專利名稱：適于治療皮膚衰老征兆的組合物的制作方法
背景技術：
本發明涉及用于預防性和/或治療性治療皮膚衰老的征兆、包括維生素E、維生素C和茶提取物的組合物。在優選實施方案中，本發明涉及通過增強G1-抑制細胞的釋放，由此使細胞更快地再生來利用維生素E、維生素C和茶提取物或包括它們的組合物減輕皮膚衰老的征兆。
人類的皮膚是表皮和真皮的復合材料。表皮的最頂端部分是角質層。該層是皮膚的剛性層，并且是受周圍環境影響最大的一層。在角質層之下是表皮的內部部分。在表皮之下，真皮的最頂端層是乳突真皮，其由相對疏松的結締組織組成。在乳突真皮之下排列的網狀真皮是緊密的結締組織，其在空間上組織在一起。網狀真皮也與粗的皺紋有關。在真皮的底部有皮下層。
皮膚的主要功能包括保護、排泄、分泌、吸收、溫度調節、色素生成、蓄積、感官知覺和免疫過程的調節。這些功能受由于衰老和過量的陽光曝曬而引起的皮膚結構變化的不利影響。例如，與皮膚衰老相關的生理變化包括屏障功能的損傷和表皮細胞代謝的降低。[Cerimele，D等，Br.J.Dermatol.，122 Suppl.35，p.13-20(1990年4月)]。
皮膚的機械性能，例如彈性，由其中的膠原和彈性纖維組織的網絡的密度和幾何結構所控制。膠原和彈性蛋白的損傷使其失去可收縮性質，導致皮膚的皺紋和皮膚表面的粗糙。當皮膚衰老或變得不健康時，產生了松弛、萎縮紋、腫塊、瘀傷或皺紋，變粗糙，而且合成維生素D的能力也降低了。衰老的皮膚也變得更薄，并由于膠原蛋白、彈性蛋白和糖胺聚糖的改變而具有平的真皮表皮界面。[Fenske，N.A.，and Lober，C.W.，J.Am.Acad.Dermatol.，15571-585(1986年10月)；Montagna，W.and Carlisle，K.，Journal of Investigative Dermatol.，73(1)47-53(1979年)]。
將各種維生素和礦物質施與個體來治療某些當病人維生素和礦物質缺乏時發生的皮膚病或其它病癥。例如，維生素A參與痤瘡的治療并促進傷口愈合；維生素C(抗壞血酸)參與皮膚損傷和傷口愈合的預防；維生素E是一種抗氧化劑；銅參與彈性組織缺乏的治療。[Neldner，K.H.，Amer.Acad.Derm.Annl.Mtg.，Wash D.C.，Dec.6，1993]。維生素C的局部使用也被認為能夠避免陽光損傷、減少結締組織的破壞，并可能促進膠原蛋白的合成。[Dial，W.，Medical World News，p.12，March1991]。為了促進皮膚保濕、對細胞進行紫外線防護、延緩早期的皮膚衰老，維生素E常常作為消炎劑來局部使用。
基于兒茶素的制劑，包括proanthanol和原花色素是非常有效的自然存在的抗氧化劑。例如，這些化合物是在花、植物葉子和葡萄籽中發現的。[Lubell，A.，Cosmetic Dermatol.9(7)58&60(July 1996)]。營養素對于衰老過程的潛在重要性已經成為幾十年來人們所關注的問題，其不僅包括飲食對于細胞衰老和死亡的作用，也包括營養素在降低免疫活性、骨胳完整性、激素平衡及其它常常與衰老的生物體相聯系的身體機能上所起的作用。一些營養素，包括維生素和必需礦物質，已經與這些疾病有益地聯系在一起了。
衰老與人的生理特征的變化和許多生理機能的衰退相關聯。雖然已知衰老的現象，但衰老的基本性質還未被很好地認識。在衰老的一些理論中，首先由Harman在1956年提出的衰老的自由基理論(J.Gerontol.1956，11，198-300)在最近幾十年內受到越來越多的關注。該理論假設自由基反應是單個通用的過程，其可能決定了衰老并且密切地參與許多與衰老相關的疾病。該理論的現代概念得到了近年來積累的數據的支持，闡明了在有利于氧化脅迫的抗氧化劑/氧化強化劑的平衡基于時間的變化，所述氧化脅迫可能導致細胞機能的協調異常和衰老。
存在于大多數好氣菌中的復雜的內在抗氧化劑防御機制清除了自由基，并減低了氧化脅迫。自由基和氧化脅迫將導致細胞毒性，并促進衰老過程。在最大壽命和潛在的抗氧化劑能力之間強的正相關性已經在若干氧化防御機制中得以確認(Cutler，R.G.，1991，Am.J.Clin.Nutr.，53，373S-379S)。此外，已經闡明了特定抗氧化劑的組織濃度與哺乳動物的固有壽命之間的正相關性。
由天然存在的物質包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、β-胡蘿卜素和histadine提供了抗氧化劑的活性。而且，細胞內酶諸如超氧物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶和過氧化氫酶，也提供了對于活化氧自由基的保護。光老化的不同臨床模式是已知的，并已被文獻所報道。老化相關的主要皮膚變化包括干燥、皺紋、松弛和各種良性腫瘤的發展。內在老化和長期暴露于紫外線和其它潛在的外在危險所產生的最終結果是皺紋、發黃、松馳、干燥和革狀的皮膚。此外，由于反復的太陽輻射導致了前癌以及癌病變。
抗氧化劑維生素E和C以及β-胡蘿卜素都以其在退行性疾病，例如癌和心血管疾病的預防中的潛在作用受到相當的關注。
已知維生素C作為抗氧化劑和自由基清除劑，在正常的細胞代謝中直接與產生的過氧化物、羥基和單線態氧反應。氧是生命所必需的。氧也以一些自由基的形式存在，其與致癌過程的開始和開始后階段以及侵入和轉移過程都有聯系。
除了它的抗氧化劑性質以外，對于維生素C的抗癌性質沒有一個普遍接受的和經過驗證的解釋。很可能包含各種途徑，其包括(1)通過促進淋巴細胞的產生來強化免疫系統；(2)補救細胞自由基損傷；(3)抑制透明質酸酶，維持腫瘤周圍的底物的完整和防止轉移；(4)通過吞噬細胞活性的增強來殺死腫瘤病毒；(5)校正通常存在于癌癥患者中的抗壞血酸缺乏；(6)刺激腫瘤“堅壁起來(walling off)”所需的膠原蛋白形成和穩定；以及(7)中和致癌毒素。
作為強烈的免疫反應所需要的關鍵營養素和重要的脂溶性抗氧化劑，已經證明了維生素E的癌癥預防作用。為了減輕癌癥，利用維生素E作為預防營養劑來防止進一步的氧化脅迫是所有減輕癌癥的營養方案的基礎。
美國專利5,648,377描述了親脂性和親水性的抗氧化劑的制劑和組合，及其在治療、食品、營養品和化妝品領域的應用。這些制劑是基于類胡蘿卜素、前類胡蘿卜素及其具有兒茶酚結構的多元酚的衍生物的應用。這些制劑可被用于預防至少部分與自由基產生過剩相關的生理病理狀況，特別是老化、動脈粥樣硬化和癌癥。因此，意外地發現親水性抗氧化劑與親脂性抗氧化劑的組合發揮遠大于在相等濃度下測定的單個化合物的總和的抗氧化活性。具體公開的抗氧化劑或其原料是從葡萄中提取的procyanidol低聚物、番茄烯、維生素E和原花青素A2。
