專(zhuān)利名稱(chēng)：肽選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于選擇耐受原性(tolerogenic)肽的方法、由該方法鑒定的肽，及其在疾病治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及含有多種此類(lèi)耐受原性肽的藥物組合物。發(fā)明背景在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別蛋白抗原的內(nèi)部表位。抗原呈遞細(xì)胞(APC)攝取蛋白抗原，并將其降解成短肽段。肽與細(xì)胞內(nèi)的I類(lèi)或II類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面。當(dāng)該肽與MHC分子一同被呈遞到細(xì)胞表面時(shí)能夠被T細(xì)胞識(shí)別(通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR))，此時(shí)，該肽可作為一種T細(xì)胞表位。
在對(duì)所有自身抗原或外源抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞表位都具有主要作用。通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵炎C明了T細(xì)胞表位在過(guò)敏性疾病(包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病和移植排異)中的重要作用。用合成的肽(根據(jù)T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu))結(jié)合佐劑進(jìn)行注射有可能引發(fā)炎性或變應(yīng)性疾病。
反之，研究表明，將可溶形式的肽表位給藥有可能導(dǎo)致針對(duì)特定肽表位的免疫耐受性。目前已證明，可溶性肽抗原給藥可作為一種抑制疾病的有效方法，用于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE——多發(fā)性硬化癥(MS)的一種模型)(Metzler and Wraith(1993)Int.Immunol.51159-1165；Liu and Wraith(1995)Int.Immunol.71255-1263；Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.281251-1261)；以及關(guān)節(jié)炎、糖尿病和色素層視網(wǎng)膜炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?見(jiàn)上文Anderton andWraith(1998)的綜述)。此外還可作為進(jìn)展性EAE疾病的治療手段(上文Anderton and Wraith(1998))。
耐受原性肽在治療或預(yù)防疾病中的用途已引起了相當(dāng)大的關(guān)注。原因之一是已發(fā)現(xiàn)某些耐受原性表位能夠下調(diào)T細(xì)胞對(duì)相同組織內(nèi)不同抗原的應(yīng)答。這種被稱(chēng)為“旁觀者(bystander)抑制”的現(xiàn)象說(shuō)明，利用特定的耐受原性肽有可能會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原內(nèi)一種以上表位(優(yōu)選的是所有表位)以及特定疾病中一種以上抗原的耐受性(上文Anderton andWraith(1998))。這樣就無(wú)需對(duì)特定疾病中的所有致病性抗原進(jìn)行鑒定。
此外，肽是用于治療的良好選擇，因?yàn)槠涑杀鞠鄬?duì)低廉，并且能夠產(chǎn)生免疫學(xué)性質(zhì)不同的肽類(lèi)似物。這樣就可以對(duì)肽進(jìn)行修飾，以改變其與MHC或TCR的相互作用。
該方法可能存在的問(wèn)題之一是，研究表明，并不是所有可充當(dāng)T細(xì)胞表位的肽都能夠誘導(dǎo)耐受性。免疫后的髓磷脂堿性蛋白(MBP)肽89-101是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，并且從引發(fā)T細(xì)胞活性和誘導(dǎo)EAE方面來(lái)看都是一種非常有效的免疫原。但研究表明，當(dāng)以溶液形式給藥時(shí)，這種肽不能誘導(dǎo)耐受性(上文Anderton and Wraith(1998))。
在T細(xì)胞表位能夠誘導(dǎo)耐受性方面，已針對(duì)觀測(cè)到的分級(jí)結(jié)構(gòu)提出了多種解釋(見(jiàn)上文Anderton and Wraith(1998)的綜述)。具體地說(shuō)，有人認(rèn)為肽對(duì)MHC的親和力與其耐受原性之間存在相關(guān)性(上文Liu andWraith(1995))，但該觀點(diǎn)與一些觀測(cè)結(jié)果不吻合。例如，MBP[89-101]能夠以相對(duì)較高的親和力與I-AS結(jié)合，但不具有耐受原性。因而并不能直接預(yù)測(cè)哪些肽能夠誘導(dǎo)耐受性。
如果有一種合理的解釋來(lái)說(shuō)明只有部分肽表位能夠誘導(dǎo)耐受性，則有助于選擇那些能夠有效地用于治療和預(yù)防過(guò)敏性病癥的耐受原性肽。
發(fā)明概述本發(fā)明人證明，如果一種肽表位具有不經(jīng)抗原加工即可被未成熟APC呈遞的適當(dāng)大小，則這種肽表位能夠誘導(dǎo)免疫耐受性。因此，一些T細(xì)胞表位具有耐受原性而其他T細(xì)胞表位不能誘導(dǎo)耐受性的觀測(cè)結(jié)果可由以下事實(shí)來(lái)加以解釋?zhuān)茨承┍砦恍杞?jīng)過(guò)進(jìn)一步加工，然后才能夠被MHC分子呈遞。這些需要進(jìn)一步加工的表位盡管與佐劑協(xié)同注射時(shí)能夠誘導(dǎo)疾病，但是以可溶形式給藥時(shí)不能誘導(dǎo)耐受性。
不需要進(jìn)一步加工的表位則能夠誘導(dǎo)耐受性，本發(fā)明人將其命名為“apitopes”(抗原加工非依賴(lài)性表位)。
該發(fā)現(xiàn)為選擇耐受原性T細(xì)胞表位提供了一種基于規(guī)則的方法，該方法無(wú)需對(duì)肽的耐受原性能力進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)。這一點(diǎn)在用于治療或預(yù)防無(wú)可用動(dòng)物模型的疾病的策略開(kāi)發(fā)方面具有特別的優(yōu)勢(shì)。甚至對(duì)具有動(dòng)物模型的疾病而言，該選擇方法也會(huì)使耐受原性成分的開(kāi)發(fā)更加簡(jiǎn)單和安全，因?yàn)樗峁┝艘环N機(jī)制，用于在體內(nèi)使用之前用人類(lèi)T細(xì)胞(可識(shí)別與人類(lèi)MHC分子結(jié)合的抗原)對(duì)肽的耐受性誘導(dǎo)能力進(jìn)行體外測(cè)試。
第一方面，本發(fā)明提供一種用于選擇耐受原性肽的方法，該方法包括選擇一種無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽的步驟。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與II類(lèi)MHC分子結(jié)合。
本領(lǐng)域有多種已知方法可用于篩選能夠充當(dāng)給定抗原的T細(xì)胞表位的肽。因此，本發(fā)明的方法通常用于從多種含有T細(xì)胞表位的肽中選擇一種耐受原性肽。
為了檢測(cè)一種肽是否無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合，可以用抗原加工非依賴(lài)性呈遞系統(tǒng)(APIPS)對(duì)該肽與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合的能力進(jìn)行研究。因此，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟(i) 用一種肽對(duì)APIPS進(jìn)行處理；并且(ii) 分析APIPS中該肽與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子的結(jié)合。
第二方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明第一方面的方法所選擇的肽。
該肽可用于疾病的治療和/或預(yù)防。具體地說(shuō)，該肽可用于治療和/或預(yù)防由自反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。本發(fā)明的肽特別適用于治療/預(yù)防過(guò)敏性反應(yīng)，如變態(tài)反應(yīng)、自身免疫和移植排異。
本發(fā)明人已確定了髓磷脂堿性蛋白的多個(gè)表位，該蛋白是多發(fā)性硬化癥中的一種自身抗原。因此，在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可用于治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化癥。
已知一些肽能夠誘導(dǎo)針對(duì)相同抗原上其他表位的耐受性，甚至可誘導(dǎo)針對(duì)不同抗原上其他表位的耐受性(通過(guò)被稱(chēng)為旁觀者抑制的現(xiàn)象)。但本發(fā)明人預(yù)測(cè)，為了充分抑制所有自反應(yīng)性T細(xì)胞，將多種不同的apitopes聯(lián)合給藥于患者應(yīng)該有利于特定疾病的治療/預(yù)防。第三方面，本發(fā)明本發(fā)明提供一種藥物組合物，該組合物含有多種本發(fā)明第二方面所描述的肽，每種肽基于一種T細(xì)胞表位。
第四方面，本發(fā)明提供一種方法，用于治療和/或預(yù)防主體所患的一種疾病，該方法包括將本發(fā)明第二方面所描述的肽給藥于該主體的步驟。
治療和/或預(yù)防主體所患疾病的一般策略可包括以下步驟(i) 確定該疾病的一種抗原；(ii) 確定該抗原的一種apitope；以及(iii) 將該apitope給藥于該主體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示多發(fā)性硬化癥(MS)患者和健康個(gè)體對(duì)結(jié)核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)和MBP的動(dòng)力學(xué)曲線的典型實(shí)例。對(duì)分離自MS患者(A)和正常個(gè)體(B)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)在PPD和全MBP存在情況下的增殖能力進(jìn)行測(cè)試；將反應(yīng)于MBP的增殖動(dòng)力學(xué)曲線與反應(yīng)于第二抗原PPD的增殖動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行比較。
圖2為MS患者中的PBMC對(duì)MBP及其肽產(chǎn)生應(yīng)答的總結(jié)表。對(duì)某些個(gè)體是在三個(gè)獨(dú)立的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的間隔期約為4-7個(gè)月。
圖3為健康個(gè)體中的PBMC對(duì)MBP及MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答的總表。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的間隔期約為4-7個(gè)月。
