專利名稱：基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組蛋白及其應用，特別是涉及一種基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應用。
背景技術：
新生血管的形成是惡性腫瘤，尤其是肺癌生長和轉移過程中非常重要的過程，它不僅為肺癌組織提供了大量的生長所需要的原料，而且為其向遠處轉移提供了通道。正常狀態下，人體內的脈管系統是在血管生長因子和抑制因子相互作用下處于平衡狀態的；病理狀態下，尤其是發生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發展。PEDF(pigment epithelial derived factor)是目前所知的最重要的內源性血管生成抑制因子，我們前期的研究結果已經顯示，PEDF在肺癌細胞的胞漿中有一定程度的表達，而且PEDF陽性表達與抑制微血管的形成有關(張力建，陳晉峰，陸愛萍，等.胎盤生長因子和色素上皮衍生因子在非小細胞肺癌中的表達及其與預后的關系.中華醫學雜志，2005.853328-3331)，患者的預后分析中也發現PEDF的陽性表達是肺癌患者預后較好的影響因素之一。離體細胞學試驗，(Zhang L，Chen J，Ke Y，et al.Down-regulationof PEDF expression by ribozyme transgene in endothelial and lung cancer cellsand its impact on angiogenesis in vitro.Oncol Rep，2005，141615-9)也提示，當腫瘤細胞中PEDF基因被抑制時，腫瘤細胞的生長呈現出明顯的增加趨勢。類似的研究結果也在腦膠質瘤、黑色素瘤等其他惡性腫瘤中得到證實(Guan M，Yam HF，Su B，et al.Loss of pigment epithelium derived factor expression in gliomaprogression.J Clin Pathol，2003，56277-282；Abe R，Shimizu T，Yamagishi S，et al.Overexpression of pigment epithelium-derived factor decreasesangiogenesis and inhibits the growth of human melanoma cells in vivo.Am JPathol，2004，1641225-1232)。這些研究結果均說明PEDF是肺癌以及其他惡性腫瘤組織中腫瘤血管生成因子的對抗因子，具有抑制腫瘤生長的治療作用。
有關抗血管生成藥物的研制在惡性腫瘤的治療中已經成為熱點，但這些藥物或者為單克隆抗體，或者為化學制劑，應用于人體時均會產生一定程度毒副作用。因此，如何找到一種與人體自身組織相容性良好，高效、低毒的肺癌治療的新藥成為科研工作者需要攻克的難題。

發明內容
為了解決現有抗血管生成藥物應用于人體時均會產生一定程度毒副作用的問題，本發明提供一種人源化色素上皮衍生因子，并應用于腫瘤治療。
本發明的技術方案如下本發明提供一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。
本發明還提供所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉錄得到cDNA產物；(3).設計引物如SEQ ID No.2-7所示f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat3’(SEQ ID No.7).
(4).擴增PEDF基因全長，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
上述的正常組織是指肺部組織。
擴增PEDF的條件如下PCR反應體系如下HiFidelity master mix(AbGene公司)25μl，10μmol/L引物各2μl，模板DNA 2μl，加水至總體積 50μl；反應條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個循環。
PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體的步驟如下應用TA克隆的方法將PEDF基因全長導入pEF6/V5/His質粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)本發明提供一種重組蛋白rhPEDF，是由上述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達得到的。
本發明還提供上述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉染感受態細菌E.coli；(2).利用轉染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達人源化重組蛋白rhPEDF。
表達人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養基中，37℃培養24h；(b).將1.5ml培養液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s；(e).加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質粒的上清加入提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(f).將純化質粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質粒；(g).于CHO細胞(ATCC，Maryland，USA)細胞對數生長期時，在無血清DMEM(GIBCO公司)培養基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，Flowgen，Oxford，England，UK)；(h).更換新鮮無血清DMEM培養基繼續培養3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養基，進行傳代培養，得到穩定表達的細胞株；(j).倒去培養液后，用無菌PBS溶液(天為時代公司)洗滌細胞，加入無菌的細胞裂解液(天為時代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細胞裂解液經HiTrap純化柱(GE Healthcare公司)過濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本發明提供一種抑制PEDF表達的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)應用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴增出所需要的核酶序列，上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’(SEQ ID No.8)，下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga 3’(SEQ ID No.9)；反應條件94℃預變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復循環2次，最后在53℃退火溫度繼續循環20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴增得到的核酶序列用限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質粒(Invitrogen公司，內含耐氨芐青霉素基因)進行限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產物進行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質粒PEDFrib。
本發明提供的重組蛋白可用于制備腫瘤治療藥物。
本發明所實現的技術效果如下本發明所研制的人源化色素上皮衍生因子全身應用后，不會產生免疫原性，耐藥性的可能性相對較小；生理活性與正常蛋白完全一致，具有高效的優點，可以靶向抑制腫瘤新生血管，幾乎可以對所有的實體腫瘤發揮抑制新生血管生成的作用。
具體實施例方式
實施例1本發明提供一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。
本發明還提供所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉錄得到cDNA產物；(3).設計引物如SEQ ID No.2-7所示f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)
r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat3’(SEQ ID No.7).
