專利名稱：血管緊張素－ⅡⅠ型受體單克隆抗體的治療性用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管緊張素-II I型受體單克隆抗體的治療性用途，特別是在治療癌及血管平滑肌細(xì)胞增殖中的用途。
血管緊張素-II在哺乳動(dòng)物電解質(zhì)平衡及血壓控制中起重要作用(Peach Physiol.Rev 57 313-370(1977)；Vinson等人“The AdrenalCortex”，Prentice Hall，Englefield Heights(1992))。已認(rèn)識(shí)到兩種主要類型的稱為1型及2型(AT1及AT)的血管緊張素-II受體，但血管緊張素-II多數(shù)公知的作用是通過AT1亞型發(fā)生的(Herblin等人，Am.J.Hypertens.4 299S-302S(1991)；Ouali等人，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.43 271-280(1992))。
AT1受體亞型單克隆抗體6313/G2(Barker等人，J.Mol.Endocrinol.11 241-245(1993))用于研究受體的分布(Vinson等人，Mol.Med.Today1 35-38(1995))。建議將該單克隆抗體用作控制血管收縮，例如用于治療高血壓或子宮收縮的治療劑。
抗體在多種組織如喉癌(Marsigliante等人，Cancer Letters 110 19-27(1996))、腎(Harrison-Bernard等人Am.J.Physio.42F170-F177(1997)；Cheng等人，Am.J.Physio.43 F10-F17(1998))及腦(Yang等人，J.Neuroscience 17 1660-1669(1997))中用作特異顯象劑。顯示所述抗體可阻斷經(jīng)血管緊張素-II誘導(dǎo)的AT1受體內(nèi)化及PKC激活作用，但相反地促進(jìn)鈣反應(yīng)(Kapas等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.204 1292-1298(1994；Vinson等人，J.Endocrinol.141 R5-R9(1994))。據(jù)報(bào)道乳腺癌中存在的AT1及AT2受體局部產(chǎn)生血管緊張素(Inwang等人，Brit.J.Cancer75 1279-1283(1997)；Tahmasebi等人，Eur.J.Cancer 34 1777-1782(1998))。
單克隆抗體6313/G2是根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1993年7月22日保藏在大不列顛聯(lián)合王國(guó)Porton Down的歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏號(hào)為93072117的雜交瘤細(xì)胞系分泌的。所述保藏物是倫敦E1 4NS，Mile End路，Queen Mary & Westfield學(xué)院生物化學(xué)系的Gavin P Vinson博士和Stewart Barker博士制備的。保藏人授予本申請(qǐng)人在申請(qǐng)書中引用經(jīng)保藏材料并根據(jù)歐洲專利協(xié)議28(1)(d)條法則，無保留并不可取消地同意公眾可獲得經(jīng)保藏材料。
雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生與大鼠血管平滑肌AT1受體第8至17位氨基酸殘基特異結(jié)合的抗體，在人及牛細(xì)胞的AT1受體中也發(fā)現(xiàn)所述氨基酸殘基序列。表位序列如下EDGIKRIQDD或備選地表示為，NH2-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)針對(duì)包含血管緊張素-II I型受體N端序列的肽序列的單克隆抗體在某些醫(yī)學(xué)疾病中具有其它治療性用途，這些用途以前沒有被暗示或顯示。此外，發(fā)現(xiàn)這些治療性作用為在有關(guān)醫(yī)學(xué)疾病中所述單克隆抗體能阻斷血管緊張素-II的有害作用而保留該分子的有益作用。現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到了完整的N端序列對(duì)功能性方面的重要作用。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了針對(duì)下述肽的單克隆抗體或其片段在制備用于癌治療的藥物中的用途，所述肽包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端部分或其片段。
在以上及在本說明書中，氨基酸殘基通過一般的IUPAC單字母命名法進(jìn)行命名。單字母命名法可如以下與傳統(tǒng)的三個(gè)字母命名相對(duì)應(yīng)A＝Ala G＝Gly M＝Met S＝SerC＝Cys H＝His N＝Asn T＝ThrD＝Asp I＝Ile P＝Pro V＝Val
E＝Glu K＝Lys Q＝GlnW＝TrpF＝Phe L＝Leu R＝ArgY＝Tyr如文中應(yīng)用的，術(shù)語“肽”包含寡肽或多肽，并且這些術(shù)語可互換使用。