圖4顯示一名MS患者(MS49)的實(shí)例，該患者在2個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)多種肽產(chǎn)生應(yīng)答，但在4個(gè)月之后測(cè)量的第二時(shí)間點(diǎn)期間的識(shí)別曲線明顯不同。在MBP和一組覆蓋全長(zhǎng)MBP的肽存在的條件下培養(yǎng)PBMC，并通過(guò)3H-胸苷攝取量來(lái)測(cè)量增殖。在第一時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)到的廣泛T細(xì)胞增殖應(yīng)答與7個(gè)月后(第二時(shí)間點(diǎn))測(cè)量的應(yīng)答明顯不同。
圖5顯示一名患者的實(shí)例，該患者的廣泛表位應(yīng)答(第一時(shí)間點(diǎn))可以消退(第二時(shí)間點(diǎn))，而在1 2個(gè)月的時(shí)間后(第三時(shí)間點(diǎn))重新出現(xiàn)。
圖6顯示由動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定法確定的肽區(qū)域精確特異性圖譜，該結(jié)果是利用MS患者和健康個(gè)體產(chǎn)生的TCC獲得。用于篩選測(cè)定的大多數(shù)肽的長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸殘基，但有少數(shù)為10個(gè)氨基酸殘基，有一種肽為17個(gè)氨基酸殘基。每種TCC的特異性至少測(cè)試了2次。
圖7a的表顯示髓磷脂堿性蛋白中能夠被MS患者的T淋巴細(xì)胞識(shí)別的T細(xì)胞表位的特性。
圖7b的表顯示所有T細(xì)胞表位都不是必需被固定APC呈遞，因而不是apitopes。
圖8和圖9顯示活體和固定APC將不同MBP肽呈遞至T細(xì)胞的情況。圖8A-30-44，圖8B-110-124，圖9A-130-144，圖9B-156-170。
圖10的表顯示在3個(gè)獨(dú)立時(shí)間點(diǎn)獲得的MS患者體內(nèi)對(duì)MBP和MBP-肽的刺激指數(shù)(SI)峰值。第二時(shí)間點(diǎn)的樣本是在第一時(shí)間點(diǎn)的4-8個(gè)月后收集，第三時(shí)間點(diǎn)的樣本是在第二時(shí)間點(diǎn)的3-5個(gè)月后收集。每天測(cè)量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm；確定陽(yáng)性應(yīng)答(粗體字)的依據(jù)是SI＞3并且δcpm＞1000。(不可能在所有3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集MS19和MS67的樣本)。
圖11的表顯示健康個(gè)體對(duì)MBP和MBP-肽的刺激指數(shù)(SI)峰值。每天測(cè)量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm；確定陽(yáng)性應(yīng)答(粗體字)的依據(jù)是SI＞3并且dcpm＞1000。
圖12顯示由DR2MBP82-100轉(zhuǎn)基因小鼠分離的T細(xì)胞對(duì)APC呈遞77-100區(qū)嵌套MBP肽的應(yīng)答。
圖13顯示T細(xì)胞克隆MS17A3對(duì)APC呈遞125-148區(qū)嵌套MBP肽的應(yīng)答。
圖14顯示MBP 89-101序列中的T細(xì)胞表位識(shí)別。該序列中有3個(gè)不同但又重疊的T細(xì)胞表位89-92、92-98和95-101。圖中顯示第94和95位殘基之間可能被天冬酰胺酰肽內(nèi)切酶(AEP)的作用剪切的位點(diǎn)。
圖15顯示MBP肽87-96(A)和89-101(B)能夠充當(dāng)apitope，用于T細(xì)胞對(duì)89-94表位產(chǎn)生應(yīng)答。
發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明涉及一種用于選擇耐受原性肽的方法。耐受性文中使用的術(shù)語(yǔ)“耐受原性”是指能夠誘導(dǎo)耐受性。
耐受性是指不對(duì)某種抗原產(chǎn)生應(yīng)答。對(duì)自身抗原的耐受性是免疫系統(tǒng)的一個(gè)基本特征，當(dāng)喪失這種耐受性時(shí)可導(dǎo)致自身免疫疾病。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)必須保持對(duì)大量不同的感染性因子產(chǎn)生應(yīng)答的能力，同時(shí)避免其自有組織中所含自身抗原的自身免疫攻擊。這在很大程度上是由未成熟T淋巴細(xì)胞對(duì)胸腺中凋亡性細(xì)胞死亡的敏感性來(lái)控制(中樞耐受性)。但是在胸腺中并不能檢測(cè)到所有自身抗原，因而只有自反應(yīng)性胸腺細(xì)胞死亡還不夠。因此，還有一些機(jī)制可以使外周組織的自反應(yīng)性成熟T淋巴細(xì)胞獲得耐受性(外周耐受性)。Anderton et al(1999)(ImmunologicalReviews 169123-137)對(duì)中樞耐受性和外周耐受性的機(jī)制進(jìn)行了綜述。
耐受性的產(chǎn)生或鑒定方法是至少誘導(dǎo)部分CD4+T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性。為了激活T細(xì)胞，肽必須與能夠?qū)煞N信號(hào)遞送至T細(xì)胞的“專(zhuān)職”APC相結(jié)合。第一種信號(hào)(信號(hào)1)由APC細(xì)胞表面的MHC-肽復(fù)合物遞送，并通過(guò)TCR被T細(xì)胞接收。第二種信號(hào)(信號(hào)2)由APC表面的CD8 0和CD86等輔助刺激分子遞送，并被T細(xì)胞表面的CD28接收。當(dāng)T細(xì)胞在缺乏信號(hào)2的條件下接收信號(hào)1時(shí)不會(huì)被激活，實(shí)際上是成為無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞。無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)隨后的抗原誘發(fā)具有不應(yīng)性，并且能抑制其他的免疫應(yīng)答。無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞被認(rèn)為與介導(dǎo)T細(xì)胞耐受性有關(guān)。
盡管不希望受理論的約束，但本發(fā)明人預(yù)測(cè)，在與MHC分子一同被遞送之前需要加工的肽不能誘導(dǎo)耐受性，因?yàn)檫@些肽必須經(jīng)過(guò)成熟抗原呈遞細(xì)胞的處理。成熟抗原呈遞細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞)能夠?qū)乖M(jìn)行加工，而且能將信號(hào)1和信號(hào)2遞送至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞激活。反之，apitopes能夠與未成熟APC上的II類(lèi)MHC結(jié)合。因而無(wú)需共同刺激即能夠被呈遞至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性和耐受性。
當(dāng)然，apitopes也能夠與成熟APC細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合。但免疫系統(tǒng)中包含未成熟APC的充裕程度要高于成熟APC(研究表明，被激活的樹(shù)突細(xì)胞還不到10％，Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159285-295)。因此，apitope的默認(rèn)狀況是無(wú)反應(yīng)性/耐受性，而不是激活。
研究表明，當(dāng)通過(guò)肽吸入來(lái)誘導(dǎo)耐受性時(shí)，抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖能力下降。此外，這些細(xì)胞的IL-2、IFN-γ和IL-4產(chǎn)量被下調(diào)，但I(xiàn)L-10的產(chǎn)量提高。研究表明，在處于肽誘導(dǎo)耐受性狀態(tài)的小鼠中，IL-10的中和使小鼠完全恢復(fù)了對(duì)疾病的易感性。人們認(rèn)為，有一種始終處于耐受狀態(tài)的調(diào)節(jié)細(xì)胞群能夠產(chǎn)生IL-10，并介導(dǎo)免疫調(diào)控(Burkhart et al(1999)Int.Immunol.111625-1634)。
因此，可通過(guò)多種技術(shù)對(duì)耐受性的誘導(dǎo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中包括(a)對(duì)該肽在體內(nèi)充當(dāng)靶表位的疾病而言，降低接觸該疾病的易感性；(b)CD4+T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性的誘導(dǎo)(可通過(guò)隨后的抗原侵襲來(lái)進(jìn)行體外檢測(cè))；(c)CD4+T細(xì)胞群的改變，包括(i)增殖能力降低；
(ii) IL-2、IFN-γ和IL-4產(chǎn)量的下調(diào)；以及(iii) IL-10產(chǎn)量提高。抗原加工非依賴(lài)性表位(APITOPES)本發(fā)明所述方法的步驟包括，選擇一種無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC蛋白結(jié)合的肽。這些肽在文中被稱(chēng)為“apitopes”(抗原加工非依賴(lài)性表位)。
對(duì)來(lái)源于給定抗原的肽的細(xì)胞表面呈遞并不是隨機(jī)的，并且傾向于由少量經(jīng)常出現(xiàn)的表位占優(yōu)勢(shì)。特定肽的優(yōu)勢(shì)取決于多種因素，例如與MHC分子結(jié)合的相對(duì)親和力、在APC內(nèi)產(chǎn)生的時(shí)空點(diǎn)以及抗降解能力。抗原的表位分級(jí)結(jié)構(gòu)可以隨免疫應(yīng)答的進(jìn)行而發(fā)生改變，這為自身耐受性和自身免疫疾病提供了重要的線索。免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)可能是良好的耐受原。因此，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的apitope是基于一種優(yōu)勢(shì)表位。
但是在對(duì)免疫優(yōu)勢(shì)肽產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答后，可能出現(xiàn)表位“擴(kuò)展”至亞優(yōu)勢(shì)決定簇的現(xiàn)象(Lehmann et al(1992)Nature 358155-157)。亞優(yōu)勢(shì)表位的呈遞可能對(duì)觸發(fā)自身免疫具有重要作用。因此，本發(fā)明的apitope可基于一種亞優(yōu)勢(shì)決定簇。
對(duì)所有給定抗原而言，也可能存在隱蔽表位。隱蔽表位是指那些以肽的形式給藥時(shí)能夠刺激T細(xì)胞應(yīng)答，但是以完整抗原的形式給藥時(shí)不能產(chǎn)生這種應(yīng)答的表位。在APC將抗原加工成肽的過(guò)程中，隱蔽表位可能被破壞。本發(fā)明人已證明，MBP的肽92-98是一種隱蔽表位(實(shí)施例2C)。有趣的是，在該肽區(qū)域內(nèi)推測(cè)含有一個(gè)天冬酰胺酰肽內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)，這可能意味著APC在天然加工過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生含有該區(qū)域的肽。