(4).擴增PEDF基因全長，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
上述的正常組織是指肺部組織。
擴增PEDF的條件如下PCR反應體系如下HiFidelity master mix(AbGene公司) 25μl，10μmol/L引物 各2μl，模板DNA2μl，加水至總體積 50μl；反應條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個循環。
PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體的步驟如下應用TA克隆的方法將PEDF基因全長導入pEF6/V5/His質粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)本發明提供一種重組蛋白rhPEDF，是由上述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達得到的。
本發明還提供上述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉染感受態細菌E.coli；(2).利用轉染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達人源化重組蛋白rhPEDF。
表達人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養基中，37℃培養24h；(b).將1.5ml培養液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s；(e).加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質粒的上清加之質提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(f).將純化質粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質粒；(g).于CHO細胞(ATCC，Maryland，USA)細胞對數生長期時，在無血清DMEM(GIBCO公司)培養基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，Flowgen，Oxford，England，UK)；(h).更換新鮮無血清DMEM培養基繼續培養3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養基，進行傳代培養，得到穩定表達的細胞株；(j).倒去培養液后，用無菌PBS溶液(天為時代公司)洗滌細胞，加入無菌的細胞裂解液(天為時代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細胞裂解液經HiTra純化柱(GE Healthcare公司)過濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本發明提供一種抑制PEDF表達的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)應用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴增出所需要的核酶序列，上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’(SEQ ID No.8)，下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga 3’(SEQ ID No.9)；反應條件94℃預變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復循環2次，最后在53℃退火溫度繼續循環20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴增得到的核酶序列用限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質粒(Invitrogen公司，內含耐氨芐青霉素基因)進行限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產物進行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質粒PEDFrib。
本實施例具體步驟如下
1.提取mRNA1)取100mg正常肺組織置于研磨皿中，液氮條件下研磨至粉末狀；2)加入1ml Trizol(AbGene公司)充分勻漿，室溫靜置15分鐘，移至1.5ml離心管中；3)加入0.2ml三氯甲烷，混勻15秒，靜置15分鐘；4)4℃離心，12000轉/分×10分鐘，取上清；5)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘；6)4℃離心，12000轉/分×15分鐘，棄上清；7)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀；8)4℃離心，12000轉/分×5分鐘，棄上清；9)晾干，加入適量的DEPC(Sigma公司)處理的H2O溶解。
