專利名稱：青蒿多糖有效部位及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥領(lǐng)域，涉及青蒿多糖有效部位及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分。是一味常用中藥，具有清熱解暑，除蒸，截瘧的功能。目前對青蒿的研究主要集中在青蒿素等萜類成分及其揮發(fā)油，對其所含多糖類成分未見有研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用的青蒿多糖有效部位。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述青蒿多糖有效部位的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述青蒿多糖有效部位在制藥中應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種青蒿多糖有效部位(命名為青蒿多糖HQG)，該青蒿多糖有效部位由青蒿中提取得到，其中多糖含量按重量百分比計(jì)不低于50％，多糖分子量為5000-50000，且含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
所述的青蒿多糖有效部位，該青蒿多糖有效部位是通過下列方法制備得到的1)青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮2～3次，每次加水量為青蒿重量的10～15倍，每次1～2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量85％以上，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2)青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液冷凍干燥得粉末，即得青蒿多糖有效部位；或者取青蒿粗多糖，用水充分溶解，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫液，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，濃縮，干燥，即得青蒿多糖有效部位。
所述的青蒿多糖有效部位的制備方法，該方法包括下列步驟1)青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮2～3次，每次加水量為青蒿重量的10～15倍，每次1～2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量85％以上，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2)青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液冷凍干燥得粉末，即為青蒿多糖有效部位；或者取青蒿粗多糖，用水充分溶解，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫液，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，濃縮，干燥，即得青蒿多糖有效部位。
所述的青蒿多糖有效部位的制備方法，該方法還包括下列步驟取青蒿多糖有效部位，適量水溶解，上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/L NaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法檢測收集液，合并多糖反應(yīng)呈陽性的洗脫液，濃縮，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液40～50℃減壓濃縮，冷凍干燥，得粉末，即為純化的青蒿多糖有效部位。
或者取青蒿多糖有效部位用水溶解后分別用排阻范圍為1000～150000D的分子篩層析柱分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的純化的青蒿多糖有效部位。
所述的制備方法，其中弱陰離子交換柱是DEAE弱陰離子交換柱。
所述的制備方法，其中DEAE弱陰離子交換柱是DEAE Sepharose F.F.柱或DEAE纖維素柱。
所述的制備方法，其中分子篩層析柱是SephadexG或Sephacryl凝膠柱。
所述的青蒿多糖有效部位在制備抗腫瘤藥或治療免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果1、青蒿多糖有效部位的化學(xué)研究對采用本發(fā)明提取方法獲得的青蒿多糖HQG(按實(shí)施例1制備，下同)采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，測定結(jié)果如下

結(jié)果表明大部分樣品的糖含量可達(dá)到60％，少部分樣品糖含量可達(dá)到50％。
對用本發(fā)明提取方法獲得的青蒿多糖HQG采用高效液相法進(jìn)行分子量測定高效液相色譜系統(tǒng)waters515型高壓泵，717型自動(dòng)進(jìn)樣器，島津6A示差檢測器，色譜柱為TSK G4000Pwxl Lot.E3313(7.5×300mm，10μm)與TSK G5000Pwxl Lot.G3367串聯(lián)柱，Millineum32數(shù)據(jù)軟件。進(jìn)樣量100μL；柱溫30℃；流動(dòng)相0.2mol/LNaCl水溶液；流速0.4mL/min。結(jié)果分子量在5000-50000之間成多重峰分布。
對用本發(fā)明提取方法獲得的青蒿多糖HQG采用酸水解后制備糖醇乙酸酯并進(jìn)行氣相測定的方法分析糖組成氣相色譜系統(tǒng)GC-14B氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器(SHIMADZU，日本)，色譜柱OV-225毛細(xì)管色譜柱(0.32mm×30m，5μm)(蘭州中科安泰分析科技有限公司)，N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限)。
稱取樣品約10mg，加2mol/L三氟乙酸，安瓿封裝，置110℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)反應(yīng)45分鐘，取出，加甲醇適量，蒸干；加蒸餾水20mL溶解，加入NaBH430mg，室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，不時(shí)振搖，加醋酸至無氣泡，加甲醇蒸干，共4次，每次20mL，前兩次加醋酸1滴，100℃鼓風(fēng)烘箱干燥15分鐘；加乙酸酐15mL，100℃鼓風(fēng)烘箱反應(yīng)1小時(shí)，每20分鐘振搖一次，加甲苯15mL共沸蒸餾除去溶劑加氯仿10mL，蒸餾水萃取5次，棄去水層，氯仿層加無水NaSO4適量脫水，過濾，濾液減壓蒸去溶劑，加氯仿0.5mL溶解，即為糖醇乙酸酯衍生物。進(jìn)樣2μl。
結(jié)果表明青蒿多糖HQG中含有鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
2、本發(fā)明提供的青蒿多糖HQG對小鼠尾靜脈注射急性毒性小，對小鼠移植性腫瘤EAC、Heps、S180有明顯抑制作用，體外免疫學(xué)研究表明，青蒿多糖HQG具有顯著的免疫促進(jìn)作用，可用于制備抗腫瘤藥或增強(qiáng)免疫藥物。
3、本發(fā)明提供的制備方法簡單易行，適于產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。
以下是采用本發(fā)明方法制得的青蒿多糖HQG(簡稱HQG，按實(shí)施例1制備)及青蒿多糖HQG注射劑(按實(shí)施例3制備)進(jìn)行有關(guān)藥效學(xué)研究一、青蒿多糖HQG的急性毒性實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器動(dòng)物ICR種小白鼠，18-22g，雌雄各半；合格證號SCXK(蘇)2002-0011；飼料顆粒飼料；飼養(yǎng)條件空調(diào)房間，溫度18-24℃，相對濕度70％。
供試樣品青蒿多糖HQG。
2 實(shí)驗(yàn)方法急性毒性實(shí)驗(yàn)分為預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)找到大致劑量范圍后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。設(shè)六個(gè)劑量組，每劑量組10只小鼠，雌雄各半，藥物劑量按等比排列，比值0.8，分別為190.054、237.568、296.96、371.2、464、580mg/kg，尾靜脈注射，給藥體積0.4ml/只，一次注射后，在24小時(shí)后多次觀察，連續(xù)觀察7天。記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物的分布，死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行尸檢，并記錄病變情況，若有肉眼可見病變組織時(shí)，需進(jìn)行該組織的病理形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果用Bliss統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LD50值。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠靜脈注射給藥后中毒癥狀為茸毛卷臥，步履蹣跚，活動(dòng)減少，嗜睡，呼吸減慢。死亡動(dòng)物解剖，各臟器未見明顯異常。死亡分布和統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。
表1青蒿多糖小鼠尾靜脈注射LD50測定結(jié)果