隱蔽表位可作為一種體外apitope，因?yàn)樗鼰o(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與MHC分子結(jié)合，并在識(shí)別該隱蔽表位的T細(xì)胞中誘導(dǎo)無(wú)反應(yīng)性。但這種表位不可能應(yīng)用于治療，因?yàn)樗荒軌蚰褪芸勺R(shí)別該抗原的天然加工表位的T細(xì)胞。
抗原表位的鑒定方法可以是，測(cè)量T細(xì)胞對(duì)APC呈遞的覆蓋整個(gè)抗原的重疊肽(見(jiàn)下文)的應(yīng)答。這些研究通常是獲得肽“嵌套組”，通過(guò)測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答即可確定特定T細(xì)胞系/克隆的最小表位。
并不能認(rèn)為抗原的最小表位會(huì)具有apitope的作用。很可能最小表位的側(cè)翼氨基酸是與MHC最佳結(jié)合所必需的。設(shè)計(jì)apitope時(shí)應(yīng)考慮到不同T細(xì)胞克隆的最小表位之間存在細(xì)微差別的可能性。
應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，可能無(wú)法確定所有表位的apitope。一個(gè)明顯的證據(jù)是，有些表位是以依賴(lài)于內(nèi)體中的MHC負(fù)載方式與MHC結(jié)合，因而需要加工(Viher et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.922214-2218)。這也是不能認(rèn)為每種最小表位都必然具有apitope作用的另一原因。鑒定含有T細(xì)胞表位的肽本領(lǐng)域有多種已知方法可用于鑒定給定抗原中的T細(xì)胞表位。
鑒定天然加工表位的方法可以是，對(duì)來(lái)源于帶有抗原的APC的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。這些APC已經(jīng)過(guò)處理而促進(jìn)其攝取抗原，或是已通過(guò)轉(zhuǎn)化適當(dāng)基因而迫使其在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生該蛋白。通常是將APC與溶液中的或是適當(dāng)定向于APC細(xì)胞表面的蛋白共保溫。37℃保溫之后，在去污劑中將細(xì)胞裂解，并通過(guò)諸如親和層析法將II類(lèi)蛋白純化。用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)介質(zhì)(如酸性條件)對(duì)純化MHC進(jìn)行處理，從而將肽由MHC洗脫。分離出這種肽合并物，并將其曲線與來(lái)自相同方式處理的對(duì)照APC的肽進(jìn)行比較。對(duì)蛋白表達(dá)/飼養(yǎng)細(xì)胞獨(dú)特的峰進(jìn)行分析(例如用質(zhì)譜法)，并對(duì)這些肽段進(jìn)行鑒定。利用該方法一般可獲得關(guān)于肽段抗原經(jīng)抗原呈遞而產(chǎn)生的肽的范圍信息(通常出現(xiàn)在“嵌套組”中)。
鑒定表位的另一種方法是通過(guò)體外測(cè)定對(duì)重疊并且覆蓋該抗原全長(zhǎng)的合成肽庫(kù)進(jìn)行篩選。例如，可以使用長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸并且有5或10個(gè)氨基酸重疊的一些肽。用含有抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原呈遞系統(tǒng)對(duì)這些肽進(jìn)行測(cè)試。例如，該抗原呈遞系統(tǒng)可以是鼠脾細(xì)胞制品、人類(lèi)扁桃體細(xì)胞制品或PBMC。作為選擇，該抗原呈遞系統(tǒng)還可含有特定的T細(xì)胞系/克隆和/或特定類(lèi)型的抗原呈遞細(xì)胞。
T細(xì)胞激活可通過(guò)T細(xì)胞增殖(例如用3H-胸苷摻入法)或細(xì)胞因子產(chǎn)量來(lái)加以測(cè)定。舉例來(lái)說(shuō)，TH1型CD4+T細(xì)胞的激活可通過(guò)IFNγ產(chǎn)量來(lái)檢測(cè)，其檢測(cè)可采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，如ELISPOT測(cè)定法。
對(duì)重疊肽的研究一般會(huì)指明抗原中的表位定位區(qū)域。然后可測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答，以評(píng)定特定T細(xì)胞的最小表位。舉例來(lái)說(shuō)，如果對(duì)重疊庫(kù)中含有第1-15位殘基的肽產(chǎn)生了應(yīng)答，則可以用兩端截短的肽組(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15、4-15等)來(lái)確定最小表位。
本發(fā)明人認(rèn)為，通過(guò)體外測(cè)定(特別是利用T細(xì)胞系)對(duì)抗原免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)進(jìn)行檢測(cè)的方法會(huì)產(chǎn)生不對(duì)稱(chēng)的肽活性模式。實(shí)施例中描述的用于確定MBP表位的研究是采用動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定法，該方法是測(cè)量由MS患者和健康個(gè)體獲得的PBMC在重疊肽庫(kù)作用下的增殖。該方法的依據(jù)是，盡管由健康個(gè)體和MS患者獲得的T細(xì)胞對(duì)純化蛋白抗原的應(yīng)答方式類(lèi)似，但它們對(duì)基于MBP序列的肽的應(yīng)答方式不同。與正常的健康供體相比，由MS患者獲得的T細(xì)胞對(duì)肽抗原的應(yīng)答具有更高的數(shù)量級(jí)和更快的動(dòng)力學(xué)速度。因而能夠篩選和鑒定使特定患者在特定時(shí)間產(chǎn)生應(yīng)答的表位。在本文描述的研究中，該方法已揭示了利用常規(guī)技術(shù)未能確定的大量含有表位的區(qū)域。此外，該研究還說(shuō)明，T細(xì)胞識(shí)別可表現(xiàn)為一種循環(huán)模式，在某一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)，消退，繼而在后一時(shí)期重新出現(xiàn)。
本發(fā)明人描述的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法可作為一種重要的工具，因?yàn)樵摲椒山沂净颊咴谔囟〞r(shí)間正在應(yīng)答的表位。該信息可用于為特定患者量身定制一種將apitope給藥的治療方法，即確定相關(guān)表位的apitope(如果存在)，并將其給藥。該信息還可用于擬定疾病的一般發(fā)展模式，從而可以對(duì)治療性組合物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其含有與可能在疾病的特定時(shí)期呈遞的表位相對(duì)應(yīng)的apitope。抗原加工非依賴(lài)性呈遞系統(tǒng)(APIPS)一旦確定了表位，下一步是要檢測(cè)其是否也具有apitope的作用。
apitope必須在無(wú)需抗原加工的條件下被呈遞至T細(xì)胞。在確定了含有T細(xì)胞表位的肽之后，可以用一種無(wú)加工系統(tǒng)來(lái)確定apitope。可以用抗原加工非依賴(lài)性呈遞系統(tǒng)(APIPS)對(duì)截短肽和肽類(lèi)似物的激活作用進(jìn)行測(cè)試。
APIPS的實(shí)例包括a)固定的APC(含有或不含抗CD28抗體)；b)含有I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子的脂質(zhì)膜(含有或不含抗CD28抗體)；以及c)結(jié)合于平板的純化的天然或重組MHC(含有或不含抗CD28抗體)。
已知可以用固定的APC來(lái)研究T細(xì)胞應(yīng)答，例如在檢測(cè)多肽的最小表位的研究中，可以測(cè)量對(duì)截短肽的應(yīng)答(Fairchild et al(1996)Int.Immunol.81035-1043)。APC的固定可采用，例如，甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛。
脂質(zhì)膜(可以是平面膜或脂質(zhì)體)的制備可采用人工脂，也可以是APC的質(zhì)膜/微粒體組分。
在使用時(shí)，可以將APIPS添加到組織培養(yǎng)板的孔中。然后添加肽抗原，并添加選定的T細(xì)胞系或克隆，以檢測(cè)該肽與APIPS的MHC部分的結(jié)合。T細(xì)胞系或克隆的激活可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)定，如3H-胸苷摻入法或細(xì)胞因子分泌法。肽本發(fā)明的第二方面涉及一種肽。
從正常意義上來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“肽”是指一連串殘基，通常是L-氨基酸，這些殘基一般是通過(guò)相鄰氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵相繼連接。該術(shù)語(yǔ)還包括修飾的肽和合成的肽類(lèi)似物。
本發(fā)明的肽可以是無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合的任何長(zhǎng)度。
與I類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽的長(zhǎng)度一般為7-13個(gè)氨基酸，更常見(jiàn)的是8-10個(gè)氨基酸。該肽的兩個(gè)末端可通過(guò)肽主鏈原子與所有I類(lèi)MHC分子的肽結(jié)合溝不變位點(diǎn)之間的接觸而使其結(jié)合保持穩(wěn)定。在肽結(jié)合溝的兩端均有與肽氨基端和羧基端結(jié)合的不變位點(diǎn)。通過(guò)肽骨架的扭曲可以適應(yīng)不同的肽長(zhǎng)度，這種扭曲通常出現(xiàn)在能夠滿足所需柔性的脯氨酸殘基或甘氨酸殘基。
與II類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽的長(zhǎng)度一般為8-20個(gè)氨基酸，更常見(jiàn)的是10-17個(gè)氨基酸，并且還可以長(zhǎng)得多。這些肽沿著兩端開(kāi)口的(與I類(lèi)MHC肽結(jié)合溝不同)II類(lèi)MHC肽結(jié)合溝以伸展的構(gòu)象存在。該肽主要是通過(guò)主鏈原子與沿著肽結(jié)合溝排列的保守殘基的接觸而保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 本發(fā)明的肽可通過(guò)化學(xué)方法來(lái)制備(《肽化學(xué)實(shí)踐手冊(cè)》MikosBodansky，Springer-Verlag，Berlin)。舉例來(lái)說(shuō)，肽的合成方法可以是固相技術(shù)(Roberge JY et al(1995)Science 269202-204)，從樹(shù)脂上裂解，并通過(guò)制備性高效液相色譜進(jìn)行純化(如Creighton(1983)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，WH Freeman and Co，New York NY)。還可以用，例如，ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)根據(jù)廠商提供的說(shuō)明來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)合成。
