專利名稱：乙肝病毒多聚酶蛋白ymdd功能區的抑制肽及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術的分子生物學和生物化學等領域，涉及從噬菌體肽庫中篩選到的乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的抑制肽，可抑制乙型肝炎病毒復制，適用于抗乙型肝炎病毒藥物的研究以及乙型肝炎病毒的分子病毒學研究。
背景技術：
慢性乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的，嚴重危害人類健康的常見病，慢性乙型肝炎的防治是一個全球性公共衛生問題，已引起世界各國的關注。開發切實有效的抗乙型肝炎病毒的治療藥物，是當前亟待解決的重大課題。
在HBV復制周期中，肝細胞核中的HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)分子是HBV mRNA和前基因組RNA的合成模板，它是HBV持續感染的主要因素，因此抑制HBV cccDNA的合成是根治乙型肝炎的關鍵所在。乙型肝炎不能徹底治愈的根本原因在于目前所用的抗病毒藥物無法抑制肝細胞核內HBV cccDNA的合成。HBV逆轉錄酶抑制劑能阻斷大部分新的HBV DNA合成，但對核內多達50或更多拷貝的cccDNA池影響甚微。這也是目前臨床使用的拉米呋啶(Lamivudine，3TC)等核苷類似物不能根治乙型肝炎的原因。并且，已經發現部分病人在使用拉米呋啶治療后出現了病毒多聚酶P蛋白YMDD的功能區出現變異，導致病毒對拉米呋啶耐藥。因此，有必要開發能抑制HBV cccDNA，且能與拉米呋啶作用互補的藥物。
大多數開發成功或正在開發的直接作用于病毒的藥物為核苷類似物，其抑制多聚酶功能的機制為競爭性抑制作用。根據競爭性抑制作用的原理，作用的藥物必須有較高濃度才起作用。理想的抑酶藥物應該是能與酶促反應中間產物結合，產生反競爭性抑制作用或非競爭性抑制作用。抑制肽與靶蛋白(多聚酶)的結合，并非酶與底物的關系，而是類似抗原抗體反應的分子間作用力。親合力高的抑制肽有可能達到這種效果。
應用噬菌體展示技術篩選抑制肽，是將外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持特定的空間構象，利用特異性親和作用以篩選與靶分子特異性結合的多肽的一項新技術。它將基因型與表型、分子結合活性與噬菌體的可擴增性結合在一起，是一種高效的篩選技術。將待選基因插入噬菌體信號肽序列與主要衣殼蛋白基因之間，每一個噬菌體只含有一個外源基因，即每一個噬菌體只表達一種外源肽或蛋白，且呈現在噬菌體表面，而且不影響噬菌體的完整性。利用展示的多肽與目的蛋白(主要是抗體、抗原及一些細胞生長因子受體等)或其他生物大分子親和的性質可高效率的篩選出特異多肽。噬菌體展示的有特異性結合力的多肽可以用固定的配體從肽庫中篩選出來，篩選出來的多肽的序列可以從被包裹著的DNA序列推論出。

發明內容
本發明是利用噬菌體表面展示技術，篩選到與乙肝病毒多聚酶(P蛋白)的YMDD功能區能特異性結合的抑制肽，用于抑制HBV復制。該抑制肽適用于抗HBV藥物的研制以及HBV的分子病毒學研究。
上述抑制肽有三種，三種抑制肽的氨基酸序列分別為SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser ThrSEQ NO 2Gly Pro Phe Ash Asn Pro ProSEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp本發明抑制肽的篩選方法為用乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的短肽作為靶位，利用噬菌體表面展示技術篩選與所述靶位特異性結合的肽，即為本發明的抑制肽。乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區短肽的氨基酸序列為SEQ NO 4Arg Arg Ala Phe Pro HisCys Leu Ala Phe Ser Try Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala。
本發明的三種抑制肽可應用于抗HBV藥物的制備。
本發明抑制肽的篩選方法具體包含以下的步驟1、HBV多聚酶YMDD功能區活性位點短肽的合成，合成的序列為RRAFPHCLAFSYMDDVVLGA。
2、噬菌體肽庫篩選、滴度的測定、噬斑的擴增噬菌體多肽庫篩選的方法，參見實施例一。
3、模板序列測定方法參見實施例一。根據提供的載體信息，三種抑制肽核苷酸序列測定的結果分別為AGTCGAATTATTCGTATACCA，AGGCGGATTATTAAAAGGACC，ATCAGGAGGAGGCAACCAACC，其反向互補序列是多肽的編碼序列，推出該抑制肽的氨基酸序列為SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser ThrSEQ NO 2Gly Pro Phe Asn Asn Pro ProSEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp4、抑制肽抑制HBV多聚酶復制的生物學功能測定方法參見實施例二。