美國專利US5,156,852公開了一種用于清除與眼病相關的自由基及其它氧化劑的組合物，其包括維生素E和C、醋酸鋅、銅、硒、錳以及L-半胱氨酸、吡哆醇和核黃素這三者中的至少一種。維生素C和E起抗氧化劑的作用，而醋酸鋅、銅、硒和錳作為金屬酶的輔因子來清除氧化劑。其余的三種化合物能增加谷胱甘肽的濃度。
抗氧化劑是體內抵御氧化脅迫的重要成分，并且已知具有普遍的抗老化特性和特定疾病防護的功能。在這方面重要的抗氧化劑例如為維生素E、維生素C和胡蘿卜素，其組合提供了協同的細胞保護(Boehm，F.，Edge，R.，McGarvey，D J，FEBS Lett.436，387-389，1998)。此外，其它來源于食物而沒有維生素功能的抗氧化劑，例如類黃酮、多酚或番茄紅素也具有非常重要的抗氧化功能。
一般已知某些維生素和礦物質、抗氧化劑和植物提取物具有有益的健康效果。例如，許多年前就已知了抗氧化劑的一些有益的方面。抗氧化劑是與自由基，例如羥基基團反應的化學制劑，來保護某些生物學系統。已經表明從體內除去自由基能延長人類壽命；特別地，已經表明抗氧化劑包括類胡蘿卜素、維生素E和尿酸的存在與哺乳動物中抗組織的天然自氧化和對DNA的氧化破壞正相關(Cutler，R.，Am.J.Clin.Nutr.53373S-9S(1991))。如使用例如A、E和C的維生素以及硒(US 5,149,321)來復蘇大腦的方法所示，已知抗氧化劑也限制了依靠自由基來醫治腦組織所造成的破壞。
除了其抗氧化劑活性之外，已知維生素A、C和E具有其它有益的健康效果。例如，已知維生素E有助于保持正常的血糖水平。作為另一個例子，已知維生素C在體內的結締組織和結構組織的完整性上起必要的作用。已知維生素A在好的視覺和生長發育中起作用。因此，這些維生素的足量供應對于維持最佳健康狀態是必需的。已經表明當與某些活性肽聯合使用時，維生素A、E、C和硒的應用可用來作為抑制或阻止人類皮膚的膠原交聯的手段(WO 90/06102)。
US 5,648,377涉及表現協同抗氧化劑活性的番茄紅素與葡萄提取物(葡萄籽提取物)的組合物。US 6,627,231教導了令人驚奇的發現，即，葡萄籽提取物、番茄紅素、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素的組合給藥以協同作用的方式顯著增強了細胞保護。依據這種發現，上述物質的細胞保護作用在統計學上要大于葡萄籽提取物和番茄紅素或維生素C和番茄紅素的組合物的作用。
WO 01/78674公開了特別以膠囊和片劑的形式來用于治療皮膚老化的組合物。這些組合物包括有效組分番茄紅素、葡萄籽提取物、維生素C和維生素E。
WO 99/483 86公開了一種食品添加劑，其包括碧蘿芷(pycnogenol)、番茄紅素、維生素C和維生素E。
US 5,895,652涉及最佳化體內固有生化途徑來由此限制在自然老化過程中的缺陷所引起的損傷的口服補充方案。這些補充的單個組合物列在一個很長的目錄中，其延續了若干頁，并包括番茄紅素、維生素C、維生素E和葡萄籽提取物。
WO 98/33494公開了用于抗血管和毛細管疾病的營養素和治療劑組合物，并組合了不同的抗氧化劑或具有抗氧化作用的組分，包括番茄紅素、葡萄籽提取物、維生素E和茶多酚。
WO 01/51088公開了用于降低心血管疾病患病風險的組合物，并包括番茄紅素、維生素E、維生素C和葡萄籽提取物。
WO 02/071874公開了用于防止或修復哺乳動物老化相關功能的缺乏，并包括維生素C、維生素E、番茄紅素、洋甘菊(chamomille)干提取物、葡萄籽提取物和茶葉兒茶酸。
因此，現有技術教導了至少維生素C、維生素E、番茄紅素和葡萄籽提取物降低對細胞的氧化損害，從而預防各種與老化相關的癥狀的組合作用。
抗氧化劑的基本功能是保護細胞不受活性氧(ROS)或其它自由基的氧化。ROS是高效中間體，其攜帶未成對電子，并容易影響人體組織中的其它分子，導致氧化反應。ROS作為線粒體呼吸的正常副產物而產生，并對正常細胞功能是必不可少的。但是，ROS也可以由氧化脅迫引起，由外部因素誘發，并已經與許多疾病過程相聯系。一般地，在體內存在的抗氧化劑清除了這些非必需的ROS，并通過電子轉移將其轉化為穩定的化合物。抗氧化劑的這個活性防止了ROS對于細胞組分的氧化損傷。但是，當氧化脅迫過度時，體內的抗氧化劑可被耗盡，導致細胞損傷。過度的氧化脅迫可能是由一些抗腫瘤劑(其產生ROS)所誘發的，也可能是由癌癥本身所誘發的。因此，已經進行了研究來確定抗氧化劑對于癌細胞和抗腫瘤劑活性的作用。
在氧化脅迫期間，過量的ROS導致脂類過氧化物酶的大量產生。隨后，脂類過氧化物酶通過延長G1期或使細胞進入G0期來影響細胞周期。
在增殖細胞中，細胞周期包括四個階段。Gap1(G1)是在有絲分裂和DNA復制之間的時期，以細胞生長為特征。在G1的限制點(R)發生的轉變使細胞進入增殖循環。DNA的復制發生在合成(S)期，其后有第二個Gap期(G2)，其間進行生長以及細胞分裂的準備。在M期進行有絲分裂，并產生兩個子細胞。
通過細胞周期的四個時期的傳代是由細胞周期蛋白家庭所調節的，其作為細胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)的調節亞基。調節通過細胞周期G1-S-G2期的進行的各種細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的活性是由在細胞周期的特定時期的適當的細胞周期蛋白的合成所控制的。然后，細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物由主要位于cdk亞基上的復合物的關鍵殘基的連續磷酸化與脫磷酸化作用來活化。