作為選擇，還可采用重組方法或從較長(zhǎng)多肽上剪切的方法來(lái)制備肽。例如，可采用從靶抗原上剪切的方法來(lái)獲得肽。肽的成分可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序(如Edman降解法)來(lái)加以確認(rèn)。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該肽來(lái)源于一種靶抗原。靶抗原是指能夠在疾病過(guò)程中被APC加工并被T細(xì)胞識(shí)別的一種分子(如蛋白或糖蛋白)。當(dāng)然，靶抗原應(yīng)取決于目標(biāo)疾病。優(yōu)選的是該肽來(lái)源于一種通過(guò)APC對(duì)該抗原的天然加工而產(chǎn)生的抗原片段。
出于實(shí)際應(yīng)用的目的，該肽還應(yīng)具有其他多種特性。例如，該肽應(yīng)能夠以允許體內(nèi)應(yīng)用的濃度溶解。優(yōu)選的是該肽能夠以最高達(dá)0.5mg/ml的濃度溶解，更優(yōu)選的是該肽能夠以高達(dá)1mg/ml的濃度溶解，最優(yōu)選的是該肽能夠以高達(dá)5mg/ml的濃度溶解。
就鼻內(nèi)給藥而言，可通過(guò)當(dāng)前方法被吸收的最大體積劑量約為每個(gè)鼻孔200μl。如果該肽能夠以1mg/ml的濃度溶解，則每個(gè)鼻孔使用加倍劑量時(shí)，可將800μg給藥于患者。在任何單一劑量中給藥超過(guò)5mg的情況并不常見(jiàn)。
該肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性也很重要，這種穩(wěn)定性應(yīng)足以將其應(yīng)用于治療。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)條件下，給藥后30分鐘的測(cè)試肽總量降至約50％，給藥后4小時(shí)的量降至約30％，但5天后仍能夠檢測(cè)到這種肽(約5％)。該肽的體內(nèi)半衰期至少應(yīng)為10分鐘，優(yōu)選的是至少30分鐘，更優(yōu)選的是至少4小時(shí)，最優(yōu)選的是至少24小時(shí)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻內(nèi)給藥后，引流淋巴結(jié)中的肽量峰值出現(xiàn)在給藥后約4小時(shí)，但在5天后仍能夠檢測(cè)到該肽(水平約為最大值的5％)。優(yōu)選的是該肽具有足夠的穩(wěn)定性，使其在引流淋巴結(jié)中以治療活性濃度存在的時(shí)間足以發(fā)揮其療效。
此外，該肽應(yīng)在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物利用度。該肽還應(yīng)在體內(nèi)保持一種使其能夠與細(xì)胞表面MHC分子無(wú)障礙結(jié)合的構(gòu)象。目標(biāo)疾病在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明第二方面所描述的肽可用于疾病的治療和/或預(yù)防。
II類(lèi)MHC的apitope可能特別適用于由CD4+T細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)的疾病。例如，由不適當(dāng)?shù)幕蜻^(guò)量的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致或維持的疾病。
這種肽可能特別適用于過(guò)敏性病癥的治療。過(guò)敏性反應(yīng)包括(i) 由針對(duì)無(wú)毒外源物的不適當(dāng)應(yīng)答導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)；(ii) 由針對(duì)自身組織抗原的應(yīng)答導(dǎo)致的自身免疫疾病；以及(iii) 由針對(duì)移植物的應(yīng)答導(dǎo)致的移植排異。
變態(tài)反應(yīng)的實(shí)例包括，但不局限于枯草熱、外源性哮喘、昆蟲(chóng)咬傷及刺傷變態(tài)反應(yīng)、食物及藥物變態(tài)反應(yīng)、變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、過(guò)敏性綜合征、蕁麻疹、血管性水腫、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、結(jié)節(jié)性紅斑、多形紅斑、Stevens-Johnson綜合征、鼻結(jié)膜炎、結(jié)膜炎、皮膚壞死性微靜脈炎、炎性肺病和大皰性皮膚病。
自身免疫疾病的實(shí)例包括，但不局限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無(wú)力(MG)、多發(fā)性硬化癥(MS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、多發(fā)性肌炎和某些類(lèi)型的糖尿病、系統(tǒng)性血管炎、多發(fā)性肌炎-皮肌炎、系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)、Sjogren病、強(qiáng)直性脊柱炎和相關(guān)的脊柱關(guān)節(jié)病、風(fēng)濕熱、過(guò)敏性肺炎、變應(yīng)性支氣管肺部曲霉病、無(wú)機(jī)灰塵致塵肺、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血、免疫性血小板病癥、諸如冷沉纖維蛋白原血癥等寒冷病，以及自身免疫性多內(nèi)分泌腺病。
在臨床醫(yī)學(xué)中，通常可以對(duì)多種組織進(jìn)行移植，其中包括腎、肝、心肺、皮膚、角膜和骨髓。目前，除角膜以外的所有移植以及某些骨髓移植通常都需要長(zhǎng)期的免疫抑制。
在本發(fā)明該方面的一項(xiàng)實(shí)施方案中，可以將肽用于糖尿病的治療和/或預(yù)防。該實(shí)施方案中的這種肽可來(lái)源于靶抗原IA2。
在本發(fā)明該方面的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可以將肽用于多發(fā)性硬化癥(MS)的治療和/或預(yù)防。多發(fā)性硬化癥(MS)是一種慢性炎性疾病，其特征是整個(gè)CNS白質(zhì)中散布有多處脫髓鞘性病變，該疾病可以在不同部位和不同時(shí)間出現(xiàn)(McFarlin and McFarland，1982 New England J.Medicine 3071183-1188和1246-1251)。MS被認(rèn)為是由自反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的。
該實(shí)施方案中的肽可來(lái)源于一種自身抗原，具體地說(shuō)，是髓磷脂堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)。MBP可能比PLP更合適，因?yàn)镻LP具有強(qiáng)疏水性，來(lái)源于該蛋白的肽傾向于凝集在一起。MBP具有免疫原性，并且MBP特異性T淋巴細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)具有致腦炎活性(Segal et al.，1994 J.Neuroimmunol.517-19；Voskuhl et al.，1993 J.Neuroimmunol42187-192；Zamvil et al.，1985 Nature 317355-8)。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的肽來(lái)源于MBP的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)之一，即1-24、30-54、75-99、90-114、105-129、120-144、135-159和150-170。
在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的肽選自本發(fā)明人證明可充當(dāng)apitopes的MBP肽，其中包括以下的肽30-44、80-94、83-99、81-95、82-96、83-97、84-98、110-124、130-144、131-145、132-146和133-147。
I類(lèi)MHC的apitopes可用于，例如，以耐受原性方式對(duì)抗病毒性CD8+應(yīng)答進(jìn)行修飾。藥物組合物本發(fā)明人認(rèn)為，盡管存在“旁觀者抑制”，但為了有效地誘導(dǎo)耐受性，還是必需以多種不同的T細(xì)胞克隆為目標(biāo)。因此，為了預(yù)防或治療疾病，可以將多種肽給藥于個(gè)體。
第三方面，本發(fā)明涉及含有多種apitopes的一種藥物組合物。
該藥物組合物可含有，例如，2-50種apitopes，優(yōu)選的是2-15種apitopes。這些apitopes可來(lái)源于相同或不同的靶抗原。優(yōu)選的是這些apitopes都無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)MHC結(jié)合，或都無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與II類(lèi)MHC結(jié)合。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物中的所有apitopes都無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC結(jié)合。
該藥物組合物可采用試劑盒的形式，其中單獨(dú)提供了用于同時(shí)、單獨(dú)或序貫給藥的一些或所有apitopes。
作為選擇(或除此之外)，如果要以多劑量方式將該藥物組合物(或其任意部分)給藥，可以將每劑單獨(dú)包裝。
該藥物組合物可含有治療有效劑量或預(yù)防有效劑量的一種或所有apitope，并且可選擇性地含有一種藥學(xué)容許的載劑、稀釋劑或賦形劑。
此外，在本發(fā)明的藥物組合物中，可以將一種或每種apitope與任何適當(dāng)?shù)囊环N或多種粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、涂布劑或增溶劑相混合。給藥在不使用佐劑的情況下，本發(fā)明的肽應(yīng)以溶液形式給藥。
優(yōu)選的是通過(guò)粘膜將肽給藥。
研究表明，當(dāng)以溶液形式進(jìn)行腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈內(nèi)(i.v.)或鼻內(nèi)(i.n.)給藥時(shí)，肽可以誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性(上文Anderton and Wraith(1998)；上文Liu and Wraith(1995)；Metzler and Wraith(1999)Immunology 97257-263)。
優(yōu)選的是將肽進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。
