圖2a:Her2+3SKBR-3細胞的殺傷:使用微小轉移檢測系統進行的繪圖分析；*與表3相對應的數目圖2b:Her2+lHCT-8細胞的殺傷:使用微小轉移檢測系統進行的繪圖分析；*與表3相對應的數目圖2c:陰性Her2LoX細胞的殺傷:使用微小轉移檢測系統進行的繪圖分析；*與表3相對應的數目圖2d:Her2+lHCT-8細胞的殺傷；供體2作為MDS工作流程的實例的繪圖結果；*與表3相對應的數目 圖3:使用細胞因子珠點陣系統(CBA)測量24小時后在產克隆測定上清液中的細胞因子分泌。圖4:假定的三細胞復合物。三官能抗體能夠通過不同的免疫學機制加速對腫瘤細胞的識別和破壞。Bei der Auflistung der Zytokine im Bildsollte man nochIFN- Yaufnehmen注釋:ADCC，抗體依賴性細胞的細胞毒性；DC，樹突細胞；NK，天然殺傷細胞；DC-CK1，樹突細胞細胞因子I ;IL，白介素；LFA，白細胞功能相關抗原；TNF_a，腫瘤壞死因子 a ;CD，分化簇(摘自 Ruf 和 Lindhofer，2001)圖5.Bi20的純化。(A)陽離子交換層析(CIEX)。將母體小鼠抗體(峰I)在HR10/10高效SP-瓊脂糖柱上與三官能抗體(峰2)分開。(B)Bi20三官能抗體純化的等電聚焦(IEF)。母體大鼠抗體(26II6)在蛋白質A親和層析(AC Β 20)后去除，并且母體小鼠抗體(TPAlO)通過CIEX(CIEX Pl Β 20)與三官能抗體分開。純化的Bi20在陽離子交換層析的峰2(CIEX P2 Β 20)中發現。圖6.Β 20特異性結合效應細胞。將190ng Β 20與5x IO5個靶細胞溫育，并且通過FACS分析測量結合。Ramos細胞(A)用作⑶20臂的靶細胞，并且THP-1細胞⑶用于Fe部分。對于競爭測定，將細胞與利妥昔單抗(RU)在指定抗體過量的情況下預先溫育30分鐘。圖7.在效應細胞存在下，Bi20調控有效的B細胞消耗。(A)將lxl06/ml PBMCs和 2x 105/ml 腫瘤細胞(Raji, Mecl)用 50ng/ml 的 Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗，或母體抗體TPAlO和26II6溫育。在第3天通過單核細胞、B細胞和T細胞的錐蟲藍排除計數和FACS分析而確定B細胞的清除。將在沒有抗體的測定(陰性)中的絕對的B細胞數目設定為 100%。(B)Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml Raji 細胞用增加量(0.5_250ng/ml)的Bi20溫育。在第1、2和3天，通過錐蟲藍排除和FACS分析確定絕對的B細胞計數，并且計算B細胞消耗的百分數。圖8.Β 20 調控 T 細胞的激活。(A) Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml Raji 腫瘤細胞用50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗,或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。⑶25在⑶4+和⑶8+細胞上表達的MFI通過FACS分析確定。(B)PBMC和Raji細胞用增加量(0.5-250ng/ml)的Β 20溫育。在第1、2和3天測量CD25在CD4+T細胞上表達的MFI。圖9.Bi20誘導T細胞的增殖。Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml Raji細胞用濃度為50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗,或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。T細胞數目通過錐蟲藍排除計數和使用抗-⑶5/4和抗-⑶5/8抗體的FACS分析確定。圖10.Bi20_ 介導的單核細胞的激活。(A)Ix 106/ml PBMCs 和 2xl05/ml Raji 腫瘤細胞用50ng/ml的Bi20, catumaxomab (Catum),或利妥昔單抗溫育I天。⑶14+單核細胞表達CD25 的 MFI 通過 FACS 分析確定。(B)Ix 106/ml PBMCs 和 Ix 105/ml THP-1 細胞用 50ng/ml的 Bi20, catumaxomab (Catum)，利妥昔單抗(Rit)，TPA10,或 26II6 溫育 I 天。CD33+THP-1細胞的激活通過⑶25或⑶40的表達而確定。圖11.在健康的供體效應細胞的存在下，Β 20誘導CLL B細胞的消耗。(A)Ix 106/ml PBMCs 和 2x 105/ml CLL 腫瘤細胞用 5，50，或 250ng/mlBi20，250ng/mlcatumaxomab (Catum),或250ng/ml利妥昔單抗(Rit)溫育3天。在第3天通過單核細胞、B細胞和T細胞的錐蟲藍排除計數和FACS分析而確定B細胞的清除。將在沒有抗體的測定(陰性)中的絕對B細胞的數量設定為100%。MV =CLL-1到CLL-9的平均值。(B)⑶20在CLL患者樣品(1-14)，細胞系(Raji，Mec-1)，和一名健康供體(PBMC)中的表達的縱覽。