專利名稱：合成的抗微生物多肽的制作方法
背景技術：
抗微生物肽(AMP)是相對新近發現的一組具有新作用模式的抗微生物劑。
AMP廣泛分布于動物、植物和微生物并且屬于最古老的宿主防御因子。絕大多數的該種肽在天然情況下是陽離子的和兩親性的；該特性允許與帶負電荷的細菌或真菌的膜相互作用。
該種肽大小范圍從6-7個氨基酸至60個氨基酸。迄今為止已經分離出500種以上不同的AMP。基于結構或氨基酸組成可以將它們分為幾類。最簡單的結構是小的α-螺旋肽。其它AMP折疊形成β-片層結構，而另外的再次形成剛性的二硫橋連接的三級結構。
AMP通常是殺微生物的(與靜止相對)并且作用極其快。通常，靶生物在幾分鐘之內被殺死。它們通過干擾靶生物的膜功能而起作用。已經顯示存在幾種不同的作用機制，但是對于大多數AMP，總體結果是膜破裂和/或細胞裂解。
對微生物膜的選擇性是由膜組成、膜電荷和跨膜電位介導的。微生物膜比更高等生物的膜具有較高的負電荷，其包含不同類型的磷脂而不含膽固醇。
已經證明在靶生物中誘導對AMP的抗性極端困難。這是靶標的原因；為了顯著性改變膜組成或電荷，靶標將不得不發生多重基因組改變。
發明概述在本發明的第一個方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；并且其中X1-X5中最多4個是相同的。
在本發明的第二個方面涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
在本發明的第三個方面涉及包含編碼本發明多肽的核苷酸序列的核酸構建體，該核苷酸序列與指導多肽在適當宿主中產生的一個或多個控制序列有效連接。
在本發明的第四個方面涉及包含本發明核酸構建體的重組表達載體。
在本發明的第五個方面涉及包含本發明核酸構建體的重組宿主細胞。
在本發明的第六個方面涉及生產本發明多肽的方法，該方法包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養重組宿主細胞；和(b)回收多肽。
本發明的其它方面在以下描述和附加權利要求中是顯而易見的。
定義在更加詳細地討論本發明之前，首先定義以下術語和規定抗微生物活性術語“抗微生物活性”文中定義為能夠殺死或抑制微生物細胞生長的活性。在本發明的上下文中，術語“抗微生物的”旨在指具有殺菌和/或抑菌和/或殺真菌和/或抑真菌作用和/或殺病毒作用，其中術語“殺菌的”應理解為能夠殺死細菌細胞。術語“抑菌的”應理解為能夠抑制細菌生長，即抑制正在生長的細菌細胞。術語“殺真菌的”應理解為能夠殺死真菌細胞。術語“抑真菌的”應理解為能夠抑制真菌生長，即抑制正在生長的真菌細胞。術語“殺病毒的”應理解為能夠使病毒失活。術語“微生物細胞”指細菌或真菌細胞(包括酵母)。
在本發明的上下文中，術語“抑制微生物細胞生長”旨在指細胞處于非生長狀態，即它們不能夠繁殖。
為了本發明的目的，按照Lehrer等(Journal of ImmunologicalMethods，第137卷，(2)第167-174頁，1991)所描述的方法可以確定抗微生物活性。
在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)水溶液中；優選地在10％(w/w)水溶液中；更加優選地在5％(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在1％(w/w)水溶液中；最優選地在0.5％(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.1％(w/w)水溶液中于20℃孵育8小時后(優選地4小時后，更加優選地2小時后，最優選地1小時后，并且具體而言30分鐘后)，具有抗微生物活性的多肽能夠將大腸桿菌(Escherichia coli)(DSM 1576)的活細胞數量降低至1/100。
當加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時；優選地為500ppm時；更加優選地為250ppm時；甚至更加優選地為100ppm時；最優選地為50ppm時；并且具體而言為25ppm時，該多肽還能夠在25℃下抑制大腸桿菌(DSM 1576)在微生物生長基質中生長達24小時。
在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)水溶液中；優選地在10％(w/w)水溶液中；更加優選地在5％(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在1％(w/w)水溶液中；最優選地在0.5％(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.1％(w/w)水溶液中于20℃孵育8小時后(優選地4小時后，更加優選地2小時后，最優選地1小時后，并且具體而言為30分鐘后)，具有抗微生物活性的多肽能夠將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)的活細胞數量降低至1/100。
當加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時；優選地為500ppm時；更加優選地為250ppm時；甚至更加優選地為100ppm時；最優選地為50ppm時；并且具體而言為25ppm時，該多肽還能夠在25℃下抑制枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)在微生物生長基質中生長達24小時。
本發明多肽將優選地具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少20％。在特別優選的實施方案中，多肽將具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少40％，例如至少50％，優選地至少60％，例如至少70％，更加優選地至少80％，例如至少90％，最優選地至少95％，例如大約或至少100％。
片段當文中使用時，本發明氨基酸序列的“片段”是多肽的亞序列，其中氨基末端和/或羧基末端的一個或多個氨基酸已經缺失。優選地為從羧基末端缺失一個或多個氨基酸。優選地，片段由至少20個氨基酸組成。
等位基因變體在本文中，術語“等位基因變體”表示占據同一染色體位點的基因的任意兩種或多種可選擇形式。等位基因變體在天然情況下通過突變產生，并且可以導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(沒有改變所編碼多肽)或者可以編碼氨基酸序列發生改變的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體所編碼的多肽。
基本上純的多核苷酸如文中所使用術語“基本上純的多核苷酸”是指多核苷酸制劑，其中多核苷酸已經脫離了其天然遺傳環境并因此不含其它外來的或不必要的編碼序列，并且是適宜在遺傳工程蛋白質生產系統中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸包含最多10％(按重量計算)的與其天然相關的其它多核苷酸物質(優選較低百分比的其它多核苷酸物質，例如按重量計算最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％以及最多0.5％)。然而，基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區，例如啟動子或終止子。優選地，基本上純的多核苷酸的純度至少為92％(即多核苷酸組成了制劑中存在的總多核苷酸物質重量的至少92％)，并且優選更高的百分比，例如純度至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，并且最多99.5％。優選地，文中所公開多核苷酸是基本上純的形式。具體而言，文中公開的多核苷酸優選地是“本質上純的形式”，即多核苷酸制劑基本上不含與其天然相關的其它多核苷酸物質。在文中，術語“基本上純的多核苷酸”與術語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”同義。
修飾在本發明上下文中，術語“修飾”旨在指由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5組成的多肽或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319的任意一個氨基酸序列的任意化學修飾以及對編碼多肽的DNA的遺傳操作；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；并且其中X1-X5中最多4個是相同的。修飾可以是氨基酸側鏈的替換，目的氨基酸中或目的氨基酸處的替代、缺失和/或插入；或者在氨基酸序列中使用具有相似特性的非天然氨基酸。具體而言修飾可以是酰胺化，例如C末端的酰胺化。
cDNA當用于本文中時，術語“cDNA”旨在涵蓋能夠通過逆轉錄從來自真核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子制備得到的DNA分子。cDNA缺乏在相應基因組DNA中通常存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄本是mRNA的前體，并且在成為成熟的剪接mRNA之前其將經歷一系列加工事件。這些事件包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因此當cDNA來自mRNA時其缺乏內含子序列。
核酸構建體當文中使用時，術語“核酸構建體”意思是指單鏈或雙鏈核酸分子，其從天然存在的基因分離得到或者已經進行了修飾以包含自然界中不存在的核酸的片段。當核酸構建體包含本發明編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。
控制序列術語“控制序列”文中定義為包括本發明多肽表達所必需或者有利于本發明多肽表達的全部元件。相對于編碼多肽的核苷酸序列，每個控制序列可以是天然的或外來的。每個控制序列包括但不限于前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。在最低限度時，控制序列包括啟動子和轉錄及翻譯終止信號。控制序列可以具有接頭，以便導入便于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區相連接的特異限制性酶切位點。
有效連接術語“有效連接”文中定義為一種構象，其中控制序列適當地放置于與DNA序列的編碼序列相關的位置從而使控制序列指導多肽表達。
編碼序列當用于文中時，術語“編碼序列”旨在涵蓋核苷酸序列，該序列直接指定其蛋白質產物的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常通過開放閱讀框確定，開放閱讀框通常起始于ATG起始密碼子。編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。
表達在本發明的上下文中，術語“表達”包括參與多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯和翻譯后修飾。優選地，表達還包括多肽的分泌。
表達載體在本發明的上下文中，術語“表達載體”涵蓋線性或環狀DNA分子，其包含編碼本發明多肽的片段，并且其與用于其轉錄的另外片段有效連接。
宿主細胞如文中所使用，術語“宿主細胞”包括易于用核酸構建體轉化的任何細胞類型。
在題目為“具有抗微生物活性的多肽”的部分中定義術語“多核苷酸探針”、“雜交”以及各種嚴格性條件。
發明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個方面，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5，優選地多肽由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5組成；其中X1、X2、X3、X4和X5獨立地為P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P或R-P-P-Z12；其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11和Z12獨立地為F、L、V或I。
本發明還涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5，優選地多肽由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5組成；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I。
在一個實施方案中，X1、X2、X3、X4和X5選自氨基酸序列P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P和R-P-P-Z12；其中除了Z1-Z12氨基酸以外X1-X5是相同的；其中Z1-Z12選自氨基酸F、L、V和I。
優選地，X1-X5中最多4個是相同的；更加優選地為X1-X5中最多3個是相同的，甚至更加優選地為X1-X5中最多2個是相同的；最優選地為X1-X5不相同。
在另一個實施方案中，除了X1、X2、X3、X4和X5的Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11和Z12獨立地為F、L、V或I以外；X1＝X2＝X3＝X4＝X5為P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P或R-P-P-Z12。
在另一個實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6，優選地多肽由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6組成；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6獨立地為P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P或R-P-P-Z12；其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11和Z12獨立地為F、L、V或I。
在另一個實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6，優選地多肽由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6組成；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I。
在另一個實施方案中，X1、X2、X3、X4、X5和X6選自氨基酸序列P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P和R-P-P-Z12；其中除了Z1-Z12氨基酸以外X1-X6是相同的；其中Z1-Z12選自氨基酸F、L、V和I。
優選地，X1-X6中最多4個是相同的；更加優選地為X1-X6中最多3個是相同的，甚至更加優選地為X1-X6中最多2個是相同的；最優選地為X1-X6不相同。
在另一個實施方案中，除了X1、X2、X3、X4、X5和X6的Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11和Z12獨立地為F、L、V或I以外；X1＝X2＝X3＝X4＝X5＝X6為P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P或R-P-P-Z12。
在優選的實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個的氨基酸序列，優選地多肽由SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個的氨基酸序列組成。
還在另一個實施方案中，氨基酸序列與氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5最多5個氨基酸(例如5個氨基酸)、例如最多4個氨基酸(例如4個氨基酸)、例如最多3個氨基酸(例如3個氨基酸)、特別是最多2個氨基酸(例如2個氨基酸)、例如1個氨基酸不同；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；或者氨基酸序列與氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6最多5個氨基酸(例如5個氨基酸)、例如最多4個氨基酸(例如4個氨基酸)、例如最多3個氨基酸(例如3個氨基酸)、特別是最多2個氨基酸(例如2個氨基酸)、例如1個氨基酸不同；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6中的每一個選自P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；或者氨基酸序列與SEQ ID NO1至SEQ IDNO319中任意一個的氨基酸序列最多5個氨基酸(例如5個氨基酸)、例如最多4個氨基酸(例如4個氨基酸)、例如最多3個氨基酸(例如3個氨基酸)、特別是最多2個氨基酸(例如2個氨基酸)、例如1個氨基酸不同。
優選地，本發明的多肽包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列；或者具有抗微生物活性的其片段。在另一個優選的實施方案中，多肽由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列組成。
組成本發明多肽的氨基酸可以獨立地選自D型或L型。
本發明的多肽可以由20-500個氨基酸、優選20-400個氨基酸、更加優選20-300個氨基酸、甚至更加優選20-200個氨基酸(例如20-150個氨基酸)、最優選20-100個氨基酸并且具體而言20-50個氨基酸組成。
在氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6之前立即為3-10個氨基酸(例如3-5個氨基酸)的氨基酸序列，其中在所述氨基酸序列當中至少2個氨基酸在中性pH時帶正電荷(例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)。優選地，在氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6之前立即為氨基酸序列R-X7-R；其中X7為R、F、L、V或I。術語“之前立即為”意思是氨基酸序列連接于氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6的N末端。
本發明多肽可以是人工變體，其包含(優選地由其組成)這樣一種氨基酸序列，即所述的氨基酸序列與氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列相比具有最多3個、例如最多2個、諸如最多1個氨基酸替換、缺失和/或插入。
此類人工變體可以通過本領域已知的標準技術構建，例如通過將包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319任意一個氨基酸序列的多肽進行定點/隨機誘變。在本發明的一個實施方案中，氨基酸變化在特性上變化較小，即為不顯著影響蛋白質折疊和/或活性的保守氨基酸替換；小的缺失(一般為1個至大約5個氨基酸缺失)；小的氨基末端或羧基末端延伸(例如氨基末端蛋氨酸殘基)；多至大約10-25個殘基的小的接頭肽；利于通過改變凈電荷進行純化或者利于其它功能的小的延伸(例如多聚組氨酸、抗原表位或結合結構域)。
保守替換的例子是堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸)、芳香族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)中的組內替換。通常不改變特異活性的氨基酸替換在本領域中是已知的并且由例如H.Neurath和R.L.Hill(The Proteins，Academic Press，1979，New York)描述。最常發生的互換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，以及相反的那些互換。
在本發明的一個有趣的實施方案中，氨基酸變化使多肽的物理-化學性質改變。例如，可以進行能夠改善多肽熱穩定性、改變底物特異性、改變最適pH等等的氨基酸變化。
N末端延伸本發明多肽的N末端延伸可以適當地由1-50個氨基酸、優選2-20個氨基酸、特別是3-15個氨基酸組成。在一個實施方案中，N末端肽延伸不包含Arg(R)。在另一個實施方案中，N末端肽延伸包含如下面將進一步定義的kex2或kex2樣切割位點。在一個優選的實施方案中，N末端延伸為包含至少2個Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基的肽，例如包含序列EAE、EE、DE和DD之一的N末端延伸。
Kex2位點Kex2位點(見例如Methods in Enzymology 185卷，D.Goeddel編，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“Gene ExpressionTechnology”)和kex2樣位點為在一些蛋白質的前肽編碼區和成熟區之間發現的二堿基識別位點(即切割位點)。
已經表明，在某些情況下kex2位點或kex2樣位點的插入改善了在前肽切割位點處的正確的內肽酶加工，導致蛋白質分泌水平增加。
在本發明的上下文中，與氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列所示的成熟多肽相比，kex2或kex2樣位點的插入導致可以在N末端延伸(使抗微生物多肽被延伸)內的一定位點進行切割。
融合多肽本發明多肽還包括融合多肽或可切割融合多肽，其中另一個多肽與本發明多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發明的核苷酸序列(或其部分)融合產生融合多肽。產生融合多肽的技術在本領域中是已知的，其包括將編碼多肽的編碼序列如此連接以致于使它們處于同一閱讀框并且使融合多肽在同一啟動子和終止子控制下表達。