2.RNA定量和電泳鑒定1)紫外分光光度計檢測(計算OD260/OD280的比值)取比值為1.8-2.0的樣本；2)RNA濃度(μg/μl)＝OD260×40×稀釋倍數/1000(取OD260＝0.2-0.3之間的樣本)；3)RNA電泳檢測RNA質量1μl RNA樣本與1μl上樣緩沖液混合后在1％瓊脂糖凝膠，90伏電壓下電泳；4)確定提取的RNA質量良好，在-80℃冰箱保存。
3.逆轉錄得到cDNA產物逆轉錄試劑盒中主要試劑成分

1)3μg總RNA，加入以下反應物Oligo(dT)15(10ng/l)1μldNTP Mix(10mM) 1μl
加DEPC-dH2O至10μl，65℃5分鐘，立即置冰上不少于1分鐘。
2)準備以下反應物，按順序加入10×PCR buffer 2μl25mM MgCl24μ0.1mM DTT2μlRNase Out(50u/μl) 1μl在每個變性后的RNA樣品中加入上述混合物共9μl；3)42℃溫浴2分鐘后加Superscript II；4)42℃1小時；5)70℃ 15分鐘，置冰不少于1分鐘；6)加入RNase H 1μl，37℃ 20分鐘；7)立即置于冰上，得到cDNA產物。
4.設計引物，合成PEDF基因全長PCR產物純化過程需要上海華舜公司膠回收純化試劑盒，內含S1液、W1液、T1液、吸附柱。
1)應用引物設計軟件Beacon Designers(Version 2.0，Polo Alto，California，USA)設計出合成PEDF全長的引物序列如下f15’Atgcaggccctggtgcta3’(SEQ ID No.2)f25’gacatgcaggccctggt3’(SEQ ID No.3)r15’cctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.4)r25’ggggcccctggggtccagaa3’(SEQ ID No.5)r35’ggggcccctggggtccagaatctt3’(SEQ ID No.6)r45’gcccctggggtccagaat’3(SEQ ID No.7).
2)反應體系HiFidelity master mix(AbGene公司) 25μl10μmol/L引物 各2μl模板DNA 2μl加水至總體積 50μl3)反應條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個循環。
4)電泳得到1542bp的單一條帶。切下條帶，放于1.5ml離心管中。
5)按每100mg瓊脂糖加入300μl S1液，置50℃水浴10分鐘使膠完全熔化并混勻。
6)將瓊脂糖液移入吸附柱，離心1分鐘，棄去液體，在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，再在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，離心1分鐘。
7)吸附柱中加入30μl T1液體，靜置1分鐘，離心1分鐘，得到純化的目的DNA片段。
8)用純化的100ng的目的DNA片段，10μmol的f1引物，送上海申能博采公司進行測序。
9)測序結果與Gene Bank中PEDF基因序列，在NCBI網站的序列比對界面http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行序列比對后，確定所得序列正確，如SEQID No.1所示。
5.PEDF全長基因導入載體并轉染感受態細菌應用TA克隆的方法將PEDF基因全長導入pEF6/V5/His質粒載體(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)連接反應在滅菌的0.5ml離心管中進行。
10μl體積反應體系如下①取pEF6/V5/His質粒載體1μl，加入2μl PCR產物。
②加入含ATP的10×Bufferlμl，T4DNA連接酶(Invitrogen，Paisley，Scotland，UK)10IU，用ddH2O補足至10μl。
稍加離心，4℃水浴過夜，得到PEDF基因與pEF6/V5/His載體(Invitrogen公司)已經相連接的重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
1)用冷卻的無菌吸頭吸取200μl感受態細菌E.coli(TOP-10，Invitrogen公司)至離心管中，并加入已經連接好的重組載體pEF6/V5/His-PEDF10μl，輕輕旋轉，混勻后置于冰中30min。
2)再將離心管置于預加溫至42℃的循環水浴中，放置90s。
3)再次將離心管置于冰浴中，冷卻1min。
4)加入800μl SOC培養基(天為時代公司)，水浴加熱至37℃，轉移至搖床上，溫育45分鐘。
5)將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細菌接種在SOC瓊脂培養基上12～24小時。
6.提取克隆的細菌株的DNA小劑量DNA提取試劑盒(上海華舜公司)內含DL液、DT液、Rnase A、Proteinase K、W1液、異丙醇、TE液、吸附柱、收集管等。