MFI =平均熒光密度。表1:所用抗體及它們相對應的檢測抗體的特征* TRION Pharma,慕尼黑，$Roche, #Micromet,慕尼黑表2:所用細胞系及它們的Her2/neu得分*:依據Ross等，分子和細胞蛋白質組學(Molecular andCelIularProteomics)3:379-398,2004表3:產克隆測定樣品Ab =抗體，μ g =微克，ng =納克表4:Bi20調控的細胞因子分泌。Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml腫瘤細胞(Raji，Ramos, MecI, Granta, D0HH-2)用 50ng/ml Bi20, catumaxomab (Catum),利妥昔單抗，或母體抗體TPAlO和26II6溫育3天。收集上清液，并且用CBA測定和FACS分析測量細胞因子的分泌。表5:Bi20在體外以自體形式調控的CLL B細胞的消除。B和T細胞的百分數、⑶20在B細胞上的表達(MFI)、和E:T比例在CLL PBMC制備后和溫育之前立即確定。在第
0、3、6和9天，將CLL細胞用指定量的Bi20或利妥昔單抗溫育。取決于患者樣品，如顯不在第3天和第10天之間確定B細胞的清除。B細胞的清除表示為消耗的％ B細胞。T細胞激活:⑶25在⑶4+和⑶8+T細胞上的表達上調至少5倍(++)。效應器/靶點比例(E:T)定義為單核細胞、NK細胞和T細胞的數目相對于B細胞的數目。(10%的B細胞清除標定為陰性(neg)。實施例1實施例1涉及Her2/neu結合三官能雙特異性抗體關于其用于治療在HercepTest 中具有得分1+的患者的能力的特征。施細胞系和抗體Rexomun (由Trion Pharma,慕尼黑生產)是一種三官能抗體,其用一個結合臂祀向腫瘤-相關抗原Her2/neu,并且用另一個臂結合T細胞上的⑶3分子。此外，Rexomunu以其有效的Fe區域結合FcyRI和FcyRIII陽性細胞(例如，巨噬細胞、NK細胞、樹突細胞)，所述Fe區域由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b同種型組成。單克隆抗體2502A (Trion Pharma, 慕尼黑)對Her2/neu特異，并且是包含在RexomunR中的一種母體抗體。26II6 (Trion Pharma，慕尼黑)對⑶3特異，并且是包含在Rexoimm'u中的另一種母體抗體。520C9(ATCC HB-8696)是識別Her2/neu受體的另一種單克隆抗體。曲妥單抗是從鼠源抗Her2/neu抗體Mab 4D5開發的一種人源化抗Her2單克隆抗體(58)。表I顯示所用的抗體及它們相對應的檢測抗體的特征。SKBR3 (ATCC H TB-30)是通過 IHC 檢測具有強 Her2/neu 過表達(HercepTestΦ得分+3)的乳腺癌細胞系(58.HCT-8 (ATCC CCL-244)是結腸癌細胞系，和Lox是黑素瘤細胞系(表2)。Her2/neu 得分HCT-8 細胞的 Her2/neu 狀態使用 HercepTest 試劑盒(DAKO, Glostrup,丹麥)通
過IHC評估，并且由慕尼黑LMU的病理學研究所按照供應商的手冊進行。FACS 分析FACS分析用5xl05靶細 胞(SKBR3，HCT-8或Lox)進行。將細胞用IOOng單克隆抗體或IOOng三官能抗體Rexomun 在4°c溫育45分鐘。然后，將樣品用不含Mg2+和Ca2+的磷酸緩沖鹽(PBS) (PAN Biotec, Aidenbach)洗漆,并且用相對應的檢測抗體(Dianova^R堡)(表I)在4°C溫育45分鐘。在用PBS的另一次洗滌步驟后，將細胞重懸在含有0.01 μ g/ml溴化乙錠(西格瑪，慕尼黑)的PBS中。抗體結合的量通過在疊加柱狀圖中的平均熒光強度進行分析。只具有抗人檢測抗體的樣品或用26116(抗CD3)及其相對應的檢測抗體(同種型對照)溫育的樣品作為陰性對照。所有的FACS分析都在FACSCalibur (BectonDickinson,海德爾堡)上進行，并且用CellQuest Pro或WinMDI 2.8分析。產克隆測定抗體介導的腫瘤清除用關于未刺激的效應細胞的長期產克隆測定進行研究。因此，將IO6PBMC摻加入5%的靶細胞(SKBR3，HCT-8或Lox)，并且接種在24孔平板(Greiner)中。將抗體以在表3所示的不同濃度和組合加入。單獨的靶細胞的樣品和由靶細胞和效應細胞的混合物組成而沒有添加任何抗體的樣品作為對照。將樣品在37°C /5% CO2中溫育，并且每3天用RPMI 1640，L-谷氨酰胺和10% FCS培養。在溫育8天后，將細胞從24孔平板中收集起來，用PBS w/o Mg2VCa2+洗滌，并且通過錐蟲藍用死細胞排除在Neubauer細胞室中計數。然后將活細胞離心在細胞離心涂片器載玻片(Menzel)上，濃度為每載玻片2，5xIO5個細胞。將細胞離心涂片器樣品干燥過夜，然后進行免疫細胞化學。實驗使用來自3名不同供體的PBMC重復3次。免疫細胞化學將在細胞離心涂片器載玻片上的非特異性結合特征用10%的人血清飽和。