多核苷酸和核苷酸序列本發明還涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具體而言，本發明涉及由編碼本發明多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，技術人員將容易地認識到可以制備編碼本發明每一多肽的幾種核苷酸序列。在本領域中眾所周知，編碼本發明多肽的氨基酸的密碼子由核苷酸組成。
本發明還涉及編碼具有抗微生物活性的氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列的片段的多核苷酸。多核苷酸的亞序列為其中5’和/或3’末端的一個或多個核苷酸已經缺失的核苷酸序列。
通過在遺傳工程中使用的標準克隆步驟，可以將核苷酸序列從一個位置移到其可以進行復制的不同位點。克隆步驟包括包含編碼多肽的核苷酸序列的目的片段的切除和分離、將片段插入載體分子以及重組載體整合入宿主細胞，在那里將復制出核苷酸序列的多重拷貝或克隆。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成來源、合成來源或其任意組合。
編碼本發明多肽的核苷酸序列的修飾對于多肽的合成可能是必需的，其中與氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6或者SEQ ID NO1至SEQ ID NO319中任意一個氨基酸序列相比所述多肽所包含的氨基酸序列具有至少一個替換、缺失和/或插入。這些人工變體在某些工程化方式上可能不同于從其天然來源分離得到的多肽，例如在特異活性、熱穩定性、最適pH等等方面不同的變體。
可以在分子功能關鍵區域外進行此類修飾，并且此類修飾仍然能夠產生活性多肽，這對于本領域技術人員是顯而易見的。根據本領域已知的方法例如位點定向誘變或丙氨酸掃描誘變(見例如Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)可以鑒定出對于本發明核苷酸序列所編碼多肽的活性所必需的、因此優選不進行修飾(例如替代)的氨基酸殘基。在后一種技術中，在分子中每一個帶正電荷的殘基處導入突變，并且測定所得到的突變體分子的抗微生物活性以鑒定對于分子活性關鍵的氨基酸殘基。通過使用諸如核磁共振分析、晶體學或光親和標記法(見例如de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal of MolecularBiology 224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)的技術所確定的三維結構分析也能夠確定底物-酶相互作用的位點。
此外，通過導入核苷酸替換可以修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列，其中核苷酸替換不產生由核苷酸序列所編碼的多肽的另一種氨基酸序列但是符合打算產生酶的宿主生物的密碼子選擇。
通過使用本領域已知的任意方法的位點定向誘變可以實現將突變引入核苷酸序列中以便將一個核苷酸替換為另一個核苷酸。特別有用的是這樣一種方法，其利用具有目的插入片段的超螺旋、雙鏈DNA載體和包含所期望突變的兩個合成引物。在溫度循環期間通過Pfu DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，其中每條寡核苷酸引物與載體的相反鏈互補。一旦引物摻入，則產生了包含交錯缺刻的突變質粒。溫度循環之后，使用對甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產物以消化親本DNA模板并選擇出包含突變的合成DNA。還可以使用本領域已知的其它方法。對于核苷酸替換的概述見例如Ford等，1991，Protein Expression and Purification 295-107。
核酸構建體本發明還涉及包含本發明核苷酸序列的核酸構建體，其中所述核苷酸與能夠指導編碼序列在與控制序列相容條件下在適宜宿主細胞中表達的一種或多種控制序列有效連接。
為了使多肽表達，可以以多種方式操作編碼本發明多肽的核苷酸序列。在插入載體之前對多核苷酸進行操作可能是期望的或必需的，這取決于表達載體。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。
控制序列可以是適當啟動子序列，即在核苷酸序列表達時可被宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇宿主細胞中表現轉錄活性的任何核苷酸序列，其包括突變體啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的細胞外多肽或細胞內多肽的基因獲得。
用于指導本發明核酸構建體轉錄，尤其是在細菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的例子是從大腸桿菌lac操縱基因、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核的β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 753727-3731)獲得的啟動子以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。另外的啟動子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria”(ScientificAmerican，1980，24274-94)和Sambrook等，1989，見上。
用于指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的例子是從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶基因、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶基因、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)基因、米黑根毛霉脂肪酶基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉丙糖磷酸異構酶基因、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶基因和尖鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動子(WO 96/00787)以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)以及其突變啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子。
在酵母宿主中有用的啟動子是從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因獲得的啟動子。用于酵母宿主細胞的其它啟動子描述于Romanos等，1992，Yeast 8423-488。
控制序列還可以是適宜轉錄終止序列，即宿主細胞識別以終止轉錄的序列。終止序列與編碼多肽的核苷酸序列的3’末端有效連接。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何終止子可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α-葡糖苷酶基因和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的終止子。
用于酵母宿主細胞的優選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶基因、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)基因和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因獲得的終止子。用于酵母宿主細胞的其它終止子描述于Romanos等，1992，見上。
控制序列還可以是適宜前導序列，即對宿主細胞翻譯而言重要的mRNA非翻譯區域。前導序列有效連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何前導序列可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選前導序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶基因獲得的。
用于酵母宿主細胞的適宜前導序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子基因和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因獲得的。
控制序列還可以是多聚腺苷酸化序列，即有效連接于核苷酸序列3’末端并且在轉錄時被宿主細胞識別作為向所轉錄mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號的序列。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何多聚腺苷酸化序列可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選多聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因和黑曲霉α-葡糖苷酶基因獲得的。
Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述了對于酵母宿主細胞有用的多聚腺苷酸化序列。
控制序列還可以是信號肽編碼區，其中所述信號肽編碼區編碼連接于多肽氨基末端的氨基酸序列并且指導所編碼多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可內在地包含與編碼分泌性多肽的編碼區片段以翻譯閱讀框天然連接的信號肽編碼區。備選地，編碼序列的5’端可包含對編碼序列而言為外來的信號肽編碼區。當編碼序列在天然情況下不包含信號肽編碼區時，可能需要外來的信號肽編碼區。備選地，可以將外來的信號肽編碼區簡單地替換天然的信號肽編碼區以便增強多肽的分泌。然而，能夠指導所表達多肽進入所選擇宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區可用于本發明。
用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是從芽孢桿菌NCIB 11837麥芽糖淀粉基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因獲得的信號肽編碼序列。另一些信號肽描述于Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137。
用于絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、孤獨腐質霉(Humicola insolens)纖維素酶基因和柔毛腐質霉(Humicola lanuginoSa)脂肪酶基因獲得的。
用于酵母宿主細的信號肽編碼區是從釀酒酵母α-因子基因和釀酒酵母轉化酶基因獲得的。其它有用信號肽編碼區描述于Romanos等，1992，見上。
控制序列還可以是編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽編碼區。得到的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下稱為酶原(zymogen))。多肽原通常為非活性的并且可通過將前肽從多肽原中催化性切下或自催化性切下而轉換為成熟的活性多肽。前肽編碼區可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)基因、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)基因、釀酒酵母α-因子基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因和Myceliphthorathermophila漆酶基因(WO 95/33836)獲得。
當信號肽和前肽區均出現于多肽的氨基末端時，則前肽區位于多肽氨基端而信號肽區位于前肽區的氨基端。
添加使多肽表達相對于宿主細胞生長而受到調節的調節序列也是適當的。調節系統的實例是那些對化學刺激或物理刺激(包括調節性化合物的存在)做出反應從而引起基因表達開啟或關閉的系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac和trp操縱基因系統。在酵母中可使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKAα淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可用作調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的調節序列。在真核系統中，這些調節序列包括能夠在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在下擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調節序列有效連接。
表達載體本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組表達載體。上面所述的各種核苷酸和控制序列可以連接在一起以產生重組表達載體，該重組表達載體可以包含一個或多個適宜的限制性酶切位點以允許編碼多肽的核苷酸序列在此位點處插入或替換。備選地，通過將包含該序列的核苷酸序列或核酸構建體插入用于表達的適當載體中可以表達本發明的核苷酸序列。在構建表達載體時，編碼序列位于載體內從而使編碼序列與用于表達的適當控制序列有效連接。
重組表達載體可以是能夠方便進行重組DNA步驟并且能夠引起核苷酸序列表達的任意載體(例如質粒或病毒)。對載體的選擇一般取決于載體與載體將要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環狀的質粒。
載體可以是自主復制型載體，即載體作為染色體外的實體而存在，它的復制獨立于染色體的復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。
載體可以以任意方式保證自我復制。備選地，當導入宿主細胞時載體可以整合入基因組并與其已經整合入的染色體一起復制。而且，可以使用單一載體或質粒或者兩個或多個載體或質粒(共同包含待導入宿主細胞基因組的總DNA)或者轉座子。
本發明載體優選包含允許對轉化細胞進行容易篩選的一個或多個選擇標記。選擇標記是其基因產物可提供對殺生物劑或病毒抗性、對重金屬抗性、針對營養缺陷型的原養型等等的基因。
細菌選擇標記的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環素抗性的標記。用于酵母宿主細胞的適當標記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及其等效物。
優選地用于曲霉屬(Aspergillus)細胞的標記是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明載體優選地包含允許載體穩定整合入宿主細胞基因組或者載體在細胞內獨立于基因組之外自主復制的元件。
對于整合入宿主細胞基因組，載體依賴于編碼多肽的核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組將載體穩定整合入基因組的載體的任意其它元件。備選地，載體可以包含用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列能夠使載體在染色體內的精確位置整合入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件將優選地包含足夠數量的核苷酸，例如100-1,500個堿基對、優選400-1,500個堿基對并且最優選800-1,500個堿基對，其與相應靶序列高度同源以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可以是非編碼核苷酸序列或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合入宿主細胞基因組。
對于自主復制，載體可以進一步包含使載體在所述宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的例子是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點和允許在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的例子是2micron復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合。復制起點可以具有突變，該突變使其在宿主細胞中以溫度敏感方式起作用(見例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751433)。
可以將一個以上拷貝的本發明核苷酸序列插入到宿主細胞中以增加基因產物的生產。核苷酸序列拷貝數的增加可以通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組獲得或者通過包含與核苷酸序列在一起的可擴增選擇標記基因獲得，在第二種情況下通過在適當選擇劑存在下培養細胞能夠篩選出包含擴增拷貝選擇標記基因并因此包含附加拷貝核苷酸序列的細胞。
用于連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法對于本領域技術人員是眾所周知的(見例如Sambrook等，1989，見上)。
宿主細胞本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組宿主細胞，其方便地用于多肽的重組生產。如先前所描述，將包含本發明核苷酸序列的載體導入宿主細胞從而使載體作為染色體整合體或作為自主復制染色體外載體得以維持。
宿主細胞可以是單細胞微生物例如原核生物，或者是非單細胞微生物例如真核生物。
有用的單細胞是細菌細胞例如革蘭氏陽性細菌(包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、Bacillus lautus、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)；或者鏈霉菌屬(Streptomyces)細胞例如變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus))或者革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonas sp)。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優選的實施方案中，桿菌細胞是嗜堿性芽孢桿菌。
通過例如原生質體轉化(見例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168111-115)、使用感受態細胞(見例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(見例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)或者接合作用(見例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)可以實現載體向細菌宿主細胞的導入。
宿主細胞可以是真核生物例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。
在優選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。如文中所使用“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，同上，第171頁中所引用)和全部有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
在更加優選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。如此處所使用的“酵母”包括產子囊酵母(內孢霉目(Endomycetales))、產擔孢子目酵母(basidiosporogenous)和屬于半知菌類的酵母(芽酵母屬(Blastomycetes))。由于酵母的分類將來可能發生變化，為了本發明的目的，酵母應當如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，編者，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述進行定義。
在甚至更加優選的實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或亞羅酵母屬(Yarrowia)細胞。
在最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最選的實施方案中，酵母宿主細胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)細胞。
在另一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有絲狀真菌(如Hawksworth等，1995，見上，所定義)。絲狀真菌的特征為具有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復雜多糖構成的菌絲壁。營養生長通過菌絲延長進行并且碳代謝是專性需氧。與此不同，酵母例如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽進行并且碳代謝可以是發酵。
