專利名稱：利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法。
背景技術(shù)：
蝦青素(Astaxanthin)是一種鮮紅色脂溶性色素，屬于酮式類胡蘿卜素。大量實(shí)驗(yàn)表明，蝦青素不但具有獨(dú)特的著色功能，而且還表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗氧化特性和多種生物活性。由于突出的生理功能，蝦青素在水產(chǎn)及家禽養(yǎng)殖、食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，因此幾十年來利用各種途徑生產(chǎn)蝦青素一直是國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問題。目前蝦青素的規(guī)模化生產(chǎn)主要依靠化學(xué)手段人工合成，或是從甲殼類動(dòng)物及其加工后的廢物、紅法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous,即以前的Phaffiarhodozyma)及雨生紅球藻(Haema tococcus pluvialis)中提取生物合成的天然奸青素。由于生產(chǎn)技術(shù)難度高及菌種和藻種本身的限制，蝦青素的產(chǎn)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，這也在一定程度上制約了天然蝦青素的廣泛應(yīng)用。小球藻Chlorella zofingiensis合成奸青素的能力自二十世紀(jì)90年代報(bào)道后引起了廣泛關(guān)注，被認(rèn)為有可能成為新的天然蝦青素工業(yè)來源。1994年，Rise等首次報(bào)道了 C. zofingiensis在高光和氮缺乏的協(xié)同作用下,能夠在胞內(nèi)大量合成并積累奸青素,用以抵御光氧化損傷。隨后，C. zofingiensis的奸青素合成模式、合成途徑、及其合成途徑上關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制陸續(xù)被報(bào)道出來。2005年，Ip和Chen首次發(fā)現(xiàn)了光照不是誘導(dǎo)C. zofingiensis奸青素積累的必要條件,在黑暗條件下C. zofingiensis仍然能以較快的速度合成奸青素，提出了暗異養(yǎng)培養(yǎng)C. zofingiensis生產(chǎn)奸青素的概念,并申請(qǐng)了美國(guó)專利(US2005214897-A1)。上述研究進(jìn)展暗示,雖然小球藻C. zofingiensis和雨生紅球藻
H.pluvialis 一樣同屬單細(xì)胞綠藻,但二者的細(xì)胞生理生化特性和奸青素合成機(jī)制截然不同。因此，C. zofingiensis源奸青素的生產(chǎn)工藝不能照搬照抄現(xiàn)有的H. pluvialis源奸青素的生產(chǎn)模式和調(diào)控技術(shù)，必須專門針對(duì)C. zofingiensis細(xì)胞特性及其奸青素代謝調(diào)控機(jī)制建立一套新的工藝流程和設(shè)備，這是C. zofingiensis源奸青素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)前必須首先完成的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為(I)活化培養(yǎng)將小球藻(Chlorella zofingiensis)在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，獲得同步化生長(zhǎng)的藻液，待用； (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)取步驟(I)中生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶輔助因子，同時(shí)補(bǔ)充碳源和氮源進(jìn)行培養(yǎng)，直至藻體細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累量最高時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，采收細(xì)胞破壁提取蝦青素。所述活化培養(yǎng)是將小球藻(C. zofingiensis)培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中振蕩發(fā)酵養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30°C，光強(qiáng)0-200 μ mol πΓΥ1，轉(zhuǎn)速100_200rpm，光暗比為12-24h/12-24h。所述液體培養(yǎng)基為Kuhl、BG-11、BBM、Basal、CZ-M1、KM1 中的一種。所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為取步驟(I)中生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶輔助因子，同時(shí)補(bǔ)充碳源和氮源進(jìn)行振蕩發(fā)酵養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30°C，光強(qiáng)0-200 μ mol HT2s-1,轉(zhuǎn)速100-200rpm，光暗比為12_24h/12_24h ;直至藻體細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累量最高時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，采收細(xì)胞破壁提取蝦青素。所述色素合成酶輔助因子為Mg、Zn、Cu、Fe、Mn中的一種或幾種；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 02-20mM。所述碳源為無機(jī)碳源和/或有機(jī)碳源；所述氮源為無機(jī)氮源和/或有機(jī)氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。所述無機(jī)碳源為二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽中的一種或幾種；所述有機(jī)碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸鹽中的一種或幾種。所述無機(jī)氮源為硝酸鹽、銨鹽、氨水中的一種或幾種；所述有機(jī)氮源為尿素、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種。`本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明基于對(duì)小球藻C. zofingiensis中蝦青素合成代謝調(diào)控的研究，篩選出了蝦青素合成的有效促進(jìn)劑(色素合成酶輔助因子)，實(shí)現(xiàn)了小球藻蝦青素的快速合成和高效積累。本發(fā)明采用廉價(jià)原料，操作簡(jiǎn)單，具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值，具體為通過在細(xì)胞生長(zhǎng)的指數(shù)期添加蝦青素合成促進(jìn)劑，同時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充碳源和氮源，在避免了這些物質(zhì)過早加入對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的同時(shí)，大幅提高了蝦青素的產(chǎn)量，是對(duì)照組的1. 