統(tǒng)計(jì)分析，回歸方程為Y＝-9.9322+5.8758X(r＝0.9832)(Y為概率單位加5后的數(shù)值，X為劑量的對數(shù))；LD50＝423.8894mg/kg，置信系數(shù)a＝0.05時(shí)的置信區(qū)間為299.4602mg/kg≤LD50≤403.8729mg/kg。結(jié)果表明青蒿多糖靜脈注射毒性較小，安全范圍大。
二、青蒿多糖HQG對移植性腫瘤EAC、Heps、S180的抑制作用(一)青蒿多糖HQG對動(dòng)物移植性腫瘤EAC的抑制作用1試驗(yàn)材料1.1受試藥物青蒿多糖HQG注射劑。
1.2動(dòng)物ICR種小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室提供。合格證號SCXK(蘇)2002-0011；飼料顆粒飼料，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室供給；飼養(yǎng)條件空調(diào)房間，溫度18-24℃，相對濕度70％。
1.3陽性藥環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。規(guī)格200mg/瓶，批號0309152實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容藥物尾靜脈注射對小鼠移植瘤EAC的抑制作用3實(shí)驗(yàn)方法和步驟3.1給藥途徑尾靜脈注射(iv)3.2給藥周期按移植性腫瘤研究法接種EAC實(shí)體型，接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，停藥后第2天處死解剖小鼠。
3.3劑量設(shè)置共設(shè)5組 3.4給藥體積0.4ml/20g3.5實(shí)驗(yàn)方法取上述規(guī)格小鼠50只按移植性腫瘤研究法接種EAC實(shí)體型，接種后24小時(shí)稱鼠重，并隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，于停藥后第2天小鼠稱重，處死荷瘤小鼠并分離瘤塊，稱瘤重，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。
3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，與空白對照組相比，HQG各劑量組均可顯著抑制小鼠移植瘤EAC的生長(P＜0.01)，但100，50mg/kg劑量組對動(dòng)物體重影響較大(P＜0.01)，HQG25mg/kg劑量組對動(dòng)物體重影響相對較小(P＜0.05)。陽性藥CTX對移植瘤的抑制作用也很明顯(P＜0.01)，對小鼠體重影響也較大。見表2。
表2.青蒿多糖HQG靜脈注射對小鼠移植瘤EAC的抑制作用

*P＜0.05**P＜0.01與空白對照組比較。
(二)青蒿多糖HQG對動(dòng)物移植性腫瘤Heps的抑制作用1試驗(yàn)材料1.1受試藥物青蒿多糖HQG注射劑。
1.2動(dòng)物ICR種小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室提供。
合格證號SCXK(蘇)2002-0011；飼料顆粒飼料，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室供給；飼養(yǎng)條件空調(diào)房間，溫度18-24℃，相對濕度70％。
1.3陽性藥環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。規(guī)格200mg/瓶，批號030915。
2實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容HQG靜脈注射對小鼠移植瘤Heps的抑制作用3實(shí)驗(yàn)方法和步驟3.1給藥途徑尾靜脈注射(iv)3.2給藥周期按移植性腫瘤研究法，接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，停藥后第2天處死解剖小鼠。
3.3劑量設(shè)置
共設(shè)5組