1)用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml SOC液體培養基上，37℃振蕩培養12小時。
2)在200μl細菌培養液中加入400μl DL液，振蕩懸浮后，置65℃溫浴使小塊組織消失(15分鐘以上)，期間來回顛倒離心管數次。再加入200μl DT液，20μl RnaseA和25μl Proteinase K，迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65℃溫浴15-30分鐘，期間來回顛倒離心管數次，離心3分鐘，將上清移至另外一個離心管中。
3)加入200μl異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混勻后，移取600μl至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。
4)加入500μl W1液，靜置1分鐘后，離心30秒。
5)將吸附柱移入另外一個干凈的收集管中。加入500μl W1液，離心15秒。
6)棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中。離心1分鐘。
7)將吸附柱移入一個干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100μl TE(pH8.5)液，65℃靜置5分鐘后，離心1分鐘。最后1.5ml離心管(DNA)內為模板DNA，-20℃保存。
7.提取的DNA進行PCR反應，確定序列正確的克隆(1)反應體系10×PCR標準緩沖液(Promega公司) 5μl10mmol/L的dNTPs 1μl10μmol/L引物(上游、下游)2μlpfu高保真DNA聚合酶(Promega公司) 3unit模板DNA 2μl加水至總體積 50μl。
(2)引物序列上游5’Atgcaggccctggtgcta3’；下游5’gcccctggggtccagaat3’。
(3)反應條件95℃變性3min，56℃退火15s，72℃延伸1min。
(4)PCR產物純化、回收(上海華舜公司膠回收純化試劑盒，內含S1液、W1液、T1液、吸附柱)1)PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段條帶，放于1.5ml離心管中。
2)按每100mg瓊脂糖加入300μl S1液，置50℃水浴10分鐘使膠完全熔化并混勻。
3)將瓊脂糖液移入吸附柱，離心1分鐘，棄去液體，在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，再在吸附柱中加入500μL W1液，離心15秒，棄去液體，離心1分鐘。
4)吸附柱中加入30μl T1液體，靜置1分鐘，離心1分鐘5)PCR產物經稀釋適當倍數，測量OD值，1OD＝50微克DNA，推算PCR產物量。純化的DNA置于-20℃保存(5).PCR純化產物直接測序(1)用純化的100ng的目的DNA片段，10μmol的上游f1引物，送上海申能博采公司進行測序。
(2)測序結果與Gene Bank中PEDF基因序列，在NCBI網站的序列比對界面http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行序列比對后，確定所得序列正確。
8.得到人源化表達的rhPEDF蛋白(1).將含有能夠正確表達PEDF基因的pEF6/V5/His-PEDF質粒的E.coli細菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養基中，37℃培養24小時。
(2).將1.5ml培養液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s。
(3).棄去上清，將細菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻。
(4).加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s.
(5).同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質粒的上清加入質粒提純分離柱(Plasmid purification column，Sigma)；(6).將純化質粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
(7).于CHO細胞(ATCC，Maryland，USA)細胞對數生長期時，在無血清DMEM(GIBCO公司)培養基中，置入電擊槽(electoporation cuvette)在250V 1500A的條件下電擊(Easyject，Flowgen，Oxford，England，UK)。
(8).更換新鮮無血清DMEM培養基繼續培養3天。
(9).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養基，進行傳代培養，得到穩定表達的細胞株。