肽應(yīng)具有賦予抗原性所需的至少最小大小，一般它應(yīng)具有至少六個(gè)或七個(gè)殘基，但可具有任何適當(dāng)長(zhǎng)度，可達(dá)到例如20個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的，它可具有或9個(gè)或10個(gè)殘基。最好的肽可預(yù)計(jì)對(duì)應(yīng)于天然血管緊張素-II I型受體分子的拓?fù)鋵W(xué)表面特征，即這些特征具有一些三維特征，突出自或延伸到受體的周圍表面水平。優(yōu)選的肽對(duì)應(yīng)于1至45位區(qū)域，優(yōu)選對(duì)應(yīng)于8至17位殘基。
大概最簡(jiǎn)單的保證至少部分分子抗原性等同于所述肽的方法是對(duì)于分子的那部分包含與肽相同或構(gòu)象相似的氨基酸殘基序列。然而，可應(yīng)用任何其它產(chǎn)生抗原性等同物的任何方法一個(gè)實(shí)例為應(yīng)用抗獨(dú)特型抗體或其(甚至非蛋白質(zhì)的)類似物。
因此本發(fā)明包含針對(duì)與血管緊張素-II I型受體具有結(jié)構(gòu)同源性的短肽(優(yōu)選10個(gè)氨基酸殘基或更少，但一般至少4或5個(gè)氨基酸殘基，例如6至8個(gè)殘基，或7至9個(gè)殘基)的單克隆抗體的用途。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，因此本發(fā)明包含針對(duì)含有氨基酸序列EDGIKRIQDD的肽序列或其活性片段和/或其保守性突變體的單克隆抗體的用途。此序列取自大鼠血管緊張素-II I型受體序列，為第8至17位殘基。此片段的保守性替代為用D替代E，用E替代D，用A替代G、L或I，用R替代K，用K替代R，用N替代Q，或其組合。
序列EDGIKRIQDD在人、黑猩猩、鼠(AT1b)及(AT1b)、牛、犬、羊、兔、大鼠(AT1b)中完全100％保守。在第8位殘基處有變化，豚鼠為Q，大鼠(AT1a)為D且沙鼠為D。對(duì)N端序列的1至45位殘基區(qū)域，這些物種序列同源性在圖9顯示。
因此，對(duì)應(yīng)于血管緊張素-II I型受體第8至17位殘基的肽的優(yōu)選共有序列具有結(jié)構(gòu)
EDGIKRIQDD每一下列殘基可獨(dú)立地為殘基8可為E、D或Q，殘基9可為D或E，殘基10可為G或A，殘基11可為I或A，殘基12可為K或R，殘基13可為R或K，殘基14可為I或A，殘基15可為Q或N，且殘基16和17每個(gè)可為D或E。
肽一般具有抗原性并能刺激產(chǎn)生抗體，當(dāng)施用時(shí)所述抗體可用于治療癌。
如以上闡述的，特定序列的活性亞片段可如定義的進(jìn)行應(yīng)用。活性亞片段可由五肽組成或包括五肽，其包括一個(gè)或多個(gè)TEDGIEDGIKDGIKRGIKRIIKRIQKRIQDRIQDDIQDDC活性亞片段也可由六肽組成或包括六肽，其包括一個(gè)或多個(gè)STEDGITEDGIKEDGIKRDGIKRIGIKRIQIKRIQDKRIQDDRIQDDCIQDDCP活性亞片段可備選地由七肽組成或包括七肽，其包括一個(gè)或多個(gè)
SSTEDGISTEDGIKTEDGIKREDGIKRIDGIKRIQGIKRIQDIKRIQDDKRIQDDCRIQDDCPIQDDCPK此外，活性亞片段可由八肽組成或包括八肽，其包括NSSTEDGISSTEDGIKSTEDGIKRTEDGIKRIEDGIKRIQDGIKRIQDGIKRIQDDIKRIQDDCKRIQDDCPRIQDDCPKIQDDCPKA此外，活性亞片段可由九肽組成或包括九肽，其包括LNSSTEDGINSSTEDGIKSSTEDGIKRSTEDGIKRITEDGIKRIQ
EDGIKRIQDDGIKRIQDDGIKRIQDDCIKRIQDDCPKRIQDDCPKRIQDDCPKAIQDDCPKAG此外，活性亞片段可由十肽組成或包括十肽，其包括ILNSSTEDGILNSSTEDGIKNSSTEDGIKRSSTEDGIKRISTEDGIKRIQTEDGIKRIQDEDGIKRIQDDDGIKRIQDDCGIKRIQDDCPIKRIQDDCPKKRIQDDCPKARIQDDCPKAGIQDDCPKAGR優(yōu)選的片段包括那些包含序列EDGIKRIQDD中的一些殘基例如至少四個(gè)殘基的片段。
應(yīng)當(dāng)注意可應(yīng)用一個(gè)以上上述序列的組合。
根據(jù)本發(fā)明用于制備用于應(yīng)用的單克隆抗體的肽和其它分子可表現(xiàn)抗原性或以多種方式呈遞。優(yōu)選地，本發(fā)明分子中的抗原性區(qū)(如肽片段或亞片段)包含與載體肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的經(jīng)選擇氨基酸序列。一般優(yōu)選具有與載體結(jié)合的多個(gè)例如5至10個(gè)拷貝的肽序列(例如一個(gè)或多個(gè)以上序列)。載體有益的一般可為大蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在材料方面為惰性物質(zhì)并衍生自與天然生長(zhǎng)激素相關(guān)的不同種或?qū)佟］d體的實(shí)例包括白蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白及卵清蛋白(雖然可能極少肽能由卵清蛋白攜帶)。備選地，可用匙孔血藍(lán)蛋白。載體一般優(yōu)選來自基于片段的不同物種。