3.4給藥體積0.4ml/20g3.5實(shí)驗(yàn)方法取上述規(guī)格小鼠50只按移植性腫瘤研究法接種Heps實(shí)體型，接種后24小時(shí)稱鼠重，并隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，于停藥后第2天小鼠稱重，處死荷瘤小鼠并分離瘤塊，稱瘤重，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。
3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，與空白對照組相比，HQG各劑量組均可顯著抑制小鼠移植瘤Heps的生長(P＜0.01)，但100，50mg/kg劑量組對動(dòng)物體重影響較大(P＜0.01)，HQG25mg/kg劑量組對動(dòng)物體重影響相對較小(P＜0.05)。陽性藥CTX對移植瘤的抑制作用也很明顯(P＜0.01)，對小鼠體重影響也較大。見表3。
表3.青蒿多糖HQG藥靜脈注射對小鼠移植瘤Heps的抑制作用

*P＜0.05**P＜0.01與空白對照組比較(三)青蒿多糖HQG對動(dòng)物移植性腫瘤S180的抑制作用1試驗(yàn)材料1.1受試藥物青蒿多糖HQG注射劑。
1.2動(dòng)物ICR種小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室提供。
合格證號SCXK(蘇)2002-0011；飼料顆粒飼料，由中國藥科大學(xué)動(dòng)物室供給；飼養(yǎng)條件空調(diào)房間，溫度18-24℃，相對濕度70％。
1.3陽性藥環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。規(guī)格200mg/瓶，批號0309152實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容青蒿多糖HQG注射劑靜脈注射對小鼠移植瘤S180的抑制作用3實(shí)驗(yàn)方法和步驟3.1給藥途徑尾靜脈注射(iv)3.2給藥周期按移植性腫瘤研究法[1]接種S180實(shí)體型，接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，停藥后第2天處死解剖小鼠。
3.3劑量設(shè)置共設(shè)7組 34給藥體積0.4ml/20g3.5實(shí)驗(yàn)方法取上述規(guī)格小鼠50只按移植性腫瘤研究法接種S180實(shí)體型，接種后24小時(shí)稱鼠重，并隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。接種24小時(shí)后給藥，iv給藥，隔天一次，共給藥4次，于停藥后第2天小鼠稱重，處死荷瘤小鼠并分離瘤塊，稱瘤重，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。
3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，與空白對照組相比，HQG各劑量組均可顯著抑制小鼠移植瘤S180的生長(P＜0.01)，但100mg/kg劑量組對動(dòng)物體重影響較大(P＜0.05)。陽性藥CTX對移植瘤的抑制作用也很明顯(P＜0.01)，對小鼠體重影響也較大。見表4。
表4.HQG靜脈注射對小鼠移植瘤S180的抑制作用

*P＜0.05**P＜0.01與空白對照組比較多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本品對移植性實(shí)體瘤EAC，Heps及S180均有一定的療效，低、中、高本品其抑瘤率達(dá)30～50％以上，抗腫瘤作用有一定量效關(guān)系，雖然作用小于陽性藥CTX，但毒性小，安全性高。
三、青蒿多糖HQG的免疫調(diào)節(jié)作用研究(一)青蒿多糖HQG的淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器試劑和材料RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉(GBICO)，小牛血清(HyClone)，MTT(sigma)，DMSO(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，其它生化試劑均為分析純。
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(costar)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純系昆明小白鼠7周齡，20±2g，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
儀器超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)，LXJ-II離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)原理采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法。
活細(xì)胞中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶使淡黃色MTT還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶(formazan，甲瓚)沉淀于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，而增殖的活細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶比非增殖的活細(xì)胞多，所以，增殖細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍所還原成藍(lán)紫色比非增殖的活細(xì)胞更深，但死細(xì)胞失去線粒體能量代謝產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶的功能，故死細(xì)胞不著色。因此，根據(jù)細(xì)胞的著色深淺，用酶標(biāo)比色計(jì)可以區(qū)分增殖的活細(xì)胞、非增殖的活細(xì)胞和死細(xì)胞(甲瓚在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解)。脾細(xì)胞體外無任何外界刺激是不增殖的，但可以短時(shí)間內(nèi)存活，約1周。試驗(yàn)組比陰性組數(shù)據(jù)高，說明藥物可促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖。反之，說明有毒性作用。
2.2溶液的配制2.2.1 PBS(0.01M，pH7.4)分別稱取8.0gNaCl、3.84gNa2HPO4·12H2O、0.2gKCl、0.24gKH2PO4，用去離子水定容至1000mL，經(jīng)121℃×15min高壓滅菌。
2.2.2 Hank’s液分別稱取8.0gNaCl、0.06gNa2HPO4·12H2O、0.4gKCl、0.06gKH2PO4、0.098gMgSO4·7H2O、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl2，溶于適量去離子水，用7％NaHCO3溶液調(diào)PH至7.4，定容至1000mL，0.22μm膜過濾除菌，于4℃保存。
2.2.3 Tris-NH4Cl(紅細(xì)胞裂解液)分別稱取0.747gNH4Cl和0.26gTris(三羥甲基氨基甲烷)用去離子水定容至100mL，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存。
2.2.4 RPMI-1640完全培養(yǎng)基取RPMI1640培養(yǎng)基干粉，按說明書配制，0.22μm膜過濾除菌，加10％小牛血清，分裝于4℃保存。
2.2.5 MTT用0.01MPBS配成5mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，于-20℃避光保存。
2.2.6青蒿多糖HQG樣品的配制精密稱取青蒿多糖HQG樣品適量，溶于滅菌PBS中，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存；臨用前用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
2.3脾細(xì)胞懸液的制備將小鼠脫頸處死，浸于75％的酒精中5min；無菌操作取出脾臟，研磨過200目鋼篩，收集分離的脾細(xì)胞懸液，2000rpm×5min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10mL，重懸細(xì)胞，靜置5min后離心，用Hank’s液洗滌離心3次；重懸細(xì)胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至107個(gè)/mL。
2.4青蒿多糖HQG的淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后加入樣品，100μL/孔，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基的陰性對照。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)44h。取出細(xì)胞板，加MTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出細(xì)胞板，3000rpm×5min，棄盡上清液；加DMSO，100μL/孔，37℃振蕩裂解細(xì)胞10min；用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD570值。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果青蒿多糖HQG的淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5青蒿多糖HQG的淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