4-6. 5倍。從中提取的蝦青素可用于水產(chǎn)及家禽養(yǎng)殖、食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1I)活化培養(yǎng)無菌條件下挑取小球藻C. zofingiensis單藻落到滅菌的Kuhl液體培養(yǎng)基中，而后將藻種按10% (體積比)接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在溫度為25°C,轉(zhuǎn)速為150rpm,光照強(qiáng)度為IOOymol IrT2S4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)。Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/LEDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)取步驟(I)培養(yǎng)3天后中生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，在無菌條件下，向培養(yǎng)液內(nèi)加入氯化亞鐵至終濃度O. 2mM,葡萄糖至終濃度200mM，硝酸鉀至終濃度5mM。繼續(xù)培養(yǎng)20天后，藻細(xì)胞的生物量和蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最高，培養(yǎng)結(jié)束，取樣采用液相色譜(HPLC)法測(cè)定(色譜儀采用Waters 2695自動(dòng)抽氣進(jìn)樣系統(tǒng)和Waters 2996紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器(PDA);光譜掃描波長(zhǎng)范圍為300-700nm;積分定量用檢測(cè)波長(zhǎng)為 450nm ;溫度 4°C ;進(jìn)樣量 20 μ I ;流速 L 2ml mirT1 ;色譜柱采用
權(quán)利要求
1.一種利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于 (1)活化培養(yǎng)將小球藻(Chlorellazofingiensis)在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng),獲得同步化生長(zhǎng)的藻液，待用； (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)取步驟(I)中生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶輔助因子，同時(shí)補(bǔ)充碳源和氮源進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)后菌株細(xì)胞破壁提取蝦青素。
2.按權(quán)利要求1所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于 所述活化培養(yǎng)是將小球藻(C. zofingiensis)培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中振蕩發(fā)酵養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度 20-30°C，光強(qiáng) 0-200iimol nT2s'轉(zhuǎn)速 100_200rpm，光暗比為 12_24h/12_24h。
3.按權(quán)利要求1或2所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基為Kuhl、BG-11、BBM、Basal、CZ-MUKMl中的一種。
4.按權(quán)利要求3所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。
5.按權(quán)利要求3所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為取步驟I)中生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶輔助因子，同時(shí)補(bǔ)充碳源和氮源進(jìn)行振蕩發(fā)酵養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30°C，光強(qiáng)0-200 iimol HT2s-1,轉(zhuǎn)速100-200rpm，光暗比為12_24h/12_24h ;直至藻體細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累量最高時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，采收細(xì)胞破壁提取蝦青素。
6.按權(quán)利要求1或5所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述色素合成酶輔助因子為Mg、Zn、Cu、Fe、Mn中的一種或幾種；并且其一次性添加或流加，流加量控制在0. 02-20mM。
7.按權(quán)利要求1或5所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述碳源為無機(jī)碳源和/或有機(jī)碳源；所述氮源為無機(jī)氮源和/或有機(jī)氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。
8.按權(quán)利要求7所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述無機(jī)碳源為二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽中的一種或幾種；所述有機(jī)碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸鹽中的一種或幾種。
9.按權(quán)利要求7所述的利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述無機(jī)氮源為硝酸鹽、銨鹽、氨水中的一種或幾種；所述有機(jī)氮源為尿素、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用色素合成酶輔助因子誘導(dǎo)小球藻合成蝦青素的方法。具體為將小球藻在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，獲得同步化生長(zhǎng)的藻液，待用；取上述生長(zhǎng)到處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，并向藻液中添加色素合成酶輔助因子，同時(shí)補(bǔ)充碳源和氮源進(jìn)行培養(yǎng)，直至藻體細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累量最高時(shí)培養(yǎng)結(jié)束，采收細(xì)胞破壁提取蝦青素。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行、成本低廉、能顯著增加蝦青素的產(chǎn)量，從而大大提高小球藻生產(chǎn)蝦青素的效率。
文檔編號(hào)C12R1/89GK103045708SQ20111031878
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者王艷, 秦松 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所