(10).倒去培養液后，用無菌PBS溶液(天為時代公司)洗滌細胞，加入無菌的細胞裂解液(天為時代公司)，其中含有大量的人源化PEDF蛋白。
(11).將細胞裂解液經HiTra純化柱(GE Healthcare公司)過濾后，得到純化的PEDF蛋白。
本實施例所制備的rhPEDF生物應用性效果驗證如下細胞試驗證實外源性PEDF蛋白可以抑制血管內皮細胞的血管形成過程，而且證實PEDF基因表達被抑制后，肺癌腫瘤細胞的生長增加。
選用的細胞株為HECV細胞(人類細胞內皮細胞系，ICLC HL01001)，肺腺癌A549細胞(ATCC CCL-185)；，細胞外基質為Matrigel(200μg/mlSigma公司)，DMEM培養基(GIBCO公司)；CO2孵箱(Shellab公司)，CO2濃度為5％。
體外實驗直接證明基因重組PEDF蛋白可以抑制血管內皮細胞的小管形成過程。
(1)96孔板的每個平板孔中加入100μl Matrigel膠，平鋪于平板底部，在通風廚中(56℃)風干2小時，使膠在平板底部形成薄層基質膜。加100μl培養基新水化(2)每孔加入的3×103個HECV細胞，每孔200μl，各組細胞分為3孔分別加入，在37℃孵箱中孵育2小時，使細胞能夠均勻貼于Matrigel膠上生長。
(3)將平板小心傾斜，吸去多余的細胞培養液，加入100μl第二層Matrigel膠。
(4)加入100μl DMEM細胞培養液于第二層Matrigel膠上，分為三組不同的組分，分別為不加入任何生長因子的培養液的細胞組，加入已經制好的重組的PEDF蛋白組，加入重組的PEDF蛋白和VEGF因子的混合蛋白組。
(5)各組細胞在37℃孵箱中孵育24和48小時后，分別在倒置顯微鏡下測量小管形成的直徑，取平均值進行比較，并作統計學分析。
(6)實驗結果顯示外源性VEGF蛋白可以增加HECV細胞在體外的小管形成作用，基因重組的PEDF蛋白與對照組相比，可以明顯抑制VEGF對HECV細胞的體外小管形成的促進作用，具有抑制體外血管內皮細胞小管形成的作用。
體外實驗證實肺癌細胞株中PEDF基因表達被抑制后，腫瘤細胞的生長明顯增加。
1.抑制PEDF表達的錘頭狀核酶的合成與克隆(1)利用Zucker’s mFold軟件對人PEDF mRNA的二級結構和最低能量進行分析，同時結合NCBI Gene Bank進行同源性分析設計核酶的序列。從中尋找出一個適合錘頭狀核酶的靶位點(2)應用降落PCR(Touch down PCR)的方法擴增出所需要的核酶序列。其上游引物PEDFribR5’actagtggcagcggctgtctccaacttttcgtcctcacggact3’；下游引物PEDFribF5’ctgcagcacccggtacaggtcatagccctgatgagtccgtgagga3’。
反應條件94℃預變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復循環2次，最后在53℃退火溫度繼續循環20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存。
(3)在引物的5’末端的6個堿基對中均含有SpeI和PstI的限制性酶切位點。在無菌的eppendorf管(Promega公司)中用微量槍將1μg所得的DNA和內切酶緩沖液2μl，加入雙蒸餾水至總體積19μl，混勻后加入1μl限制性內切酶(New England Biolabs公司)。
(4)將eppendorf管在37℃水浴條件下保溫4小時。
(5)加入0.1mol/L EDTA(pH8.0)(Promega公司)2μl，停止酶切反應，得到目的DNA序列的酶解液。
(6)在無菌的eppendorf管(Promega公司)中用微量槍將1μg pEF6/V5/His質粒進行如上的酶解過程，得到質粒的酶解液。
(7)在微量離心管中加入下列連接混合液25μg/ml的DNA序列酶解液1μlpEF6/V5/His質粒酶解液 20ng(Invitrogen公司，內含耐氨芐青霉素基因)10×連接緩沖液 1μl連接酶 3U總體積 10μl(8)14℃孵育4小時，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質粒，命名為PEDFrib。
(9)用冷卻的無菌吸頭吸取200μl感受態細菌E.coli(TOP-10，Invitrogen公司)至離心管中，并加入已經連接有核酶基因的質粒10μl，輕輕旋轉，混勻后置于冰中30分鐘。
(10)再將離心管置于預加溫至42℃的循環水浴中，放置90s。
(11)再次將離心管置于冰浴中，冷卻1分鐘。
(12)加入800μl SOC培養基(天為時代公司)，水浴加熱至37℃，轉移至搖床上，溫育45分鐘，得到可以正確表達PEDFrib質粒的E.coli細菌。
2.穩定轉染細胞的建立(1)將含有能夠正確表達PEDFrib質粒的E.coli細菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養基(天為時代公司)中，37℃培養24小時。
(2)將1.5ml培養液置入eppendorf管中，4℃下12,000離心30s。
(3)棄去上清，將細菌沉淀懸浮于120ml STET(Sigma公司)中，混勻。
(4)加入10ml溶菌酶溶液(Sigma公司)，旋渦振蕩3s.