G1早期的細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物是與細胞周期蛋白D同種型相結合的cdk2、cdk4或cdk6。存在一些可以在G1期抑制細胞周期的蛋白。如果發生了DNA損傷，p53在細胞中積累，并誘發細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶的p21介導的抑制。Mdm2，通過促進p53的核釋放/失活，成為失活p21介導的G1停滯的抑制反饋環路的一部分。類似地，TGF-b受體的活化誘導p15對細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制，而cAMP通過p27抑制細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物。如果細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物被抑制，則成視網膜細胞瘤蛋白(Rb)處于低磷酸化狀態，并與轉錄因子E2F緊密結合，抑制其活性。
經過限制點并轉換到S期的途徑是由細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶復合物的活化所觸發的，其使Rb磷酸化。磷酸化Rb與E2F分離，然后E2F得以自由啟始DNA復制。在G期晚期，細胞周期蛋白D/細胞周期蛋白依賴性激酶2積累，并觸發進入S期。在S期，整個基因組被復制。細胞周期蛋白B/細胞周期蛋白依賴性激酶2的合成與積累也在S期開始，但該復合物在Thr14-Tyr15處磷酸化，并失活。細胞周期蛋白A/細胞周期蛋白依賴性激酶2在S期積累，其活化觸發向G2的轉變，G2期以細胞周期蛋白B/細胞周期蛋白依賴性激酶2的積累、DNA復制的抑制、細胞生長和新蛋白質的合成為特征。
簡單地說，在DNA的重新合成(在S期)和在有絲分裂(M期)的細胞分裂以前，每個細胞都具有非常精細的機制來修復DNA損傷。作為DNA損傷的反應，增加某些細胞周期調節劑例如p16和p53，通過抑制特異性細胞周期蛋白依賴性激酶(cdk4和cdk2)來抑制細胞周期的進行。這使細胞能夠在DNA在所謂的G1/S關卡重新合成之前修復DNA損傷，來防止細胞從G1進入S期(

圖1)。在紫外線誘導損傷之后，如皮膚活組織檢查所示在皮膚中p53增加，而恢復到基礎水平是測量皮膚的修復狀況的尺度。在細胞衰老階段p16升高。
在早期研究中(Emri等人，J Invest Dermatol 115435-440，2000)在紫外線照射4天后，在G2/M期發現了成纖維細胞的劑量依賴性增加。
將G1停滯細胞釋放到S階段取決于DNA的損傷程度。因為DNA的損傷程度直接與細胞的氧化水平相關，可以預期氧化水平的最有效減少又將導致G1停滯細胞最快速地釋放進入S階段。根據現有技術，這意味著至少維生素C、維生素E、番茄紅素和葡萄籽提取物的聯合作用。
Abid-Essefi等人(TOXICOLOGY，192(2-3)237-248，2003年11月5日)描述了維生素E可能在DNA修復發生的時候起維持延長的細胞周期停滯的作用。
Galli等人(ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS，423(1)97-102，2004年3月1日)描述了維生素E對細胞周期蛋白D1的表達有抑制作用，同時減慢細胞的生長。
Gysin等人(FASEB JOURNAL，16(12)，2002年10月)描述了維生素E通過降低細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E的水平來抑制細胞周期的進行。
Panaro等人(British Journal of Cancer(1999)80，1905-1911)顯示細胞周期可被各種抗氧化劑，包括維生素C和很多的類黃酮所阻斷。
因此，現有技術說明抗氧化劑的給藥導致細胞周期阻斷的延長。
已經顯示了，紫外線(UVB和UVA)輻射引起皮膚各種形式的損傷。UVB輻射(波長280-315nm)連續地誘導我們皮膚的上層的(DNA)損傷。UVA輻射(315-400nm)更深地進入較下的皮膚層，真皮，但幸運的是這類輻射比高能的UVB輻射的損傷要小得多。
DNA損傷大概是紫外輻射所引起的最嚴重的損傷，因為其直接影響細胞的遺傳潛能。UVB誘導的DNA損傷導致細胞周期調節劑的誘導，其后在DNA修復可以發生時細胞周期停滯。細胞的UVA照射可能通過間接的機制包括形成氧自由基來損傷DNA。迄今為止還沒有完全闡明UVA如何誘導損傷影響細胞周期的控制，以及氧化損傷的抑制是否必然影響細胞周期的進行。
令人驚訝的是，申請人發現維生素C和維生素E的協同作用，優選連同白茶提取物，導致細胞從G1停滯快速的釋放。
由此可見，細胞的氧化水平和相關的DNA損傷不能直接地與需要再生細胞并進入S期的時間有相互關系。用于處理皮膚衰老表征的有效方案無疑取決于在發生氧化損傷之后細胞繼續生長的能力。
發明概述本發明的一個方面是用于預防性和/或治療性處理患皮膚衰老的征兆的個體的包含維生素E、維生素C和白茶提取物的口服給藥的組合物。特別地，當組合物作用于成纖維細胞時，老化的征兆減少。
根據本發明，在皮膚老化(例如皺紋)的反向確定臨床特征中，獲得了包含維生素C、E和白茶提取物以及各種植物提取物、氨基葡糖和礦物的口服營養補充劑的潛在好處。根據定義，營養劑是具有健康好處的物質，其包括疾病的預防和治療。
以前已經證明了一些礦物質在對來自內在和外在因素的細胞保護中的作用。硒、硅、銅、鋅和錳是可包括在根據本發明的制劑內的礦物質。鋅作為超氧化物歧化酶(SOD)的輔助因子，其依次與銅SOD、線粒體錳SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶同時起作用，作為主要的細胞抗氧化劑。錳，一種過渡金屬，結合膠原纖維，并抑制彈性蛋白酶，所述彈性蛋白酶分解膠原和彈性組織。錳也在膠原和糖蛋白合成中起關鍵作用，并作為催化葡糖胺轉換為透明質酸的輔因子。另外，已經顯示了錳保護培養的人皮膚成纖維細胞不受UVA和過氧化氫的氧化損傷。
該組合物可包含更多已知抑制老化過程的組分。特別地，植物提取物例如白茶提取物、葡萄籽提取物、具有高含量番茄紅素的番茄提取物、大豆提取物、琉璃苣籽油、亞麻籽油、洋甘菊干提取物和特定的分餾椰子油都與本發明相關。此外，例如列于各種組織包括軟骨的提取物中的成分，可包括在該組合物中。
本發明的組合物可配制成任何適合的形式。優選配制本發明的組合物，用于口服給藥。為了口服給藥，本發明的組合物可以任何適當的形式提供，特別是以口服液、片劑、膠囊、營養食品或營養補充劑的形式。這樣的組合物進一步包含至少一種合適的賦形劑和/或適于口服的助劑。