a平均值±SD。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG的OD570值明顯高于陰性對照組，說明青蒿多糖HQG能顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖，并且無明顯細(xì)胞毒性。
(二)青蒿多糖HQG誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器試劑和材料RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉(GBICO)，小牛血清(HyClone)，ConA(sigma)，LPS(sigma)，MTT(sigma)，DMSO(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，其它生化試劑均為分析純。香菇多糖注射液(福洲梅峰制藥廠)。
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(costar)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純系昆明小白鼠7周齡，20±2g，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
儀器超凈臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)，離心沉淀機(jī)LXJ-II(上海醫(yī)用分析儀器廠)。
2實(shí)驗(yàn)方法采用MTT法。
2.1溶液的配制2.1.1 PBS(0.01M，pH7.4)分別稱取8.0gNaCl、3.84gNa2HPO4·12H2O、0.2gKCl、0.24gKH2PO4，用去離子水定容至1000mL，經(jīng)121℃×15min高壓滅菌。
2.1.2 Hank’s液分別稱取8.0gNaCl、0.06gNa2HPO4·12H2O、0.4gKCl、0.06gKH2PO4、0.098gMgSO4·7H2O、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl，溶于適量去離子水，用7％NaHCO3調(diào)PH至7.4，定容至1000mL，0.22μm膜過濾除菌，分裝于4℃保存。
2.1.3 Tris-NH4Cl(紅細(xì)胞裂解液)分別稱取0.747gNH4Cl和0.26gTris(三羥甲基氨基甲烷)用去離子水定容至100mL，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存。
2.1.4 RPMI-1640完全培養(yǎng)基取RPMI1640培養(yǎng)基干粉，按說明書配制，0.22μm膜過濾除菌，加10％小牛血清，分裝于4℃保存。
2.1.5 ConA用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成1mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于-20℃保存。
2.1.6 LPS用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成1mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于一20℃保存。
2.1.7 MTT用0.01MPBS配成5mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于-20℃避光保存。
2.1.8多糖樣品的配制精密稱取青蒿多糖HQG和香菇多糖樣品適量，溶于滅菌PBS中，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存；臨用前用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
2.2脾細(xì)胞懸液的制備將小鼠脫頸處死，浸于75％的酒精中5min；無菌操作取出脾臟，研磨過200目鋼篩，收集分離的脾細(xì)胞懸液，2000rpm×5min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10mL，重懸細(xì)胞，靜置5min后離心，用Hank’s液洗滌離心3次；重懸細(xì)胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至107個(gè)/mL。
2.3青蒿多糖HQG誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后加入樣品，100μL/孔，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，ConA終濃度為10μg/mL，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)44h。取出細(xì)胞板，加MTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出細(xì)胞板，3000rpm×5min，棄盡上清液；加DMSO，100μL/孔，37℃振蕩裂解細(xì)胞10min；用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD570值。
2.4青蒿多糖HQG和ConA聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后分別加入ConA和樣品，50μL/孔，其中ConA終濃度為5μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，樣品空白對照僅加ConA，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)44h。取出細(xì)胞板，加MTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出細(xì)胞板，3000rpm×5min，棄盡上清液；加DMSO，100μL/孔，37℃振蕩裂解細(xì)胞10min；用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD570值。
2.5青蒿多糖HQG和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后分別加入LPS和樣品，50μL/孔，其中LPS終濃度為10μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/L，樣品空白對照僅加LPS，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)44h。取出細(xì)胞板，加MTT，20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出細(xì)胞板，3000rpm×5min，棄盡上清液；加DMSO，100μL/孔，37℃振蕩裂解細(xì)胞10min；用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD570值。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1青蒿多糖HQG誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)青蒿多糖HQG誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見表6。
表6青蒿多糖HQG誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