(5)加同量中和溶液(SIGMA)后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質粒的上清加之質提純分離柱(Plasmid purificationcolumn，Sigma)；。
(6)將純化質粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質粒。
(7)于A549細胞對數生長期時，在無血清的DMEM(GIBCO公司)培養基中，將其與含有除菌處理的質粒和脂質體(Invitrogen公司)的混合物在CO2孵箱(Shellab公司)共同孵育24小時。
(8)更換新鮮DMEM培養基繼續培養3天。
(9)4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin(5μg/ml)的篩選培養基，進行傳代培養，得到穩定表達的細胞株。
在轉染過程中同時設立沒有裝入目的片段的空載體作為空白對照。經過PEDFrib轉染的A549細胞命名為A549PEDFrib；轉染入pEF6/V5/His空質粒的A549細胞命名為A549control；沒有經過轉染的A549細胞命名為A549wt。
3.Western blot檢測細胞中PEDF蛋白的表達(1).各組A549細胞分別經胰蛋白酶(天為時代公司)消化后呈懸浮狀態。
(2).離心后加入細胞裂解液(Applygen Technologies Co.，Ltd.)，所得的蛋白定量為0.4μg/μl。
(3).將蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠(天為時代公司)中電泳，樣品在濃縮膠中泳動時，電壓為100V，進入分離膠后，電壓增至150～200V(約15V/em)。
(4).把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。
1)轉移緩沖液(天為時代公司)洗滌凝膠和硝酸纖維素膜(天為時代公司)，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預先用轉移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。
5)接通電源開始電泳轉移。
6)轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
(5).將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置。
(6).用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
(7).膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
(8).室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
(9).用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
(10).袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
(11).混合NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(10毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時(或4℃過夜)(12).用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
(13).將羊抗人PEDF的多克隆抗體(1∶500)(Santa Cruz公司)加在袋內，于室溫下搖動1小時。
(14).按步驟9洗滌。
(15).加入兔抗羊IgG(1∶1000)(Santa Cruz公司)，于室溫下搖動1小時。
(16).按步驟9洗滌。
(17).加入ECL系統(Applygen Technologies Co.，Ltd.)顯色液體，于室溫下靜置5分鐘。
(18).將薄膜轉到暗室中，底片曝光10分鐘。
檢測結果顯示與對照組相比，PEDF蛋白在A549PEDFrib組細胞中的表達明顯被抑制。
3.MTT法檢測細胞增殖并繪制細胞生長曲線MTT試劑(Sigma公司)濃度配制成0.1mg/ml，分裝儲存。
(1)96孔板中每孔加入的3×103個細胞，每孔200μl，各組細胞分為3孔分別加入。
(2)共需5個96孔板，分別用于計數第0~4天時細胞的數量。
(3)空白對照孔內不加入細胞，其測定的吸光光度值作為基線值；(4)第0天為細胞接種后4小時的測定值。