在甚至更加優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是如頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢霉屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)各種的細胞，但不限于此。
在最優選實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細胞。在甚至最優選的實施方案中，所述的絲狀真菌母細胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)細胞。在另一個最優選的實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細胞是孤獨腐質霉、柔毛腐質霉、米黑毛霉(Mucormiehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、長柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)、李氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)細胞。
真菌細胞可通過包括原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的方法以本身已知的方式轉化。適用于轉化曲霉屬宿主細胞的方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 811470-1474。適用于轉化鐮孢霉屬各種的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787。對酵母的轉化可使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編者，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187頁，Academic Press，Inc.，New York中)；Ito等，1983，Journal of Bacteriology153163以及Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 751920中描述的方法進行。
生產方法本發明還涉及用于產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養宿主細胞；和(b)回收多肽。
在本發明的生產方法中，使用本領域已知的方法將細胞培養于適宜多肽產生的營養培養基中。例如，可以通過在實驗室或工業發酵罐內于適宜培養基中并且在允許多肽表達和/或分離的條件下進行搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、補料分批發酵或固態發酵)培養細胞。使用本領域已知的方法在包含碳和氮源和無機鹽的適宜營養培養基中進行培養。適宜培養基可從商品供應商獲得或者按照已公布的組成制備(例如在美國典型培養物保藏中心的產品目錄中公布的組成)。如果多肽分泌入營養培養基，則可以直接從培養基回收多肽。如果多肽不分泌，則可以從細胞裂解物回收多肽。
使用本領域已知的對多肽特異的方法檢測多肽。這些檢測方法包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或者酶底物的消失。例如，如文中所描述酶測定法可以用于測定多肽活性。
通過本領域已知的方法可以回收所得到的多肽。例如，通過包括但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發或沉淀的常規方法可以從營養培養基中回收多肽。
可以通過本領域已知的各種方法純化本發明多肽，所述方法包括但不限于層析法(例如離子交換層析、親和層析、疏水層析、色譜聚焦層析和大小排阻層析)、電泳方法(例如制備型等電聚焦電泳)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(見例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
植物本發明還涉及轉基因植物、植物部分或植物細胞，它們已經用編碼具有本發明抗微生物活性的多肽的核苷酸序列進行轉化以便以可回收量表達并產生多肽。可以從植物或植物部分回收多肽。備選地，包含重組多肽的植物或植物部分可以用于提高食品或飼料的質量(例如提高營養價值、適口性和流變學特性)或者為了破壞抗營養因子。回收的多肽、植物或植物部分還可以用于改善或改變動物和家畜中的消化菌群。
轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例為草例如牧草(藍草，禾本科)、飼料草如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、溫帶草如Agrostis和谷類如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁和玉蜀黍(玉米)。
雙子葉植物的實例為煙草、馬鈴薯、甜菜、豆類如羽扇豆、豌豆、扁豆和大豆、十字花科植物(十字花科(Brassicaceae))如花椰菜、油菜，以及關系密切的模式生物擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的實例為莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖。特殊植物組織如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細胞質也認為是植物部分。此外，任何植物細胞無論組織來源如何也認為是植物部分。
此類植物、植物部分和植物細胞的后代也包括于本發明范圍之內。
按照本領域已知的方法可以構建表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞。簡言之，通過將編碼本發明多肽的一個或多個表達構建體整合入植物宿主基因組并將所得到的修飾的植物或植物細胞繁殖成為轉基因植物或植物細胞而構建植物或植物細胞。
方便地，表達構建體是包含編碼本發明多肽的核苷酸序列的核酸構建體，其中核苷酸序列與在所選則植物或植物部分中表達核苷酸序列所需要的適當調控序列有效連接。此外，表達構建體包含用于鑒定表達構建體已經整合入其中的宿主細胞的選擇標記和將構建體導入所述植物所必需的DNA序列(后者取決于所使用的DNA導入方法)。
對調控序列如啟動子和終止子序列以及任選地信號或轉運序列的選擇要基于例如期望多肽在何時、何處和如何表達來確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或可誘導的，或者可以是發育、時期或組織特異性的，并且基因產物可以靶向于特異組織或植物部分如種子或葉。調控序列描述于例如Tague等，1988，Plant Physiology 86506。
對于組成型表達，可以使用35S-CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell 21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯存庫組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)或來自代謝庫組織如分生組織(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)的啟動子，種子特異性啟動子如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)、來自蠶豆(Vicia faba)豆球蛋白B4和未知種子蛋白質基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)、來自種子油體蛋白質的啟動子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)、來自歐洲油菜(Brassica napus)的貯存蛋白質napA啟動子或者本領域已知的任意其它種子特異性啟動子例如WO 91/14772中描述的啟動子。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子例如來自水稻和番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)，或者創傷誘導啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecular Biology 22573-588)。
啟動子增強子元件也可以用于實現酶在植物中較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu等(1993，同上)公開了水稻肌動蛋白1基因的第一個內含子用于增強表達的用途。
選擇標記基因和表達構建體的任意其它部分可以從本領域可利用的那些進行選擇。
按照本領域已知的常規技術將核酸構建體整合入植物基因組，所述技術包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等，1989，Nature 338274)。
目前，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的基因轉移是選擇用于產生轉基因雙子葉植物的方法(對于綜述見Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)。然而該方法也能夠用于轉化單子葉植物，盡管其它轉化方法對于這些植物通常是優選的。目前，選擇用于產生轉基因單子葉植物的方法是胚胎愈傷組織或發育胚胎的粒子轟擊(用轉化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)(Christou，1992，PlantJournal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10667-674)。轉化單子葉植物的備選方法是Omirulleh等(Plant Molecular Biology，1993，21415-428)所描述的基于原生質體的轉化。
在轉化之后，按照本領域眾所周知的方法選擇出其中整合有表達構建體的轉化體并將轉化體再生成為完整植物。
本發明還涉及產生本發明多肽的方法，其包括(a)在易于產生多肽的條件下培養包含編碼多肽(具有本發明抗微生物活性)的核苷酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收多肽。
組合物在更進一步的方面，本發明涉及包含本發明抗微生物多肽的組合物，例如藥物組合物。
組合物可以包含作為主要多肽成分的本發明多肽，例如單一成分組合物。備選地，組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
組合物可以進一步包含另一種藥物活性試劑，例如另外的殺生物劑，例如表現為如上所述抗微生物活性的另一種抗微生物多肽。如本領域已知，殺生物劑可以是抗生素。抗生素種類包括青霉素類例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉素、羧芐青霉素、乙氧萘青霉素、氨芐青霉素等等；與β-內酰胺酶抑制劑頭孢菌素類相組合的青霉素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素類；氨基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹啉類；氯霉素；甲硝唑；大觀霉素；甲氧芐啶；萬古霉素等等。殺生物劑還可以是抗真菌劑，包括多烯類如兩性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn；和唑類如咪康唑、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。
在一個實施方案中，殺生物劑是非酶化學試劑。在另一個實施方案中，殺生物劑是非多肽化學試劑。
在殺生物劑的25％(w/w)水溶液中；優選地在10％(w/w)水溶液中；更加優選地在5％(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在1％(w/w)水溶液中；最優選地在0.5％(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.1％(w/w)水溶液中于20℃孵育8小時后(優選地4小時后，更加優選地2小時后，最優選地1小時后，并且具體而言30分鐘后)能夠將大腸桿菌(DSM 1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)的活細胞數量降低至1/100。
當加入1000ppm濃度的殺生物劑時；優選地當加入500ppm濃度的殺生物劑時；更加優選地當加入250ppm濃度的殺生物劑時；甚至更加優選地當加入100ppm濃度的殺生物劑時；最優選地當加入50ppm濃度的殺生物劑時；并且具體而言當加入25ppm濃度的殺生物劑時，殺生物劑能夠在25℃抑制大腸桿菌(DSM 1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)的生長達24小時。
可以選擇本發明抗微生物多肽和殺生物劑的組合物從而獲得協同抗微生物作用。
組合物可以包含適當載體物質。組合物還可以包含適宜遞送媒介物，當組合物用作藥物時所述媒介物能夠將本發明的抗微生物多肽遞送至預期位點。
組合物可以按照本領域已知的方法制備并且組合物可以是液體或干燥形式的組合物。例如多肽組合物可以是顆粒或微顆粒形式。按照本領域已知的方法可以使組合物所包含的多肽穩定。
下面給出了本發明多肽組合物的優選用途的例子。基于本領域已知的方法可以確定本發明多肽組合物的劑量和使用該組合物時的其它條件。
方法和用途本發明還包含本發明抗微生物多肽的多種用途。抗微生物多肽一般用于遭受細菌、真菌、酵母或藻類污染的任何場所。一般地，場所是水系統例如冷卻水系統、洗衣房漂洗水，油系統例如切削油、潤滑油、油田等等，在這些地方需要殺死微生物或者需要控制微生物生長。然而，本發明還用于已知抗微生物組合物有用的全部應用中，例如木材、乳膠、粘合劑、膠、紙張、硬紙板、織物、皮革、塑料、膩子膠和飼料的保護。
其它用途包括食品、飲料、化妝品如洗劑、乳膏、凝膠、軟膏、肥皂、洗發劑、調節劑、止汗劑、除臭劑、漱口劑、隱形眼鏡產品、酶制劑或食品成分的保藏。
因此，在例如痤瘡、眼睛或口腔感染、皮膚感染的治療中；在止汗劑或除臭劑中；在浴足鹽中；在對隱形眼鏡、堅硬表面、牙齒(口腔護理)、創傷、挫傷等等的清洗和消毒中，本發明抗微生物多肽可以用作消毒劑。
通常，可以預期本發明抗微生物多肽能夠用于任何堅硬表面的清洗、消毒或抑制微生物生長。可以方便地與本發明抗微生物多肽相接觸的表面的實例是在例如牛奶場、化學或藥物加工廠、水衛生系統、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠和冷卻塔使用的加工設備的表面。本發明抗微生物多肽應以一定量使用，該量可有效地對所述表面進行清洗、消毒或抑制微生物生長。
另外，可以預期本發明抗微生物多肽能夠方便地用于就地清洗(C.I.P.)系統以便清洗任何種類加工設備。
本發明抗微生物多肽還可以用于食品加工廠和任何準備食物或餐飲服務區域(如醫院、療養院、餐館特別是快餐館、熟食店等等)的表面清洗和烹調器具清洗。本發明抗微生物多肽還可以在食品制品中用作抗微生物劑，并且其作為乳酪、水果和蔬菜以及沙拉條食品中的表面抗微生物劑是特別有用的。
本發明抗微生物多肽還可以用作水性涂料中的防腐劑或消毒劑。
本發明抗微生物多肽還可以用于水系的微生物控制以及用于水的消毒，具體而言用于工業水的消毒。
本發明還涉及本發明抗微生物多肽或組合物用作藥物的用途。此外，本發明抗微生物多肽或組合物還可以用于制造控制或防止微生物(如真菌生物或細菌，優選革蘭氏陽性細菌)的藥物。
本發明組合物和抗微生物多肽還可以用作抗微生物獸用或人用治療劑或預防劑。因此，本發明組合物和抗微生物多肽可以用于制備治療微生物感染(如細菌或真菌感染，優選革蘭氏陽性細菌感染)的獸用或人用治療劑或預防劑。具體而言，微生物感染與肺病(包括但不限于結核病、肺炎和囊性纖維化)和性傳播疾病(包括但不限于淋病和衣原體)相關。
本發明組合物包含有效量的本發明抗微生物多肽。
當文中使用時，術語“有效量”旨在指足以抑制所述微生物生長的本發明微生物多肽的量。
本發明還涉及創傷愈合組合物或產品如繃帶、醫療用具如導管，并且進一步涉及抗皮屑頭發產品如洗發劑。
本發明抗微生物多肽的制劑可施用于患有或者易患微生物感染的宿主。施用可以是局部的、局限的或全身的，這取決于特定微生物，優選局限施用。通常，本發明抗微生物多肽劑量足以使微生物菌群減少至少大約50％，通常減少至少1個殺死對數級(log of killing)并且可以降低2個或更多個殺死對數級。可以以降低微生物種群同時使任何副作用最小化的劑量施用本發明化合物。可以預期，對于體內使用可以在醫師指導下獲得并使用組合物。本發明抗微生物多肽特別地用于殺死革蘭氏陰性細菌包括銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)和砂眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)和革蘭氏陽性細菌包括各種葡萄球菌和鏈球菌。
本發明抗微生物多肽對于殺死微生物的體外制劑也是有用的，特別是當人們不希望引入大量常規抗生素時。例如，本發明抗微生物多肽可以加入動物和/或人類食物制劑中；或者它們作為添加劑用于細胞體外培養以便防止微生物在組織培養中過度生長。
如實驗部分所詳細描述，通過體外測試可以確定特定微生物對本發明抗微生物多肽致死的敏感性。一般地，將各種濃度抗微生物多肽與微生物一起培養一段時間使蛋白質充分起作用，通常在大約1小時和1天之間。然后計數活的微生物并確定殺傷水平。
目的微生物包括但不限于革蘭氏陰性細菌例如檸檬酸細菌(Citrobacter sp.)；腸桿菌(Enterobacter sp.)；埃希氏菌(Escherichia sp.)，例如大腸桿菌；克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)；摩根氏菌(Morganella sp.)；變形菌(Proteus sp.)；普羅威登斯菌(Providencia sp.)；沙門氏菌(Salmonellasp.)例如傷寒沙門氏菌(S.typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌(Serratia sp.)；志賀氏菌(Shigella sp.)；假單胞菌(Pseudomonassp.)例如銅綠假單孢菌；耶爾森氏菌(Yersinia sp.)例如鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)，假結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西絲氏菌(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌(Pasturella sp.)；弧菌(Vibrio sp.)例如霍亂弧菌(V.cholerae)，副溶血弧菌(V.parahemolvticus)；彎曲桿菌(Campylobacter sp.)例如空腸彎曲菌(C.jejuni)；嗜血菌(Haemophilus sp.)例如流感嗜血菌(H.influenzae)，杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；博德特氏菌(Bordetella sp.)例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)，支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)，副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布魯氏菌(Brucella sp.)，奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)等等。其它目的細菌包括軍團菌(Legionella sp.)例如嗜肺軍團菌(L.pneumophila)；利斯特氏菌(Listeria sp.)例如單核細胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；枝原體(Mycoplasma sp.)例如人型枝原體(M.hominis)，肺炎枝原體(M.pneumoniae)；分枝桿菌(Mycobacterium sp.)例如鳥結核分枝桿菌(M.tuberculosis)，麻瘋分枝桿菌(M.leprae)；密螺旋體(Treponema sp.)例如蒼白密螺旋體(T.pallidum)；包柔螺旋體(Borrelia sp.)例如伯氏包柔螺旋體(B.burgdorferi)；鉤端螺旋體(Leptospirae sp.)；立克次氏體(Rickettsia sp.)例如立氏立克次氏體(R.rickettsii)，斑疹傷寒立克次氏體(R.typhi)；衣原體(Chlamydia sp.)例如砂眼衣原體，肺炎衣原體(C.pneumoniae)，鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；螺桿菌(Helicobacter sp.)例如幽門螺桿菌(H.pylori)等等。
非細菌性的目的病原體包括真菌和原生動物病原體，例如瘧原蟲(Plasmodia sp.)例如惡性瘧原蟲(P.falciparum)，錐蟲(Trypanosoma sp.)例如布氏錐蟲(T.brucei)；shistosomes；阿米巴(Entaemoeba sp.)，隱球酵母(Cryptococcus sp.)，假絲酵母(Candida sp.)例如白假絲酵母(C.albicans)等等。
可以采用多種方法施用。多肽制劑可以口服給藥，或者通過血管內、皮下、腹膜注射給藥、通過氣溶膠、眼(opthalmically)、膀胱內、局部給藥等等。例如通過吸入施用的方法是本領域述眾所周知的。取決于待施用特異性抗微生物多肽、疾病性質、施用頻率、施用方式、試劑從宿主的清除等等，治療制劑的劑量將可以在很大范圍內變動。起始劑量可以較大，隨后是較小的維持劑量。劑量可以每周或每兩周不頻繁施用，或者分成較小劑量且每日、每半周施用一次或幾次等等以便維持有效劑量水平。在許多情況下，口服施用比靜脈內施用需要更高劑量。可以修飾酰胺鍵以及氨基和羧基末端以便在口服施用時具有更大穩定性。例如，羧基末端被酰胺化。