將SKBR3和HCT-8細胞用1.5yg/載玻片的抗細胞角蛋白(Cytokeratine) 8，18，19抗體(A45B-B3，小鼠IgGl，Micromet，慕尼黑)染色，Lox細胞用1.5 μ g/載玻片的抗EGFR抗體(小鼠IgG2a,由慕尼黑的Htun博士饋贈)染色。用于細胞角蛋白染色的抗-小鼠IgGlAlexaFluor 477 (FITC)抗體(Molecular probes (分子探針),Eugene)或用于 EGFR 染色的抗-小鼠 IgG2aAlexa Fluor 477 (FITC)抗體(Molecular probes (分子探針)，Eugene)以1.5 μ g/載玻片用作檢測抗體。將細胞離心涂片器載玻片在微小轉移檢測系統(MDS，Applied Imaging(應用成像))中使用計數FITC標記細胞的計算機化成像分析進行分析。結腸癌細胞系HCT-8表現出+lHer2/neu表達為了找到具有+1的Her2/neu表達的細胞系，在不同細胞系上研究Her2/neu的表達水平。因此，使用單克隆Her2/neu抗體2502A，520C9,曲妥單抗和三官能抗體Rexomunu進行FACS分析。單克隆抗CD3抗體26II6作為模擬對照。圖1A-F顯示所用的抗體在SKBR3，HCT-8或Lox細胞上的結合模式。由于對照作為僅具有不同檢測抗體的流式細胞術樣品(圖1A)，同種型對照是具有其相對應的檢測抗體的26II6 (抗CD3)(圖1B)。黑素瘤細胞系Lox----如預計----沒有表現出Her2/neu受體的表達(圖1C-F),
而SKBR3細胞用單克隆抗體520C9(圖1C)，2502A(圖1D)和曲妥單抗(圖1E)針對Her2/neu濃重染色。Rex0immu染色SKBR3細胞至較低的程度，可能是由于其一個結合臂的性質(圖1F)。與SKBR3細胞相比，使用所有所用的Her2抗體，HCT-8細胞具有顯著更弱的Her2/neu受體表達(圖1C-F)，進一步證明這些細胞的評估。HCT-8細胞的Her2/neu表達另外使用DAKO HercepTestli進行分析。該檢測由病理學研究所(慕尼黑TU)進行。在進行的DAKO檢測中，結腸癌細胞系HCT-8表現出+1的Her2/neu表達，這證實了 FACS分析的結果。表2顯示所用的細胞系、它們的Her2/neu得分以及用于確定Her2/neu表達的方法的總結。Rexomun 能夠在體外殺死 Her2/neu+3 和 Her2/neu+l 細胞系Rexomun I! 時召集并且激活不同類型的免疫細胞到腫瘤位點的能力導致這樣的假說，即，Rexomun^還可能能夠清除Her2/neu(l+)低表達的腫瘤細胞。因此，建立了長期的細胞毒性測定(產克隆測定)。將3名健康供體的PBMC與表達 Her2/neu+3 的細胞系 SKBR-3、Her2/neu_ 陰性 Lox 細胞系或表達 Her2/neu+l 的 HCT-8細胞系共溫育8天。如在表3所示加入不同抗體濃度的曲妥單抗(100 μ g/ml-1 μ g/ml)或.Rexomun. (100ng/ml-lng/ml)。在8天后通過收集所述細胞,將它們轉移到細胞離心涂片器載玻片上，并且用抗CK 8，18，19抗體(SKBR-3和HCT-8)或抗EGFR-抗體(Lox)和相對應的Alexa-Fluor FITC抗體進行細胞染色，而評價腫瘤細胞的殺傷。然后將染色的細胞離心涂片器載玻片在微小轉移檢測系統(MDS, AppliedImaging(應用成像)，英國)上使用載玻片掃描程序通過計算機化的圖像分析進行評估。在本研究中，將三官能抗體Rexomun (抗Her2/neu x抗⑶3)與人源化抗Her2/neu單克隆抗體曲妥單抗 在其抑制表達低Her2/neu的腫瘤細胞系HCT-8的腫瘤細胞(HercepTest得分:+1)生長的能力上進行比較。在細胞系SKBR3 (+3Hercep 得分)，HCT-8 (+IHercep 得分)和 Lox (Her2/neu 陰性)上的Her2/neu表達通過FACS分析測量,而HCT-8細胞還通過HercepTest 檢測。使用針對Her2/neu的不同抗體的FACS分析表明在SKBR3細胞上的強Her2表達，在HCT-8細胞上的較弱表達，和在Lox細胞上沒有Her2/neu表達。這些結果對應HCT-8細胞的+1的
HercepTest'81得分。與所述單克隆抗體的二價結合相比，由于Kexomun 的單價結合(圖1，A-F)，所述三官能抗體Rexomun 的平均熒光值比所述單克隆抗體的值略低。為了檢測Rexomun'!和Trastuzumab 抑制表達低的Her2/neu的細胞系HCT-8的生長的能力，進行了產克隆測定。在培養8天后，將細胞從培養皿中收集起來，離心到細胞離心涂片器載玻片上，并且對于腫瘤 細胞進行染色。在MDS中細胞離心涂片器染色后，所有不添加抗體的對照樣品(12，500腫瘤細胞/24孔平板)(圖2a-c，樣品Al，BI，Cl)對于細胞系SKBR3，HCT-8和Lox都表現出腫瘤細胞生長。具有250000PBMC無摻加的腫瘤細胞或加入的抗體的載玻片完全沒有表現出一一如預計一一腫瘤細胞(圖2a-c，樣品A2，B2，C2)。腫瘤生長在同種異型對照中也是明顯可見的，其中PBMC與5 %的SKBR3，HCT-8或Lox細胞混合而不添加任何抗體(圖2a-c，樣品A3，B3, C3)。Her2+3細胞系SKBR-3的腫瘤細胞生長如預計通過加入100 μ g，50 μ g，10 μ g和lyg Trastuzumab 而被抑制(圖2a,樣品A4-A8)。