a平均值±SD。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值均高于陰性對照組，說明對小鼠脾淋巴細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)增殖作用，且有明顯劑量依賴性。由于香菇多糖是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤多糖類藥物，療效確切，故用其作為對照藥物，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值和香菇多糖接近，表明在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量范圍內(nèi)，青蒿多糖HQG各部位對小鼠脾淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖作用和香菇多糖相當(dāng)，大于ConA。
3.2青蒿多糖HQG和ConA聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)青蒿多糖HQG和ConA聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見表7表7青蒿多糖HQG和ConA聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

a平均值±SD。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值均高于樣品空白組，說明青蒿多糖HQG對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖有明顯促進(jìn)作用，且有明顯劑量依賴性。青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值和香菇多糖接近，說明在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量范圍內(nèi)，青蒿多糖HQG對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的促進(jìn)作用和香菇多糖相當(dāng)。
3.3青蒿多糖HQG和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)青蒿多糖HQG和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果見表8。
表8青蒿多糖HQG和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

a平均值±SD。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值均高于樣品空白組，說明青蒿多糖HQG對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖有明顯促進(jìn)作用，且有明顯劑量依賴性。青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的OD570值和香菇多糖接近，說明在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量范圍內(nèi)，青蒿多糖HQG對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的促進(jìn)作用和香菇多糖相當(dāng)。
(三)青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌的影響1實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器試劑和材料RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉(GBICO)，小牛血清(HyClone)，ConA(sigma)，LPS(sigma)，MTT(sigma)，DMSO(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。IL-2、IFN-γ和TNF-αELISA檢測試劑盒(進(jìn)口分裝，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。其它生化試劑均為分析純。香菇多糖注射液(福洲梅峰制藥廠)。
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(costar)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純系昆明小白鼠7周齡，20±2g，由中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
儀器超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo)，離心沉淀機(jī)LXJ-II(上海醫(yī)用分析儀器廠)。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞因子是一群小分子量(約8-80kDa)蛋白，通常以自分泌(作用于分泌這些細(xì)胞因子的細(xì)胞)或旁分泌(作用于鄰近的細(xì)胞)形式發(fā)揮作用。細(xì)胞因子的活性極高，可發(fā)揮作用于微微克分子級甚至毫微微克分子級。細(xì)胞因子是細(xì)胞間信號網(wǎng)絡(luò)的組成部分。這一網(wǎng)絡(luò)調(diào)控天然免疫和特異性免疫應(yīng)答中各種功能性事件，如炎癥反應(yīng)、防御病毒感染、特異性T、B細(xì)胞克隆的增殖及其功能的調(diào)節(jié)。細(xì)胞因子包括白介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、生長因子(GF)、集落刺激因子(CSF)、和趨勢性細(xì)胞因子[4]。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒對細(xì)胞因子含量進(jìn)行測定，研究青蒿多糖HQG對細(xì)胞因子的誘生作用。ELISA試劑盒是根據(jù)抗原、抗體的特異性相互作用，以及通過酶聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)信號而設(shè)計(jì)的。IFN-γ、IL-2和TNF-αELISA試劑盒專門用于測定IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量變化。
2.2溶液的配制2.2.1 PBS(0.01M，pH7.4)分別稱取8.0gNaCl、3.84gNa2HPO4·12H2O、0.2gKCl、0.24gKH2PO4，用去離子水定容至1000mL，經(jīng)121℃×15min高壓滅菌。
2.2.2 Hank’s液分別稱取8.0gNaCl、0.06gNa2HPO4·12H2O、0.4gKCl、0.06gKH2PO4、0.098gMgSO4·7H2O、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl，溶于適量去離子水，用7％NaHCO3調(diào)PH至7.4，定容至1000mL，0.22μm膜過濾除菌，分裝于4℃保存。
2.2.3 Tris-NH4Cl(紅細(xì)胞裂解液)分別稱取0.747gNH4Cl和0.26gTris(三羥甲基氨基甲烷)用去離子水定容至100mL，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存。
2.2.4 RPMI-1640完全培養(yǎng)基取RPMI1640培養(yǎng)基干粉，按說明書配制，0.22μm膜過濾除菌，加10％小牛血清，分裝于4℃保存。
2.2.5 ConA用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成1mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于-20℃保存。
2.2.6 LPS用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成1mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于-20℃保存。
2.2.7 MTT用0.01MPBS配成5mg/mL溶液，0.22μm膜過濾除菌，分裝于-20℃避光保存。
2.2.8 多糖樣品的配制精密稱取青蒿多糖HQG樣品適量，溶于滅菌PBS中，0.22μm膜過濾除菌，4℃保存；臨用前用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
2.3脾細(xì)胞懸液的制備將小鼠脫頸處死，浸于75％的酒精中5min；無菌操作取出脾臟，研磨過200目鋼篩，收集分離的脾細(xì)胞懸液，離心2000rpm×5min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10mL，重懸細(xì)胞，靜置5min后離心，用Hank′s液洗滌離心3次；重懸細(xì)胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至107個(gè)/mL。
2.4腹腔巨噬細(xì)胞懸液的制備將小鼠脫頸處死，浸于75％的酒精中5min，收集腹腔內(nèi)液。離心1000rpm×5min，棄上清，用Hank′s液洗滌離心3次。重懸細(xì)胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL。
2.5青蒿多糖HQG聯(lián)合ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后分別加入ConA和樣品，50μL/孔，其中ConA終濃度為5μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100、10和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，樣品空白對照僅加ConA，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。吸出和合并相同加樣孔的培養(yǎng)液，3000rpm×5min，棄沉淀，上清液于-20℃保存待測。
2.6青蒿多糖HQG聯(lián)合ConA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備首先將制備好的腹腔巨噬細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1mL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)，棄上清，Hank’s液洗去非粘附細(xì)胞，即為所需巨噬細(xì)胞。分別加入ConA和樣品，50μL/孔，其中ConA終濃度為5μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，樣品空白對照僅加ConA，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h。吸出和合并相同加樣孔的培養(yǎng)液，3000rpm×5min，棄沉淀，上清液于-20℃保存待測。
2.7青蒿多糖HQG聯(lián)合LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備首先將制備好的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔。然后分別加入LPS和樣品，50μL/孔，其中LPS終濃度為10μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100、10和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，樣品空白對照僅加LPS，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。吸出和合并相同加樣孔的培養(yǎng)液，3000rpm×5min，棄沉淀，上清液于-20℃保存待測。
2.8青蒿多糖HQG聯(lián)合LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備首先將制備好的腹腔巨噬細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1mL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)，棄上清，Hank’s液洗去非粘附細(xì)胞，即為所需巨噬細(xì)胞。然后分別加入LPS和樣品，50μL/孔，其中LPS終濃度為10μg/mL，每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100、10和1μg/mL)復(fù)3孔；同時(shí)，設(shè)立陽性對照、樣品空白對照和陰性對照，其中陽性對照香菇多糖終濃度為50μg/mL，樣品空白對照僅加LPS，陰性對照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將加好樣品的細(xì)胞板置5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48h。吸出和合并相同加樣孔的培養(yǎng)液，3000rpm×5min，棄沉淀，上清液于-20℃保存待測。
2.9細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2和TNF-α的測定按ELISA試劑盒說明檢測，其中樣品0、1、2、5、10和香菇多糖的細(xì)胞培養(yǎng)上清復(fù)2孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線做復(fù)2孔，其余單孔。測定OD492值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出IFN-γ、IL-2和TNF-α的濃度，分析樣品對不同細(xì)胞因子的誘生作用。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的測定3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表9IFN-γ含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