制劑本發明化合物能夠摻入到用于治療性施用的各種制劑中。更加具體而言，本發明化合物能夠通過與適當藥用載體或稀釋劑組合按配方配制成藥物組合物，并且可以按配方制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑例如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟膏劑、乳膏劑、泡沫劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球劑、洗劑和氣霧劑。照此，化合物的施用能夠以多種方式進行，包括口服、頰部、直腸、胃腸外、腹膜內、真皮內、經皮、氣管內等等施用。本發明抗微生物多肽在施用后可以全身分布，或者可以通過使用能將活性劑量維持于植入位點的植入物或其它制劑使本發明抗微生物多肽在施用后局限分布。
在一個實施方案中，局部使用的制劑包含降低二價陽離子(具體而言是鈣和鎂)有效濃度的螯合劑。例如可以包括諸如檸檬酸鹽、EGTA或EDTA的試劑，其中優選檸檬酸鹽。檸檬酸鹽濃度通常大約1-10mM。
本發明化合物能夠單獨施用、彼此組合施用或者能夠與其它已知化合物(例如穿孔素、抗炎劑、抗生素等等)組合使用。在藥物劑型中，化合物可以以其可藥用鹽的形式施用。以下方法和賦形劑僅作為實例而不是限制本發明。
對于口服制劑，化合物能夠單獨使用或者與適當添加劑組合以制成片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，例如與常規添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉組合；與粘合劑如微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠組合；與崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂組合；以及如果期望的話還可以與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調味劑組合。
通過將化合物以及(如果期望)常規添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑在水或非水溶劑(如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇)中溶解、懸浮或乳化而配制成用于注射的制劑。
化合物可以制成氣霧劑制劑以便通過吸入施用。本發明化合物能夠配制成可增壓拋射劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。
化合物可以與常規添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑配制成洗劑以防止例如燒傷感染。
而且，可以將化合物與多種基質如乳化基質或水溶性基質相混合制成栓劑。本發明化合物能夠通過栓劑經直腸施用。栓劑包括諸如可可豆脂、碳蠟和聚乙二醇的媒介物，其在體溫下熔化而在室溫下固化。
可以提供用于口服或直腸施用的單位劑型如糖漿劑、酏劑和混懸劑，其中每種劑量單位如一茶匙、一大湯匙、片劑或栓劑包含預定量的含有一種或多種本發明化合物的組合物。同樣，用于注射或靜脈施用的單位劑型可以包含本發明化合物(作為無菌水溶液中的組合物)、生理鹽水或另一種可藥用載體。
用于緩釋制劑的埋植劑是本領域眾所周知的。埋植劑可按配方與生物可降解聚合物或非生物可降解聚合物配制成微球劑、板等等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主可良好耐受的易蝕聚合物。將包含本發明抗微生物多肽的埋植劑放置于感染位點附近，以致于活性成分的局部濃度高于身體其它部位。
如文中所使用，術語“單位劑型”指適宜作為用于人或動物受試者的單一劑量的物理不連續單位，每一單位包含預定量的本發明化合物以及可藥用稀釋劑、載體或媒介物，預定量為所計算出的足以產生預期效果的量。本發明單位劑量的規格取決于所使用特定化合物和打算獲得的效果，以及與宿主中的化合物相關的藥效學。
可藥用賦形劑如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑是公眾可以得到的。而且，可藥用輔助物質如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑、穩定劑、潤濕劑等等是公眾可以得到的。
全身施用的一般劑量范圍為每次每公斤受試者體重0.1pg-100毫克。一般劑量為每次一個片劑，每日2-6次，或者每次一個按比例增加活性成分含量的定時釋放膠囊或片劑，每日一次。使用在不同pH值下溶解的膠囊材料，通過由滲透壓緩慢釋放的膠囊或者通過任何其它已知的控制釋放方法獲得定時釋放效果。
技術人員將容易意識到，劑量水平可以隨特異化合物的功能、癥狀的嚴重性和受試者對副作用的易感性而改變。一些特異化合物比其它化合物更有效。本領域技術人員通過多種方法可以容易地確定給定化合物的優選劑量。優選方法是測量給定化合物的生理效能。
脂質體用作遞送工具是目的方法之一。脂質體與靶位點的細胞融合并將腔內內容物遞送入細胞內。使用多種保持接觸的方法(如分離、粘合劑等等)，可以將脂質體與細胞保持接觸足夠的時間以便融合。在本發明的一方面，將脂質體設計成氣霧化經肺施用。使用介導膜融合的純化蛋白質或肽如仙臺病毒或流感病毒等等制備脂質體。脂類可以是已知形成脂質體的脂類的任意有用的組合，其中形成脂質體的脂類包括陽離子或兩性離子脂類如磷酯酰膽堿。剩余的脂類通常是中性或酸性脂類，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等等。
為了制備脂質體，可以使用Kato等(J.Biol.Chem.1991，2663361)所描述的方法。簡言之，將脂類和包含肽的腔內組合物組合于適宜水介質中，方便地為總固體量為重量的大約1-10％的鹽介質。大約5-60秒的短時間劇烈振蕩后，將管置于大約25-40℃的溫水浴中，并且重復該循環大約5-10次。然后將組合物超聲達適宜時間，通常大約1-10秒，并且通過渦旋振蕩進一步攪動。然后加入水介質以擴大體積，通常增加大約1-2倍的體積，隨后搖動并冷卻。該方法允許將高分子量分子摻入腔內。
具有其它活性劑的制劑為了用于本發明方法，本發明抗微生物多肽可以與其它藥物活性劑、具體而言為其它抗微生物劑一起進行配制。如本領域已知，其它目的試劑包括廣泛多種的抗生素。抗生素的類別包括青霉素例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉素、羧芐青霉素、乙氧萘青霉素、氨芐青霉素等等；與β-內酰胺酶抑制劑頭孢菌素類組合的青霉素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素類；氨基糖苷類抗生素；四環素類；大環內酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹啉類；氯霉素；甲硝唑；大觀霉素；甲氧芐啶；萬古霉素等等。
抗霉菌劑也是有用的，其包括多烯類如兩性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn；和唑類如咪康唑、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。抗結核藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。本發明抗微生物多肽制劑也可以包括細胞因子，例如干擾素γ、腫瘤壞死因子α、白介素12等等。
體外合成本發明抗微生物肽可以使用如本領域已知的常規方法體外合成制備。可以獲得多種商業化的合成裝置例如Applied Biosystems Inc.、Beckman等的自動化合成儀。通過使用合成儀可以將天然存在氨基酸替換為非天然氨基酸，特別是D-異構體(或D-型)如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構體、具有不同長度或功能性的側鏈等等。特定序列和制備方式將根據方便性、經濟狀況、所需純度等等確定。
可以向包含適宜功能性的多種肽或蛋白質提供化學交聯以便結合，例如氨基用于形成酰胺或取代酰胺如還原性胺化作用、巰基用于形成硫醚或二硫化物、羧基用于形成酰胺等等。
如果期望，在合成或表達過程中可以將多種基團引入肽內，這允許與其它分子或表面連接。因此半胱氨酸能夠用于產生硫醚、組氨酸用于與金屬離子絡合物連接、羧基用于形成酰胺或酯、氨基用于形成酰胺等等。
按照重組合成的常規方法還可以分離并純化多肽。裂解物可以是從表達宿主制備的并且可以使用HPLC、大小排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術純化裂解物。對于絕大部分，相對于產物制備方法及其純化相關的污染物，所使用的組合物以重量計將包含至少20％的目的產物，更加通常至少大約75％，優選地至少大約95％，并且為了治療目的通常至少大約99.5％。通常，百分比以總蛋白質為基礎。
動物飼料本發明還涉及將具有抗微生物活性的多肽用于動物飼料的方法，以及包含本發明抗微生物多肽的飼料組合物和飼料添加劑。
術語動物包括全部動物，包括人類。動物的例子為非反芻動物和反芻動物如奶牛、綿羊和馬。在特定實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物例如豬或豬類(包括但不限于小豬、生長豬和母豬)；家禽例如火雞和小雞(包括但不限于燒烤雞、母雞)；年幼小牛；和魚(包括但不限于鮭魚)。
術語飼料或飼料組合物意思是指適宜或旨在由動物攝入的任何化合物、制劑、混合物或者組合物。
在根據本發明的用途中，抗微生物多肽可以在喂食之前、之后或同時投喂于動物。優選同時投喂。
在一個特定實施方案中，對加入到飼料中或飼料添加劑中的形式的抗微生物多肽進行了充分限定。充分限定意思是指如通過大小排阻層析所確定抗微生物多肽制劑純度至少為50％(見WO 01/58275的實施例12)。在另一個特定實施方案中，如通過該方法所確定抗微生物多肽制劑純度至少為60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％或者至少95％。
充分限定的抗微生物多肽制劑是有利的。例如，正確地確定投喂基本上沒有其它抗微生物多肽干擾或污染的抗微生物多肽的劑量更加容易。術語正確地確定劑量具體而言是指獲得一致和恒定結果的目標以及基于預期效果優化劑量的能力。
然而，對于在動物飼料中的用途，抗微生物多肽不需要那種純度；它可以包含例如其它酶，在這種情況下其可以稱為抗微生物多肽制劑。
抗微生物多肽制劑能夠(a)直接加入飼料(或者直接用于植物性蛋白的處理過程中)，或者(b)用于一種或多種中間組合物如隨后加入到飼料中的飼料添加劑或綜合微量添加劑(premix)的生產中(或者用于處理過程中)。上面所描述的純度的程度是指最初抗微生物多肽制劑的純度，而不管是否按照上面(a)或(b)使用。
使用重組生產方法尤其可以獲得該數量級純度的抗微生物多肽制劑，然而當抗微生物多肽是通過傳統發酵方法生產時，該數量級純度的抗微生物多肽制劑不易得到并且還存在批次間差異。
當然此種抗微生物多肽制劑可以與其它酶混合。
如文中所使用，術語植物蛋白是指包含至少一種衍生于或來源于植物的蛋白質(包括修飾蛋白質和蛋白質衍生物)的任何化合物、組合物、制劑或混合物。在特定實施方案中，植物蛋白的蛋白質含量為至少10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物蛋白可以從植物性蛋白質來源如豆類和谷類得到，例如來自豆科(Fabaceae(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。
在特定實施方案中，植物性蛋白質來源是來自一種或多種豆科植物如大豆、羽扇豆、豌豆或扁豆的材料。
在另一個特定實施方案中，植物性蛋白質來源是來自一種或多種藜科植物如甜菜、糖甜菜、菠菜或昆諾阿藜的材料。
植物性蛋白質來源的其它例子是油菜籽和甘藍。
大豆是優選的植物性蛋白質來源。
植物性蛋白質來源的其它例子是谷類例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、水稻和高梁。
當抗微生物多肽是相對純的抗微生物多肽時能夠以任何形式加入到飼料，或者與其它旨在添加到動物飼料中的其它成分相混合，即以動物飼料添加劑(例如所謂的動物飼料綜合微量添加劑)的形式。
在本發明的另一方面涉及用于動物飼料的組合物，例如動物飼料和動物飼料添加劑如綜合微量添加劑。
除了包含本發明抗微生物多肽之外，本發明動物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種微量礦物質(trace mineral)和/或至少一種巨量礦物質(macro mineral)。
此外，任選地，飼料添加成分是著色劑、芳香化合物、穩定劑和/或至少一種選自肌醇六磷酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4的其它酶。
在一個特定實施方案中，這些其它酶是充分限定的(如上對抗微生物多肽制劑所限定)。
其它抗微生物肽(AMP)的例子是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、Defensin、Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer，2000)或者保留抗微生物活性的其變體或片段。
其它抗真菌多肽(AFP)的例子是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽，以及保留抗真菌活性的其變體或片段，如在WO 94/01459和PCT/DK02/00289[一旦公布則替換成WO編號]中所描述。
通常脂溶性和水溶性微生素以及微量礦物質形成了旨在添加到飼料中的所謂綜合微量添加劑的部分，而巨量礦物質通常分開加入到飼料中。當組合物中富含本發明抗微生物多肽時，任一種類型的這些組合物是本發明的動物飼料添加劑。
在特定實施方案中，在動物餌料或飼料中旨在包含(或規定必須包含)0.01-10.0％、更加具體而言0.05-5.0％或者0.2-1.0％(％意思是每100g飼料中添加劑的克數)水平的本發明動物飼料添加劑。特別是對于綜合微量添加劑情況如此。
以下是這些組分的非排外性實例清單
脂溶性維生素的例子是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K如維生素K3。
水溶性維生素的例子是維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸如D-泛酸鈣。
微量礦物質的例子是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
巨量礦物質是鈣、磷和鈉。
這些組分的營養需求(以家禽和小豬/豬為例)列于WO 01/58275的表A中。營養需求意思是指這些組分將以所指定濃度提供于餌料中。
在另一方面，本發明動物飼料添加劑包含至少一種在WO 01/58275表A中所指定的個別組分。至少一種意思是指1種、或2種、或3種、或4種等等直到全部13種、或者直到全部15種個別組分中的任一種、一種或多種。更加明確地說，本發明添加劑中所包含的該至少一種個別組分的量能夠提供在表A第4列、或第5列、或第6列所指定范圍內的飼料內濃度。
本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或餌料具有相對高含量的蛋白質。如在WO 01/58275中表B第2-3列所指出，對家禽和豬的飼料進行特征描述。如在表B第4列所指出，對魚類餌料進行特征描述。此外，此類魚類餌料通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根據本發明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白質含量，并且此外還包含至少一種如文中所要求權利保護的抗微生物多肽。
此外，或者作為(對于上面所指出的粗蛋白質含量的)選擇，本發明動物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的可利用的磷含量；和/或0.1-100g/kg的蛋氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的蛋氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。
在特定實施方案中，可代謝能量、粗蛋白質、鈣、磷、蛋氨酸、蛋氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量處于WO 01/58275表B中第2、3、4或5列(R.2-5)的任意一個的范圍內。
粗蛋白質計算為氮(N)乘以系數6.25，即粗蛋白質(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通過Kjeldahl方法確定氮含量(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，WashingtonDC)。
基于NRC出版物豬的營養需求(Nutrient requirements in swine)(第9次修訂版，1988，國家研究委員會，農業委員會，動物營養委員會，豬營養小組委員會，National Academy Press，Washington，D.C.，第2-6頁)和歐洲家禽飼料能量值表(the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs)(Spelderholt centre for poultry research and extension，7361DA Beekbergen，荷蘭Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5)計算可代謝能量。
對完全動物餌料中鈣、可利用磷和氨基酸的餌料內含量的計算基于飼料表例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，、CentralVeevoederbureau，Runderweg 6，8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7。
在一個特定實施方案中，本發明動物飼料組合物包含至少一種如上所定義的植物性蛋白質或蛋白質來源。
在另一個特定實施方案中，本發明動物飼料組合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高梁；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％魚粉；和/或0-20％乳清。動物餌料能夠加工成例如搗碎飼料(非顆粒)或顆粒飼料。一般地，磨碎的飼料是混合的，并且根據對所述物種的規范添加足夠量的必需維生素和礦物質。酶可以作為固體或液體酶制劑加入。例如固體酶制劑一般在混合步驟之前或混合步驟過程中加入；而液體酶制劑一般在粒化步驟之后加入。酶還可以摻入到飼料添加劑或綜合微量添加劑中。
餌料中最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白質/kg餌料的范圍內，例如在5-30mg酶蛋白質/kg動物餌料的范圍內。
抗微生物多肽可以以下列量(劑量范圍)的一種或多種施用0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10-全部這些范圍為每千克飼料中的抗微生物多肽蛋白質毫克數(ppm)。
為了確定每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質的毫克數，從飼料組合物純化抗微生物多肽，并且使用相關測定法(見下面抗微生物活性、底物和測定法)確定所純化抗微生物多肽的特異活性。照此使用相同測定法還可確定飼料組合物的抗微生物活性，并且基于這兩次測定可計算出每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質毫克數的劑量。
也可使用相同原理確定飼料添加劑中的抗微生物多肽蛋白質的毫克數。當然，如果用于制備飼料添加劑或飼料的抗微生物多肽樣品是可以得到的，則可以從該樣品中測定特異活性(不需要從飼料組合物或添加劑純化抗微生物多肽)。
清潔劑組合物本發明的抗微生物多肽可添加至洗滌劑組合物中并且因此成為它們的一種組分。
本發明的洗滌劑組合物可以配制成例如手洗或機洗衣物洗滌劑組合物(其包含適用于預處理臟織物的衣物添加劑組合物和漂洗加入的織物柔軟劑組合物)，或者配制成用于一般家居硬質表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制成用于手工用或機器用洗碟操作的洗滌劑組合物。
在一個特定方面，本發明提供了包含本發明抗微生物多肽和表面活性劑的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或過氧化物酶(例如鹵素過氧化物酶)。
通常，所選則酶的特征應當與所選擇洗滌劑相容(例如最佳pH、與其它酶或非酶成份的相容性等等)，并且酶應當以有效量存在。
蛋白酶適宜蛋白酶包括那些動物來源、植物來源或微生物來源的蛋白酶。優選微生物來源的蛋白酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，尤其是源自芽孢桿菌屬的那些枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(如豬或牛來源)和在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的鐮孢霉屬蛋白酶。
有用蛋白酶的實例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的變體，尤其在如下位置存在一個或多個替代的變體第27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274位。