以上描述的肽序列不必與白蛋白結(jié)合它們可與其它大分子，如β-半乳糖苷酶，特別是細(xì)菌源的半乳糖苷酶結(jié)合。
本發(fā)明包含針對(duì)上述肽或與上述肽具有實(shí)質(zhì)上的(例如30％、50％或甚至70％以上，適當(dāng)?shù)?0％、85％、90％或95％以上)序列同源性的肽區(qū)這樣的分子的單克隆抗體的用途。同樣地，保守性氨基酸替代可不降低肽的免疫原性或抗原性。因此抗原性相似的同系物可引起抗體產(chǎn)生，所述抗體在如以上定義肽的同一區(qū)域與血管緊張素-II I型受體結(jié)合。應(yīng)用同系物是避開“自身”耐受的方法是公知的。因此，在本發(fā)明中應(yīng)用來自其它物種的對(duì)應(yīng)序列是有益的。
制備針對(duì)分子的單克隆抗體是備選可能的，所述分子是或者包含如以上描述序列的聚合物的肽。適當(dāng)?shù)男蛄锌赏ㄟ^兩個(gè)半胱氨酸殘基的交聯(lián)以形成二硫鍵或通過用外部化學(xué)偶合劑(如碳二亞胺、戊二醛或其它二醛或二-(或聚-)官能羧酸。作為其它備選，可用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生肽聚合物。
應(yīng)當(dāng)注意化學(xué)偶聯(lián)(例如可通過賴氨酸殘基參與發(fā)生)及二硫鍵的形成不限于當(dāng)偶聯(lián)殘基位于序列末端時(shí)內(nèi)部殘基也可是合適的。偶聯(lián)殘基例如半胱氨酸殘基可根據(jù)需要進(jìn)行添加。
可以發(fā)現(xiàn)將任何以上描述的序列與外部肽偶聯(lián)不是必要的。它們自身可具有抗原性。在此種情況下，可建議選擇特定佐劑如DEAE葡聚糖及Merck 7426。
根據(jù)本發(fā)明用于應(yīng)用的單克隆抗體可通過Kohler & Milstein的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Nature 256 495-497(1975))免疫近交系小鼠進(jìn)行制備。對(duì)應(yīng)于以上描述表位序列的肽可通過任何常規(guī)化學(xué)或生物學(xué)途徑進(jìn)行合成，然后所述合成的肽與牛血清白蛋白(BSA)或其它適當(dāng)分子偶聯(lián)，并然后用于免疫小鼠。在肽-BSA偶聯(lián)物加強(qiáng)注射后，將小鼠的脾取出，并將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。然后經(jīng)混合的骨髓瘤-淋巴細(xì)胞雜交體通過在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中在次黃嘌呤、胸苷及氨喋呤中生長(zhǎng)以抑制非融合骨髓瘤細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞雜交體的增殖而篩選。
雜交瘤細(xì)胞可用Engvall等人Immunochem.8，871(1991)描述的技術(shù)使用血管緊張素-II I型受體通過ELISA對(duì)表位反應(yīng)性進(jìn)行篩選。備選地，可用Beckmann等人J.Immunol.144，4212(1990)描述的抗體捕獲技術(shù)。陽性雜交瘤細(xì)胞可腹膜內(nèi)注射到同系Balb/c小鼠以產(chǎn)生包含高濃度針對(duì)以上描述的來自血管緊張素-II I型受體N端序列表位的抗體的腹水。備選地，雜交瘤細(xì)胞可在細(xì)胞瓶中或轉(zhuǎn)瓶中通過多種技術(shù)體外生長(zhǎng)。小鼠腹水產(chǎn)生的單克隆抗體可通過硫酸銨沉淀，接著通過凝膠排阻層析進(jìn)行純化。備選地，可用基于抗體與蛋白A或蛋白G結(jié)合的親和層析，也能基于與產(chǎn)生單克隆抗體的表位進(jìn)行結(jié)合的親和層析。單克隆抗體6313/G2如Barker等人J.Mol.Endocrinol.11，241-245(1993)描述的進(jìn)行制備。抗體在治療高血壓及控制子宮收縮的用途在WO-A-9509186中進(jìn)行了描述。然而，在其它潛在治療性領(lǐng)域沒有任何更廣泛用途的建議。
大鼠血管緊張素-II I型受體在Murphy等人，Nature 351，233-236(1992)中進(jìn)行了描述并且經(jīng)鑒定至少包含8至17位殘基的以氨基酸序列DGIKRIQDD表示的胞外結(jié)構(gòu)域。來自以上描述的血管緊張素-II I型受體N端1至45位，優(yōu)選8至17位殘基序列的表位通過氨基酸替代、和/或插入、和/或缺失可發(fā)生變化以致表位整體形狀和/或構(gòu)象仍具有抗原性。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，單克隆抗體為6313/G2。單克隆抗體6313/G2是通過雜交瘤細(xì)胞系分泌的，所述雜交瘤細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1993年7月22日保藏在大不列顛聯(lián)合王國(guó)Porton Down的歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，保藏號(hào)為93072117。雜交瘤細(xì)胞系可適當(dāng)?shù)匕礃?biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行培養(yǎng)。