用小鼠進(jìn)行的研究表明，誘導(dǎo)耐受性所需的肽給藥持續(xù)時(shí)間取決于接受者的T細(xì)胞前體頻率(上文Burkhart et al(1999))。許多實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)耐受性需要將肽進(jìn)行重復(fù)給藥(上文Burkhart et al(1999))。因此，肽的確切劑量和給藥次數(shù)應(yīng)取決于個(gè)體，但在優(yōu)選實(shí)施方案中是進(jìn)行多次給藥。
如果同時(shí)將多種肽給藥，這些肽可采用適合于單次或多次給藥的“混合物”形式。作為選擇，優(yōu)選的是進(jìn)行多次給藥，但每次給藥的肽相對(duì)濃度不同。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以采用“劑量遞增”法，也就是以遞增的濃度對(duì)患者進(jìn)行多次給藥。該方法已用于，例如，對(duì)蜂毒變態(tài)反應(yīng)的免疫治療應(yīng)用中的磷脂酶A2肽給藥(Müller et al(1998)J.Allergy ClinImmunol.101747-754和Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.10298-106)。
實(shí)施例以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但不應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的限制。本發(fā)明尤其涉及這些實(shí)施例中描述的特別實(shí)施方案。實(shí)施例1——確定MBP中的T細(xì)胞表位材料與方法抗原按Deibler et al.(Deibler et al.，1972制備生物化學(xué)2139)的描述由腦白質(zhì)制備人MBP，并通過(guò)SDS-PAGE確定其純度。增殖測(cè)定是以前人確定的最佳濃度用MBP和結(jié)核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)來(lái)進(jìn)行(UK central Veterinary Laboratory，Surrey)；每種抗原的最佳濃度為50μg/ml。利用標(biāo)準(zhǔn)的F-moc化學(xué)劑在Abimed AMS422多重肽合成儀(Abimed，Langenfeld，German)上合成一組覆蓋全MBP分子的含15個(gè)殘基的重疊肽。每種肽有5個(gè)氨基酸殘基被替換，有10個(gè)氨基酸殘基重疊。我們產(chǎn)生了33種肽，其合并成3組，并以50μg/ml的最佳濃度對(duì)合并物進(jìn)行測(cè)試，以使每種肽的體外濃度為16.6μg/ml。患者和對(duì)照主體該項(xiàng)研究的主體包括12名臨床確診或?qū)嶒?yàn)室確定為MS的患者(Poseret al.，1983)，年齡為29-51歲。12名患者中的8名參與β-干擾素試驗(yàn)，而其他所有MS患者在該研究開(kāi)始前至少3個(gè)月內(nèi)未接受任何皮質(zhì)類(lèi)固醇治療。對(duì)照組包括13名健康個(gè)體，年齡為25-55歲，并且在取血樣前至少3個(gè)月內(nèi)均未接受任何免疫抑制治療。組織培養(yǎng)基使用的組織培養(yǎng)基為補(bǔ)加20mM HEPES(Sigma，Poole，UK)、青霉素(100U/ml)、硫酸鏈霉素(100mg/ml)和4mM L-谷氨酰胺(均購(gòu)于LifeTechnologies，Paisley，Scotland)的RPMI-1640培養(yǎng)基。淋巴樣細(xì)胞和TCL的清洗采用無(wú)血清培養(yǎng)基。在所有培養(yǎng)條件和測(cè)定中，使用的培養(yǎng)基均添加10％熱滅活的自體血漿。培養(yǎng)條件和T細(xì)胞增殖測(cè)定在獲得被告知的書(shū)面同意之后，通過(guò)靜脈穿刺從每個(gè)主體中收集檸檬酸化周?chē)?50-100ml)。通過(guò)Histopaque-1077(Sigma，Poole，UK)上的密度離心從血液中分離周?chē)獑魏思?xì)胞(PBMC)，并以1.5ml體積和1×106細(xì)胞/ml的濃度培養(yǎng)在含有PPD、MBP或MBP肽的24孔組織培養(yǎng)板上(Nunc International，Costar)。在5％CO2/95％空氣的潮濕環(huán)境中將板37℃保溫。在第5和第14天之間，從每種培養(yǎng)物中吸取2份100μl的試樣，轉(zhuǎn)移到96孔圓底微量滴定板中，并用0.4μCi的[3H]胸苷(Amersham International，Amersham，UK)進(jìn)行脈沖標(biāo)記。18小時(shí)后，用Machlll收集器96(Tomtec，Orange，New Jersey，USA)將細(xì)胞收集在玻璃纖維墊上(LKB-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。用Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(LKB-Wallac)進(jìn)行胸苷量摻入測(cè)定。當(dāng)δcpm＞1000，并且刺激指數(shù)(SI)＞3時(shí)，含有抗原的測(cè)試孔被認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果，其中SI＝含抗原培養(yǎng)物CPM/無(wú)抗原培養(yǎng)物CPM。T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生MBP特異性T細(xì)胞系(TCL)產(chǎn)生于8名MS患者和2名健康對(duì)照供體。按上文所述由每個(gè)主體分離PBMC，并在MBP存在(50μg/ml)的條件下以1×106細(xì)胞/ml的濃度鋪在6孔板中；將每個(gè)主體的部分PBMC進(jìn)行常規(guī)冷凍和保存，用于隨后的再刺激。7天后，用含有2％IL-2(Lymphocult-HT；Biotest LTD.，Birmingham，UK)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)的第12天用抗原對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行再刺激，抗原為IL-2以及作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的經(jīng)過(guò)照射(2500 Rad)的自體PBMC，細(xì)胞比率為1T細(xì)胞5APC。每3-4天在IL-2中擴(kuò)增細(xì)胞，并在第14天如上文所述用抗原IL-2和PBMC進(jìn)行再刺激。在首次再刺激時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)MBP的特異性增殖。簡(jiǎn)單地說(shuō)，是在MBP存在的條件下將2×104個(gè)T細(xì)胞和1×105個(gè)經(jīng)過(guò)照射的自體PBMC培養(yǎng)在96孔圓底平板中，一式三份。將細(xì)胞培養(yǎng)2天，并用0.4μCi/孔的[3H]胸苷進(jìn)行18個(gè)小時(shí)的脈沖標(biāo)記。然后如上所述收集細(xì)胞，δcpm＞1000并且SI＞3的TCL被認(rèn)為具有MBP特異性。
進(jìn)行3次再刺激/擴(kuò)增循環(huán)之后，在作為APC的經(jīng)過(guò)照射的自體PBMC存在的條件下，用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)將TCL克隆。在有限稀釋條件下以0.1細(xì)胞/孔、0.3細(xì)胞/孔和1細(xì)胞/孔的濃度將T細(xì)胞鋪板，并培養(yǎng)在含有1×104個(gè)經(jīng)過(guò)照射的PBMC、5μg/ml PHA和2％IL-2的Terasaki平板中。10-12天后，將陽(yáng)性生長(zhǎng)細(xì)胞擴(kuò)增到含有1×105個(gè)經(jīng)過(guò)照射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2的96孔圓底平板中。3天后，添加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，第7天時(shí)，將克隆擴(kuò)增到含有5×105個(gè)經(jīng)過(guò)照射的PBMC、PHA和IL-2的48孔板中；此時(shí)利用增殖測(cè)定法檢測(cè)克隆對(duì)MBP的特異性應(yīng)答。1周后，用含有PHA或Dynabeads(Dynal，UK)以及IL-2的1×106個(gè)經(jīng)過(guò)照射的PBMC將MBP特異性克隆擴(kuò)增到24孔板中。基本按上文所述用7-10天的再刺激/擴(kuò)增循環(huán)將克隆維持在24孔板中。按上文所述用增殖測(cè)定法檢測(cè)T細(xì)胞克隆(TCC)對(duì)一組MBP肽的識(shí)別能力。結(jié)果在MS患者和健康個(gè)體中的MBP-肽識(shí)別本發(fā)明人利用動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定法檢測(cè)了MS患者及健康個(gè)體的PBMC對(duì)覆蓋全長(zhǎng)人MBP的一組含有15個(gè)殘基的合成肽的應(yīng)答能力。對(duì)來(lái)自各培養(yǎng)物的PBMC的增殖應(yīng)答測(cè)定是在2周時(shí)間內(nèi)分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，并且將MBP和肽的應(yīng)答動(dòng)力學(xué)曲線與PPD的應(yīng)答進(jìn)行比較，后者代表一種次級(jí)應(yīng)答/記憶抗原。在PBMC對(duì)MBP和/或肽的應(yīng)答方面，β干擾素組患者與未處理組患者之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差別(數(shù)據(jù)未顯示)。MS患者和健康對(duì)照對(duì)MBP的應(yīng)答峰均遲于對(duì)PPD的應(yīng)答，因而符合非記憶抗原應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)特征。圖1顯示MS患者和健康個(gè)體對(duì)PPD和MBP的動(dòng)力學(xué)曲線的典型實(shí)例。
如圖2所示，能夠被MS患者最普遍識(shí)別的兩種肽為90-114和75-99(各有6/12患者)，然后是區(qū)域30-54、135-159和150-170(5/12患者)，以及1-24和105-129(4/12患者)。有3名患者對(duì)aa 15-39和120-144產(chǎn)生應(yīng)答。有2名患者識(shí)別45-69，沒(méi)有一名患者對(duì)區(qū)域60-84產(chǎn)生應(yīng)答。
根據(jù)圖10，當(dāng)所有患者都呈HLA-DR2陽(yáng)性時(shí)，能夠被MS患者最普遍識(shí)別的兩種肽為90-114和75-99(各有6/11患者)，然后是區(qū)域120-144、135-159和150-170(5/12患者)，以及1-24、15-39、30-54和105-129(4/11患者)。有3名患者對(duì)aa 45-69產(chǎn)生應(yīng)答，并且仍沒(méi)有一名MS患者對(duì)區(qū)域60-84產(chǎn)生應(yīng)答。
