專利名稱：一種水蛭多肽凍干粉針制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于醫藥制藥技術領域，具體涉及一種水蛭多肽凍干粉針制劑及其制備方法。
背景技術：
水蛭(學名)又名螞蟥，是一種生長于沼澤、湖泊或水田中的環節動物，以吸食人畜的血液為生。水蛭是較強的活血化瘀藥物，據《神農本草經》記載“水蛭味咸平，主逐惡血，月閉，破血瘕集聚，無子，利水道。”歐洲的JohnHaycraft博士在1884年發現歐洲醫用水蛭會分泌出某種阻止血液凝結的物質以利于水蛭吸食血液消化。在20世紀初人們發現這種物質是一種蛋白質，并命名為水蛭素(Chirudin)。它能阻止凝血酶對血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而釋放，從而延緩或阻止血液的凝固。
當今世界正步入老年社會，僅我國50歲以上的人口就有3億之多。血栓病是老年人的常見病，全世界有血栓栓塞性病人約1500萬所需溶栓劑的潛在市場約20億美元。目前在臨床上還沒有治療血栓栓塞的特效藥，早期的抗(溶)血栓藥物有纖維蛋白原溶解酶、尿激酶、鏈激酶等，但它們的臨床應用有幾個顯著的缺點，如凝血酶會高比例再生等。而小的合成抑制因子如三肽d-Phe-Pro-Arg雖然具有高選擇的抗凝血酶活性，但其半衰期僅有幾分鐘。
重組水蛭素已經在臨床應用，國內已有多家獲新藥證書。但是，重組水蛭素與天然水蛭素相比，卻存在著天生性的缺陷。第一，由于重組水蛭素的二級結構與凝血酶不具有互補性，其作用效果遠不及天然水蛭素理想；第二，由于受發酵提取環節的的影響，批與批之間產品不一致，導致質量、效果都難以保證；第三，重組水蛭素的抗凝血作用時間短，推測機制可能是由于重組水蛭素與凝血酶結合不完全，不能完全阻礙凝血酶活性中心。
天然水蛭素盡管目前研究不少，但至今為止還沒有天然水蛭素藥品應用于臨床。其原因在于第一，天然水蛭素提取十分困難，而且受天然水蛭來源影響，提取過程中的工序復雜，提取過程中導致水蛭素失效等因素，導致獲得純化的水蛭素非常困難，不僅價格昂貴，而且沒有產品，甚至連標準品都沒有購到。這種情況不僅在國內如此，國外亦是如此。第二，目前文獻中所稱的天然水蛭素實際上絕大部分為水蛭多肽。第三，天然水蛭多肽純化后還有不穩定現象。
申請號為95117701的專利公開了采用親合色譜法純化水蛭素，但在實際應用過程中，只適用于實驗室，不能進一步中試放大和生產，不利于產業化推廣。專利申請號為03113566的專利公開了提取純化水蛭素的方法，但該方法在實際操作過程中因為運用有機溶劑使得環境要求特別高，并且只應用了陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF層析(凝膠過濾柱層析只是分子篩的作用)進行純化，雜質沒有分離完全，水蛭素的純度不高，也未見該專利關于水蛭素純度的報道。申請專利號200410037695.7的專利公開了一種水蛭素凍干粉針制劑及其制備方法，其特征在于從鮮水蛭提取水蛭素，純化后加或不加藥用輔料，制備成水蛭素凍干粉針制劑，此專利所述的水蛭素凍干粉針制劑實際上也是指水蛭多肽，該制備方法得到的水蛭多肽凝血酶比活為1∶16，影響凝血酶比活的原因可能是純化過程中使用的凝膠柱并沒有達到理想的分離純化效果，或者沒有找到真正適合該多肽提取純化的凝膠柱，所以提取純度的原因直接影響了藥理活性。

發明內容
基于上述原因，本發明在原有制備方法的基礎上，純化過程中經過多次實驗對陽、陰離子凝膠色譜柱的型號及其填料進行篩選，最終優選使用兩組分離純化效果最佳的陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25。該制備方法簡單，提取過程不使用任何有機試劑；操作過程無環境污染，省時節源，采用該純化方法得到的水蛭多肽不但分離純化效果好，同時收率也得到提高。采用該制備純化方法所得到的水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32，比原制備方法作用效果大大加強。
一、工藝制法(1)水蛭多肽凍干粉針制劑的處方組成為處方1水蛭多肽2-4重量份。
處方2水蛭多肽2-4重量份，賦形劑為96-98重量份。
(2)提取物的制備1>稱取水蛭，加入純水，洗去雜質，用電動絞肉機充分攪碎使成粗制勻漿。將粗制勻漿經膠體磨勻漿，待勻漿呈粘稠狀態且無明顯可見粒狀物時，即停止研磨，將全部勻漿立即分裝于經煮沸消毒的離心瓶中，于-20±5℃冰柜凍結24-36小時，再用水溫為25±5℃的振蕩水浴中解凍，反復凍、融5-7次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，收集上清液；2>將上清液用截留分子量為8000-12000的中空纖維膜進行超濾，壓力為0.1MPa，雙向流TWT式，外壓式分離，當分離至截留液體積基本達到原溶液體積的1/4-1/3時，加入1/3截留液體積的注射用水，繼續超濾，直至超濾液體積基本達到上清液量時停止超濾，超濾結束后，將超濾液分裝到離心瓶中，凍存于-20±5℃冰柜中。