此夕卜，Rexomuii'81還能夠通過只加入100ng，50ng，10ng或Ing而抑制腫瘤生長。如在樣品A9-A12 (圖2a)中所示，腫瘤細胞的生長比使用Tra st UZii in ab 得到更有效地抑制。Her2/neu陰性細胞系Lox的腫瘤細胞生長既沒有通過加入不同量的Trastuzumab丨!也沒有被Rexomun1!抑制，這表明腫瘤細胞清除的特異性是由Her2/neu受體的存在而推動的(圖2c，樣品C4-C12)。顯著地，結腸癌細胞系HCT-8 (Her2/neu得分+1)的生長沒有被不同量的(100 μ g-1 μ g) Trastuzumab "(圖 2b,樣品 B4-B8)所抑制，其與使用 Her2/neu+l 乳房癌細胞系MCF-7的先前的發現相對應(5)。由于MCF-7細胞(ATCC HTB-22)表現出對TNF-α的生長抑制，所以這些細胞不能用于廣克隆測定，因為rexomuti 如二官能抗體removab1<}(抗EpCAM X抗CD3)由于其激活特性促進TNF-α的分泌(59)。然而Rexomun 能夠以低至IOOng, 50ng和IOng/孔的濃度破壞+lHer2/neu細胞系HCT-8 (四Zh樣品B9-B11)。Ing的Rexomunκ沒有成功地抑制HCT-8細胞的腫瘤細胞生長(圖2b，樣品B12)。圖2d顯示使用HCT-8細胞作為靶點的供體2的產克隆測定的原始MDS數據圖。總之，Rexomun 不僅是用于具有+3或+2過量表達/基因擴增的乳房癌患者，而且是用于具有低Her2/neU表達水平的患者的治療選擇。實施例2這里我們描述Bi20的生產和功能特征，特別是其用于治療僅以低水平表達腫瘤抗原⑶20的患者的治療的能力，所述Bi20是一種針對人⑶3和人⑶20的新三官能雙特異性抗體。⑶20是一種35-kDa的非糖基化的磷蛋白，其已被提議作用為鈣通道，在B細胞分化中起作用。24然而，它的準確的功能仍然未知，原因在于CD20-缺陷型小鼠表現出正常的B細胞發育并且還是表型正常的。25出于下述原因選擇CD20作為定向免疫治療的靶點:(i)它專門在正常和惡性B細胞上表達，而不在血液前體細胞或在其它人組織中的細胞上表達，26(ii)它在大部分B細胞淋巴瘤細胞上表達，27和(iii)當抗體結合時它沒有被排出(shed)或分泌。28’29此外，⑶20作為腫瘤治療靶點的適合性已經得到了利妥昔單抗的成功應用，特別與常規化學治療結合的成功應用的臨床驗證。在我們目前的研究中，我們詳細分析了 Bi20的體外特征，表明這種trAb有效殺傷人B細胞腫瘤細胞以及來源自僅表達低水平的CD20的CLL患者的細胞。對于腫瘤細胞的清除，不需要效應細胞的預先激活，其伴隨著典型的Thl細胞因子模式和T細胞與單核細胞的強激活。作為臨床應用重要的先決條件， Bi20可以以有效量容易地純化和生產。因此，這種trAb可以為目前為止難以治愈的NHL和CLL患者提供新的治療選擇。材料和方法
抗體和試劑將產生⑶20-特異性的單克隆IgG2a抗體的小鼠細胞系TPAlO與26II6融合，這導致產生Bi20(FBTA05)的細胞雜交瘤細胞系TPBs05，所述26II6為一種大鼠細胞系，其分泌0)3-特異性的IgG2b抗體。Catumaxomab (Removab )用作三官能對照抗體，由26II6-來
源的⑶3-特異性臂和抗EpCAM特異性組成。利妥昔單抗(Mabtheral嵌合抗-⑶20抗體，獲自羅氏(Roche)(巴塞爾，瑞士)。抗-⑶20抗體及相對應的同種型獲自BeckmanCoulter Immunotech(Krefeld,德國)。用于FACS分析的所有其它抗體購自BD生物科學(BD Biosciences)(海德爾堡,德國)。碘化丙錠獲自西格瑪化學(Sigma Chemicals)(Deisenhofen,德國)。細胞系和PBMC制備CLL 細胞系 Mecl 由 Michael Hallek 博士饋贈(GSF,慕尼黑，德國)。Burkitt’ s淋巴瘤(BL)細胞系Ramos獲自ATCC(美國)。BL細胞系Raji，NHL細胞系D0HH-2和Granta,以及AML細胞系THP-1購自DSMZ (Braunschweig,德國)。細胞生長在補充了10%熱滅活的FCS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和L-谷氨酸(PAN-Biotech)的RPM1-1640培養基(PAN-Biotech，Aidenbach,德國)中。人外周血單核細胞(PBMCs)通過使用PANCOLL(PAN-Biotech)進行密度梯度離心而分離自健康供體的肝素化的血液。在告知同意后獲得來自CLL患者的外周血樣品。CLL的診斷是基于標準的臨床和實驗室標準。在純化后，CLL細胞立即使用或者冰凍保存備用。將CLL細胞在補充了 10% FCS的MDM(PANBiotech)中培育。對于以自體形式的測定，只使用新鮮制備的CLL細胞。Bi20的生成和純化Bi20應用細胞雜交瘤技術產生。3°對于與靶細胞結合的trAb，通過FACS分析檢測細胞雜交瘤細胞的上清液。將產生trAb的細胞亞克隆幾次，以增加抗體生產的穩定性，并且建立主細胞庫。TrAbs通過使用ΑΚΤΑ純化器100 (Amersham Biosciences (安瑪西亞生物科學)，烏普薩拉，瑞典)如所述31用蛋白質A親和和離子交換層析從所述細胞雜交瘤細胞培養物上清液中純化。