繪制的IFN-γ含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，可見IFN-γ含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.6877x-2.0257(r＝0.9943)。
3.1.2樣品測定測定結(jié)果見表10。
表10青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響結(jié)果

a單位為pg/mL。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的IFN-γ細(xì)胞因子濃度數(shù)值明顯高于樣品空白，說明青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ有明顯的促進(jìn)作用，并且有明顯的劑量依賴性；青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的IFN-γ細(xì)胞因子濃度數(shù)值大于香菇多糖，說明在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量范圍內(nèi)，青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的促進(jìn)作用大于香菇多糖。
3.2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2的測定3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表11IL-2含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

繪制的IL-2含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，可見IL-2含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.6658x-1.9869(r＝0.9911)。
3.2.2樣品測定測定結(jié)果見表6-8。
表12青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響結(jié)果

a單位為pg/mL。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的IL-2細(xì)胞因子濃度數(shù)值明顯高于樣品空白，洗明青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IL-2有明顯的促進(jìn)作用，并且有明顯的劑量依賴性。對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IL-2的促進(jìn)作用方面，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)劑量范圍內(nèi)，作用大于香菇多糖；對LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IL-2的促進(jìn)作用方面，作用和香菇多糖相當(dāng)。
3.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的測定3.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表13TNF-α含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