優選實施方式現在已經發現了減少皺紋和改善其它的皮膚狀況，例如增加皮膚彈性和皮膚柔軟度的制劑。此外，對于不健康的皮膚，例如老化的皮膚或日光照射過度的皮膚的預防或治療，可有益地通過用本發明的組合物對需要治療的人給藥來實現。該組合物包括許多不同組分的組合，所述不同組分相互作用來提供所想要的對皮膚的改善。
本發明有益的藥物組合物通過利用足夠使皮膚細胞解除G1停滯量的維生素E和維生素C來預防和改善皮膚狀況。該組合物的更多的有益組分可包含從例如葡萄籽和番茄中提取出來的天然存在的抗氧化劑、包含糖胺聚糖的提取物、具有結合膠原和彈性纖維并使皮膚變厚的有效量的過渡金屬組分、以及抑制在皮膚中存在的抗膠原酶的足夠量的基于兒茶素的組分。
較厚的真皮如愿地減少當皮膚區域變薄時出現的皺紋。除了解除細胞周期足短的令人驚奇的效果之外，抗氧化劑，例如維生素C，抑制了分解膠原和彈性組織的酶，膠原酶和彈性蛋白酶。這些抗氧化劑參與預防增加的皺紋，并促進皮膚組織的愈合。最終，包含過渡金屬組分來結合膠原纖維，并抑制彈性蛋白酶，該酶也分解膠原和彈性組織。
包括主要抗氧化劑的組合物，其典型的是維生素C源，并優選是抗壞血酸，或其藥學上可接受的鹽或酯，更優選是棕櫚酸抗壞血酸酯、L-抗壞血酸二棕櫚酸酯、L-抗壞血酸-2-硫酸鈉或抗壞血酸鹽，例如抗壞血酸鈉、鉀或鈣或其混合物。當使用該組合物的口服制劑時，優選使用維生素C的非酸形式來降低當使用酸性形式時所出現的胃刺激。
術語“包含氨基葡糖的提取物”是指包括軟骨、可從中提取的組分以及其衍生物，包括可從軟骨和合成制備的衍生物中提取的組分的合成形式。這樣的組合物也可在其它包含結締組織的組織中，例如皮膚中得到，并可從中提取。軟骨可選自海洋動物軟骨、魚類軟骨、軟體動物軟骨和陸地居住哺乳動物軟骨。海洋動物可選自由鯨、海豚和海豹；魚可選自由鯊魚、鮭魚、金槍魚、鱈魚及其它已知的魚類；軟體動物可為魷魚；陸地居住哺乳動物可選自由牛、豬、雞、鴨和火雞。
軟骨或其提取物優選選自牛軟骨、豬軟骨、鯊魚軟骨、魷魚軟骨、雞軟骨和鮭魚軟骨。軟骨本身可被使用。其可典型地以無水干燥形式使用，例如凍干、粉末狀軟骨。上述類型的軟骨或其它含有合適的組分的組織的有用提取物可典型地通過熟組織的局部酶的蛋白水解，之后過濾并干燥水解產物，例如通過噴霧干燥或冷凍干燥進行制備。軟骨提取物典型地包含從軟骨中提取的一種或多種化合物，并優選包含糖胺聚糖，選擇性地與肽相結合。
軟骨的提取物優選包含軟骨素硫酸鹽、角質素硫酸鹽、透明質酸或皮膚素硫酸鹽或其混合物。術語軟骨提取物指包括可從軟骨中獲得的化合物，但其事實上可通過其它來源獲得這些化合物。
術語軟骨提取物可涉及從軟骨或其衍生物中提取的化合物。如上所述，軟骨提取物可來自其它的天然來源，但可來自合成來源，即合成或半合成制備的來源。
軟骨提取物優選包含選自由軟骨素酯、角質素酯、透明質酸或其酯、皮膚素酯、肝素和乙酰肝素酯所組成的組的糖胺聚糖。這些可與蛋白質或肽結合或作為軟骨素酯、角質素酯、透明質酸或其酯、皮膚素酯、肝素、乙酰肝素酯，優選軟骨素硫酸鹽、角質素硫酸鹽、透明質酸或其酯、皮膚素硫酸鹽、肝素、乙酰肝素硫酸鹽的差向異構體或多聚體。糖胺聚糖可選自由軟骨素硫酸鹽和角質素硫酸鹽所組成的組，其每個可選擇性地與肽相結合。最優選地，本發明的組合物包含5％軟骨提取物，其包含選擇性地與肽結合的軟骨素硫酸鹽。
在優選的實施方案中，本發明的組合物包含小于1％重量/重量的膠原，優選小于0.5％，特別優選小于0.1％膠原蛋白。使用典型的方式來制備膠原提取物，其不包含任何可見量的膠原。優選通過酶的蛋白水解而將膠原蛋白消化為肽來制備提取物。優選不將膠原或其來源進一步加到本發明的組合物中。在最優選的實施方案中，該組合物基本上是不含膠原的。
本發明的制劑可同時包括一或多種氨基酸以增加真皮的密度。優選聯合使用兩或多種氨基酸。L-或D-型氨基酸都可接受。賴氨酸和脯氨酸是最優選的氨基酸，并有利于組合使用。如果需要，也可以使用半胱氨酸、甲硫氨酸或其它氨基酸。氨基酸可包含在可溶形式例如氫氯化物，即L-賴氨酸氫氯化物中。氨基酸各存在大約2到25重量％，優選各存在大約4到20重量％，更優選各存在大約6到15重量％。在藥物組合物中，每種氨基酸的單位劑量一般地是各大約35mg到200mg，優選各大約50mg到150mg，更優選各大約70mg到120mg。氨基酸另外的有用形式包括下列半胱氨酸源，優選N-乙酰半胱氨酸，可以組合物的大約1到10的重量％存在，優選大約2到8的重量％，更優選大約3到6的重量％。甲硫氨酸源，優選L-硒代甲硫氨酸，可以組合物的大約0.1到5的重量％存在，優選0.2到3的重量％，更優選0.3到1的重量％，其中硒組分占甲硫氨酸源的大約0.1到3的重量％。
包含有效量的一種或多種過渡金屬組分結合膠原和彈性組織來復原皮膚。某些過渡金屬組合物通過抑制彈性蛋白酶來抑制膠原和彈性組織的分解。優選過渡金屬包括鋅、錳和銅。
可加入鋅組分來參與結合膠原和彈性纖維，兩者都參與皺紋的預防和皺紋皮膚的復原。同時，已知鋅是整個集合的金屬酶的重要輔因子，并且并不限于清除潛在的氧化劑過氧化物的超氧化物歧化酶。
鋅組分可為任何鋅化合物或其在藥學上可接受的鹽，優選葡萄糖酸鋅，其中鋅一般以組合物的大約1到10的重量％存在，更優選大約2到7的重量％，最優選大約3到5的重量％。
本發明組合物中的抗氧化劑可以來自自然或合成來源。在典型的實施方案中，天然源選自由松樹皮、葡萄、茶(Camelia sinensis)、歐洲七葉樹(Aesculus hippocastanum)、銀杏(Gingo biloba)、Cardusmarianum)、Vaccinium myrifilus、水飛薊(Silybum marianum)所組成的組。
在適當的實施方案中，一個或多個天然抗氧化劑是從葡萄籽中提取出來的。
天然源的一個或多個抗氧化劑一般包含達到25％重量/重量的兒茶素、表兒茶精和沒食子酸；達到90％重量/重量的表兒茶精二聚物、三聚物和/或其沒食子酸鹽，以及達到10％重量/重量的表兒茶精五聚物、六聚物和/或七聚物，和/或其沒食子酸鹽。
一個或多個天然抗氧化劑可選自多酚及其酯；抗壞血酸(維生素C)及其酯；以及其藥學上可接受的鹽。多酚一般地為兒茶素、無色花色素和黃烷酮；黃烷、異黃酮和花色素、黃酮醇、黃酮木脂素及其寡聚物。
這樣的多酚、黃酮木脂素或類黃酮，是在許多植物中天然存在的抗氧化劑。在本發明中，異黃酮提取自大豆，黃酮提取自紫草科、百里香或歐芹，兒茶素提取自茶葉(優選白茶)，前花色素提取自葡萄(優選葡萄籽)。