相比之下，能夠被健康個(gè)體識(shí)別的肽要少得多，只有2名對(duì)照主體對(duì)2種以上的肽產(chǎn)生應(yīng)答(C和J；圖3)。只有C和J這2名對(duì)照個(gè)體識(shí)別aa 60-84，該區(qū)域在該組的患者中未被識(shí)別。有趣的是，這2名個(gè)體均表達(dá)DRB1*0701等位基因。所有健康供體均不能識(shí)別區(qū)域45-69和105-129，而識(shí)別75-99和150-170的健康個(gè)體有4名；識(shí)別135-159的健康個(gè)體有3名；識(shí)別1-24、30-54、60-84和120-144的健康個(gè)體有2名；識(shí)別15-39和90-114的個(gè)體有1名。總體上，有8/13的健康個(gè)體對(duì)所有重疊肽均不產(chǎn)生應(yīng)答，而始終不識(shí)別MBP肽的MS患者只有1/12(MS19)。值得注意的是，該患者是唯一不對(duì)MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答的患者。
圖11也顯示健康個(gè)體對(duì)MBP肽的應(yīng)答。在該研究中，只有1名對(duì)照主體對(duì)2種以上的肽產(chǎn)生應(yīng)答(N11)。N11也是識(shí)別aa 60-84的唯一個(gè)體，該區(qū)域在該組的患者中未被識(shí)別。所有健康供體均不能識(shí)別區(qū)域15-39、45-69和105-129，而識(shí)別120-144和135-159的健康個(gè)體有2名；識(shí)別1-24、30-54、60-84、75-99、90-114和150-170的個(gè)體有1名。總體上，有9/12的健康個(gè)體對(duì)所有重疊肽均不產(chǎn)生應(yīng)答。
總的來(lái)說(shuō)，在對(duì)MBP和/或肽產(chǎn)生應(yīng)答的峰值出現(xiàn)時(shí)間方面，健康個(gè)體與患者之間沒(méi)有明顯的差別，并且這兩組的動(dòng)力學(xué)曲線均類(lèi)似于初級(jí)抗原應(yīng)答。此外，在對(duì)MBP和肽的應(yīng)答強(qiáng)度方面，患者和健康個(gè)體之間沒(méi)有差別。對(duì)MBP-肽的識(shí)別隨時(shí)間而改變?cè)诖_定MS患者能夠?qū)V泛類(lèi)型的MBP肽產(chǎn)生應(yīng)答之后，本發(fā)明人決定檢測(cè)相同個(gè)體中的PBMC識(shí)別是否集中在大約4-12個(gè)月的時(shí)間內(nèi)并保持穩(wěn)定。如圖2、圖10和圖3所示，MS患者和健康個(gè)體均未表現(xiàn)出相同的肽識(shí)別模式。
圖4顯示一名MS患者(MS49)的實(shí)例，該患者在2個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)多種肽產(chǎn)生應(yīng)答，但在4個(gè)月之后測(cè)量的第二時(shí)間點(diǎn)期間的識(shí)別曲線明顯不同。也就是說(shuō)，在第二次動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，PBMC仍保持對(duì)aa 15-39、30-54和150-170的應(yīng)答，但是對(duì)75-99和105-129的應(yīng)答消退，并且改變成對(duì)90-114和135-159的應(yīng)答。
圖5(MS60)顯示一名患者的實(shí)例，該患者的主要表位應(yīng)答在4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)消退成一種集中應(yīng)答。第二次測(cè)試的健康個(gè)體未對(duì)任何肽產(chǎn)生應(yīng)答(圖3)。
總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果說(shuō)明MS患者未能表現(xiàn)出固定的識(shí)別模式。如MS49患者所示，在每名患者中，PBMC對(duì)幾種肽的應(yīng)答可以保持、消退，以及改變成對(duì)MBP新區(qū)域的應(yīng)答。肽識(shí)別循環(huán)當(dāng)在12個(gè)月的時(shí)間內(nèi)分3個(gè)或更多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分析PBMC對(duì)肽的應(yīng)答時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)某些患者中的表位識(shí)別表現(xiàn)為波動(dòng)起伏，而不是不可逆地改變成對(duì)新肽區(qū)域的應(yīng)答。舉例來(lái)說(shuō)，如圖2和圖10所示，患者M(jìn)S60對(duì)aa 120-144和135-159的識(shí)別表現(xiàn)為一種循環(huán)模式；也就是在第一測(cè)試時(shí)間點(diǎn)時(shí)，在眾多被識(shí)別的區(qū)域中包括殘基120-144和135-159，在第二時(shí)間點(diǎn)時(shí)，對(duì)這2個(gè)區(qū)域的應(yīng)答消退，而在4個(gè)月后的第三測(cè)試時(shí)間點(diǎn)時(shí)重新出現(xiàn)。與此類(lèi)似，患者M(jìn)S41的動(dòng)力學(xué)曲線表明，對(duì)aa 135-159的識(shí)別在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的過(guò)程中表現(xiàn)為波動(dòng)起伏(見(jiàn)圖2和圖10)。
在健康對(duì)照組中(圖3)，有1名個(gè)體(M)對(duì)區(qū)域75-99和135-159的應(yīng)答表現(xiàn)為波動(dòng)起伏，另1名個(gè)體(F)在3次分析時(shí)間點(diǎn)中有2次表現(xiàn)為能夠識(shí)別區(qū)域75-99，還有1名個(gè)體(D)對(duì)殘基15-39的應(yīng)答表現(xiàn)為循環(huán)模式。MBP應(yīng)答的精確制圖由8名MS患者和2名健康個(gè)體獲得TCC，并用于闡明在動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定中確定的肽區(qū)域的精確特異性。各TCC特異性的測(cè)試方法是檢測(cè)其對(duì)含有15個(gè)殘基的一組肽的增殖應(yīng)答。克隆SDA7識(shí)別區(qū)域1-24，而在該區(qū)域中，該TCC對(duì)aa 5-19產(chǎn)生應(yīng)答。識(shí)別區(qū)域30-54的有4種克隆(MS49D3、MS49C8、MS49A8、MS49B6)，而該區(qū)域中的表位為30-44。有一種來(lái)自MS患者的克隆(MS39D7)能夠識(shí)別肽60-74，有趣的是，在我們的動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定中，有1名健康個(gè)體對(duì)該區(qū)域(60-84)產(chǎn)生應(yīng)答。有5種克隆(MS43A7、MS41B6、MS41A2、MS41C6、N58)能夠識(shí)別含有區(qū)域75-99的aa 83-99。一名患者產(chǎn)生了對(duì)aa 110-124具有特異性的TCC(MS60A2、MS60B3)，該區(qū)域包含在105-129合并物中，該患者產(chǎn)生的另一種TCC對(duì)120-144區(qū)域中包含的130-144具有特異性(MS60E1)。有5名個(gè)體產(chǎn)生了能夠識(shí)別區(qū)域135-159中所含表位的克隆MS60F7、MS60D1、MS59F1和N519可識(shí)別aa 140-154；MS57A1對(duì)140-149具有特異性，而TCC MS17A3能夠?qū)π蛄?30-144產(chǎn)生應(yīng)答。該組克隆清楚地說(shuō)明，在MBP的135-159區(qū)域中至少存在2種T細(xì)胞表位。最后，區(qū)域150-170能夠被2種對(duì)aa 156-169具有特異性的克隆識(shí)別。所有TCC的特異性總結(jié)于圖6。實(shí)施例2——確定MBP中的apitopes材料與方法利用APIPS進(jìn)行抗原呈遞測(cè)定將肽呈遞至T細(xì)胞克隆的檢測(cè)是利用增殖方法來(lái)進(jìn)行。在0.5％多聚甲醛中將APC固定，并以1×105細(xì)胞/孔的濃度鋪在96孔組織培養(yǎng)板中。以2×104細(xì)胞/孔的濃度將T細(xì)胞克隆鋪在含有含有不同濃度肽的板中。37℃培育48小時(shí)，然后利用16-20小時(shí)的[3H]胸苷摻入方法進(jìn)行增殖測(cè)定。將結(jié)果與T細(xì)胞對(duì)或APC呈遞的表位產(chǎn)生應(yīng)答的能力進(jìn)行比較。
將肽呈遞至由DR2MBP82-100轉(zhuǎn)基因小鼠分離的T細(xì)胞的測(cè)定方法基本如上文所述，只是APC的鋪板濃度為5×105細(xì)胞/孔，T細(xì)胞的鋪板濃度為1×105細(xì)胞/孔，并且在添加[3H]胸苷之前培育72小時(shí)。結(jié)果該實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)上述實(shí)施例中確定為表位的肽被APIPS呈遞的能力。結(jié)果顯示于圖7b。在目前已檢測(cè)的5種表位中，發(fā)現(xiàn)有4種是apitopes(30-44、80-94、110-124和130-144)，有1種可作為表位，但不能作為apitope(156-170)。實(shí)施例2A——對(duì)MBP肽30-44、110-124、130-144和156-170的研究為了研究多種MBP肽是否為apitopes，對(duì)這些肽被固定的APC呈遞至T細(xì)胞的能力進(jìn)行檢測(cè)。在含有肽的血清或只在血清中將活體的或預(yù)脈沖標(biāo)記的Mgar(HLA-DR2+ve)細(xì)胞進(jìn)行3.5小時(shí)的預(yù)脈沖標(biāo)記。然后將過(guò)量的肽去除，并添加適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞克隆。利用[3H]胸苷攝取方法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖應(yīng)答。
如圖8和圖9所示，肽30-44(圖8A)、110-124(圖8B)和130-144(圖9A)無(wú)需進(jìn)一步加工即可被固定的APC呈遞。因此，這些肽被確定為apitopes。另一方面，肽156-170需要進(jìn)一步加工才可被呈遞至T細(xì)胞(圖9B)。固定的APC不能將該表位呈遞至T細(xì)胞，因而156-170不是一種apitope。實(shí)施例2B——確定MBP區(qū)域77-100和125-148中的apitopes對(duì)任何給定的表位而言，都可能存在一種或多種無(wú)需進(jìn)一步加工即可被呈遞至APC的apitopes。對(duì)兩種MBP區(qū)域內(nèi)的apitopes存在情況進(jìn)行檢測(cè)，方法是在含有MBP區(qū)域77-100(圖12)和區(qū)域125-148(圖13)的重疊肽的血清或只在血清中培育活體的或多聚甲醛固定的Mgar(HLA-DR2+ve)細(xì)胞。培育72小時(shí)(圖12)或48小時(shí)(圖13)后，添加T細(xì)胞，并利用[3H]胸苷攝取方法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖應(yīng)答。用于MBP77-100的T細(xì)胞分離自DR2MBP 82-100轉(zhuǎn)基因小鼠，用于MBP130-144的是T細(xì)胞克隆MS17A3。