繪制的TNF-α含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，可見TNF-α含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝1.6164x-1.9884(r＝0.9959)3.3.2樣品測定測定結(jié)果見表14。
表14青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響結(jié)果

a單位為pg/mL。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蒿多糖HQG實(shí)驗(yàn)組的TNF-α細(xì)胞因子濃度數(shù)值高于樣品空白，說明青蒿多糖HQG對ConA、LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α有明顯的促進(jìn)作用，并且有明顯的劑量依賴性。對ConA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的促進(jìn)作用方面，作用大于香菇多糖；對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的促進(jìn)作用方面，作用小于香菇多糖。
(四)小結(jié)研究結(jié)果表明，青蒿多糖HQG無明顯細(xì)胞毒性，能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，其作用有劑量依賴性，和臨床上廣泛使用的香菇多糖作用相當(dāng)。青蒿多糖HQG安全性高，對機(jī)體損害小，有明顯的免疫促進(jìn)作用，是一種很好的免疫促進(jìn)劑，在腫瘤等疾病的免疫治療方面，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明公開的青蒿多糖HQG，尾靜脈注射急性毒性小，對小鼠移植性腫瘤抑制作用明顯，體外實(shí)驗(yàn)顯示其具有顯著的免疫促進(jìn)作用，對腫瘤免疫治療相關(guān)的細(xì)胞因子有促生作用，提供了一種具有臨床抗腫瘤藥用價(jià)值的活性植物多糖。