3>將超濾液用緩沖液調pH值為5.0-7.0后，分別經過陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25進行分離純化陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱C-25、C-50的流動相用緩沖液調pH至6.0-7.0進行洗脫，陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF、A-25的流動相用緩沖液調pH至7.0-8.0進行梯度洗脫；在紫外檢測下，自動收集具有抗凝血酶活性部分的洗脫液，至紫外檢測器檢測不到吸收為止；將各個單一組分分別進行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，濾液用反滲透膜機濃縮脫鹽，或用凝膠柱脫鹽并進一步純化，并留樣檢測，得到水蛭多肽半成品。
(3)凍干粉針劑的制備將上述水蛭多肽半成品與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
用于本發明提取水蛭多肽的水蛭品種為螞蝗(Whitmania Pigra whitman)、亞洲水牛蛭(菲牛蛭)、日本醫蛭(Hirudo nipponica Whitman)、柳葉螞蝗(Wh.acranulatc Whitman)、歐洲醫用水蛭、印度水蛭、寬體金線蛭中的任何一種。
二、檢測分析采用高效液相色譜法對水蛭多肽進行檢測。
1.實驗儀器waters600E型高效液相色譜儀，996PDA檢測器；色譜柱日本TOSOH TSK2000SW 7.5×300；色譜條件工作站millennium chromatograph；波長260nm；流動相0.01mol/L、pH值6.68的磷酸緩沖溶液(配制方法按照中國生物制品主要原輔材料質控標準2000年版，中國生物制品標準委員會編，化學工業出版社，P13-14配制)。
2.實驗藥物水蛭多肽樣品為本發明工藝制備的水蛭多肽(廣州天之驕藥物開發有限公司)。
3.樣品制備取樣品，用多肽純化離心管，進行離心分離，取離心液體即為樣品。
4.上樣取上述處理的樣品用微量注射器吸取定量液體，注入進樣器進行檢測。
5.結果對五批樣品進行測定，采用歸一化法計算水蛭多肽的純度為98.4％-99.9％。
三、藥理實施例實施例一水蛭多肽比活性的檢測1.實驗原理天然水蛭多肽的活性檢測國家尚未公布標準的檢測方法，根據凝血酶活性的檢測方法(中國生物制品規程2000年版附錄1)，依據水蛭多肽與凝血酶是1∶1的比例結合，消耗一個凝血酶單位，相等于一個抗凝血單位(ATU)的原則，采用試管法(連續稀釋法)檢測水蛭多肽的抗凝血單位的效價。
2.實驗材料5g/L纖維蛋白原的生理鹽水溶液，注射用生理鹽水(廣州天之驕藥物開發有限公司)冷凍干燥凝血酶(安徽桑原生物技術研究所購買，每瓶含量為500IU，用時用生理鹽水稀釋至每毫升含凝血酶0.5IU)3.待測樣品水蛭多肽樣品為本發明工藝制備的水蛭多肽(廣州天之驕藥物開發有限公司提供)4.檢測方法取10×80mm試管8支，在每支試管中加入生理鹽水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待測樣品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混勻后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，將多余的0.2ml混合液廢棄，此時各試管都為0.2ml，其濃度稀釋比例依次為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素，作為試驗對照，加樣結束后，放到37℃水浴使樣品與凝血酶作用5-10min，再于各試管中加入5g/l纖維蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，觀察記錄1-24小時結果，并進行計算。計算方法為發生凝固或沉淀的試管為無抗凝血酶活性(陰性)，不凝固或無沉淀產生的試管為具有抗凝血酶活性。
5.結果經過計算本發明的水蛭多肽的效價比為1∶32。
6.說明
(1)由于目前文獻報導中對于水蛭多肽的效價大部分應用檢測儀器進行檢測，以5分鐘為判定終點。我們的研究發現，5分鐘測定有抗凝活性，但30分鐘至4小時仍可能發生凝固，至24小時仍能保持抗凝血酶活性。因此本發明的檢測結果是以37℃、24小時結果為準。
(2)研究表明24小時的檢測結果1IU/mg相當于儀器檢測5分鐘檢測結果80IU/mg。
實施例二水蛭多肽制劑對小鼠凝血時間的影響。
1.實驗藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發有限公司提供)2.實驗動物昆明種小鼠，體重18～22g，動物雌雄兼用，隨機分為4組。
3.實驗方法實驗用小鼠30只，動物雌雄兼用，隨機分為3組；生理鹽水作為空白對照組，水蛭注射液作為陽性對照組。于末次給藥后1h用玻璃毛細管插入小鼠眼內球后靜脈叢，深約4～5mm輕輕轉動再縮回，自血液流入管內開始計時，血液注滿后取出毛細管平放于桌面上，每隔30s折斷兩端毛細管約0.5cm，并緩慢向左右拉開。觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現為止，所歷時間即為血凝時間，毛細管兩端數據的平均值即為該鼠的血凝時間，結果見表1。