在本發(fā)明的用途中，癌的治療可包括但不限于抑制轉(zhuǎn)移、抑制與腫瘤細(xì)胞基質(zhì)蛋白結(jié)合、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及抑制腫瘤細(xì)胞增殖。對(duì)此種治療敏感的癌性腫瘤實(shí)例包括但不限于乳腺癌及前列腺癌。
在本發(fā)明的第二方面，提供了針對(duì)肽的單克隆抗體或其片段在制備治療血管平滑肌(VSM)細(xì)胞增殖藥物中的用途，所述肽包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N-端部分或其片段。
治療血管平滑肌細(xì)胞增殖可包括治療動(dòng)脈硬化癥，所述動(dòng)脈硬化癥顯示為與VSM細(xì)胞增殖相關(guān)的復(fù)雜疾病。
因此本發(fā)明的第一方面也延伸到用于治療癌的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用治療量的針對(duì)包含通過以上描述氨基酸序列所定義血管緊張素-II I型受體N端部分的肽或其片段的單克隆抗體或其片段。
因此本發(fā)明的第二方面也延伸到用于治療血管平滑肌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用治療量的針對(duì)包含通過以上描述氨基酸序列所定義血管緊張素-II I型受體N端部分的肽或其片段的單克隆抗體或其片段。
根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的抗體可用適當(dāng)?shù)目伤幱米魟┖?或稀釋劑制劑以用于靜脈內(nèi)注射。注射可為靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)，包括皮下注射。不排除其它施用方式，如通過脂質(zhì)體、腸包衣膠囊經(jīng)口施用等。
適當(dāng)?shù)兀鶕?jù)本發(fā)明應(yīng)用的抗體可如US 4,816,567及WO 94/10332中描述的為人源化抗體；或如WO 94/09817中描述的為微體；或如GB-A-2272440中描述的為轉(zhuǎn)基因抗體。此類合成構(gòu)建體包括嵌合分子。因此例如，人源化(或靈長(zhǎng)類源化(primatised))抗體或其衍生物的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。人源化抗體的實(shí)例為具有人構(gòu)架區(qū)，但具有嚙齒類高變區(qū)的抗體。
除了完整抗體外，本發(fā)明包括如以上定義的單克隆抗體衍生物的用途，所述單克隆抗體衍生物能結(jié)合選自如以上描述的血管緊張素-II I型受體N端區(qū)的表位。因此，本發(fā)明也包括抗體片段的用途。Dougall等人，Tibtech12，372-379(1994)給出了抗體片段的實(shí)例。
抗體片段包括例如Fab、F(ab′)2及Fv片段(Roitt等人，“Immunology”，第二版(1989)，Churchill Livingstone，倫敦)。可將Fv片段進(jìn)行修飾以產(chǎn)生已知為單鏈Fv(scFv)分子的合成構(gòu)建體。所述分子包括有助于該分子穩(wěn)定性的共價(jià)結(jié)合Vh及Vl區(qū)的肽接頭。
其它合成構(gòu)建體包括CDR肽。CDR肽是包含抗原結(jié)合決定簇的合成肽。也可用肽模擬物。這些分子通常為模似CDR環(huán)結(jié)構(gòu)并包括抗原相互作用側(cè)鏈的構(gòu)象限制型有機(jī)環(huán)。因此能結(jié)合目的表位的此類分子的用途也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第三方面提供了肽序列或其片段在制備治療癌的藥物中的用途，所述肽序列包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端區(qū)。
本發(fā)明的第四方面提供了包含肽序列或其片段的疫苗組合物，所述肽序列包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端區(qū)。疫苗組合物可包含以上序列的多肽或如以上定義的抗原性片段，它們?nèi)芜x地與載體蛋白相結(jié)合。產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)或肽抗原性的方法在與本發(fā)明前述方面相關(guān)的部分進(jìn)行了定義。例如，載體蛋白可為白蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白及卵清蛋白。備選地，可用匙孔蛋白質(zhì)(有時(shí)也稱匙孔血藍(lán)蛋白)。載體一般來自與片段基于的物種不同的物種。疫苗組合物中也可存在其它佐劑，例如皂甙佐劑，例如Quillaja皂甙或其衍生物。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了用于抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附和侵襲的方法，其包括(1)將任選地與載體肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體和其片段制劑在合適的可藥用佐劑和/或稀釋劑中，如用于靜脈內(nèi)注射，其中所述單克隆抗體和其片段為針對(duì)包含如以上定義的血管緊張素-II I型受體N端部分的肽。