脂肪酶適宜脂肪酶包括那些細菌來源或真菌來源的脂肪酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。有用脂肪酶的實例包括來自腐質霉屬(同義詞嗜熱真菌屬)如在EP 258 068和EP 305 216中描述的柔毛腐質霉或者在WO 96/13580中描述的孤獨腐質霉的脂肪酶；假單胞菌脂肪酶如來自產堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種SD 705菌株(Pseudomonas sp.strain SD 705)(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶如來自枯草芽胞桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(WO91/16422)的脂肪酶。
另一些實例是如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶變體。
淀粉酶適宜淀粉酶(α和/或β)包括那些細菌來源或真菌來源的淀粉酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。淀粉酶包括例如自芽孢桿菌如更加詳細描述于GB 1,296,839中的地衣芽孢桿菌特定株獲得的α-淀粉酶。
有用淀粉酶的實例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的變體，尤其在如下位置存在一個或多個替代的變體第15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444位。
纖維素酶適宜纖維素酶包括那些細菌來源或真菌來源的纖維素酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。適宜纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼屬、頂孢霉屬的纖維素酶，例如公開于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US5,776,757和WO 89/09259中的由孤獨腐質霉、Myceliphthora thermophila和尖鐮孢產生的真菌纖維素酶。
尤其適合的纖維素酶是助于護色的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纖維素酶。另一些實例是在WO 94/07998、EP 0 531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體。
過氧化物酶/氧化酶適宜過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。有用過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬(Coprinus)如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶以及在WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中描述的它們的變體。
通過添加包含一種或多種酶的單獨添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，使洗滌劑組合物中包含洗滌劑酶。本發明的洗滌劑添加劑(即單獨添加劑或組合添加劑)可配制成顆粒、液體、漿夜等。優選的洗滌劑添加劑制劑是顆粒(尤其為非塵狀顆粒)、液體(尤其是穩定液體)或漿液。
非塵狀的顆粒可例如按照US 4,106,991和4,661,452中所公開那樣產生并且可任選地通過本領域已知的方法包衣。蠟質包衣材料的實例是平均分子量為1000-20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；在醇中包含12-20個碳原子并且存在15-18個環氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸以及脂肪酸的單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。適用于通過流化床技術形成膜的包衣材料的實例在GB 143591中給出。液體酶制劑可以根據已建立方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸進行穩定處理。經保護的酶可根據在EP238,216中公開的方法制備。
本發明的洗滌劑組合物可為任何方便形式，如棒狀、片狀、粉末、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水液體，一般含有高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或者是非水液體。
洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是包括半極性在內的非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑水平一般為重量的0.1％-60％。
當在洗滌組合物中包含陰離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約1％至大約4％的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鈉、α烯烴磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α硫代脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。
當在洗滌組合物中包含非離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約0.2％至大約40％的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。
洗滌劑可以包含0-65％的助洗劑或絡合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或層狀硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。聚合物的實例是羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N-氧化物、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可以包含含有過氧化氫源如過硼酸鹽或過碳酸鹽的漂白系統，其中所述過氧化氫源可與形成過酸的漂白激活物如四乙酰基乙二胺或壬酰羥苯磺酸鹽混合。備選地，漂白系統可包含例如酰胺型、二酰亞胺型或砜型的過氧酸。
本發明洗滌劑組合物中的酶(類)可使用常規穩定劑進行穩定，穩定劑如多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且組合物可以按照如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。
洗滌劑還可以包含其它常規洗滌劑成份例如織物調節劑，包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防塵污再沾著劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑或香料。
目前考慮按照相當于每升洗滌液體0.01-100毫克酶蛋白、優選每升洗滌液體0.05-10毫克酶蛋白、更加優選每升洗滌液體0.1-5毫克酶蛋白并且最優選每升洗滌液體0.1-1毫克酶蛋白的量向洗滌劑組合物中加入任意酶和本發明的抗微生物多肽。
本發明的抗微生物多肽可以額外加入到WO 97/07202中所公開的洗滌劑配方中，該專利文中引用作為參考。
通過以下實施例進一步描述本發明，這些實施例將不構成對本發明范圍的限制。
實施例用作緩沖液和底物的化學試劑是至少試劑級的商業化產品。
實施例1合成的抗微生物肽的設計、構建和評價為了研究和設計具有有效抗微生物活性的新的AMP，構建了一系列假定的AMP。選擇3個相鄰精氨酸置于6個連續的四氨基酸重復之前。基于其膜相互作用能力和在天然的PR富含肽中的豐度，選擇苯丙氨酸作為系列最初的疏水殘基(Z1-Z12)。這導致形成12種不同的衍生物，將衍生物指定為SEQ ID NO1至SEQ ID NO12(見表1)。
從12條特異寡核苷酸(引物1至引物12)合成了編碼SEQ ID NO1至SEQ ID NO12的12個基因，每一個編碼一條肽。通過互補引物(引物13)在標準PCR反應中進行5輪循環的聚合作用將單鏈寡核苷酸轉變成雙鏈DNA。NcoI DNA限制性酶切位點(加下劃線)位于引物近端部分而XbaI限制性酶切位點(加下劃線)位于引物遠端部分-這些位點用于克隆入相應表達載體pBAD/gIIIA(Invitrogen，美國)。
引物1-SEQ ID NO1正向(SEQ ID NO320)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCGCC ACGTTTTCCA CCTCGTTTTC CACCTCGTTTCCCTCCACGT TTCCCTCCAC GCTTCCCACC TCGTTTCTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物2-SEQ ID NO2正向(SEQ ID NO321)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCACG TTTTCCACCT CGTTTTCCAC CTCGTTTCCCTCCACGTTTC CCTCCACGCT TCCCACCTCG TTTCCCGTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物3-SEQ ID NO3正向(SEQ ID NO322)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCGTTT TCCACCTCGT TTTCCACCTC GTTTCCCTCCACGTTTCCCT CCACGCTTCC CACCTCGTTT CCCGCCATAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物4-SEQ ID NO4正向(SEQ ID NO323)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTTTTCC ACCTCGTTTT CCACCTCGTT TCCCTCCACGTTTCCCTCCA CGCTTCCCAC CTCGTTTCCC GCCACGTTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物5-SEQ ID NO5正向(SEQ ID NO324)
CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCACG TCCTTTTCCG CGCCCTTTTC CACGTCCATTCCCTCGTCCT TTCCCACGCC CTTTTCCACG CCCATTCTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物6-SEQ ID NO6正向(SEQ ID NO325)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCGTCC TTTTCCGCGC CCTTTTCCAC GTCCATTCCCTCGTCCTTTC CCACGCCCTT TTCCACGCCC ATTCCCATAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物7-SEQ ID NO7正向(SEQ ID NO326)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCTTT TCCGCGCCCT TTTCCACGTC CATTCCCTCGTCCTTTCCCA CGCCCTTTTC CACGCCCATT CCCACGTTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物8-SEQ ID NO8正向(SEQ ID NO327)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTTTTCC GCGCCCTTTT CCACGTCCAT TCCCTCGTCCTTTCCCACGC CCTTTTCCAC GCCCATTCCC ACGTCCTTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物9-SEQ ID NO9正向(SEQ ID NO328)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCACC ATTTCGTCCA CCTTTCCGTC CTCCATTTCGCCCGCCGTTT CGGCCACCGT TTCGACCTCC TTTCCGTTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物10-SEQ ID NO10正向(SEQ ID NO329)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCATT TCGTCCACCT TTCCGTCCTC CATTTCGCCCGCCGTTTCGG CCACCGTTTC GACCTCCTTT CCGTCCATAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物11-SEQ ID NO11正向(SEQ ID NO330)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTTTTCG TCCACCTTTC CGTCCTCCAT TTCGCCCGCCGTTTCGGCCA CCGTTTCGAC CTCCTTTCCG TCCACCATAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物12-SEQ ID NO12正向(SEQ ID NO331)
CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCGTCC ACCTTTCCGT CCTCCATTTC GCCCGCCGTTTCGGCCACCG TTTCGACCTC CTTTCCGTCC ACCATTTTAA TTGCTCTAGAACAAAAACTC引物13-反向(SEQ ID NO332)GAGTTTTTGTTCTAGAGCAA TTA如國際專利申請WO 00/73433的實施例1中所公開，在自殺表達系統(SES)中測試了AMP的抗生素活性。該系統應用敏感宿主(這里為大腸桿菌)和具有可誘導啟動子的質粒(pBAD/gIIIA)。如果肽具有抗菌活性，肽合成的誘導將導致生產細胞的生長抑制和/或細胞死亡-因此為自殺表達系統。通常，抗微生物活性越強，所觀察到的抑制作用越強。
將12個雙鏈PCR片段進行純化，用XbaI和NcoI進行限制性酶切并將其克隆入pBAD/gIIIA，將它們轉化入大腸桿菌TOP10(Invitrogen)，并在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上重新劃線接種。SEQ IDNO1至SEQ ID NO12的各個克隆在37℃下生長于100微孔板(Honeycomb板)的150μl RM+0.2％葡萄糖+100μg/ml氨芐青霉素中，培養基在Bioscreen C(Thermosystems，芬蘭)中振蕩。
將過夜培養物在100孔honeycomb板中的150μl RM+0.2％甘油+100μg/ml氨芐青霉素(不含有或含有0.1％的誘導物(阿拉伯糖))中稀釋50倍。通過在37℃測量Bioscreen C中的OD450，每30分鐘監測一次細胞密度。生長抑制作用的百分比計算為每個樣品的終點OD測量值除以從包含對照載體的細胞中獲得的終點OD測量值并乘以100。方程式如下 其中“空白OD”對應于只有生長培養基的OD值。
合成AMP的氨基酸序列和相應生長抑制作用示于表1。
表1
如所預期，當缺乏誘導物時沒有觀察到抑制作用或者抑制作用非常小(數據未顯示)。當存在0.1％的誘導物時，全部合成AMP導致生長抑制。實施例2合成AMP在酵母中的表達將指定為SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的AMP克隆入酵母表達載體pHH3885。簡言之，pHH3885是基于pYES(Invitrogen)的酵母/大腸桿菌穿梭載體。該質粒包含2μ酵母復制起點和用于在酵母中篩選的Ura3基因。為了在大腸桿菌中繁殖使用了pUC起始和bla基因。表達由Gal啟動子控制，并且使用釀酒酵母α-前導序列介導肽分泌。
由于有效AMP的表達將殺死生產微生物，所以抗微生物活性必須被掩蓋。這可以使用能夠掩蓋對抗微生物活性至關重要的鄰近電荷的一段陰離子氨基酸實現。因此，所有3個AMP前面是一段天冬氨酸和谷氨酸(DDDDE)。由于一些蛋白酶特異地在谷氨酸殘基(E)之后切割，所以陰離子延伸段(stretch)能夠從AMP釋放出來以允許監測AMP的抗微生物活性。
在標準PCR反應中使用特異性正向引物和通用反向引物可以擴增指定為SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的PR富含AMP。由于正向寡核苷酸含有全部編碼信息所以不需要模板。
引物14-SEQ ID NO1正向(SEQ ID NO333)GTATCGATGG CCAAGAGAGA AGCCGACGAT GACGATGAAC GTCGCCGTCC GCCACGTTTTCCACCTCGTT TTCCACCTCG TTTCCCTCCA CGTTTCCCTC CACGCTTCCC ACCTCGTTTCTAGATGGCTC TAGAGGGCCG引物15-SEQ ID NO5正向(SEQ ID NO334)GTATCGATGG CCAAGAGAGA AGCCGACGAT GACGATGAAC GTCGCCGTCC ACGTCCTTTTCCGCGCCCTT TTCCACGTCC ATTCCCTCGT CCTTTCCCAC GCCCTTTTCC ACGCCCATTCTAGATGGCTC TAGAGGGCCG引物16-SEQ ID NO10正向(SEQ ID NO335)GTATCGATGG CCAAGAGAGA AGCCGACGAT GACGATGAAC GTCGCCGTCC ATTTCGTCCACCTTTCCGTC CTCCATTTCG CCCGCCGTTT CGGCCACCGT TTCGACCTCC TTTCCGTCCATAGATGGCTC TAGAGGGCCG引物17-反向(SEQ ID NO336)CGGCCCTCTA GAGCCATCTA使用BalI和XbaI限制性酶切雙鏈PCR片段并將其克隆入使用相同的兩種酶限制性酶切的pHH3885。將相應質粒轉化入大腸桿菌并測序。證實序列之后，將穿梭載體電轉化入釀酒酵母(JG169)并鋪在SC+2％葡萄糖+100μg/ml氨芐青霉素瓊脂平板上。
將酵母菌落重新劃線接種并在30℃下生長于5ml液體SC基礎培養基(添加2％葡萄糖)中3天。
通過以3500轉/分離心5分鐘沉淀細胞。取500μl轉移至microconYM-3離心過濾器(Millipore Corp.，美國)并通過離心將體積減少至大約20μl。將濃縮的樣品與Tricine加樣緩沖液混合并在16％Tricine凝膠(Novex，Invitrogen，美國)中分析。
在三份培養物的每一份中都觀察到清楚的具有預期分子量的條帶，表明表達了三種肽。在包含對照質粒的酵母細胞的上清液中沒有觀察到條帶。
實例例3SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10變體的評價SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10在突變高通量篩選中用作起始點以便獲得具有提高活性的AMP。為了簡單起見，SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10全部含有作為疏水殘基的苯丙氨酸。僅應用一種類型疏水氨基酸可能對抗微生物活性不是最適的；通過天然肽也說明了這一點，在天然肽中全部含有疏水殘基的混合。設計了簡并DNA寡聚體，其編碼4種疏水氨基酸的每一種而不是限制于苯丙氨酸。原則上，由于SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO10的每一個包含6個苯丙氨酸殘基，在理論上該庫能夠編碼46或4096種不同的變體。
如上使用一條編碼完整肽的長的正向引物(SEQ ID NO1簡并引物，SEQ ID NO5簡并引物和SEQ ID NO10簡并引物)和一條較小的用于合成反向鏈的反向引物(引物13)構建了該庫。N代表25％可能性的4種核苷酸(G、A、T和C)之一，以允許在指定位置摻入4種疏水氨基酸。
SEQ ID NO1簡并引物(SEQ ID NO337)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCGCC ACGTNTTCCA CCTCGTNTTC CACCTCGTNTCCCTCCACGT NTCCCTCCAC GCNTCCCACC TCGTNTCTAA TTGCTCTAGA ACAAAAACTC
SEQ ID NO5簡并引物(SEQ ID NO338)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCACG TCCTNTTCCG CGCCCTNTTC CACGTCCANTCCCTCGTCCT NTCCCACGCC CTNTTCCACG CCCANTCTAA TTGCTCTAGA ACAAAAACTCSEQ ID NO10簡并引物(SEQ ID NO339)CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCANT TCGTCCACCT NTCCGTCCTC CANTTCGCCCGCCGNTTCGG CCACCGNTTC GACCTCCTNT CCGTCCATAA TTGCTCTAGA ACAAAAACTC將DNA片段克隆入SES載體pBAD/gIIIA并轉化入大腸桿菌以產生三個獨立的庫，每個庫大約一百萬個菌落。