表1 水蛭多肽凍干粉針劑對小鼠凝血時間的影響(x±s)

注與空白對照組比較*P＜005，與陽性對照組比較**P＜001；結論本實驗結果表明，水蛭多肽制劑可延長小鼠凝血酶時間，并且明顯優于水蛭注射液陽性對照組。提示水蛭多肽制劑具有較好抗凝血的作用，為其治療血栓性疾病提供了可靠的實驗依據。
實施例三水蛭多肽制劑對大鼠靜脈血栓的影響1.實驗藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發有限公司提供)2.實驗動物Wistar大鼠，體重200～300g，動物雌雄兼用。
3.實驗方法取大鼠30只，隨機分為3組，生理鹽水作為空白對照組，水蛭注射液為陽性對照組。實驗組與對照組連續ig給藥3d，于末次給藥后，立即麻醉大鼠，開腹分離下腔靜脈，在左腎靜脈下方用線結扎，2h后，于結扎處2cm處結扎血管，阻斷血流，取出血栓，稱濕重，結果見表2。
表2 水蛭多肽凍干粉針劑對大鼠靜脈曲栓的影響(x±s)

注與空白對照組比較*P＜005，與陽性對照組比較**P＜001；結論通過以上藥理實驗表明，本發明的水蛭多肽制劑可抑制大鼠靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，對血栓具有較強溶解作用，與市售同類品種比較具有更強的藥理作用。
實施例四水蛭多肽制劑對家兔體外血栓長度、干重的影響1.實驗藥物水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)；本發明水蛭多肽凍干粉針劑(廣州天之驕藥物開發有限公司提供)2.實驗儀器DS-87BChandler氏體外血栓形成儀(鎮江美達生物儀器有限公司產品)3.實驗動物大耳白兔，雄性，2.0～2.5kg(廣州天之驕實驗動物中心提供)4.實驗方法雄性大耳白兔10只，隨機均分組給藥組和陽性對照組(水蛭注射液)。家兔自耳緣靜脈注射給藥(0.5mg/kg)，給藥前及給藥后5、15、30、60及120min分別自心臟取血1.5mL，不加抗凝劑，棄去初始幾滴，迅速將1mL血注入已預溫(37℃)的塑料管中，管連成環狀，置Chandler氏體外血栓形成儀轉盤上，立即啟動轉盤，以12r/min旋轉10min，儀器自動停轉，立即取出塑料環，小心取出血栓，用濾紙吸去殘血，測量血栓長度，64℃烘干30min后稱量其干重。以藥前為基準，計算給藥后各時間點的栓長和血栓干重的抑制百分率(％)，結果見表3，表4。
表3 水蛭多肽凍干粉針劑對家兔體外血栓長度的影響(x±s，n＝5)

注與陽性對照組比較*p＜0.05結論本實驗結果表明，本發明的水蛭多肽制劑可抑制家兔靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，與水蛭注射液比較有顯著性差異，對血栓具有較強溶解作用。
表4 水蛭多肽凍干粉針劑對家兔體外血栓干重的影響(x±s，n＝5)


注與陽性對照組比較*p＜0.05結論本實驗結果表明，本發明的水蛭多肽制劑可抑制家兔靜脈血栓形成，具有很好的溶栓作用，與水蛭注射液比較有顯著性差異，對血栓具有較強溶解作用。
四、制備實施例實施例1(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)5.0公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結30小時，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復操作3次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.05(20℃)的溶液；將濃縮的透過液用磷酸鹽緩沖液調PH值為6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗4倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調PH值為7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為372克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例2(1)取日本醫蛭(Hirudo nipponica Whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-20℃冰柜凍結24小時，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，反復凍、融6次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為8000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復操作5次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.10(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為712克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例3(1)取柳葉螞蝗(Wh.acranulatc