(5)每孔加入100μl MTT，37℃孵育4小時，仔細吸去上清液體后每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)充分溶解MTT，15分鐘后于分光光度計570nm處測量吸光度值，反映細胞數量。
(6)以時間為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制細胞生長曲線(見附圖
6)。
實驗結果顯示，轉染PEDFrib后的A549PEDFrib細胞與A549control及A549wt相比，PEDF基因表達被明顯抑制，MTT細胞生長曲線顯示，A549PEDFrib組細胞的生長明顯高于A549control及A549wt組，說明PEDF表達被抑制后，肺癌細胞的生長明顯增加。
臨床試驗證實PEDF蛋白的表達與肺癌患者預后之間的關系。
為進一步了解PEDF蛋白在肺癌組織中的表達與肺癌患者預后之間的關系，收集手術切除的非小細胞肺癌標本81例。根據1997年第八屆國際肺癌大會制定的分期標準分類和分級。男性58例，女性23例，中位年齡62(39～77)歲。術后分期(pTNM)I-II期55例(67.9％)，III-IV期26例(32.1％)。組織病理學類型鱗癌45例(55.6％)，腺癌36例(44.4％)。81例患者中位隨訪時間24.6個月(2～49個月)，平均生存時間為36.5個月(95％CI32.88-40.14)。應用免疫組化的方法在臨床試驗研究中證實PEDF蛋白在肺癌組織中陽性表達時，患者的生存時間明顯高于陰性表達的患者，說明PEDF蛋白可以抑制肺癌細胞的生長，具有一定程度的治療肺癌的作用。
1.制備切片1)載玻片用清洗液浸泡24小時，清水洗凈烘干。
2)酸處理24小時，清水洗凈，晾干。
3)將清潔的載玻片置入1∶50丙酮稀釋的多聚賴氨酸溶液(中衫公司)中浸泡30秒。
4)置入純丙酮溶液中洗去未結合的多聚賴氨酸溶液，涼干備用。
5)常規切片厚4μm。
6)切片置烤箱58~62℃，8~12小時。
2.免疫組化染色1)二甲苯脫蠟10分鐘，梯度酒精水化15分鐘。
2)PBS(中衫公司)洗，5分鐘×3次。
3)3％過氧化氫溶液孵育，室溫10分鐘。
4)PBS洗，5分鐘×3次。
5)枸櫞酸緩沖液(0.01M，PH 6.0)(中衫公司)微波熱修復，650W，10分鐘。
6)室溫冷卻后，PBS洗，5分鐘×3次。
7)滴加羊抗PEDF的多克隆抗體(Santa Cruz公司)，40μl/切片，4℃孵育過夜。
8)PBS洗，5分鐘×3次。
9)滴加二抗(中杉公司)，30μl/切片，室溫30分鐘。
10)PBS洗，5分鐘×3次。
11)滴加新鮮配制的DAB顯色液(中衫公司)，100μl/切片，室溫3-5分鐘，顯微鏡下觀察顯色滿意即終止反應。
12)蘇木素復染胞核，20-30秒。
13)1％鹽酸酒精分化，5秒。
14)流水沖洗30分鐘。
15)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。
16)顯微鏡下觀察，PEDF陽性染色均位于細胞漿，陽性腫瘤細胞的百分率＞5％為表達陽性，≤5％為表達陰性。
生存分析的統計結果顯示PEDF蛋白在肺癌組織中陽性表達時，患者的生存時間明顯高于陰性表達的患者。
本實施例所制備的重組蛋白經全身靜脈注射、局部腫瘤內注射、肌肉注射或皮下注射，均會達到有效抑制腫瘤內新生血管生成的作用，是一種非常前途的抗腫瘤新藥。
序列表<110>張，力建姜，文國<120>基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應用<130>Guan M，Yam HF，Su B，et al.Loss of pigment epithelium derivedfactor expression in glioma progression.J Clin Pathol，2003，56277-282<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1542<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>primer<400>9ctgcagcacc cggtacaggt catagccctg atgagtccgt gagga 4權利要求
1.一種重組載體pEF6/V5/His-PEDF，其特征在于，所述重組載體含有SEQ IDNo.1所示的基因序列。