(2)任選地，進(jìn)一步將(1)的單克隆抗體制品制劑為脂質(zhì)體或腸包衣膠囊劑型。
(3)對(duì)體外癌細(xì)胞群或癌患者施用制劑(2)或(3)。
備選地，本實(shí)施方案也可只包含步驟(1)和(2)。
此實(shí)施方案延伸到此種制劑在制備治療癌例如前列腺癌、乳腺癌(包括乳腺癌細(xì)胞粘附或侵襲)的藥物的用途。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了用于抑制平滑肌細(xì)胞增殖的方法，所述方法為對(duì)已作必要修正的以上描述步驟(1)至(3)進(jìn)行重復(fù)。
用于本發(fā)明第二及后來方面的優(yōu)選特征為如已作必要修正的第一方面。
現(xiàn)在本發(fā)明通過參考以下實(shí)施例及附圖的方式進(jìn)行進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例及附圖只為了進(jìn)行闡述，并不用于限制本發(fā)明。在所涉及的圖中

圖1顯示抗體對(duì)PNT1a細(xì)胞增殖的作用。
圖2通過測(cè)定攝入的含氚胸苷，顯示抗體對(duì)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
圖3顯示MCF-7細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞粘附測(cè)定結(jié)果。
圖4顯示MCF-7細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的化學(xué)侵襲(chemoinvasion)測(cè)定結(jié)果。
圖5顯示在乳腺癌細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α-3及β-1表達(dá)測(cè)定中Western印跡結(jié)果。
圖6顯示在MCF-7細(xì)胞中抗體6313/G2刺激的鈣反應(yīng)。
圖7顯示在RASMC中抗體6313/G2刺激的鈣反應(yīng)。
圖8顯示血管緊張素-II作用的示意圖，顯示了單克隆抗體激活位點(diǎn)及單克隆抗體阻斷位點(diǎn)。
圖9顯示來自不同物種的血管緊張素-II I型受體N端序列的序列同源性，其中“X”表示缺失的殘基，“-”表示相同的殘基。
實(shí)施例1抗體6313/G2抑制前列腺PNT1A細(xì)胞增殖四唑鹽，溴化3-(4，5二甲基噻唑-2-某基)-2，5-二苯基四唑(MTT)廣泛用作用于細(xì)胞氧化代謝活性的指示劑。MTT還原形成深色的甲產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可用比色法進(jìn)行測(cè)定并因此常用作細(xì)胞活力及增殖的定量評(píng)估。
將前列腺上皮細(xì)胞系PNT1a以每孔1000個(gè)細(xì)胞濃度接種到96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞在添加有2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、2％青霉素和鏈霉素及1mM丙酮酸鈉、10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)兩天，并接著在無血清RPMI 1640培養(yǎng)基(200μl/孔)中靜止孵育24小時(shí)。然后加入適當(dāng)濃度刺激物并孵育24小時(shí)及96小時(shí)。孵育結(jié)束前4小時(shí)，將20μl經(jīng)過濾(0.2μm孔徑)的5mg/ml MTT溶液(在RPMI培養(yǎng)基中溶解)加入到每孔并于37℃繼續(xù)孵育。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)將200μl DMSO，接著將25μl Sorensen’s甘氨酸緩沖液(0.1M甘氨酸、0.1M NaCl，用1M NaOH調(diào)整至pH10.5)加入到每孔，充分混合。5分鐘后，于545nm測(cè)定吸光度。
圖1顯示了結(jié)果，在其中經(jīng)純化抗體(ab)加入到培養(yǎng)的PNT1a細(xì)胞。抗體濃度為(1∶1600)100nmol/l、(1∶160)1μmol/l、(1∶16)10μmol/l。在應(yīng)用的所有抗體濃度下對(duì)增殖的抑制作用是顯著的(P＜0.05或更低)。