具體實施例方式
本發明結合實施例作進一步說明。
實施例一 乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的抑制肽的篩選
(一)乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區短肽的合成根據HBV ayw基因型序列設計(genbank access noU95551)，在杭州中肽生化有限公司合成短肽，序列為Arg Arg Ala PhePro His Cys Leu Ala Phe Ser Try Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala。短肽的純度＞85％，溶解度＞0.5mg/ml。
(二)噬菌體肽庫篩選1.第一天1.1.以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制備的靶分子溶液乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區短肽配成150g/ml的溶液，先以DMSO助溶，再加0.1M NaHCO3(PH 8.6)溶解。
1.2.包被在每孔內加入1501靶分子溶液，重復渦旋直至表面完全濕潤。在濕盒中，4℃溫和振蕩孵育過夜。4℃保存于濕盒中備用。
2.第二天2.1.將ER2537接種至10ml LB培養基中。如果是在同一天擴增洗脫的噬菌體，也可以將ER2537過夜培養物接種于含有20ml LB培養基的250ml錐形瓶中(比例為1∶100)。37℃劇烈振搖4.5~5hrs(至A600值約0.5)。
2.2.將平皿反扣在潔凈的紙巾上，去除包被液，加滿封閉液，4℃孵育至少1hr。
2.3.去除包被液。用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗滌6次。反復旋轉確保孔底及孔側面都被洗滌。每次更換紙巾，以避免交叉污染。
2.4.用1001 TBST稀釋2×1010噬菌體(101原庫)，加至包被后的平皿內，室溫下輕緩搖動10-60min。
2.5.以步驟2.3的方法去除未結合的噬菌體。
2.6.以步驟2.4的方法用TBST洗滌板子10次，每次換用潔凈的紙巾，避免交叉污染。
2.7.用1ml的洗脫緩沖液洗脫結合的噬菌體。洗脫液可以是含有配體(0.1-1mM)的TBS，或是含有靶蛋白(100g/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白競爭結合噬菌體。室溫下輕緩搖動10-60min。將洗脫液轉入微量離心管中。
2.8.使用通用緩沖液(酸洗脫液)100ul
。輕緩搖動不超過10min，將洗脫液轉入微量離心管中，以1501 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。
2.9.取小量洗脫液(11)測定滴度。可將第一輪或第二輪測定滴度的噬斑進行測序(見后續操作)。(未用的洗脫物可4℃保存過夜，第二天進行擴增。在這種情況下，用LB過夜培養ER2537，第二天，用LB培養基以1∶100將該培養物稀釋至20ml，加入未擴增的洗脫液，在250ml的錐形瓶內，37℃劇烈振搖孵育4.5hrs，進入步驟2.11)。
2.10.將剩余的洗脫物進行擴增將洗脫物加入20ml ER2537培養物中(對數早期)，37℃劇烈振搖孵育4.5hrs。
2.11.將培養物轉入50ml離心管中，4℃，10000轉離心10min，將上清轉入新的離心管中，再次離心。
2.12.將80％的上清轉入新的離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌體至少60min或過夜。
3.第三天3.1.4℃，10000轉離心PEG的沉淀物15min，傾去上清，再次離心，吸去多余的上清。
3.2.用1ml TBS懸浮沉淀物并轉入微量離心管中，4℃離心5min使殘留的細胞沉淀。
3.3.將上清轉入新的離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次進行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃離心10min，棄上清，再次短暫離心，用微量槍頭吸去殘留的上清。
3.4.用2001 TBS，0.02％NaN3懸浮沉淀物，離心1min，將上清轉入新管中，即為擴增的洗脫液。
3.5.測定洗脫物在擴增后的濃度，貯存于4℃。
3.6.包被平皿進行第二輪篩選，同步驟1-3。