2.權利要求1所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1).提取正常組織的mRNA；(2).逆轉錄得到cDNA產物；(3).設計引物如SEQ ID No.2-7所示(4).擴增PEDF基因全長，如SEQ ID No.1所示；(5).將PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體，獲得重組載體pEF6/V5/His-PEDF。
3.根據權利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，上述的正常組織是指肺部組織。
4.根據權利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，擴增PEDF基因全長的條件如下PCR反應體系如下HiFidelity master mix 25μl，10μmol/L引物 各2μl，模板DNA 2μl，加水至總體積50μl；反應條件為95℃ 5min，94℃ 1min，57℃ 60s，72℃ 75s；共30個循環。
5.根據權利要求2所述的重組載體pEF6/V5/His-PEDF的制備方法，其特征在于，PEDF全長基因導入pEF6/V5/His質粒載體的方法如下應用TA克隆的方法將PEDF基因全長導入pEF6/V5/His質粒載體。
6.一種重組蛋白rhPEDF，其特征在于，所述重組蛋白是由權利要求1所述重組載體pEF6/V5/His-PEDF表達得到的。
7.權利要求6所述重組蛋白rhPEDF的制備方法，包括如下步驟(1).重組載體pEF6/V5/His-PEDF轉染感受態細菌E.coli；(2).利用轉染重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli菌表達人源化重組蛋白rhPEDF。
8.根據權利要求7所述重組蛋白rhPEDF的制備方法，表達人源化重組蛋白rhPEDF的步驟如下(a).將含有重組載體pEF6/V5/His-PEDF的E.coli細菌在含有氨芐青霉素的SOC液體培養基中，37℃培養24h；(b).將1.5ml培養液置入eppendorf管中，4℃下12000rpm離心30s；(c).棄去上清，將細菌沉淀懸浮于120ml STET中，混勻；(d).加入10ml溶菌酶溶液，旋渦振蕩3s；(e).同量中和溶液后，將eppendorf置入4℃條件下12000rpm離心10min，取上清；并將含質粒的上清加入提純分離柱；(f).將純化質粒在75％酒精中洗滌2次，沉淀后溶于無菌蒸餾水中，得到純化的滅菌處理的質粒；(g).于CHO細胞細胞對數生長期時，在無血清DMEM培養基中，置入電擊槽在250V 1500A的條件下電擊；(h).更換新鮮無血清DMEM培養基繼續培養3天；(i).4天后更換為含有10％胎牛血清和Blasticidin的篩選培養基，進行傳代培養，得到穩定表達的細胞株；(j).倒去培養液后，用無菌PBS溶液洗滌細胞，加入無菌的細胞裂解液，其中含有大量的人源化PEDF蛋白；(k).將細胞裂解液經HiTra純化柱過濾后，得到純化的PEDF蛋白。
9.權利要求6所述重組蛋白制備的腫瘤治療藥物。
10.一種用于權利要求6所述重組蛋白rhPEDF檢測的錘頭狀核酶，其制備方法包括如下步驟(1)以SEQ ID No.8和SEQ ID No.9為引物，應用降落PCR的方法擴增出所需要的核酶序列，反應條件為94℃預變性3分鐘，退火起始溫度為68℃，終止于53℃，退火溫度每降低1℃重復循環2次，最后在53℃退火溫度繼續循環20次，72℃延伸3分鐘，然后在4℃保存；(2)將步驟(1)擴增得到的核酶序列用限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(3)pEF6/V5/His質粒進行限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切；(4)將步驟(2)和(3)制得的酶切產物進行連接，得到核酶基因裝入pEF6/v5-his載體的質粒PEDFrib。
全文摘要
本發明涉及一種重組蛋白及其應用，特別是涉及一種基因重組人源化色素上皮衍生因子及其應用。本發明提供一種重組載體pEF6/V5/His－PEDF，含有SEQ ID No.1所示的基因序列。本發明還提供所述重組載體pEF6/V5/His－PEDF的制備方法。本發明所研制的人源化色素上皮衍生因子全身應用后，不會產生免疫原性，耐藥性的可能性相對較小；生理活性與正常蛋白完全一致，具有高效的優點，可以靶向抑制腫瘤新生血管，幾乎可以對所有的實體腫瘤發揮抑制新生血管生成的作用。
文檔編號A61K38/17GK1924021SQ20061012779
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月8日 優先權日2006年9月8日
發明者張力建, 姜文國 申請人:張力建, 姜文國