在MBP區(qū)域77-100中，以下的肽被確定為apitopesMBP 83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTPMBP 80-94 TQDENPVVHFFKNIVMBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVTMBP 82-96 DENPVVHFFKNIVTPMBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPRMBP 84-98 MPVVHFFKNIVTPRT能夠被來(lái)源于DR2 MBP 82-100轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞識(shí)別的最小MBP序列為區(qū)域85-94。
在MBP區(qū)域125-148中，以下的肽被確定為apitopesMBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGVMBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVDMBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDAMBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ能夠被T細(xì)胞克隆MS17A3識(shí)別的最小MBP序列為區(qū)域133-144。實(shí)施例2C——對(duì)MBP區(qū)域89-101的研究本發(fā)明人此前發(fā)現(xiàn)，與其他髓磷脂T細(xì)胞表位不同的是，以可溶形式將肽89-101給藥不能防止小鼠被完整髓磷脂或肽89-101本身誘導(dǎo)產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)(Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.281251)。MBP 89-101含有3個(gè)T細(xì)胞表位為了研究T細(xì)胞對(duì)MBP區(qū)域81-111的反應(yīng)性，在體外用81-111刺激已被81-111致敏的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞，并用覆蓋81-111區(qū)域且依次錯(cuò)位2個(gè)殘基的一組含有10個(gè)殘基的重疊肽(即81-90、83-92、85-94、87-96、89-98、91-100、93-102、95-104、97-106、99-108和101-111)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。對(duì)覆蓋89-101的肽的應(yīng)答模式說(shuō)明，有5種相鄰的肽(N端87-96至95-104)具有刺激能力，這表明至少存在2種(可能是3種)不同的表位。
為了對(duì)該區(qū)域做進(jìn)一步研究，由最初的81-111應(yīng)答性T細(xì)胞系產(chǎn)生了3種亞細(xì)胞系，并用覆蓋84-106區(qū)域且依次錯(cuò)位1個(gè)殘基的一組含有10個(gè)殘基的重疊肽對(duì)這些細(xì)胞系再次進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果說(shuō)明89-101序列中存在3種不同但又重疊的T細(xì)胞表位89-94、92-98和95-101(見(jiàn)圖14)。MBP肽92-98是一種隱蔽表位當(dāng)測(cè)試對(duì)89-101肽和整個(gè)重組MBP的反應(yīng)性時(shí)，這3種表位特異性T細(xì)胞系(TCL)表現(xiàn)出十分有趣的差異。所有3種TCL都能夠?qū)﹄?89-101)產(chǎn)生應(yīng)答，但只有89-94特異性TCL和95-101特異性TCL能夠?qū)ν暾腗BP產(chǎn)生應(yīng)答。這說(shuō)明完整MBP的抗原加工優(yōu)先產(chǎn)生89-94識(shí)別性T細(xì)胞和95-101識(shí)別性T細(xì)胞的配體，而不產(chǎn)生92-98識(shí)別性T細(xì)胞的配體。這表明92-98表位是隱蔽的(即不能通過(guò)天然抗原加工產(chǎn)生)。MBP的89-101肽似乎能參與3種不同的與MHC分子的相互作用，從而產(chǎn)生被3種獨(dú)立T細(xì)胞群識(shí)別的肽/MHC配體。但是對(duì)MBP的加工只產(chǎn)生被其中2種T細(xì)胞群識(shí)別的配體(見(jiàn)圖14)。
誘導(dǎo)EAE要求T細(xì)胞能夠識(shí)別CNS中由于完整MBP降解而表達(dá)的自身抗原性表位。用只含有上述3種T細(xì)胞表位之一的肽對(duì)小鼠進(jìn)行免疫的結(jié)果說(shuō)明，只有包含天然加工表位(89-94或95-101)的肽才能夠誘導(dǎo)EAE。這進(jìn)一步支持92-98為隱蔽表位的結(jié)果。MBP肽92-98是MBP區(qū)域89-101的優(yōu)勢(shì)表位如上所述，區(qū)域89-101含有3種不同但又重疊的肽。其中，肽92-98似乎在該區(qū)域占有優(yōu)勢(shì)。例如，當(dāng)由98-101肽致敏的小鼠產(chǎn)生T細(xì)胞克隆時(shí)，產(chǎn)生的所有6種克隆都能夠?qū)?2-98產(chǎn)生應(yīng)答。通過(guò)使用在每個(gè)位置含有單個(gè)丙氨酸取代的89-101肽類(lèi)似物，發(fā)現(xiàn)將92-98的任一位置取代都會(huì)導(dǎo)致應(yīng)答性喪失，這說(shuō)明92-98核心中任何殘基的改變都會(huì)對(duì)該表位的識(shí)別產(chǎn)生總體上的影響。MBP肽89-101不能使識(shí)別天然加工MBP表位的EAE相關(guān)T細(xì)胞獲得耐受性總之，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)a)89-101序列有可能產(chǎn)生3種T細(xì)胞表位；b)對(duì)完整MBP的抗原加工(包括體內(nèi)和體外)只能產(chǎn)生其中的2種表位(89-94和95-101)；c)能有效誘導(dǎo)EAE的肽只有包含天然加工表位的肽，而不是包含隱蔽表位的肽；d)在肽治療實(shí)驗(yàn)中，89-101肽不能預(yù)防EAE。
這些信息可作為依據(jù)，用于研究89-101肽不能與疾病相關(guān)T細(xì)胞直接結(jié)合因而無(wú)法誘導(dǎo)EAE耐受性的假設(shè)。為了證明該假設(shè)，這種肽(89-101)應(yīng)該不能誘導(dǎo)對(duì)致腦炎性表位(89-94)的耐受性，因?yàn)樗荒芘c適當(dāng)構(gòu)象的MHC限制性因子(I-AS)直接結(jié)合。換句話說(shuō)，89-101將不能作為對(duì)89-94產(chǎn)生應(yīng)答的T細(xì)胞的apitope。
為了檢測(cè)這種可能性，用89-101肽和87-96肽進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)(圖15A&B)。87-96肽含有誘導(dǎo)EAE最有效的表位(89-94)。方法使小鼠在第-8、-6和-4天接受含有200μg肽的PBS或只接受PBS，然后在第0天接受與弗氏完全佐劑混合的100μg肽。10天后，將引流淋巴結(jié)細(xì)胞(6×105每孔)培養(yǎng)在補(bǔ)加5×10-5M 2-巰基乙醇和2M L-谷胺酰胺并且含有或不含抗原的X-Vivo 15培養(yǎng)基中。最后用0.5μCi[3H]胸苷對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行16個(gè)小時(shí)的脈沖標(biāo)記，然后用液體閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行摻入量測(cè)定。結(jié)果表示為3份培養(yǎng)物的每分鐘計(jì)數(shù)的平均值。結(jié)果用87-96致敏的結(jié)果是誘導(dǎo)了一種對(duì)其本身的強(qiáng)記憶應(yīng)答和一種對(duì)89-101的較弱應(yīng)答(分別為圖15A及B的□和○)。這說(shuō)明需要經(jīng)過(guò)抗原加工由89-101產(chǎn)生89-94。在用87-96致敏之前用87-96作為耐受原的結(jié)果是同時(shí)抑制了對(duì)87-96和89-101的記憶應(yīng)答(圖15A的■和●)。這說(shuō)明89-94反應(yīng)性T細(xì)胞一旦在體內(nèi)獲得無(wú)反應(yīng)性，將不能在體外對(duì)89-96或89-101產(chǎn)生的89-94產(chǎn)生應(yīng)答。但重要的是，在用87-96致敏之前將89-101作為耐受原不能抑制對(duì)87-96和89-101的記憶應(yīng)答(圖15B A的■和●)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，將肽89-101以耐受原形式給藥不能產(chǎn)生對(duì)基于89-94序列的天然加工致腦炎性表位的耐受性89-101肽不能作為89-94表位的apitope。
盡管不希望受理論的約束，但本發(fā)明人相信，這些觀測(cè)結(jié)果可通過(guò)肽89-101在MHC肽結(jié)合位點(diǎn)中的位置來(lái)加以解釋。如果該肽可優(yōu)先結(jié)合，并使92-98區(qū)域位于肽結(jié)合袋中，則能夠被MBP 92-98特異性T細(xì)胞識(shí)別。這可用于解釋為何用MBP 89-101致敏小鼠時(shí)，產(chǎn)生的所有T細(xì)胞克隆都能夠識(shí)別MBP 92-98表位。同樣，當(dāng)用89-101使T細(xì)胞獲得耐受性時(shí)，主要是識(shí)別MBP92-98表位的T細(xì)胞獲得耐受性。如果MBP92-98是一種隱蔽表位，則不能由完整抗原的天然加工過(guò)程產(chǎn)生，因而在體內(nèi)可能不存在識(shí)別該表位的T細(xì)胞。即使體內(nèi)確實(shí)存在MBP92-98特異性T細(xì)胞，這種T細(xì)胞也與該疾病無(wú)關(guān)。因此，89-101不能預(yù)防由完整MBP誘導(dǎo)的EAE。實(shí)施例3——用于MS小鼠模型的肽治療方法本發(fā)明人此前發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腹膜內(nèi)(Liu and Wraith(1995)Int Immunol81255-1263)或鼻內(nèi)(Metzler and Wraith(1993)51159-1165)途徑進(jìn)行單劑量肽抗原全身給藥的方法能夠有效地保護(hù)小鼠在長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)不患實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)(Metzler and Wraith(1999)Immunology 97257-263)。在表達(dá)EAE特異性T細(xì)胞受體(Liu etal(1995)Immunity 3407-415)的Tg4-轉(zhuǎn)基因小鼠(Burkhart et al(1999)111625-1634)中誘導(dǎo)耐受性至少需要5劑肽。最近的工作表明，對(duì)Tg4小鼠而言，鼻內(nèi)(IN)途徑比腹膜內(nèi)(IP)途徑更安全，但在非轉(zhuǎn)基因小鼠中，這兩種方法的安全性相同。
對(duì)MBP肽83-99的測(cè)試是在Fug/D6轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行，這種小鼠能夠同時(shí)表達(dá)適當(dāng)?shù)腍LA-DR2 II類(lèi)MHC分子和來(lái)源于對(duì)該肽具有特異性的人T細(xì)胞克隆的TCR。根據(jù)處理Tg4轉(zhuǎn)基因小鼠所采用的標(biāo)準(zhǔn)劑量(Tg4方案)或用于治療變態(tài)反應(yīng)患者的肽劑量遞增脫敏方案(脫敏方案)，用肽對(duì)小鼠進(jìn)行治療。