等電聚焦將抗體樣品點樣到pH 7-llIsoGel-瓊脂糖-1EF(Cambrex生物科學(Cambrex BioScience), Rockland,美國)上，并且在1500V, 50mA,和25W分離75分鐘。抗體同種型通過用考馬斯亮藍(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Inc.),密蘇里州，美國)染色而顯現，并且對凝膠進行掃描用于分析。FACS 分析抗體與靶細胞的結合，效應細胞的激活，相對CD20表達和細胞亞型組成使用裝配有488-nm氬氣激光的FACS calibur (BD生物科學(BD Biosciences)，海德爾堡，德國)通過流式細胞術而進行分析。數據使用Cellquest軟件(BD生物科學)分析。為了分析抗體結合，將5x IO5細胞(Ramos，Jurkat，或THP-1)用指定濃度的Bi20在4°C溫育30分鐘，用補充了 2%熱滅活FCS的PBS洗漆，并且用FITC-標記的小鼠抗-大鼠IgG檢測抗體(Ramos)或FITC-標記的大鼠抗-小鼠抗體(Jurkat，THP-1)在4°C溫育30分鐘。為了表征Bi20的激活特性，將Ix 106/ml PBMCs和2x 105/ml人腫瘤細胞用指定濃度的抗體在RPMI培養基中在37°C溫育1、2和3天。對細胞進行收集、洗滌并且用針對CD25和CD69的FITC-或PE-標記的檢測抗體在4°C溫育30分鐘。細胞亞型組成通過將3x IO6PBMCs用下述抗-⑶抗體混合物(FITC/PE/APC):14/19/5，4/8/5，4/8/25，45/3/5，和 16/56/5 進行染色而確定。B細胞消耗測定Bi20_介導的B細胞消耗使用生物測定進行確定。將獲自健康供體的PBMCs(lx106/ml)補充 2x 105/ml 的指定的腫瘤細胞(Raji, Ramos, Mecl, D0HH-2,或 Granta)或 CLL患者細胞(效應器-與-靶點比例5: I)，并且在指定濃度的不同抗體的存在下在Iml的總體積中進行溫育。在第1、2和3天，對細胞進行收集和洗滌，并且使用PE-綴合的抗-CD19檢測抗體通過FACS分析而分析存活的B細胞的百分數。存活細胞的總數通過錐蟲藍排除計數而確定。為了檢驗在自體CLL樣品中抗體-介導的B細胞消耗，將從CLL患者分離的PBMCs以2x IO6細胞/ml的密度接種，并且在第0、3和6天以指定的濃度加入抗體。在指定的時間點進行FACS測量和錐蟲藍排除計數。細胞因子的測量Bi20_誘導的細胞因子釋放在與用于所述B細胞消耗實驗相同的條件下確定。將來自健康供體的腫瘤B細胞系和PBMCS用50ng/ml的指定抗體溫育。3天后，收集上清液。細胞因子用人Thl/Th2細胞計數珠點陣(CBA，BD生物科學，海德爾堡，德國)測量，其允許同時分析IFN-Y，TNF- a , IL-2, IL- 4, IL-6，和IL-10。數據獲得和分析按照供應商的流程進行。結果Β 20的產生和純化trAb Bi20在細胞雜交瘤細胞中產生，并且通過蛋白質A親和層析捕獲。母體大鼠抗體不與蛋白質A結合，并且因此不存在于洗脫物中。然后，雜質如母體小鼠抗體通過陽離子交換層析(CIEX)去除(圖5A)。小鼠抗體在148mM NaCl處洗脫下來(圖5A，峰I)，而trAbs在320mM NaCl處洗脫。純化的trAbs的等電聚焦表現出具有 8.65-8.15pl范圍的不同的條帶模式。TrAbs只在CIEX分離的峰2發現。沒有檢測到污染的母體抗體。Bi20的結合特異性為了證明Bi20的三官能性質，我們檢驗了其與特異的靶細胞的結合。我們使用⑶20+Burkitt’s淋巴瘤細胞系Ramos來證實⑶20-結合臂的官能性,⑶3+T-細胞系Jurkat用于⑶3-結合臂，并且單核細胞系THP-1用來驗證Fe Y-RI結合(圖6)。為了證實Bi20與CD20的結合，用利妥昔單抗進行競爭性結合測定。Bi20在Ramos細胞上的結合可以通過將所述細胞與21倍過量的利妥昔單抗預先溫育而完全封閉(圖6A)。類似地，Β 20與THP-1細胞的結合可以被利妥昔單抗競爭掉(圖6B)。Β 20與Jurkat細胞上的⑶3的結合與Bi20與Ramos細胞上的⑶20的結合相當(數據未顯示)。由于Bi20的⑶3-結合臂與在充分表征的trAbs catumaxomab和ertumaxomab中相對應的臂相同，所以沒有進行關于⑶3-結合臂的特異性的進一步分析。概言之，這些數據證實Bi20的三價結合模式和結合的特異性。Bi20調控B細胞消除為了研究Bi20對B細胞殺傷的作用，我們開發了基于FACS的生物測定。將不含任何預刺激或共刺激的新鮮制備的PBMCs與腫瘤B細胞以5: I的比例和50ng/ml的指定的抗體混合，并且溫育3天。收集細胞，并且亞群的組成通過FACS分析確定。進行錐蟲藍排除計數以獲得絕對細胞數。使用CD20+Burkitt’ s淋巴瘤細胞系Raii作為靶細胞，用50ng/ml的Bi20觀察有效的B細胞清除(圖7)。作為對照，我們使用不結合B細胞(數據未顯示)的trAbcatumaxomab (抗-EpCAM x 抗-CD3)，和母體抗體 26116 (抗-CD3)和 TPAlO (抗-CD20)。