在優選的實施方案中，天然抗氧化劑是從由前花色素A2和低聚物前兒茶精(OPC)，最優選低聚物前兒茶精選擇的兒茶素。黃酮木脂素一般地是水飛薊素或其組分之一，例如水飛薊素、水飛薊寧、次水飛薊素和異水飛薊素。
如上所述，特別優選天然抗氧化劑是來自葡萄籽，即葡萄的種子的提取物，所述提取物一般地是通過使用有機溶劑，例如丙酮和/或乙酸乙酯等提取葡萄籽、蒸發溶劑、再溶解水中的殘渣、過濾和干燥(例如通過噴霧干燥或冷凍干燥)濾液來獲得的。在特別優選的實施方案中，該提取物一般包含達到25％重量/重量的兒茶素、表兒茶精和沒食子酸；達到90％重量/重量的表兒茶精二聚物、三聚物和/或四聚物，和/或其沒食子酸鹽；以及達到10％重量/重量的表兒茶精五聚物、六聚物和/或七聚物，和/或其沒食子酸鹽。
另外，抗氧化劑一般是類胡蘿卜素、前類胡蘿卜素、5-生育酚、植物甾醇和泛醌。類胡蘿卜素是特別重要的親脂性的抗氧化劑，其可選自α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素、番茄紅素、玉米黃質、隱黃質、葉黃素和xanthofyll。
本發明的組合物一般包含小于25重量％的β-胡蘿卜素，優選小于10％的β-胡蘿卜素，特別優選小于0.1重量％的β-胡蘿卜素。因此，本發明的進一步的方面涉及所述在極少或基本上沒有β-胡蘿卜素的條件下，可以獲得有益效果的組合物。
番茄提取物，包含番茄紅素。優選，番茄提取物包含大約5到12重量％，一般大約10重量％的番茄紅素(重量/重量)。番茄提取物可來自單個番茄或番茄混合物。
在典型的實施方案中，用于制備番茄提取物的番茄種類是Lycopersicum aesculentum。
在本發明的優選實施方式中，組合物包含0.1到5重量％的番茄紅素(重量/重量)，優選0.2到4重量％的番茄紅素，例如0.3到2重量％的番茄紅素，最優選0.3到1重量％的番茄紅素，特別是0.3到0.8重量％，例如0.3到0.6重量％的番茄紅素。
在本發明的組合物的選擇性定義中，組合物包含植物提取物和軟骨提取物，其中植物提取物包含葡萄籽提取物和番茄紅素，其重量/重量比大約是5∶1到15∶1，優選大約10∶1。
依據本發明的進一步的合適的組合物包含下列組分10-200mg，優選20-100mg，更優選30-80mg，更優選35-65mg，最優選45-55mg的軟骨提取物；10-200mg，優選20-100mg，更優選30-80mg，更優選35-65mg，最優選45-55mg的植物提取物；1-50mg，優選3-40mg，更優選5-30mg，更優選8-25mg，最優選10-20mg的維生素C；0.1-30mg，優選0.5-20mg，更優選1-15mg，更優選2-10mg，最優選3-7mg的維生素E；1-50mg，優選3-40mg，更優選5-30mg，更優選8-25mg，最優選10-20mg的白茶提取物；以及1-40mg，優選2-30mg，更優選3-20mg，更優選5-15mg，最優選7-12mg的葡萄糖酸鋅，其中植物提取物包含低聚物procyanidol和番茄紅素，軟骨提取物包含糖胺聚糖。
用于給藥的單位劑量可在50到2000mg之間，優選在100到1500mg之間，更優選在150到900mg之間，更優選在200到700mg之間，最優選在250到600mg之間。
雖然可使用任何合適的給藥途徑來向病人提供有效劑量的依照本發明的組合物，但是優選口服方式。合適的途徑包括，可使用例如口服的、直腸的、腸胃外的、靜脈內的、局部的、透皮的、皮下的、肌肉內等的給藥方式。
合適的劑型包括片劑、錠劑、消散劑、分散劑、液劑、膠囊劑、貼片、栓劑等，雖然優選口服劑型。用于本發明方法的藥物組合物包括如上所述的活性成分，也可包括藥學上可接受的載體、賦形劑等，以及選擇性的其它治療組分。
術語“藥學上可接受的鹽”指從藥學上可接受的無毒的酸或堿，包括無機或有機酸所制備的鹽。這種無機酸的實例是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、乙酸、硫酸和磷酸。合適的有機酸可選自，例如，來自有機酸的脂肪族、芳香族、羧基和磺酸基類，所述有機酸例如甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙二酸、葡萄糖醛酸、馬來酸、糠酸、谷氨酸、安息香酸、氨茴酸、水楊酸、苯乙酸、扁桃酸、embonic(雙羥萘酸)、甲基磺酸、乙基磺酸、泛酸、苯甲基磺酸、硬脂酸、磺胺酸，、algenic和半乳糖醛酸。用于與本發明的硫酸鹽或磷酸鹽化合物形成潛在的鹽的這種無機堿的實例是，包括用鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制取的金屬鹽。合適的有機堿可選自，例如，N，N-二芐基乙烯二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因。
用于本發明的組合物例如懸浮液、液劑和酏劑；氣霧劑；例如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等，的載體的組合物，在口服固體制劑(例如粉劑、膠囊劑和片劑)的情況下，口服固體制劑比口服液體制劑更優選。最優選的口服固體制劑是片劑。
由于其給藥的便利，片劑和膠囊劑代表了最有益的口服單位劑型，此時使用固體藥物載體。如果需要的話，可通過標準水成或非水成的技術來包被片劑。
例如，可通過擠壓或模壓選擇性地與一或多輔助成分制備片劑。可通過在合適的設備上壓縮自由流動形式的活性成分，例如粉末或顆粒，選擇性地與結合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合，來制備擠壓的片劑。可通過模壓，在合適的設備上，用被惰性液體稀釋劑潤濕的粉末化合物的混合物來制備模壓片劑。
實施例1抗氧化劑組分對細胞周期的影響在一系列實驗中，使用FACS分析來測定紫外線對于培養的皮膚成纖維細胞的細胞周期分布的影響。發現UVB(1kJ/m2)和UVA(250kJ/m2)都引起細胞周期的抑制。同時對于UVA，在照射之后第一天發現G1細胞增加。研究了抗氧化劑治療對于皮膚成纖維細胞的細胞周期的作用。