Tg4方案對(duì)多組小鼠進(jìn)行處理，方法是用總體積25μl的肽83-99(以4mg/ml的濃度溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS))或只用PBS進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。每周的第1和第5天對(duì)小鼠進(jìn)行處理，持續(xù)5周，共10次給藥。在第6周開(kāi)始時(shí)，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對(duì)每只小鼠進(jìn)行注射，此外還在第1和第3天用百日咳毒素(200ng)進(jìn)行IP注射。
脫敏方案對(duì)多組小鼠進(jìn)行處理，方法是用總體積25μl的遞增劑量的肽83-99或只用PBS進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。遞增劑量從0.1μg開(kāi)始，再依次為1、3、6、12、50μg，然后是3次100μg。每周的第1和第5天對(duì)小鼠進(jìn)行處理，持續(xù)5周，共10次給藥。在第6周開(kāi)始時(shí)，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對(duì)每只小鼠進(jìn)行注射，此外還在第1和第3天用百日咳毒素(200ng)進(jìn)行IP注射。對(duì)EAE的進(jìn)展情況至少監(jiān)測(cè)30天。實(shí)施例4——將一種apitope混合物鼻內(nèi)給藥于MS患者制備一種含有MBP肽30-44、83-99、110-124和130-144(即已被確定為apitopes的某些MBP表位)的疫苗。在Phase Ia/Ib試驗(yàn)中，將該疫苗給藥于35名患者。該試驗(yàn)為單交叉試驗(yàn)，其中的患者保持3個(gè)月的非治療狀態(tài)，然后接受單劑量的肽(Ia)。為評(píng)定安全性，在單劑量疫苗給藥后，對(duì)患者進(jìn)行3個(gè)月的監(jiān)測(cè)。此外，該治療還包括兩次鼻內(nèi)沉積給藥，每周一次。對(duì)每名患者用磁共振成像法分析臨床活性，每月一次；用增殖動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測(cè)定法監(jiān)測(cè)免疫活性；并用基于細(xì)胞的ELISA法監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)量。
該試驗(yàn)最初涉及對(duì)5名慢性進(jìn)展性疾病(CP)患者的治療。這些患者是根據(jù)低MRI活性來(lái)挑選的，并且首先用最高劑量的肽進(jìn)行處理。從CP患者組開(kāi)始治療的原因是，他們最可能通過(guò)MRI活性的提高來(lái)表明任何可能的不良影響。在確定對(duì)CP組的單劑量和多劑量治療均具有安全性之后，即可開(kāi)始對(duì)復(fù)發(fā)緩解患者的治療。在這一較大的組中，30名復(fù)發(fā)緩解患者的挑選依據(jù)是他們?cè)?個(gè)月的監(jiān)測(cè)期內(nèi)出現(xiàn)MRI病變加強(qiáng)。這些患者被分為3組，分別用高、中或低劑量肽進(jìn)行治療。
縮寫(xiě)APC＝抗原呈遞細(xì)胞；MHC＝主要組織相容性復(fù)合體；TCR＝T細(xì)胞受體；EAE＝實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；APITOPE＝抗原加工非依賴(lài)性表位；APIPS＝抗原加工非依賴(lài)性呈遞系統(tǒng)；aa＝氨基酸；MS＝多發(fā)性硬化癥；MBP＝髓磷脂堿性蛋白；PLP＝蛋白脂質(zhì)蛋白；TCL＝T細(xì)胞系；TCC＝T細(xì)胞克隆；PBMC＝外周血單核細(xì)胞；PPD＝結(jié)核分支桿菌純化蛋白衍生物；PHA＝植物血球凝集素本領(lǐng)域的技術(shù)人員都了解，在不脫離本發(fā)明的范圍和主旨的條件下，本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)可有多種修改和變化。盡管本發(fā)明是通過(guò)特別優(yōu)選的實(shí)施方案來(lái)加以描述，但應(yīng)該了解的是，申請(qǐng)專(zhuān)利保護(hù)的本項(xiàng)發(fā)明不應(yīng)過(guò)度局限于這些特別的實(shí)施方案。實(shí)際上，本發(fā)明應(yīng)包括用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式方法的不同變化，這些變化對(duì)化學(xué)或生物或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。在上文的說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物均在此引入作為參考。
序列表<110>Bristol大學(xué)<120>肽選擇方法<130>P9611WO LCH<140>PCT/GB01/03702<141>2001-08-17<150>0020618.5<151>2000-08-21<150>0114547.3<151>2001-06-14<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr1 5 10 15Pro<210>2<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val1 5 10 15<210>8<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp1 5 10 15<210>9<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala1 5 10 15<210>10<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln1 5 10 15<210>11<211>13<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.一種用于選擇耐受原性肽的方法，該方法包括選擇一種無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的肽無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與II類(lèi)MHC分子結(jié)合。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中的肽選自每一種都含有T細(xì)胞表位的多種肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的多種肽是從一種抗原呈遞細(xì)胞的II類(lèi)MHC分子洗脫的。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中，多種肽中的每一種與佐劑一起給藥于主體時(shí)，都能夠在該主體中誘導(dǎo)一種與該抗原相關(guān)的疾病。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中的肽選自一組嵌套的截短肽。
7.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中的肽含有一種T細(xì)胞表位，并且通過(guò)以下方法檢測(cè)T細(xì)胞表位的存在(i)用該肽處理由患有疾病的主體獲得的細(xì)胞樣品，以及由不患疾病的主體獲得的細(xì)胞樣品；并且(ii)將這些細(xì)胞樣品的T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行比較。
8.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，該方法包括以下步驟(i)用一種肽對(duì)抗原加工非依賴(lài)性呈遞系統(tǒng)(APIPS)進(jìn)行處理；并且(ii)分析APIPS中該肽與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子的結(jié)合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中，對(duì)肽與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子的結(jié)合進(jìn)行分析的方法是添加T細(xì)胞并測(cè)量T細(xì)胞激活。
10.權(quán)利要求8的方法，其中的APIPS包含(i)固定的抗原呈遞細(xì)胞；(ii)含有I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子的脂質(zhì)膜；或(iii)結(jié)合于平板的I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子。
11.一種由上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法選擇的肽。
12.權(quán)利要求11的肽，該肽選自以下髓磷脂堿性蛋白肽30-44、80-94、83-99、81-95、82-96、83-97、84-98、110-124、130-144、131-145、132-146和133-147。
13.權(quán)利要求11或12的肽，用于在一種疾病的治療和/或預(yù)防中使用。
14.權(quán)利要求13的肽，其中的疾病為過(guò)敏性病癥。
15.一種藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求11-14的任意一項(xiàng)所描述的多種肽，每種肽含有疾病的一種T細(xì)胞表位。
16.一種用于治療和/或預(yù)防有需要的主體的一種疾病的方法，該方法包括將權(quán)利要求11-14的任意一項(xiàng)的肽給藥于該主體的步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，該方法包括以下步驟(i) 確定該疾病的一種抗原；(ii) 確定該抗原的一種apitope；并且(iii)將該apitope給藥于該主體。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中的肽或apitope是以多劑量給藥。
19.權(quán)利要求16-18的任意一項(xiàng)的方法，其中的肽或apitope是通過(guò)鼻內(nèi)給藥。
全文摘要
提供一種方法，用于通過(guò)選擇一種無(wú)需進(jìn)一步加工即能夠與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子結(jié)合的肽的方法來(lái)選擇耐受原性肽。此外還提供由該方法選擇的肽，及其在藥物組合物和用于治療和/或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1469883SQ0181768
公開(kāi)日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2001年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月21日
發(fā)明者D·C·弗賴(lài)斯, S·M·安德頓, G·馬扎, M·龐斯福特, H·B·斯特雷特, D C 弗賴(lài)斯, 垢Ｌ, 安德頓, 斯特雷特 申請(qǐng)人:阿皮托普技術(shù)(布里斯托爾)有限公司