實(shí)施例2在血管平滑肌細(xì)胞中抗體6313/G2抑制細(xì)胞增殖通過血管中膜外植塊法(media explant method)自大鼠胸及腹動(dòng)脈(RASMC)和牛大動(dòng)脈(BASMC)分離ASMCs并培養(yǎng)幾代以上。通過自經(jīng)殺死大鼠中仔細(xì)解剖獲得大鼠腹動(dòng)脈及胸動(dòng)脈節(jié)段。大動(dòng)脈節(jié)段獲自麻醉狀態(tài)下的牛。將大動(dòng)脈節(jié)段置于包含組織培養(yǎng)基的傾斜玻片上，然后在解剖顯微鏡下，將每個(gè)節(jié)段的外膜及外部部分仔細(xì)去除。將剩余組織的內(nèi)部部分及內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的解剖皿中并用新鮮培養(yǎng)基洗幾次。這時(shí)將每個(gè)節(jié)段切成大約1mm2并置于25cm2組織培養(yǎng)瓶中。將瓶的帽擰松并置于加濕的CO2孵箱中。兩小時(shí)后，將添加有100單位/毫升青霉素、100μg/ml鏈霉素、4μmol/L L-谷氨酰胺及20％FBS的4ml RPMI-1640培養(yǎng)基仔細(xì)加入到瓶中，而不使組織飄浮。一周后將樣本的培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基。來自外植塊的細(xì)胞在大約2周內(nèi)很大程度上長(zhǎng)成單層。然后將它們用PBS漂洗，并然后用PBS配制的具有0.125％胰蛋白酶及0.02％EDTA的溶液于37℃進(jìn)行消化1-2分鐘。將得到的細(xì)胞懸液加入到包含10ml培養(yǎng)基的75cm2組織培養(yǎng)瓶中并如以上進(jìn)行孵育。用傳3-5代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
在實(shí)驗(yàn)的第一天，用添加20％FBS的RPMI-1640制備RASMC懸液(105個(gè)細(xì)胞/毫升)。將1ml此細(xì)胞懸液分裝到24-孔多孔板的每孔中。傳代24小時(shí)后，將培養(yǎng)基用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行替換。休眠細(xì)胞(血清衍生的)或血清充滿的細(xì)胞與適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)培養(yǎng)基孵育48小時(shí)，每組4孔。將10μl3H-甲基胸苷(0.1mCi/ml)加入到每孔(1ml培養(yǎng)基/孔)。加入放射性胸苷后24小時(shí)，將培養(yǎng)基進(jìn)行吹打并將培養(yǎng)細(xì)胞用冷PBS洗3次。然后將細(xì)胞溶解于0.5ml的0.1N NaOH并將0.3ml與3.5ml閃爍液混合，于室溫過夜后，在液體閃爍計(jì)數(shù)器上分析氚含量。
結(jié)果在圖2進(jìn)行顯示，其中增殖通過10nmol/l血管緊張素-II進(jìn)行刺激并通過6313/G2(10μmol/L，**P＜0.01)進(jìn)行抑制。
實(shí)施例3乳腺癌細(xì)胞中抗體6313/G2抑制細(xì)胞的增殖將MCF-7細(xì)胞(獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA 20108，美國(guó))以每孔5000個(gè)細(xì)胞密度接種到24孔板并在包含5％胎牛血清(FBS)的Eagles’s最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)中生長(zhǎng)24小時(shí)。然后將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中再孵育24小時(shí)。接著，細(xì)胞僅在無血清培養(yǎng)基(對(duì)照孔)或在實(shí)驗(yàn)孔中僅添加血管緊張素-II(1-10nM)或添加有抗體6313/G2的無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。每個(gè)處理進(jìn)行四次重復(fù)。然后將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。20小時(shí)后，將氚化胸苷加入到每孔中(Amersham PharmaciaBiotech，Amersham，大不列顛聯(lián)合王國(guó)，50μCi/ml，比活性5Ci/mmol)并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。此階段結(jié)束后，將培養(yǎng)基進(jìn)行吹打并將培養(yǎng)細(xì)胞用冰冷緩沖溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4)洗三次。然后將細(xì)胞溶解于1ml 0.1N NaOH中，并將0.5ml此溶液與3.5ml閃爍混合液(甲苯閃爍劑，Packard Bioscience B.V.Groningen，荷蘭)混合并對(duì)氚含量進(jìn)行分析。
實(shí)施例4抗體6313抑制乳腺癌細(xì)胞粘附進(jìn)行了MCF-7細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上的細(xì)胞粘附測(cè)定研究。細(xì)胞培養(yǎng)(平底)96孔板用定量的經(jīng)純化人基質(zhì)蛋白即膠原蛋白IV型(50μg/孔)進(jìn)行包被。將它們于室溫在層流柜過夜以蒸發(fā)水分。
將MCF-7細(xì)胞(獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)Manassas，VA 20108，美國(guó))用6163/G2抗體處理48小時(shí)。對(duì)照不進(jìn)行處理。在應(yīng)用前，每孔用BSA(200μg/ml)處理以去除非特異結(jié)合。