材料和方法細胞培養和照射(更加詳盡的資料參考de Leeuw SM，Smit NP，VanVeldhoven M，Pennings EM，Pavel S，Simons JW，Schothorst AAMelanincontent of cultured human melanocytes and UV-induced cytotoxicity.J.Photochem.Photobiol.B 2001，61106-113)將來自人皮膚的成纖維細胞在補充有2.5％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)以及100IU/l青霉素和100g/l鏈霉素的Dulbecco氏修飾Eagle培養基中，在37℃、低于5％二氧化碳濃度下培養。為了繼代培養，將細胞在0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液(Gibco)中分離，水解為1∶5，在90mm Greiner Petri盤中對照培養基中進行維持。在三天之后，將細胞在不同的培養基中孵育對照；以及維生素E和C(7和10μM)加上白茶(5μgram/ml)。三天后除去培養基，用4ml PBS沖洗細胞，在帶蓋的盤中在5ml Hank氏平衡鹽溶液中照射。使用2.001型紫外源Sellas Sunlight燈(Sellas，Gevelsberg，Germany)以250KJ/m2劑量的UVA進行照射。UVASUN藍板和UVASUN藍薄膜濾波器將波長低于320nm的光濾掉2。用使用WBS320#801傳感器的IL700A測定輻射計(International Light Inc.，Newburyport，MA，USA)來監控劑量。
通過FACS分析測定細胞周期分布在UVA處理之后，將細胞在對照培養基中保存過夜。在收獲細胞一小時之前，加入100μM BrdU(5-溴代-2-脫氧尿苷，Sigma，B5002)來摻入到DNA中。通過胰蛋白酶處理來收獲細胞，并在用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗之后同定于70％乙醇中。
在除去過量乙醇之后，將細胞在含0.1％胃蛋白酶的0.9ml的2MHCl中孵育35分鐘。加入1M Tris(2.1ml)，用(PBS-Tween 0.5％)沖洗細胞兩次。然后將細胞在用含有5％初生小牛血清的PBS-Tween以1∶50稀釋的100μl小鼠-α BrdU抗體(DAKO，Bu20A)中室溫孵育1小時。在沖洗兩次之后，將細胞在含有以1∶100稀釋在PBS-Tween-NBCS稀的100μl山羊抗小鼠IgG1-FITC(Pharmingen，no 553443)中黑暗中4℃孵育1小時。在沖洗兩次之后，加入400μl溶于PBS的20μg/ml碘化吡啶，0.1％核糖核酸酶(RNase，Sigma)，通過使用FACS-Caliburl(Beckton Dickinson)的FACS分析來測定細胞。以F1-1來測定BrdU的FITC標記，記錄FL-3和10000事件中的P1，并用細胞測定軟件(Beckton Dickinson)來進行分析。
結果圖1顯示了與偽照射成纖維細胞培養物(灰色)相比，在UVA照射一天之后(黑色)細胞在G1和G2期的分布狀態。
結果確定地表現了與對照細胞相比，在用維生素E+維生素C+白茶處理的細胞中存在于G1和G2期的細胞的百分數的差異。UVA照射引起對照細胞中處于G1期的細胞(G1停滯)的增加。在用維生素E+維生素C+白茶處理的細胞中存在于G1階段的細胞的百分數相當低，表明與對照培養物相比，較少細胞在G1階段被抑制。因此，與對照細胞相比，在用維生素E+維生素C+白茶處理的細胞中存在于G2期的細胞的數目更多。
重建的皮膚等效物實施例2組合物對使用離體培養的皮膚等效物的真皮細胞外基質和表皮的發育和構建的影響試驗的目的在于使用3-D體外重建的皮膚等效物(SE)的技術來測定根據發明的特定組合物的效果(以下簡稱高濃度組合物和低濃度組合物、或一般濃度組合物)。
用較低和較高濃度的組合物(高濃度組合物和低濃度組合物)來處理來自19或49年供體的細胞所制備的SE，或對其不作處理和培養35，42或60天。此后檢查培養物的表皮和真皮層結構和組織。此外，使用Q RT-PCR和免疫熒光法來確定主要細胞外基質(ECM)組分例如肌原纖維蛋白、彈性蛋白和I型膠原的合成。
材料和方法細胞培養角質細胞和成纖維細胞的原始培養物是由整形外科的手術獲得的殘余材料(residus operatoire)所提供的人。成纖維細胞在補充有10％牛血清(Hyclone，Logan，Utah，USA)、20μg/ml慶大霉素(Panpharma，Fougeres，France)、100IU/ml青霉素(Sarbach，Suresnes，France)以及1μg/ml的兩性霉素B(Bristol Myers Squibb，Puteaux，France)的Dulbecco氏修飾Eagle培養基(DMEM with Glutamax-1，LifeTechnologies，Cergy Pontoise，France)中生長。對于SE而言，角質細胞在分別補充有10％小牛血清(FCS)(HyClone)、10ng/ml表皮生長因子(EGF)(Austral Biologic，San Ramon，California，USA)0.12IU/ml胰島素(Lilly，Saint-Cloud，France)、0.4μg/ml氫化可的松(UpJohn，St Quentin enYvelines，France)、5g/ml三碘-L-甲狀腺原氨酸(Sigma，St QuentinFallavier，France)、24.3μg/ml腺嘌呤(Sigma)和抗生素的DMEM和Ham′sF12(Life Technologies)的3∶1混合物中生長。為了制取角質細胞單細胞層，在鋪滿生長后5天內在補充有12 mMCaCl2的限制K-SFM培養基(Life Technologies)中生長。
皮膚等效物和真皮等效物使用通用的人工實驗室技術，在實驗室中制備3-D體外重建的皮膚等效物(SE)。SE在形態上和生物化學上與具有完全發育的真皮、和角質層的天然人類皮膚非常相似(Saintigny G，Bonnard M，Damour O，Collombel C.Acta.Derm.Venereol，1993，73175-180；Sahuc F，Nakazawa K，Bethod F，Collombel C，Damour O.Wound RepReg，1996，493-102)。