將該庫涂在平板上并使用菌落挑取儀從每個庫中挑取大約10,000個單獨菌落放入包含20×稀釋RM+200μg/ml氨芐青霉素的96孔微孔板中。將這些主板(master plate)復制接種于一套新的96孔板(包含20×稀釋RM培養基和0.1％或0％誘導物)中，并且于37℃培養過夜。從每個庫中分離許多最大生長抑制的克隆，將其測序并在Bioscreen C中重新測試其生長抑制作用。
SEQ ID NO1變體的氨基酸序列和相應生長抑制作用示于表2；SEQID NO5變體的氨基酸序列和相應生長抑制作用示于表3；并且SEQ IDNO10變體的氨基酸序列和相應生長抑制作用示于表4。
表2.SEQ ID NO1的變體和相應生長抑制作用
表3.SEQ ID NO5的變體和相應生長抑制作用
表4.SEQ ID NO10的變體和相應生長抑制作用
實施例4來自混合基序庫的合成的PR富含AMP的評價在實施例3中測試的AMP由簡并性的但在其它方面相同的重復組成。為了測試當將12種不同的“4氨基酸序列基序”混合成為一個序列時是否會產生有效AMP，構建了一個新的庫。在該系列中親本主鏈由以下序列基序組成PPRX、PRPX、PXRP、PPRX、PRPX和PXRP；其中X表示疏水氨基酸纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸的任意一個。再次使用等比率的疏水氨基酸。
如上面實施例3，使用一條長的編碼完整肽的正向引物(混合基序簡并引物)和較小的用于合成反向鏈的反向引物(引物13)構建了該庫。N代表25％可能性的4種核苷酸(G、A、T和C)之一。
混合基序簡并引物(SEQ ID NO340)
CCATAGCACC ATGGCGCGTC GCCGTCCGCC ACGTNTTCCA CGTCCTNTTC CANTTCGTCCACCGCCACGT NTTCCACGTC CTNTTCCANT TCGTCCATAA TTGCTCTAGA ACAAAAACTC將PCR合成的DNA片段克隆入SES載體pBAD/gIIIA并轉化進入大腸桿菌，產生了每個庫包含大約一百萬個菌落的庫。
將該庫涂在平板上并使用菌落挑取儀挑取大約10,000個單獨菌落放入包含20×稀釋RM+200μg/ml氨芐青霉素的96孔微孔板中。將這些主板復制接種于一套新的96孔板(包含20×稀釋RM培養基和0.1％或0％誘導物)中，并且于37℃培養過夜。分離許多最大生長抑制的克隆，將其測序并在Bioscreen C中重新測試其生長抑制作用。
來自混合基序庫的變體的氨基酸序列和相應生長抑制作用示于表5。
表5.具有混合基序的合成的PR富含AMP
實施例5所選擇肽的MIC、MBC和MEC的測定為了驗證在實施例1-4中所鑒定和描述肽的抗微生物潛能，測定了3種結構不同肽對一定范圍微生物的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)和最低效應濃度(MEC)。
選擇以下3種肽進行化學合成并測定其抗微生物潛能
PR-1(RRR-PRPV-PRPF-PRPV-PRPL-PRPF-PRPF)(SEQ ID NO61)PR-2(RRR-PFRP-PFRP-PFRP-PVRP-PVRP-PFRP)(SEQ ID NO79)PR-3(RRR-PPRL-PRPF-PVRP-PPRF-PRPF-PLRP)(SEQ ID NO239)測試微生物包括大腸桿菌(ATCC 10536)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、藤黃微球菌(M.luteus(ATCC 9341))、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)和釀酒酵母(ATCC 9763)。
按照稍加修改NCCLS方案進行MIC和MBC測定，其中所作的修改為將肽溶于0.01％醋酸和0.1％BSA中以避免在高濃度時肽沉淀并且使肽與塑料容器的結合最小化。按照Steinberg和Lehrer(Methods inMolecular Biology，第78卷Antibacterial Peptide Protocols)的方法在瓊脂糖彌散抗菌實驗(radial diffusion assay)裝置中測定MEC。MEC方案避免了與用NCCLS方案測試抗微生物肽相關的一些問題并且能夠提供非常靈敏的測試裝置。結果示于表6-8。
表6.MIC測定(全部數值為μg/ml)
表7.MBC測定(全部數值為μg/ml)
表8.MEC測定(全部數值μg/ml)
很明顯，三種PR富含肽在限定條件下對革蘭氏陽性微生物和革蘭氏陰性微生物具有廣譜活性。
實施例6PR-1、PR-2和PR-3的溶血活性分析了抗微生物肽溶解人紅細胞(hRBC)的能力。紅細胞檢驗測定法提供了評價測試材料的膜溶解活性的簡單測試系統。它適宜作為溶血特性的篩選測定。血紅蛋白釋放是一種有用的細胞膜完整性終點。通過測量540nm處的吸光度測定釋放的血紅蛋白。通常，計算出導致總溶解樣品50％溶血的濃度(HL50)；然而由于測試肽的低溶血活性，所以在本實施例中未計算該值。在本測試裝置中使用了8％的RBC懸浮液(12日齡)。
在表9中顯示了相對100％溶解樣品的各個溶血作用值。
表9.溶血作用值
由于肽溶解于0.01％醋酸中，所以還包括了0.01％醋酸的媒介物對照。在兩個板中都包括了含有25％、10％、5％的0.01％醋酸的PBS。在任一測試濃度都沒有觀察到與背景不同的溶血反應。
為了證實劑量/反應效應的存在，還測試了SDS的溶血活性。
表10.SDS劑量/反應值
三種測試肽變體PR-1、PR-2和PR-3在測定濃度下沒有顯示出與背景水平顯著不同的溶血特性。
在本測定中自發溶血作用水平高，可能是由于紅細胞年齡(12天)的原因。相對高水平的自發溶血作用不會影響產生這樣的結論，即三種肽在測試濃度是非溶血性的。
序列表<110>諾和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120>合成的抗微生物多肽<130>10275.204-WO<160>340<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>1Arg Arg Arg Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe20 25<210>2<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>2Arg Arg Arg Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro1 5 10 15Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro20 25<210>3<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>3
Arg Arg Arg Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg1 5 10 15Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro20 25<210>4<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>4Arg Arg Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe1 5 10 15Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg20 25<210>5<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>5Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>6<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>6Arg Arg Arg Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg1 5 10 15
Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro20 25<210>7<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>7Arg Arg Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro1 5 10 15Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg20 25<210>8<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>8Arg Arg Arg Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe1 5 10 15Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro20 25<210>9<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>9Arg Arg Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro1 5 10 15Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg20 25
<210>10<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>10Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>11<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>11Arg Arg Arg Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe1 5 10 15Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro20 25<210>12<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>12Arg Arg Arg Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg1 5 10 15Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe20 25<210>13<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>13Arg Arg Arg Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe20 25<210>14<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>14Arg Arg Arg Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Ile Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Arg Leu20 25<210>15<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>15Arg Arg Arg Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Ile Pro Pro Arg Leu Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Leu20 25<210>16<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>16Arg Arg Arg Pro Pro Arg Ile Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Val20 25<210>17<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>17Arg Arg Arg Pro Pro Arg Ile Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Leu20 25<210>18<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>18Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Ile20 25<210>19<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>19Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15
Pro Arg Ile Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Ile20 25<210>20<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>20Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val20 25<210>21<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>21Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val20 25<210>22<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>22Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe20 25
<210>23<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>23Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Phe20 25<210>24<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>24Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Phe20 25<210>25<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>25Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Ile20 25<210>26<211>27
<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>26Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Leu Arg Leu20 25<210>27<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>27Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Leu Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Pro Arg Val Pro Leu Val Ser Asn Cys Ser Arg Thr20 25 30Lys Thr His Leu Arg Arg Gly Ser Glu35 40<210>28<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>28Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>29<211>26
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>29Arg Arg Arg Pro Arg Leu Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg1 5 10 15Pro Leu Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Ile20 25<210>30<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>30Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Pro Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Leu20 25<210>31<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>31Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro His Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Ile20 25<210>32<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>32Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro His Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile20 25<210>33<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>33Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>34<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>34Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Leu20 25<210>35<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>35
Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe20 25<210>36<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>36Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Ile20 25<210>37<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>37Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val20 25<210>38<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>38Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15
Arg Pro Ile Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Ile20 25<210>39<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>39Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>40<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>40Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Val Pro Arg Pro Leu Pro Arg Pro Ile20 25<210>41<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>41Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Val Pro Arg Pro Leu Pro Arg Pro Val20 25
<210>42<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>42Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Leu Pro Arg Pro Ile20 25<210>43<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>43Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Val20 25<210>44<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>44Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Leu Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe20 25<210>45<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>46Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile20 25<210>47<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>47Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>48<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>48Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Val Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe20 25<210>49<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>51Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15
Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>52<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>52Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe20 25<210>53<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>53Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Val20 25<210>54<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>54Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Leu20 25
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<223>合成的抗微生物多肽<400>56Arg Arg Arg Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile20 25<210>57<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>57Arg Arg Arg Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>58<211>27
<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>59Arg Arg Arg Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Ile Pro1 5 10 15Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>60<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>60Arg Arg Arg Pro Arg Pro Ile Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>61<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>61Arg Arg Arg Pro Arg Pro Val Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe20 25<210>62<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>63Arg Arg Arg Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Pro Val Pro1 5 10 15Arg Pro Phe Pro Arg Pro Phe Pro Arg Gln Ser Asn Cys Ser Arg Thr20 25 30Lys Thr His Leu Arg Arg Gly Ser Glu35 40<210>64<211>27
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>64Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>65<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>65Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>66<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>66Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>67<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>67Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>68<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>68Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>69<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>69Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>70<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>70
Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>71<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>71Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>72<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>72Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>73<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>73Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15
Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>74<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>74Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>75<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>75Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>76<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>76Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25
<210>77<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>77Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>78<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>78Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>79<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>79Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>80<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>80Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>81<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>81Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>82<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>82Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>83<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>83Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>84<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>84Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25<210>85<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>85Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>86<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>86Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15
Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>87<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>87Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>88<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>88Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>89<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>89Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25
<210>90<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>90Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>91<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>91Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>92<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>92Arg Arg Arg Pro Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>93<211>27
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>93Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>94<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>94Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>95<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>95Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>96<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>96Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>97<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>97Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>98<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>98Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>99<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>99
Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>100<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>100Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>101<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>101Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>102<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>102Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15
Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>103<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>103Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro20 25<210>104<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>104Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25<210>105<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>105Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25
<210>106<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>106Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25<210>107<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>107Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>108<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>108Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>109<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>109Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>110<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>110Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>111<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>111Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>112<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>112Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Val Arg Pro20 25<210>113<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>113Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>114<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>114Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>115<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>115Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15
Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>116<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>116Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>117<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>118Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25
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<223>合成的抗微生物多肽<400>146Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Pro20 25<210>147<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>176Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25
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<223>合成的抗微生物多肽<400>184Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Leu Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>185<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>185Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>186<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>187Arg Arg Arg Pro Ile Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25<210>188<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>合成的抗微生物多肽<400>192Arg Arg Arg Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Val Arg Pro Pro Val Arg Pro Pro Phe Arg Pro20 25
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<223>合成的抗微生物多肽<400>282Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Leu Pro His Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>283<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>283Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25<210>284<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>284Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>285<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>285Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Arg Pro Phe Pro Val Arg Pro20 25<210>286<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>286Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Arg Pro Leu Pro Leu Arg Pro20 25<210>287<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>287Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Leu Pro Arg Pro Ile Pro Ile Arg Pro20 25<210>288<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>288Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Leu Arg Pro20 25<210>289<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>289Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15
Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Val Arg Pro20 25<210>290<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>290Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Leu Pro Leu Arg Pro20 25<210>291<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>291Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25<210>292<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>292Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25
<210>293<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>293Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Phe Pro Ile Arg Pro20 25<210>294<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>294Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Leu Arg Pro20 25<210>295<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>295Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Arg Pro Phe Pro Leu Arg Pro20 25<210>296<211>27
<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>296Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>297<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>297Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Ile Pro Val Arg Pro20 25<210>298<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>298Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Leu Arg Pro20 25<210>299<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>299Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>300<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>300Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Arg Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>301<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>301Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Leu Arg Pro20 25<210>302<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>302
Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>303<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>303Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Leu Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Leu Pro Ile Arg Pro20 25<210>304<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>304Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Ile Arg Pro20 25<210>305<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>305Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15
Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>306<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>306Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>307<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>307Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25<210>308<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>308Arg Arg Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25
<210>309<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>309Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>310<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>310Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>311<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>311Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25<210>312<211>27<212>PRT<213>人工的
<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>312Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Ile Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Phe Arg Pro20 25<210>313<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>313Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Ile Pro Ile Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro20 25<210>314<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>314Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Leu Pro Phe Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Phe Pro Arg Pro Ile Pro Phe Arg Pro20 25<210>315<211>27<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽
<400>315Arg Arg Arg Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Val Pro Val Arg Pro Pro1 5 10 15Pro Arg Ile Pro Arg Pro Phe Pro Val Arg Pro20 25<210>316<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>316Arg Arg Arg Thr Arg His Val Phe Ala Arg Pro Phe Pro Phe Arg Pro1 5 10 15Pro Pro Arg Ile Pro Arg Pro Phe Pro Leu Arg Pro20 25<210>317<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>317Arg Arg Arg Thr Arg His Val Phe Ala Arg Pro Val Pro Val Arg Pro1 5 10 15Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Val Arg Pro20 25<210>318<211>28<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成的抗微生物多肽<400>318Arg Arg Arg Thr Arg His Val Val Pro Arg Pro Leu Pro Val Arg Pro1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Pro Arg Pro Phe Pro Leu Arg Pro20 25<210>319<211>41<212>PRT<213>人工的<220>
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<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物3<400>322ccatagcacc atggcgcgtc gccgtcgttt tccacctcgt tttccacctc gtttccctcc60acgtttccct ccacgcttcc cacctcgttt cccgccataa ttgctctaga acaaaaactc 120<210>323<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物4<400>323ccatagcacc atggcgcgtc gccgttttcc acctcgtttt ccacctcgtt tccctccacg60tttccctcca cgcttcccac ctcgtttccc gccacgttaa ttgctctaga acaaaaactc 120<210>324<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物6<400>325ccatagcacc atggcgcgtc gccgtcgtcc ttttccgcgc ccttttccac gtccattccc 60tcgtcctttc ccacgccctt ttccacgccc attcccataa ttgctctaga acaaaaactc120<210>326<211>120<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物7<400>326ccatagcacc atggcgcgtc gccgtccttt tccgcgccct tttccacgtc cattccctcg 60tcctttccca cgcccttttc cacgcccatt cccacgttaa ttgctctaga acaaaaactc 120<210>327<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物10<400>329ccatagcacc atggcgcgtc gccgtccatt tcgtccacct ttccgtcctc catttcgccc 60gccgtttcgg ccaccgtttc gacctccttt ccgtccataa ttgctctaga acaaaaactc 120<210>330<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物11<400>330ccatagcacc atggcgcgtc gccgttttcg tccacctttc cgtcctccat ttcgcccgcc 60gtttcggcca ccgtttcgac ctcctttccg tccaccataa ttgctctaga acaaaaactc 120<210>331<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物12<400>331ccatagcacc atggcgcgtc gccgtcgtcc acctttccgt cctccatttc gcccgccgtt 60tcggccaccg tttcgacctc ctttccgtcc accattttaa ttgctctaga acaaaaactc120<210>332<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物13<400>332gagtttttgt tctagagcaa tta 23<210>333<211>140<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物15
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<221>misc_feature<222>(83)..(83)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_fcature<222>(95)..(95)<223>n為a，c，g或t<400>338ccatagcacc atggcgcgtc gccgtccacg tcctnttccg cgccctnttc cacgtccant 60ccctcgtcct ntcccacgcc ctnttccacg cccantctaa ttgctctaga acaaaaactc120<210>339<211>120<212>DNA<213>人工的<220>
<223>SEQ ID N010-簡并引物<220>
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<213>人工的<220>
<223>混合基序-簡并引物<220>
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<221>misc_feature<222>(89)..(89)<223>n為a，c，g或t<400>340ccatagcacc atggcgcgtc gccgtccgcc acgtnttcca cgtcctnttc canttcgtcc 60accgccacgt nttccacgtc ctnttccant tcgtccataa ttgctctaga acaaaaactc120
權利要求
1.具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；并且其中X1-X5中最多4個是相同的。
2.權利要求1的多肽，其中X1、X2、X3、X4和X5選自氨基酸序列P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P和R-P-P-Z12；其中除了Z1-Z12氨基酸以外X1-X5是相同的；并且其中Z1-Z12選自氨基酸F、L、V和I。
3.權利要求1的多肽，其包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6；其中X1、X2、X3、X4、X5和X6中的每一個選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；并且其中X1-X6中最多4個是相同的。
4.權利要求3的多肽，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6選自氨基酸序列P-P-R-Z1、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Z11-R-P-P和R-P-P-Z12；其中除了Z1-Z12氨基酸以外X1-X6是相同的；并且其中Z1-Z12選自氨基酸F、L、V和I。
5.權利要求1-4中任意一項所述的多肽，其中X1-X5中最多3個是相同的。
6.權利要求1-5中任意一項所述的多肽，其中X1-X5中最多2個是相同的。
7.權利要求1-6中任意一項所述的多肽，其中X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6之前立即為3-10個氨基酸的氨基酸序列，其中在所述氨基酸序列當中至少2個氨基酸在中性pH時帶正電荷。
8.權利要求1-6中任意一項所述的多肽，其由氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5或X1-X2-X3-X4-X5-X6組成。
9.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求1-8中任意一項所定義多肽的核苷酸序列。
10.包含權利要求9中所定義核苷酸序列的核酸構建體，其中所述核苷酸序列與指導多肽在適宜宿主中產生的一種或多種控制序列有效連接。
11.一種重組表達載體，其包含權利要求10中所定義的核酸構建體。
12.一種重組宿主細胞，其包含權利要求10中所定義的核酸構建體。
13.生產如權利要求1-8中任意一項所定義多肽的方法，該方法包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養如權利要求12所定義的重組宿主細胞；和(b)回收多肽。
14.一種組合物，其包含如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。
15.權利要求14的組合物，其還包含另外的殺生物劑。
16.殺死微生物細胞或抑制微生物細胞生長的方法，其包括將微生物細胞與如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽接觸。
17.一種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。
18.用作藥物的如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。
19.用作抗微生物的獸用或人用治療劑或預防劑的如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。
20.如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽的用途，其用于制備用于微生物感染治療或用于預防用途的獸用或人用治療劑。
21.如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽的用途，其用于殺死微生物細胞或抑制微生物細胞生長。
22.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經用核苷酸序列轉化，其中所述核苷酸序列編碼如權利要求1-8中任意一項所定義的具有抗微生物活性的多肽。
23.至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義抗微生物多肽在動物飼料中的用途。
24.至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義抗微生物多肽在制備用于動物飼料的組合物中的用途。
25.一種動物飼料添加劑，其包含(a)至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種微量礦物質，和/或(e)至少一種巨量礦物質。
26.權利要求25的動物飼料添加劑，其還包含肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
27.一種動物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白質含量并且包含至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。
全文摘要
本發明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發明還涉及核酸構建體、載體和包含核酸構建體的宿主細胞以及生產和使用該多肽的方法。
文檔編號A61K38/17GK1878791SQ200480033242
公開日2006年12月13日 申請日期2004年9月13日 優先權日2003年9月12日
發明者H-H·K·赫根豪格 申請人:諾和酶股份有限公司