Catumaxomab (Catum)以及母體抗體的組合誘導一些B細胞的清除,可能是由于細胞因子諸如IFN-Y和TNF-α的釋放(表4)，表明Bi20的抗腫瘤活性確實由其三官能形式引起。在這些實驗條件下(低抗體濃度和E: T比例)，利妥昔單抗只調控B細胞數目的較少的減少。使用CLL細胞系Mecl獲得了相當的數據，其具有比Raii細胞低2.5倍的⑶20表達(MFI 179相對428，數據未顯示)。這些結果鼓勵我們更詳細地分析Bi20_調控的B細胞消耗。時間動力學分析表明Raji細胞只在24小時后消耗(圖7B)，此時在低至0.5ng/ml的抗體濃度消除了至少35%的B細胞。在250ng/ml和50ng/ml的Bi20濃度，分別在第2天和第3天觀察到完全的B細胞消除。使用Mecl細胞發現相當的結果(數據未顯示)。此外，我們研究了代表其它淋巴瘤實體的B細胞系是否可以被有效地殺傷。當將D0HH-2 (濾泡淋巴瘤)，Granta (套細胞淋巴瘤)，或Ramos(Burkitt’s淋巴瘤)用作祀細胞時,檢測到有效的B細胞消耗(數據未顯示)OΒ 20不依賴于同時發生的B細胞結合調控T細胞的激活與先前描述的雙特異性抗-淋巴瘤抗體相反，其只在用例如抗-CD28抗體預先刺激后表現出B細胞毒性，32對于Bi20誘導的有效的B細胞裂解，T細胞或單核細胞的預先激活不是必需的。因此，我們詢問在Bi20結合時效應細胞是否可以被激活。將PBMCs和Raii細胞用指定的抗體溫育，并且通過流式細胞術測量在⑶4+和⑶8+T細胞上的激活標記⑶25的上調(圖8A)。Β 20和catumaxomab誘導在⑶4+和⑶8+T細胞上的⑶25的顯著的上調，表明所述trAb與CD3和 CD20的同時結合對于T細胞激活不是必需的。使用母體抗體26II6 (抗-CD3)和TPAlO (抗-CD20)的組合也觀察到CD25的上調。如預測，利妥昔單抗沒有誘導任何T細胞激活(圖8A)。如在圖SB中所示，T細胞激活依賴于溫育時間和抗體濃度，對于最高的Bi20濃度(250ng/ml)在第2天觀察到最大的⑶25表達。其它激活標記如⑶69也被上調，盡管只上調更低的程度和持續更短的時間階段(數據未顯示)。Bi20誘導T細胞增殖除了 T細胞激活外，我們確定由不同抗體誘導的CD4+和CD8+T細胞數目的增加(圖9)。與⑶4+亞型相比較，用Bi20溫育導致⑶8+亞型的T細胞的優先增殖(145%相對85%的T細胞擴增)，將CD4+: 0)8+比例由1.8: I改變到1.3: I。Catumaxomab和母體抗體也誘導T細胞增殖，但是到比Bi20更低的程度。如預測，利妥昔單抗不刺激T細胞增殖。顯著地，除了所述抗體外不需要任何刺激劑來誘導增殖。單核細胞的激活依賴于同時的T細胞結合但不依賴于同時的B細胞結合然后，我們闡釋Fe Y -RI/III+細胞諸如單核細胞/巨噬細胞是否也可以被Bi20激活的問題。將PBMCs和Raji細胞在不同抗體的存在下溫育，并且測量CD14+細胞的激活。如在圖6A中所示，trAbs Β 20和catumaxomab誘導在⑶14+單核細胞/巨噬細胞上的⑶25的上調，表明同時的B細胞結合對于單核細胞的激活不是必需的。相反，利妥昔單抗，其通過它的Fe區域結合B細胞和單核細胞/巨噬細胞而不是T細胞，不誘導CD14+佐細胞的激活。從這些結果我們推論對于佐細胞的激活T細胞的結合(engagement)是必需的。我們在不存在惡性B細胞時使用略微不同的系統證實了這一結果。將PBMCs和THP-1細胞在不同抗體的存在下溫育，并且通過⑶25和⑶40表達監測⑶33+THP-1細胞的激活(圖10B)。所有同時結合THP-1細胞和T細胞的抗體(Β 20, TPBsOl, 26II6)激活THP-1細胞。相反，當使用結合THP-1和B細胞而不結合T細胞的抗體(TPA10，利妥昔單抗)時，沒有觀察到激活。不存在PBMCs時，THP-1細胞不被任何抗體激活(數據未顯示)，表明在我們的實驗設計中，T細胞和單核細胞的同時結合對于單核細胞的激活是絕對的先決條件。Β 20誘導Th-1樣細胞因子模式由于細胞因子釋放是在治療使用單克隆抗體之后發生的一種免疫反應，33我們研究了由Bi20誘導的細胞因子模式。將PBMCs與不同的腫瘤細胞(Raji，Ramos, D0HH-2,Granta,或Mec I)和50ng/ml的抗體溫育。在3天后，收集上清液，并且分析IFN-Y ,TNF- α，IL-2, IL-4, IL-6，和 IL-10 的量(表 4)。Bi20誘導高水平的IL-6，其也在用其它抗體溫育后以顯著的更低水平檢測到。在Β 20或catumaxomab處理后檢測到TNF- α，但是在用利妥昔單抗或母體抗體溫育后沒有檢測到TNF-α。IL-2表達的強增 加可以僅在用Bi20溫育后檢測到，這證實使用trAbs的更早的研究，其表明IL-2僅在所有三種結合配偶體(腫瘤細胞、T細胞和佐細胞)都存在時才釋放。18IL-4，Th2世代的標記，只是被微量地分泌，而IFN-Y，一種Thl-特異性細胞因子被強烈產生。有趣的是，IL-10，其可以作用為抑制性的細胞因子，也被釋放，表明免疫學的逆反應。使用所有細胞系(Raji，Ramos，Mec 1，D0HH-2，Granta ;表4)獲得相似的結果。Β 20調控來源于CLL患者的B細胞的清除然后我們研究了 Bi20_介導的B細胞消耗是否可以通過使用來源于CLL患者的細胞而證實。將來自9名不同供體的細胞與來自健康供體的PBMCs和Bi20 (5，50，或250ng/ml)或對照抗體溫育，如在圖11中所示。