將細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)中500個(gè)MCF-7細(xì)胞加入到每孔中并于37℃在5％CO2環(huán)境中孵育1小時(shí)。然后將孔用無血清DMEM洗3次并用Diff-quick fix(7秒)、Diff quick I(7秒)及Diff quick II(10秒)染色，并用水洗一次。
在顯微鏡下觀察每孔，對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。抗體6313/G2顯著降低了細(xì)胞粘附(P＜0.05)。用或不用抗體6313處理而粘附到膠原蛋白(50μg/孔)的MCF-7細(xì)胞數(shù)的結(jié)果在圖3顯示。
實(shí)施例5抗體6313抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲進(jìn)行了MCF-7細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的化學(xué)侵襲測(cè)定研究。用經(jīng)純化人膠原蛋白IV基質(zhì)蛋白包被8μm濾膜插入物并于室溫在層流柜中過夜干燥。MCF-7細(xì)胞用6163/G2抗體(雜交瘤上清)處理48小時(shí)。對(duì)照細(xì)胞不進(jìn)行處理。
在應(yīng)用前，將BSA(100μg/ml)加入每孔作用1小時(shí)。通過與3T3成纖維細(xì)胞孵育進(jìn)行預(yù)處理的DMEM用作化學(xué)吸引劑。將經(jīng)包被插入物置于每孔中以形成上層及下層區(qū)室。將10,000個(gè)MCF-7細(xì)胞加入到上層區(qū)室并加入無血清DMEM。經(jīng)處理3T3細(xì)胞培養(yǎng)基置于下層區(qū)室。將板封蓋并于37℃在潮濕的5％CO2環(huán)境中孵育24小時(shí)。
孵育后，將濾膜上表面剩余的細(xì)胞完全去除并且對(duì)透過膠原蛋白并附著在濾膜下表面的細(xì)胞用Diff-Quik染色并計(jì)數(shù)。結(jié)果在表4顯示，顯示了用及不用抗體6313處理而通過膠原蛋白(50微克/孔)侵襲的MCF-7細(xì)胞數(shù)。抗體6313顯著抑制細(xì)胞侵襲(P＞0.01)。
實(shí)施例6乳腺癌細(xì)胞中抗體6313對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的作用研究了抗體6313/G2對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的作用。結(jié)果顯示抗體6313顯著降低整聯(lián)蛋白α3及β1在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)。
MCF-7細(xì)胞系用抗體6313/G2處理48小時(shí)，對(duì)照不進(jìn)行處理。制備細(xì)胞膜級(jí)分并通過非還原8％SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離。
然后將蛋白質(zhì)于4℃，30V過夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。用已建立的Western印跡法將整聯(lián)蛋白α3及β1的第一抗體及第二抗體用于檢測(cè)硝酸纖維膜上的組分。將膜在增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)western印跡檢測(cè)試劑中孵育1分鐘，通過hyper film ECL曝光對(duì)發(fā)光條帶進(jìn)行顯影。結(jié)果在圖5進(jìn)行顯示，其中C＝對(duì)照，A＝受試抗體，其它泳道(M)為分子量標(biāo)記。
實(shí)施例7在MCF-7細(xì)胞及RASMC中抗體6313對(duì)鈣反應(yīng)的作用在MCF-7細(xì)胞及RASMC中抗體6313對(duì)鈣反應(yīng)的作用進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)抗體6313刺激MCF-7細(xì)胞及RASMC的鈣反應(yīng)。
對(duì)于鈣離子([Ca2+])的測(cè)定，將細(xì)胞在改良的Krebs-Ringer碳酸氫鹽溶液(3.6mM K+，1.2mM Ca2+，0.5mM Mg2+，5mM Hepes和20mMHCO-)中裝入1μM fura-2于37℃作用30分鐘。為了同時(shí)測(cè)定fura-2的熒光，將置于蓋玻片上的在經(jīng)改良Krebs-Ringer碳酸氫鹽溶液中的細(xì)胞放置在倒置顯微鏡(Zeiss)的載物臺(tái)上。激發(fā)波長(zhǎng)為340nm及380nm，并于510nm檢測(cè)光的發(fā)射。自激發(fā)波長(zhǎng)為340nm及380nm所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比率對(duì)鈣離子濃度([Ca2+])進(jìn)行計(jì)算。
在MCF-7細(xì)胞及在RASMC中的結(jié)果在圖6顯示。垂直箭頭表示抗體6313/G2應(yīng)用的點(diǎn)。熒光強(qiáng)度比率增加與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是成比例的。