4.第四天和第五天4.1.計數藍色噬斑，確定噬菌體的滴度，計算對應于1×1011-2×1011pfu的噬菌體體積。如果滴度太低，在篩選時可采用對應于109pfu的噬菌體體積。
4.2.進行第二輪篩選重復步驟2.2-3.4，用含1×1011-2×1011pfu噬菌體的第一輪擴增洗脫液進行篩選，將洗滌液中的Tween 20濃度增至0.5％。
4.3.測定第二輪篩選擴增洗脫液的滴度。
4.4.包被平皿進行第三輪篩選，步驟1.1-2.1。
5.第六天5.1.進行第三輪篩選用第二輪擴增洗脫液中1×1011-2×1011pfu噬菌體進行篩選，洗滌時，Tween 20的濃度仍為0.5％。
5.2.測定未擴增的第三輪洗脫液的滴度。如果不進行第四輪篩選則不必擴增第三輪的篩選洗脫物。滴度測定時的藍色噬斑可用于測序平板的孵育時間不長于18hrs。將剩余得洗脫物保存于4℃。
5.3.選取單克隆ER2537過夜培養。
(三)噬菌體滴度的測定1.在5-10ml LB培養基中接種單個ER2537克隆，振搖孵育直至對數生長中期(OD600＝0.5)。
2.在細胞生長時，微波融化頂層瓊脂糖凝膠，分裝至無菌培養管內，每管3ml。維持在45℃備用。
3.37℃預熱LB/IPTG/Xgal培養板，備用。
4.以LB培養基10倍比稀釋噬菌體。
5.稀釋范圍對擴增的噬菌體培養上清，108-1011；對未擴增的篩選洗脫液，101-104。每次稀釋都換用新的加樣槍頭。
6.一旦ER2537培養物長至對數生長中期，分裝至微量離心管中，每管2001。
7.將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細菌培養物的微量離心管中，一支微量離心管中僅加入一種稀釋液101，快速渦旋，室溫孵育1-5min。
8.轉移至含有45℃頂層瓊脂糖凝膠的管中，快速渦旋混勻，立即傾倒至預熱的LB/IPTG/Xgal平板上，輕緩搖動平板使頂層膠均勻分布。
9.冷卻平板5min，37℃倒置培養過夜。
10.噬斑計數以噬斑數為100左右的平皿為準，噬斑數乘以稀釋度即可獲得每101噬菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。
(四)噬斑的擴增1.以LB培養基稀釋ER2537過夜培養物。1ml分裝至培養管，每管中接種一個克隆。
2.使用消毒牙簽或槍頭，穿刺噬斑，接種至上述培養管中。
3.37℃振搖孵育4.5-5hrs(不能過長)。
4.測定單個克隆的序列。取101未擴增的洗脫物加至1ml宿主菌稀釋液中37℃振搖孵育4.5-5hrs。
5.將培養物轉至微量離心管，離心30sec，取上清轉入新的離心管中再次離心，取上部約80％的上清轉至新的離心管。這是擴增的噬菌體貯存液，能4℃保存。
(五)測序模板的快速純化1.擴增噬斑，在第一次離心后，將5001含有噬菌體的上清轉入新的離心管中。
2.加入2001 PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫靜置10min。
3.離心10min，傾去上清。
4.再次短暫離心，仔細吸去殘留上清。
5.用1001碘化物緩沖液完全重懸沉淀物，加入2501乙醇。室溫孵育10min，室溫短暫孵育將選擇性沉淀單鏈噬菌體DNA，而大部分噬菌體蛋白保留在溶液中。
6.離心10min，傾去上清，用70％乙醇洗滌沉淀物，真空吸干。
7.用301 TE緩沖液重懸沉淀物。
8.取51作為測序模板，送出測序。
(六)測序結果共挑取30個克隆進行測序。其中，有3種克隆的序列重復出現，該3條序列進一步進行抑制病毒復制的研究。另外的序列未出現重復，不作進一步研究。根據提供的載體信息，序列測定的結果分別為AGTCGAATTATTCGTATACCA，AGGCGGATTATTAAAAGGACC，ATCAGGAGGAGGCAACCAACC，其反向互補序列是多肽的編碼序列，推出該抑制肽的氨基酸序列并命名為SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser Thr(HBV YMDD功能區抑制肽1號)，SEQ NO 2Gly ProPhe Asn Asn Pro Pro(HBV YMDD功能區抑制肽2號)，SEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp(HBVYMDD功能區抑制肽3號)。
實施例二 抑制肽對乙型肝炎病毒抑制作用的實驗(一)細胞培養1、2.2.15細胞的培養2.2.15細胞為轉染HBV全基因的肝癌細胞株，含有完整HBV基因的多倍體，能轉錄、翻譯HBV基因并產生和分泌HbsAg、HbeAg、HBV DNA和HBV顆粒。以RPMI1640培養基、10％新生小牛血清、400mg/L G418加壓培養。2.2.15細胞按2×106/平皿接種于60mm細胞培養平皿。實驗組為合成的多肽(Trp Try Thr Asn Asn Ser Thr(HBV YMDD功能區抑制肽1#)，Gly Pro Phe Asn Asn Pro Pro(HBV YMDD功能區抑制肽2#)，Gly Trp Leu Pro ProPro Asp(HBV YMDD功能區抑制肽3#)，由杭州中肽生化有限公司合成)，每平皿加301抑制肽溶液。拉米夫定對照組每平皿加31拉米夫定儲存液。所設的陰性對照組，加入301 PBS。37℃，5％CO2細胞培養箱培養。抑制肽及對照組均設三個復孔。