如Duplan-Perrat等人，2000所描述的方法來制備皮膚等效物(SE)。簡要地說，通過在膠原-糖胺聚糖-脫乙酰殼多糖多孔spongemimedisk@(Coletica，Lyon)上加入2×105成纖維細胞/cm2的懸浮液來制備真皮等效物(SE)。在包含1mM抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma)的成纖維細胞培養基中培養全部的等效物21天。每天對真皮等效物補料(DE)。在第14天，以250,000細胞/cm2的密度在真皮等效物上接種角質細胞。在角質細胞培養基中深層培養7天之后，將SE放到氣液交界面上，在包含補充有10％小牛血清、10ng/ml EGF 0.12IU/ml胰島素、0.4μg/ml氫化可的松和抗生素的DMEM的簡化角質細胞培養基中培養。培養基補充以50μg/ml L-抗壞血酸，并每天替換。總共培養SE35，42或60天。
補充組合物在SE發育的初期(從培養基首次更換開始)，將測試的組合物以兩種濃度加入(為了確定劑量反應關系)到培養基中。將成纖維細胞在Mimedisk上接種之后從培養基首次更換開始，直到試驗的最后，將組合物加入到培養基中。同時，用僅包含能溶解活性組合物化合物的的溶劑，四氫呋喃(THF)來制備對照皮膚等效物。
以兩種濃度加入組合物

樣品分析在培養35，42或60天之后，收集SE，并進行分析。將每個SE條件的三種樣品固定于福爾馬林中，并包埋到石蠟中。五μm切片用蘇木精-根皮紅-番紅花色素染色，在光學顯微鏡下觀察來鑒定真皮和表皮的結構。進一步地，為了進行免疫熒光法測定將三個樣品歸入組織-tek，為了進行定量RT-PCR將三個樣品在-80℃下冷凍。
免疫組織學和免疫熒光法將皮膚等效物的樣品包埋到OCTTissue-Tek(Miles，Immunotech，Marseille，France)中。用Frigocut 2800 cryotome(Reichert-Jung，Paris，France)獲得六個微米的冷凍切片，自然干燥，在包含1％(wt/vol)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉。用于該研究的抗體列于下表。
用于皮膚等效物的抗體


特異于人膠原的I型膠原抗體不與用于制備真皮基質的牛膠原交叉反應(Noblesse等人，J Invest Dermatol.，2004；122(3)621-30)。
第二抗體，標記有FITC的山羊抗兔IgG(1∶50稀釋，SanofiDiagnostic Pasteur，France)或山羊抗小鼠IgG(1∶50稀釋，Cedarlane，Canada)，混合了0.1％的伊文思藍來減少海綿網的非特異性染色(Kieny和Mauger，1984)。對于對照，省略了第一抗體。處理每個樣品的多個切片來保證代表的樣品。
定量RT-PCR為了在第42天和第60天產生彈性蛋白、肌原纖維蛋白1和I型膠原的mRNA，我們使用定量RT-PCR。使用來自Promega的“SV 96總RNA分離系統”提取皮膚等效物的總RNA。對于每個樣品，獲得100μl純化的總RNA，用分光光度計(spectramax190；Devices)在260nm下定量，并在使用前在-80℃下保持冷藏。
為了進行定量RT-PCR，我們設計了特異于每個基因的引物。我們使用“QuantiTect SYBR Green RT-PCR”試劑盒(Qiagen)，利用特異的引物來進行一步的定量RT-PCR。反應混合物包括SYBR綠色緩沖液1X；0.5μM的兩種特異引物；1μl的酶混合物；50ng的總樣品RNA；50μl的無RNase的qsp溶液。反應在OPTICON熱循環儀(MJ Research)上進行。在反應進行之后，將樣品在2％瓊脂糖凝膠中電泳來保證PCR產品是純的。
結果組合物對于來自19歲供體的真皮成纖維細胞的皮膚等效物重建的效果無論濃度如何，組合物延緩了表皮的老化。圖2顯示高濃度和低濃度組合物對于來自19歲供體的真皮成纖維細胞重建的皮膚等效物的效果。蘇木精-根皮紅-番紅花色素染色。放大倍數25x。
在培養的42天里，對照樣品中的表皮顯示了具有若干層有活力的表皮細胞和角質層的典型結構(圖2，對照，42天)。通過延長培養時間(對照，60天)，表皮變得相當薄，完全分化，并顯示出長時間持續培養中SE退化的一些典型特征(表皮衰老)。用組合物的處理導致衰老的延遲，其由厚的、多層的和更新的表皮的形成顯示。(圖2，高和低濃度的組合物，60天)。對真皮的影響不明顯。
組合物對于從49歲供體的真皮成纖維細胞重建的皮膚等效物的效果影響圖3顯示該高濃度和低濃度的組合物對于由49歲供體的真皮成纖維細胞重建的皮膚等效物的效果。蘇木精-根皮紅-番紅花色素染色。放大倍數40x。
組合物延緩表皮衰老，刺激致密真皮結構的形成，并延遲來自49歲供體SE中真皮的衰老。低濃度的組合物顯示更好的效果(圖3)。
用來自19歲和49歲供體的成纖維細胞所制備的對照SE之間具有顯著差異。來自49歲供體的對照樣品在培養期間顯示了與來自19歲的細胞的對照樣品相比，表皮和真皮結構更快的退化(比較圖2和3中的第42天和第60天的對照)。在第42天和第60天，來自49歲供體的SE的對照樣品與相應的來自19歲供體的SE的對照樣品相比，顯得更加加劇的退化，并顯示角質表皮殘基的分化。通過用組合物進行治療，減少了這個效果。低濃度的組合物與高濃度的組合物相比，提供了更多有益的結果。產生的SE良好生長成致密的真皮和厚的、分層良好的表皮。在圖3中比較了第60天的對照物與低濃度的組合物。
結果證明用該組合物處理皮膚等效物確實對于表皮和真皮的結構、質量和保養都具有積極的效果。組合物通過刺激表皮角質細胞的生長來延緩表皮衰老，無論細胞供體的年齡，其都導致厚的、具有優良結構的和更新的表皮。其對于致密真皮結構的形成和對來自49歲供體的SE中真皮的衰老的延緩，也有明顯的效果。
因此，組合物的治療，即用依照本發明的組合物的治療，對于表皮具有很積極的效果其無論細胞的年齡都降低了表皮衰老，并刺激了角質細胞生長和更新，即使對于來自老化細胞的SE具有更明顯的效果。與在培養42天之后顯示表皮厚度減少和無單元更新的未處理樣品相比，組合物的治療導致厚的更新表皮的保持。在真皮中，組合物刺激ECM(細胞外基質)組分的產生和沉積。