與保藏的微生物有關(guān)的聲明(PCT細(xì)則第13條之2)A.以下聲明涉及說明書第2頁第1-7行和第8頁第21-24行的微生物。
B.保藏鑒定保藏機(jī)構(gòu)名稱歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)保藏機(jī)構(gòu)地址疫苗研究和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室公共健康實(shí)驗(yàn)部門應(yīng)用微生物學(xué)和研究中心Porton Down，SalisburyWillshire SP4 0JG，UK保藏日期1993年7月22日保藏號(hào)9307211權(quán)利要求
1.針對(duì)肽的單克隆抗體或其片段在制備治療癌的藥物中的用途，所述肽包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVMIPTLYSIIFV VGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N-端部分或其片段。
2.針對(duì)肽的單克隆抗體或其片段在制備治療血管平滑肌(VSM)細(xì)胞增殖的藥物中的用途，所述肽包含通過序列MILNSSTEDGIKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV VGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N-端部分或其片段。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的用途，其中單克隆抗體為針對(duì)肽EDGIKRIQDD的單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的用途，其中單克隆抗體為人源化抗體。
5.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的用途，其中單克隆抗體是由保藏號(hào)93072117的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的6313/G2。
6.治療癌的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用治療量的針對(duì)肽的單克隆抗體或其片段，其中所述肽包含通過氨基酸序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV VGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端部分或其片段。
7.治療血管平滑肌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用治療量的針對(duì)肽的單克隆抗體或其片段，其中所述肽包含通過氨基酸序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端部分或其片段。
8.如權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的方法，其中單克隆抗體為針對(duì)肽EDGIKRIQDD的單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中單克隆抗體為人源化單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中單克隆抗體為保藏號(hào)93072117的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的6313/G2。
11.肽序列在制備治療癌的藥物中的用途，其中所述肽序列包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFVVGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端部分或其片段。
12.包含肽序列的疫苗組合物，其中所述肽序列包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV VGIFG定義的血管緊張素-II I型受體N端部分或其片段。
13.如權(quán)利要求11所述的疫苗組合物，其中肽與載體蛋白結(jié)合。
全文摘要
提供了用于治療癌及血管平滑肌細(xì)胞增殖的針對(duì)血管緊張素－II I型受體的單克隆抗體的用途。特別的，提供了肽的單克隆抗體或其片段在制備治療癌的藥物或制備治療血管平滑肌(VSM)細(xì)胞增殖的藥物中的用途，所述肽包含通過序列MILNSSTEDG IKRIQDDCPK AGRHNYIFVM IPTLYSIIFV VGIFG定義的血管緊張素－II I型受體N端部分或其片段。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1681845SQ03822205
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者G·P·文森, J·R·普代福特, S·巴克 申請(qǐng)人:瑪麗王后·威斯特費(fèi)爾學(xué)院