Whitman)6.0公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-22℃冰柜凍結28小時，再用水溫為28℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為11000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復操作5次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為410克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例4(1)取歐洲醫用水蛭6.5公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結24小時，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復操作4次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用反滲透膜機濃縮脫鹽，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為410克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例5
(1)取印度水蛭7.5公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結24小時，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復操作4次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.0(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為486克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例6(1)取亞洲水牛蛭(菲牛蛭)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-30℃冰柜凍結30小時，再用水溫為25℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為10000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復操作4次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.05(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為726克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例7(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)10.0公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-25℃冰柜凍結32小時，再用水溫為20℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為12000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/2時，加水至原體積，反復操作4次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.0(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-50，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱FF，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為712克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
實施例8(1)取螞蝗(Whitmania Pigra whitman)5.9公斤，加入注射用水，洗去雜質，用電動絞肉機破碎，再用高速剪切機制成勻漿；將勻漿分裝于有蓋容器中，于-24℃冰柜凍結36小時，再用水溫為30℃的振蕩水浴中解凍，再次凍結，再次凍結，反復凍、融5次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，吸取上清夜；將上清液用截留分子量為9000的中空纖維膜進行超濾，超濾至原溶液體積的1/3時，加水至原體積，反復操作4次，合并透過液，濃縮至相對密度為1.06(20℃)的溶液；將濃縮的透過液磷酸鹽緩沖液調pH值6.8，離子強度為0.01mol/l，以10ml/min通過陽離子葡聚糖凝膠色譜柱C-25，用緩沖液洗6倍的柱體積洗脫，收集洗脫液，再用緩沖液調pH值7.4，以10ml/min通過陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱A-25，分別用PH值為7.2、7.0、7.0的緩沖液進行梯度洗脫，洗脫至紫外檢測器檢測不到吸收為止，收集洗脫液；洗脫液用凝膠柱脫鹽并進一步純化，得到水蛭多肽原料(其中含水蛭多肽為398克)；(2)凍干粉針劑的制備將提取物與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑1000支。
權利要求
1.一種水蛭多肽凍干粉針制劑，其特征在于該制劑是以水蛭多肽2-4重量份為活性成分的注射制劑；其特征還在于水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32。
2.權利要求1所述的水蛭多肽凍干粉針制劑，其特征在于提取過程不使用任何有機溶劑，純化過程中應用的凝膠柱陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱。
3.一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)提取物的制備1>稱取水蛭，加入純水，洗去雜質，用電動絞肉機充分攪碎使成粗制勻漿。將粗制勻漿經膠體磨勻漿，待勻漿呈粘稠狀態且無明顯可見粒狀物時，即停止研磨，將全部勻漿立即分裝于經煮沸消毒的離心瓶中，于-25±5℃冰柜凍結24-36小時，再用水溫為25±5℃的振蕩水浴中解凍，反復凍、融5-7次，最后一次解凍后，用冷凍離心機離心沉淀，收集上清液；2>將上清液用截留分子量為8000-12000的中空纖維膜進行超濾，壓力為0.1MPa，雙向流TWT式，外壓式分離，當分離至截留液體積基本達到原溶液體積的1/4-1/3時，加入1/3截留液體積的注射用水，繼續超濾，直至超濾液體積基本達到上清液量時停止超濾，超濾結束后，將超濾液分裝到離心瓶中，凍存于-20±5℃冰柜中；3>將超濾液用緩沖液調pH值為5.0-7.0后，分別經過陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱進行分離純化陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調pH至6.0-7.0進行洗脫，陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱的流動相用緩沖液調pH至7.0-8.0進行梯度洗脫；在紫外檢測下，自動收集具有抗凝血酶活性部分的洗脫液，至紫外檢測器檢測不到吸收為止；將各個單一組分分別進行抗凝血酶活性檢測，將有活性的單一組分合并后除菌過濾，濾液用反滲透膜機濃縮脫鹽，或用凝膠柱脫鹽并進一步純化，并留樣檢測，得到水蛭多肽半成品。(2)凍干粉針劑的制備將水蛭多肽半成品與酪氨酸混勻，用注射用水溶解，調pH值，用0.22μm微孔濾膜過濾，滅菌，冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
4.根據權利要求1、2或3所述的水蛭多肽，其中水蛭品種為選自螞蝗、亞洲水牛蛭、日本醫蛭、柳葉螞蝗、歐洲醫用水蛭、印度水蛭、寬體金線蛭中的任何一種。
5.根據權利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的一種。
6.權利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱是sephadexC-25、sephadexC-50中的一種。
7.權利要求3的一種水蛭多肽凍干粉針制劑的制備方法，所述的陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱是sepharoseF.F、sepharoseA-25中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種水蛭多肽注射制劑及其制備方法，其特征在于水蛭多肽提取過程采用水為溶劑，純化過程單獨使用兩組效果最佳的陽離子交換葡聚糖凝膠色譜柱和陰離子交換瓊脂糖凝膠色譜柱。純化后加或不加藥用輔料，制備成水蛭多肽注射制劑；其特征還在于提取過程不使用任何有機試劑；該制備方法簡單，操作過程無環境污染，省時節源并且使水蛭多肽的純度大大提高，同時抗凝血活性得到了顯著的提高，采用該純化方法得到的水蛭多肽的凝血酶比活為1∶32。
文檔編號A61K38/17GK1891234SQ20051008031
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月1日 優先權日2005年7月1日
發明者張晴龍 申請人:張晴龍