增加濃度的Bi20導致CLL B細胞的提高的清除(至多99% )。利妥昔單抗還誘導顯著的B細胞消耗，但是即使在250ng/ml的濃度，幾乎一半的B細胞是存活的。這表明，至少在我們的實驗設計中，對于來自CLL患者的原代腫瘤細胞的清除，trAb Β 20比利妥昔單抗更加有效得多。在這種情形中，與先前使用B細胞系的實驗相比較，由catumaxomab介導的非特異性B細胞消耗基本上是減少的(圖7和11)。顯著地，甚至在檢測表達很低水平的⑶20的CLL B細胞(CLL 2，3，和4 ;圖1lA和B)時，幾乎所有的B細胞都被Bi20清除(分別為99%，93%，和98% )。相反，使用來自相同患者組的細胞，利妥昔單抗表現出更低的功效或沒有功效(分別為76 %，79 %，和I % )。然后，我們闡釋Bi20能否在不添加來自健康供體的效應細胞的自體模式中誘導CLL B細胞的殺傷的關鍵問題。因此，我們將來源于CLL患者的PBMCs用Bi20和對照抗體溫育。由于不利的E: T比例和已知的CLL中的T細胞無反應性，將細胞溫育至少6天(除了患者CLL 10之外)，并且每三天加入抗體。B細胞消耗和T細胞激活的分析在第6天和第10天之間進行，在患者CLL 10的情形中例外(在第3天)。如在表2中所總結，在分析的7份患者樣品中的3份中檢測到有效的B細胞消耗(>85%)0在一份樣品(患者CLL 13)中，觀察到65%的腫瘤B細胞消耗。有趣地，甚至在很低的⑶20表達水平也觀察到B細胞消耗(患者CLL 11，12和13，圖11B)，證實在同種異型形式中獲得的結果(圖1lA和B)。使用相同濃度的利妥昔單抗的對照實驗沒有表現出或者表現出很低的CLL B細胞的減少。有效的B細胞消耗似乎取決于效應器-與-靶點的比例(E: T)。具有最佳反應的患者樣品(CLL 10，11，和12)也具有最高的效應細胞百分數。特別地，具有最有利的E: T比例的樣品(3.5: 1，來源于患者CLL 10)只在3天后表現出有效的B細胞消除。CLL T細胞已知是無反應性的，特別是⑶4亞型。34令人吃驚地，當我們在溫育階段結束時通過⑶25的上調而分析⑶4+和⑶8+T細胞亞型的激活時，我們發現在6份患者樣品中有5份已經發生了⑶4+和⑶8+亞型的有效激活(表2)。當將樣品用利妥昔單抗處理時沒有觀察到激活(數據未顯示)。這些結果表明，至少在體外，Bi20可以克服CLL樣品中的T細胞無反應性，甚至在腫瘤細胞的存在下。盡管在用抗-C D20單克隆抗體利妥昔單抗治療B細胞淋巴瘤(特別與化學治療結合)中取得有希望的結果，患者最終復發。9’35因此，存在對于進一步的治療選擇的需求。一種改進可以是使用雙特異性抗體，其將效應細胞諸如T細胞重新定向至腫瘤細胞。在最近的10-15年內，針對B細胞-特異性抗原諸如⑶19或⑶20的雙特異性抗體一直處在廣泛的研究中，但是迄今為止只有表現出中等反應的有限的臨床數據14’36’37是可用的。此外，復雜和效率低的制備過程使得很難生產充足量的抗體用于臨床應用。這里我們描述了 Bi20的產生和生產，Bi20是一種針對⑶20和⑶3的新的三官能雙特異性抗體。特別地，由于物種-限制的重鏈/輕鏈配對，小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的同種型組合以及本文所述的其它三官能雙特異性抗體的應用能夠產生正確配對的雙特異性抗體的高產量生產。30這些trAbs特征在于同時結合腫瘤細胞、T細胞和Fe Y RI/ΙΙΓ-佐細胞，因此增強腫瘤細胞的清除。17’18表明Bi20在體外B細胞清除中非常有效，不需要任何共同刺激。B細胞消耗測定證明，甚至在低如0.5ng/ml的抗體濃度，在24小時后可以清除幾乎70%的Raji腫瘤B細胞，在3天后具有完全的腫瘤細胞清除。使用代表其它NHL實體的B細胞系(Mecl，Granta，或D0HH-2)，獲得了相似的結果，表明腫瘤細胞的清除不限于這種惡性病的特定的亞組。此外，盡管存在增加的細胞程序性死亡抗性和低⑶20表達水平，其是CLL B細胞的特征嚴’38’39來源于CLL患者的B細胞也被有效地殺死(圖1lA和B，表5)。同樣地，對于有效的CLL B細胞清除，T細胞的預先激活或共同激活不是必需的，這與已經描述的其它雙特異性抗體相反。例如，雙特異性小鼠抗體Bis20(小鼠IgGl⑶20x小鼠IgG2b⑶3)以在我們的實驗中所用的相同E: T比例誘導幾乎60%的B細胞消耗，但是具有10倍更高的抗體濃度，預先激活的T細胞和更短的溫育時間。40在使用抗-CD20x抗-CD3抗體的另一研究中，僅在將PBLs用IL-2預先刺激時，可以獲得腫瘤細胞(Raji)的裂解。甚至在IOOOng/ml的雙抗體濃度和20:1的E: T比例，只有約35%的細胞被裂解。41此外，關于抗-⑶3x抗-⑶19雙抗體，Cochlovius與同事表明，在1-2.5 μ g/ml的抗體濃度，對于有效的B細胞裂解，預先激活的PBLs和通過CD28對T細胞的共同刺激是必需的。在7份患者樣品中的4份中，Bi20誘導有效的腫瘤細胞殺傷，甚至在不添加健康供體PBMCs的自體形式中也是如此。顯著地，與利妥昔單抗相反，Bi20-介導的B細胞消耗甚至在CLL腫瘤細胞的非常低的⑶20表達水平的存在下也是有效的，其對于自體以及同種異型形式也是真實的(表5和圖11)。這一發現與CLL研究的臨床數據一致，其中利妥昔單抗只表現出作為單一治療的有限的功效，這可能是由于CLL腫瘤細胞的低⑶20表達。3’43與一些其它的雙特異性抗體相反，44’45Bi20有效地激活⑶4+和⑶8+T-細胞亞型，甚至在不存在任何共同刺激性分子如抗-CD28抗體或IL-2時。結果，我們檢測到高的INF- Y水平，其已知是由被刺激的T細胞釋放的，并且其是Thl-型應答的指征。46T細胞的激活還伴隨著兩種T細胞亞型的增殖。