免疫組織化學和定量RT-PCR對于用組合物(低濃度和高濃度)處理的來自49歲供體的成纖維細胞制備的SE在培養的60天之后顯示I型膠原的mRNA，合成肌原纖維蛋白和彈性蛋白的明顯增加。來自19歲供體的成纖維細胞不存在這種效果。這個效果得到I型膠原，彈性蛋白和肌原纖維蛋白的免疫組化染色的證實。此外，對于用該組合物處理的成纖維細胞，在60天之后表達增殖標記Ki67的細胞的數目比對照高4倍；其適合于來自19歲和49歲供體的成纖維細胞。
實驗3體內實驗片劑依照下列組分的列表用常規程序來制備片劑。
片劑1·抗壞血酸鈉·d-α-生育抗壞血酸·白茶提取物·大豆提取物·軟骨提取物·葡萄籽提取物·番茄提取物·葡萄糖酸鋅·藥用賦形劑片劑2·抗壞血酸鈉·d-α-生育抗壞血酸·白茶提取物·大豆提取物·軟骨提取物·洋甘菊提取物·葡萄籽提取物·番茄提取物·葡萄糖酸鋅·藥用賦形劑產物的檢測對測試的50個雌性對象施用片劑(早晨片劑I，晚上片劑II)來確定對于皮膚的真皮密度、硬度和網紋、皺紋存在的作用。試驗在6個月后完成。不在對照組的試驗對象每日隨著飲食消耗安慰劑片劑，消耗片劑1的試驗材料的兩個(2)片劑和片劑2的試驗材料的兩個(2)片劑。總共38個對象完成了用有活性的片劑進行的研究，43個對象完成了用安慰劑片劑進行的研究。
以下包含施用的標準(i)45-65歲(絕經后一到五年-70％的對象不使用HRT，30％的對象最少在研究開始以前3個月使用HRT)，(ii)皮膚類型I-III(Fitzpatrick；FitzpatrickII-III和GlogauII-III)，(iii)中等到嚴重的衰老征兆(GlogauII-III)，(iv)在手背上的光致損傷。
臨床分級的結果檢查測定了受試者在臉的右邊或左邊、右手背或左手背和décolletage(胸)上的特定部位的以下皮膚衰老參數臉-皺紋(前額)-細皺紋(眼周圍的區域)-能觸知的粗糙/干燥-細皺紋(口周圍的區域/嘴唇區域)-色斑著色過度-松弛(用手指皮膚的豎直提升來評價)-下垂(口周圍區域皮膚的可見下垂)-眼下黑圈-毛細血管擴張-整個臉部外觀手-縐-變薄-色斑著色過度胸-縐-色斑著色過度
-整個外觀使用如下范圍記錄臨床分級的結果0＜3輕微的3＜6中等的6＜9嚴重的將有活性的片劑與安慰劑進行比較。用星號表示的參數指示有活性的片劑明顯比安慰劑有效(p＜0.05)。值的減少(任意單位)指示了改善。
臨床分級結果

超聲皮膚密度將超聲用于臨床和實踐醫療已經超過20年了。它是一種測定真皮密度的可靠的、非侵入性的方式。超聲波由皮膚的結構成分所反射，其顯示為在超聲圖象上的色斑。色斑越多，皮膚組織越致密。
使用DUBplus(Taberna，Pro Medicum，AG)超聲裝置來測定右或左眼角區域的B-掃描圖像(通過分類選擇)。使用具有標準20MHz傳感器的DUBplus超聲裝置，其焦距12mm，分辨度40dB。在測試的位點處，28db的增益調整產生整個皮膚厚度的最好的整體形象。用眼角區域中垂直于軀干軸方向的探頭來進行測量。或者，可在前額的眉間區域進行測定。密度值的增加顯示表皮和皮組織變厚，并能被用作改善真皮結構的指征。與安慰劑組相比，有活性的片劑補充組在使用6個月之后，真皮的密度有明顯改善(p＜0.05)。
結果的概述

權利要求
1.用于預防和治療哺乳動物的皮膚病癥的口服給藥組合物，其包括維生素E、維生素C和白茶提取物。
2.權利要求1的組合物，進一步包含·提取自葡萄籽、番茄、大豆和/或洋甘菊的天然存在的抗氧化劑；·包含糖胺聚糖的提取物；·至少一種過渡金屬組分。
3.權利要求2的組合物，其中包括糖胺聚糖的提取物是軟骨提取物。
4.權利要求3的組合物，其中的軟骨提取物包含軟骨素硫酸鹽、角質素硫酸鹽、透明質酸或皮膚素硫酸鹽或其混合物。
5.權利要求1到4任一項的組合物，其中的過渡金屬組分是鋅。
6.權利要求5的組合物，其中的鋅是以葡萄糖酸鋅的形式存在。
7.權利要求6的組合物，進一步包含藥用賦形劑。
8.包含如下成分的組合物在制備適于預防性和/或治療性處理具有皮膚衰老征兆的個體的口服給藥的制劑中的應用·維生素E、·維生素C、·白茶提取物。
9.根據權利要求8的組合物的應用，其中的組合物進一步包含軟骨提取物。
10.根據權利要求8或9的組合物的應用，其中組合物進一步包含獨立地選自葡萄籽提取物、葡萄糖酸鋅和番茄提取物的組分。
11.根據權利要求8-10任一項的組合物的應用，其中組合物包含漿劑、片劑、膠囊劑或營養食品或補充劑。
12.一種組合物，基于該組合物的總重量其包含·0.1到60重量％的維生素E·0.2到90重量％的維生素C·0.2到90重量％的白茶提取物。
13.權利要求12的組合物，基于組合物的總重量進一步包含5到95重量％的提取自葡萄籽、番茄和/或洋甘菊的天然存在的抗氧化劑。
14.權利要求12或13的組合物，基于該組合物的總重量進一步包含5到95重量％的大豆提取物。
15.權利要求12到14任一項的組合物，其中維生素E占該組合物的總重量的0.5到20重量％。
16.權利要求12到15任一項的組合物，其中維生素C占該組合物的總重量的1到30重量％。
17.權利要求12到16任一項的組合物，其中維生素E占該組合物的總重量的1到10重量％。
18.權利要求12到17任一項的組合物，其中維生素C占該組合物的總重量的1到15重量％。
19.可由權利要求12到18任一項的組合物獲得的藥物組合物。
20.包含權利要求19的藥物組合物連同藥用賦形劑的片劑。
21.片劑制劑，包含·維生素C，·維生素E，·白茶提取物，·大豆提取物，·軟骨提取物，·葡萄籽提取物，·番茄提取物，·葡萄糖酸鋅和·藥用賦形劑。
22.權利要求21的片劑制劑，進一步包含洋甘菊提取物。
全文摘要
本申請公開了用于治療皮膚衰老的征兆、包括維生素E、維生素C和白茶提取物的組合物。該組合物減輕了皺紋的征兆，并改善了其它皮膚狀況，例如提高了皮膚的彈性和皮膚柔軟度。此外，不健康的皮膚，例如老化的皮膚或陽光曝曬過度的皮膚的預防或治療可以通過本發明的組合物的給藥實現。該組合物包括許多不同組分的混合物，其相互作用來提供想要的對皮膚的改善。該組合物的進一步有益的組分可包含從例如葡萄籽和番茄中提取的天然存在的抗氧化劑、包含糖胺聚糖的提取物、能結合膠原蛋白和彈性纖維并使皮膚變厚的有效量的過渡金屬組分、以及足以抑制皮膚中抗膠原酶的存在量的基于兒茶素的組分。
文檔編號A61K36/82GK101026965SQ200580028276
公開日2007年8月29日 申請日期2005年6月24日 優先權日2004年6月25日
發明者安妮貝絲·希歐·延森, 安內特·斯特拉烏普·克里斯滕森, 亨里克·恩胡森·波爾森, 亞娜·維卡諾瓦, 尼科·斯米特 申請人:費諾森股份有限公司