2、第10天收集細胞上清后，細胞用PBS洗滌2次，用0.25％胰蛋白酶消化，4℃1500g離心5min。PBS洗滌2次。稀釋后計數每個平皿的細胞總數。
(二)抑制肽對HBsAg和HBeAg表達抑制效應的測定1、HBsAg和HBeAg測定 放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)。所用試劑為山東濰坊3V診斷技術公司生產的HBsAg定量放射免疫分析試劑盒和HBeAg定量放射免疫分析試劑盒。
2、抑制肽對HBsAg和HBeAg表達的抑制率，按下列方式計算抑制率＝(實驗孔X--對照孔X)/(對照孔X-2.1)×100％(X為HBsAg和HBeAg的RIA S/N值)。計算后的抑制率見表1。
表1 各組對HBsAg和HBeAg表達抑制率

(三)熒光定量PCR檢測HBV DNA1、模板處理取細胞培養上清501，加501病毒提取A液，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀加病毒提取B液251，100℃煮沸5min，4℃12000r/min離心10min，取上清置-20℃備用。
2、PCR反應抽提好的HBV DNA模板4.01，依次加入36.01 SYBR GREEN I熒光染料、Taq酶、dNTP、Buffer混和物，混勻，在熒光定量PCR儀上擴增。PCR反應程序為95℃預變性5min后按下列程序進行40個循環94℃變性15Sec，56℃退火30Sec，72℃延伸45Sec。采用Single檢測，在每一循環后檢測DNA量，未次循環后由計算機計算出DNA含量。所用試劑為深圳匹基生物工程股份有限公司生產的HBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒，熒光定量PCR儀為Roche Light Cycler。
3、抑制率分析根據各組的HBV DNA的定量值，計算抑制肽對HBV DNA的抑制率，計算公式如下抑制率＝(陰性對照測定值-樣品測定值)/陰性對照測定值表2 各組對HBV DNA的抑制率

(四)細胞毒性試驗 以0.5％臺盼藍作細胞染色計數觀察著色活細胞比例，同時觀察培養過程中細胞生長情況。結果表明，實驗組、陽性對照組和陰性對照組細胞生長狀況無明顯差異。
上述實驗證明了本發明所篩選的三種對乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD的抑制肽對HBV的DNA有明顯的抑制作用。由于其來源于對YMDD功能區靶位特異性結合的噬菌體展示技術，作用機理為抑制HBV復制，為抗HBV藥物的制備提供了一種新的有效的源材料。相對現有的作用于阻斷HBV DNA合成的核苷酸類藥物，本發明的抑制肽從根本上抑制HBV的復制，與現有的拉米呋啶類藥物有互補作用。
權利要求
1.乙肝病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的抑制肽，其特征在于所述抑制肽的氨基酸序列為SEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp
2.按權利要求1所述乙肝病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的抑制肽在制備抗HBV藥物方面的應用。
全文摘要
乙肝病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的抑制肽及應用屬于生物技術的分子生物學和生物化學領域。用乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能區的短肽作為靶位，利用噬菌體表面展示技術篩選與所述靶位特異性結合的肽，本發明篩選的三種抑制肽其氨基酸序列分別為Trp TryThr Asn Asn Ser Thr；Gly Pro Phe Asn Asn Pro Pro；Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp。實驗證明了本發明所篩選的三種抑制肽對HBV的DNA有明顯的抑制作用，為抗HBV藥物的制備提供了一種新的有效的藥源。相對現有的作用于阻斷HBV DNA合成的核苷酸類藥物，本發明的抑制肽從根本上抑制HBV的復制，與現有的拉米呋啶類藥物有互補作用，適用于抗HBV藥物的研制以及HBV的分子病毒學研究。
文檔編號A61P1/16GK1966521SQ200610146919
公開日2007年5月23日 申請日期2005年12月12日 優先權日2005年12月12日
發明者朱海紅, 周林福, 賈紅宇, 陳智 申請人:浙江大學