圖1是IFN-γ含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2是IL-2含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3是TNF-α含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1青蒿多糖有效部位的制備1.青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮3次，每次加水量為青蒿重量的15倍，每次1.5小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量85％，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2.青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值5000的透析膜用純水透析72小時(shí)，以去除分子量5000以下的小分子雜質(zhì)，糖液濃縮，15000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心18分鐘，冷凍干燥得粉末，即為青蒿多糖有效部位。采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明糖含量在61.3％。經(jīng)測定該多糖分子量分布為5000-50000，包括鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
實(shí)施例2青蒿多糖有效部位的分離純化取按實(shí)施例1制備的青蒿多糖有效部位，適量水溶解，上DEAE Sepharose F.F.柱，用水、0.1～1mol/LNaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法檢測收集液，合并各部分多糖反應(yīng)呈陽性的洗脫液，濃縮，采用截留值5000的透析膜用純水透析72小時(shí)，以去除分子量5000以下的小分子雜質(zhì)，糖液48℃減壓濃縮，冷凍干燥，得粉末，即為純化的青蒿多糖有效部位，共有6個(gè)部位，水、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0mol/LNaCl洗脫部位。采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明各洗脫部位的糖含量分別為95.8％、85.0％、78.5％、70.1％、40.1％、20.3％。經(jīng)測定各部分多糖分子量分布為5000-50000，均包括鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
實(shí)施例3青蒿多糖注射劑的制備取按實(shí)施例1方法制得的青蒿多糖HQG加入注射液常規(guī)輔料，按注射液常規(guī)工藝用滅菌注射用水配置成1000ml，無菌過濾，灌裝。
實(shí)施例4青蒿多糖凍干粉針劑的制備取按實(shí)施例1方法制得的青蒿多糖HQG，加入凍干粉常規(guī)輔料，按凍干粉常規(guī)工藝用滅菌注射用水配置成1000ml，無菌過濾，定量灌注至玻瓶中，膠塞塞一半，冷凍干燥，膠塞全壓，軋蓋。
實(shí)施例5青蒿多糖注射劑的制備取按實(shí)施例2方法制得的純化的青蒿多糖有效部位加入注射液常規(guī)輔料，按注射液常規(guī)工藝用滅菌注射用水配置成1000ml，無菌過濾，灌裝。
實(shí)施例6青蒿多糖凍干粉針劑的制備取按實(shí)施例2方法制得的青蒿多糖有效部位，加入凍干粉常規(guī)輔料，按凍干粉常規(guī)工藝用滅菌注射用水配置成1000ml，無菌過濾，定量灌注至玻瓶中，膠塞塞一半，冷凍干燥，膠塞全壓，軋蓋。
實(shí)施例7青蒿多糖有效部位的制備1.青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮3次，每次加水量為青蒿重量的10倍，每次2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量90％，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2.青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，采用截留值5000的超濾膜去除分子量5000以下的小分子，超濾時(shí)的參數(shù)溫度為室溫、操作壓力為0.05MPa、循環(huán)流量40L/hr、平均停留時(shí)間3hr，糖液濃縮，上DEAE Sepharose F.F.柱，用水、0.1～1molNaCl梯度洗脫，收集洗脫液，采用截留值5000的透析膜用純水透析72小時(shí)，以去除分子量5000以下的小分子雜質(zhì)，濃縮，干燥，得青蒿多糖有效部位。采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明糖含量在62.1％。經(jīng)測定該多糖分子量分布為5000-50000，且鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
實(shí)施例8青蒿多糖有效部位的純化取按實(shí)施例7制備的青蒿多糖有效部位，適量水溶解，上DEAE Sepharose F.F.柱，用水、0.1～1mol/LNaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法檢測收集液，合并多糖反應(yīng)呈陽性的洗脫液，濃縮，采用截留值3500的透析膜用純水透析48小時(shí)，去除分子量3500以下的小分子，糖液45℃減壓濃縮，冷凍干燥，得粉末，即為純化的青蒿多糖有效部位，共有6個(gè)部位，水、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0mol/L NaCl洗脫部位。采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明各部分的糖含量分別為95.1％、84.3％、74.1％、71.8％、37.9％、21.5％。經(jīng)測定各部分多糖分子量分布為5000-50000，均包括鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
實(shí)施例9青蒿多糖有效部位的制備1.青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮3次，每次加水量為青蒿重量的12倍，每次2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量95％，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2.青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值3500的透析膜用純水透析72小時(shí)，以去除分子量3500以下的小分子雜質(zhì)，糖液濃縮，15000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心15分鐘，冷凍干燥得粉末，即為青蒿多糖有效部位。采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明糖含量在61.8％。經(jīng)測定該多糖分子量分布為5000-50000，包括鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
實(shí)施例10青蒿多糖有效部位的純化取按實(shí)施例2制備的青蒿多糖有效部位中的水、0.1、0.2、0.4mol/LNaCl洗脫部位，分別按下法操作。適量水溶解，用排阻范圍為1000～150000D的分子篩層析柱(SephadexG或Sephacryl凝膠柱)分離，分管收集，硫酸-苯酚法或示差折光儀檢測，描繪洗脫曲線，合并峰位的收集液，減壓濃縮，采用截留值3500的透析膜用純水透析48小時(shí)，去除分子量3500以下的小分子，糖液45℃減壓濃縮，冷凍干燥，得粉末。水、0.1、0.2、0.4mol/LNaCl洗脫部位經(jīng)過分子篩層析柱分離后得到的多糖分子量為13000、11000、20000、42000；采用硫酸-苯酚法測定糖含量，以葡萄糖為對照品，結(jié)果表明各部分的糖含量分別為95.8％、95.2％、93.7％、94.2％；經(jīng)測定均包括鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
權(quán)利要求
1.一種青蒿多糖有效部位，其特征在于該青蒿多糖有效部位由青蒿中提取得到，其中多糖含量按重量百分比計(jì)不低于50％，多糖分子量為5000-50000，且含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青蒿多糖有效部位，其特征在于該青蒿多糖有效部位是通過下列方法制備得到的1)青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮2～3次，每次加水量為青蒿重量的10～15倍，每次1～2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量85％以上，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2)青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液冷凍干燥得粉末，即得青蒿多糖有效部位；或者取青蒿粗多糖，用水充分溶解，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫液，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，濃縮，干燥，即得青蒿多糖有效部位。
3.如權(quán)利要求1或2所述的青蒿多糖有效部位的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟1)青蒿粗多糖的提取取青蒿加水煎煮2～3次，每次加水量為青蒿重量的10～15倍，每次1～2小時(shí)，提取液合并，減壓濃縮，加乙醇沉淀至含醇量85％以上，靜置，濾取沉淀，用乙醇洗滌，干燥得青蒿粗多糖；2)青蒿多糖有效部位的精制取青蒿粗多糖，用水充分溶解，濃度為0.7～1％，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液冷凍干燥得粉末，即為青蒿多糖有效部位；或者取青蒿粗多糖，用水充分溶解，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液濃縮，離心，上清液上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/LNaCl梯度洗脫，收集洗脫液，采用截留值為3500～5000D的透析膜或超濾膜去除分子量5000或3500以下的小分子，濃縮，干燥，即得青蒿多糖有效部位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的青蒿多糖有效部位的制備方法，其特征在于該方法還包括下列步驟取青蒿多糖有效部位，適量水溶解，上弱陰離子交換柱，用水、0.1～1mol/L NaCl梯度洗脫，苯酚-硫酸法檢測收集液，合并多糖反應(yīng)呈陽性的洗脫液，濃縮，采用截留值為3500～5000D的透析膜用純水透析48～72小時(shí)，去除分子量5000或3500以下的小分子，糖液40～50℃減壓濃縮，冷凍干燥，得粉末，即為純化的青蒿多糖有效部位；或者取青蒿多糖有效部位用水溶解后分別用排阻范圍為1000～150000D的分子篩層析柱分離，得到一系列分子量不同的但各系列分別為均一分子量的純化的青蒿多糖有效部位。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于弱陰離子交換柱是DEAE弱陰離子交換柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于DEAE弱陰離子交換柱是DEAESepharose F.F.柱或DEAE纖維素柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于分子篩層析柱是SephadexG或Sephacryl凝膠柱。
8.如權(quán)利要求1或2所述的青蒿多糖有效部位在制備抗腫瘤藥或治療免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了青蒿多糖有效部位及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。該青蒿多糖有效部位由青蒿中提取得到，其中多糖含量不低于50％，多糖分子量為5000－50000，且含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖六種單糖殘基。該青蒿多糖有效部位可用于制備抗腫瘤藥或治療免疫性疾病的藥物，其制備工藝簡單易行，適于產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。
文檔編號A61P35/00GK1951396SQ20061009653
公開日2007年4月25日 申請日期2006年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月30日
發(fā)明者薛明, 田麗娟, 徐向陽, 孫曄, 曹春陵 申請人:金陵藥業(yè)股份有限公司