不僅使用健康供體的T細胞，而且使用來自B-CLL患者的T細胞，觀察到T細胞的激活(表5)。這些T細胞通常特征在于無反應性，可能是由于低的CD28和T細胞受體表達造成的。47’48在我們的實驗中，甚至在沒有觀察到基本的CLL B細胞消耗的那些樣品中檢測到⑶4+和⑶8+T-細胞亞型的激活。在一些樣品(CLL-2，-4，-14)中的有限的B細胞消耗可能是由于短的溫育時間，其受到B-CLL細胞在體外的有限的存活能力的限制。最近使用單鏈CD19x CD3雙特異性抗體描述了基于不依賴于共激活劑的T細胞激活的可比較的B細胞消耗，進一步證實所述雙特異性抗體形式的功效。49’5°因此，我們的結果表明Bi20可能不僅在體外而且在體內克服CLL T細胞無反應性的潛力。除了 T細胞之外，Β 20還結合并且激活Fe Y -RI+細胞。激活取決于Bi20與T細胞的同時結合，這是因為腫瘤靶細胞和Fe Y-RI+細胞的結合對于激活是不充分的，如使用母體抗體TPAlO所示(圖1OA和B)。trAbs的Fe區域的重要性得到我們最近的觀察的支持，即，在免疫活性小鼠B細胞淋巴瘤模型中，長期持續的抗腫瘤免疫性的誘導取決于所述trAb的功能Fe部分。在這些實驗中，trAb的F (ab)2片段的使用顯著減少了這些小鼠的存活。2°這一結果與最近的公布一致51，其表明，在體外和在小鼠模型中，與單一的雙抗體相比較，抗-⑶19x抗-Fe Y RIII和抗-⑶19x抗-⑶3的雙抗體組合表現出更高的抗腫瘤活性，盡管在這兩種情形中，通過抗-⑶28抗體對T細胞的另外的共同刺激是必需的。這些結果表明，由Bi20介導的T細胞和Fe Y -R+效應細胞的同時結合和激活比與腫瘤細胞和T細胞單獨的結合允許更有效的腫瘤細胞殺傷。綜上所述，我們的結果表明，trAb Bi20是腫瘤B細胞消耗的有效的誘導劑，其不依賴于任何預先激活或共同激活，甚至在腫瘤細胞的CD20表達非常低時有效。T細胞和輔助免疫細胞的同時激活以及它們重新定向于腫瘤細胞不僅在體外而且在體內克服了關于CLL所述的T細胞無反應性。因此，本文所述的三官能雙特異性抗體提供了新的治療選擇，以治療先前難以治愈的患者中的非霍奇金淋巴瘤和CLL，其中CD20的表達如本發明所述那樣低。參考文獻1.Greiner TC,Medeiros Li, Jaffe ES.Non-Hodgkin，s lymphoma(非霍奇金淋巴瘤).Cancer (癌癥).1995 ；75:370-380.
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權利要求
1.官能雙特異性抗體用于制備用來預防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應用，所述三官能雙特異性抗體具有下述性質: (a)通過⑶3結合T細胞； (b)結合在腫瘤細胞上的腫瘤相關抗原EpCAM;和(c)通過它們的Fe-部分結合FeY -受體I型或III型陽性細胞，或它們的組合； 所述腫瘤疾病的特征在于腫瘤相關抗原EpCAM的表達，其中所述腫瘤-相關抗原EpCAM在所述腫瘤細胞上以1，000-350，000腫瘤-相關抗原/腫瘤細胞的量表達， 其中所述三官能抗體為抗CD3X抗-腫瘤-相關抗原抗體， 其中所述抗體導致細胞因子和/或共刺激性抗原的表達的起始或增加，并且 其中所述三官能抗體在其Fe-區域選自下述同種型組合的組的至少一個成員: 大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2a， 大鼠-1gG2b/小鼠-1gG2b， 大鼠-1gG2b/人-1gGl， 大鼠-1gG2b/人-1gG2。
2.照權利要求1的應用，其中所述腫瘤抗原以至少5，000,20,000,50, 000或80，000腫瘤抗原/腫瘤細胞并且最大值為300，000，150，000，110，000或100，000腫瘤抗原/腫瘤細胞的量在所述腫瘤細胞上表達。
3.照權利要求1的應用，其中所述三官能抗體選自異源雙特異性抗體。
4.照權利要求3的應用，其中所述抗體是異源大鼠/小鼠雙特異性抗體。
5.照權利要求1的應用，其中所述三官能抗體以0.05-15 μ g/kg體重的量施用。
6.照權利要求1的應用，其中所述抗體具有同種型組合大鼠_IgG2b/小鼠-1gG2a。
全文摘要
本發明描述了三官能雙特異性抗體用于制備用來預防和治療腫瘤疾病的藥物組合物的應用。已經發現所述三官能雙特異性抗體結合選自下列各項的腫瘤-相關抗原Her2/neu，D20，EpCAM，G250，蛋白聚糖，GD3，GD2，MHC II，EGF-R和CEA，其中所述腫瘤相關抗原在只具有低到中等表達水平的所述腫瘤細胞上表達。
文檔編號C07K16/28GK103083665SQ20131001119
公開日2013年5月8日 申請日期2007年2月15日 優先權日2006年2月15日
發明者霍斯特·林德霍費爾 申請人:傳恩制藥有限責任公司