一種發酵制備米渣蛋白抗氧化活性肽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵制備米渣蛋白抗氧化肽的方法，包括如下步驟：（1）利用霉菌對米渣進行固態發酵：在米渣中加入水，米渣和水的重量比為（15?25）:9，攪拌浸潤，滅菌后接種霉菌于30?35℃條件下進行前期發酵2?4天，得成曲；然后于40?42℃條件下進行后期發酵4?6天，得發酵產物；（2）將發酵產物通過超濾膜、凝膠層析過濾、制備型RP?HPLC進行抗氧化產物的分離純化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO.1所示，所述F2e序列如SEQ ID NO.2所示。利用霉菌固態發酵米渣制取抗氧化產物，可極大降低米渣綜合利用的生產成本，豐富了米渣作為食品原料的應用范圍，提高了米渣綜合利用的技術水平和商品價值，并且為天然抗氧化產物的研究開辟了新途徑。
【專利說明】
一種發酵制備米渣蛋白抗氧化活性肽的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于食品蛋白加工技術領域，具體涉及一種發酵制備米渣蛋白抗氧化肽的 方法。
【背景技術】
[0002] 稻谷是我國第一大作物糧食，總產量長居世界第一。長期以來，稻谷生產和及其副 產物的深加工一直備受食品科學家的高度關注。長久以來，米渣的利用僅限于用作動物飼 料，遠未得到更好的利用。近些年來，國內許多學者展幵了對米渣較為廣泛深入的研究，主 要集中在米渣蛋白的提取、改性和利用蛋白酶對米渣蛋白水解獲得米渣蛋白小分子生物活 性肽上。米渣肽的研究主要是米渣抗氧肽和米渣抑制肽。米渣蛋白經蛋白酶水解后，進行膜 分尚，大部分肽的分子量在lKDa下，并對多種自由基具有較強的清除力。
[0003] 米渣蛋白不溶于水，易溶于強堿、強酸，成為其應用的一大難題。米渣蛋白的修飾 改性可提高其水溶性、起泡性、乳化性等蛋白特性。利用蛋白酶有限水解米渣蛋白，改善其 蛋白特性是比較常用的蛋白改性方法。米渣除蛋白質外還含有豐富的糊精和多聚糖，可為 微生物的生長代謝提供足夠的碳源和氮源。利用微生物發酵米渣，可使生產成本大幅降低， 使利用微生物發酵大規模生產發酵食品成為可能，這方面的研究僅有少量文獻報道，而在 市場上也并未出現米澄發酵食品，因此米渣發酵食品極有市場開發前景。

【發明內容】

[0004] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種發酵制備米渣蛋白抗氧化肽的方法。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為： 所述發酵制備米渣蛋白抗氧化肽的方法包括如下步驟： (1) 利用霉菌對米渣進行固態發酵:在米渣中加入水，米渣和水的重量比為（15-25) : 9， 攪拌浸潤，滅菌后接種霉菌于30_35°C條件下進行前期發酵2-4天，得成曲；然后于40-42°C 條件下進行后期發酵4-6天，得發酵產物； (2) 將發酵產物通過超濾膜、凝膠層析過濾、制備型RP-HPLC進行抗氧化產物的分離純 化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO. 1所示，所述F2e序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006] 優選地，步驟（1)所述霉菌為黑曲霉;所述前期發酵條件為:32°C發酵3天;所述后 期發酵條件為：向成曲中加入無菌水，并于40.4 °C發酵5.5天，無菌水的加入量為80-85mL/ 10g成曲，優選為83.4mL/10g成曲。
[0007] 優選地，在對發酵產物進行抗氧化產物的分離純化前，還包括對發酵產物進行成 分分析和體外抗氧化活性分析的步驟。所述對發酵產物進行成分分析是采用福林酚法測定 發酵產物總酚含量;用甲醛滴定法測定游離氨基酸含量，凱氏定氮法測定總蛋白質含量，然 后計算水解度;參照國標GB/T12456-2008測定總酸。所述對發酵產物進行體外抗氧化活性 分析是采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和? 0H自由基清除法。
[0008] 下面對本發明作進一步說明： 本發明以價格低廉、產量巨大的米渣為發酵基質，米渣中的糊精和多聚糖為氮源，蛋白 質為碳源，首次使用霉菌菌種制備具有抗氧化活性的小分子肽。以米渣蛋白為研究對象，采 用霉菌發酵法制備抗氧化活性肽，利用黑曲霉固態發酵，對發酵產生的產物進行體外抗氧 化活性的測定，經超濾、凝膠層析和制備型RP-HPLC進行分離純化，獲得高抗氧化活性產物， 并進行結構鑒定。有效拓展了其應用領域。
[0009] 具體步驟如下： (1) 利用霉菌對米渣進行固態發酵:在前期發酵階段，分別稱取20g米渣于錐形瓶中，加 入9g蒸餾水混合，使米渣充分浸潤。而后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌30min，待冷卻 后，將活化后的霉菌種接種于不同錐形瓶中。接種后，在恒溫恒濕培養箱中32°C培養3天，待 米渣表面菌絲生長旺盛且產生大量孢子，即為成曲。在后發酵階段，以83.4ml/10g無菌水加 入成曲中，于霉菌培養箱內40.4°C下，培養5.5天。發酵液經抽濾后，冷凍干燥成粉，備用； (2) 對發酵產物進行成分分析:采用福林酚法測定發酵產物總酚含量;用甲醛滴定法測 定游離氨基酸含量，凱氏定氮法測定總蛋白質含量，然后計算水解度；參照國標GB/T 12456-2008測定總酸； (3) 對發酵產物進行體外抗氧化活性分析:a、DPPH自由基清除法:將100此待測樣品移 入10mL試管中，再加入2mL0 . ImM的DPPH的無水甲醇溶液。將試管放置于避光處反應15min 后，以無水甲醇調零，在517nm波長下測定其吸光值。根據公式計算清除率。b、ABTS自由基清 除法:7mM的ABTS溶液與2.45mM的過硫酸鉀溶液混合，室溫避光靜置12-16h。在測定當天用 無水乙醇稀釋，在734nm下測吸光值，根據公式計算清除率。c、? 0H自由基清除法：將 lmLO. 75mM鄰二氮菲無水乙醇加入試管中，分別加2mL0.2M磷酸鹽緩沖液，lmL蒸餾水，混合 均勻，加入現配的0. l%H2〇2，37°C水浴60min后，在510nm測其吸光值； (4) 通過超濾膜、凝膠層析過濾、制備型RP-HPLC對抗氧化產物分離純化:a、超濾膜分 離:將卷式膜芯裝入膜管內，關閉夾料套筒排水閥門，10L超純水倒入夾料套筒中，打開電 源，將流速設置為18mL/s，壓力差4.8kg/cm 2，將出口管接入夾料套筒，循環清洗30min，將出 口管放入排水池，將流速調至15mL/s，壓力差為4.2kg/cm 2，進行一次性清洗。當夾料筒中的 超純水液面低于3L時，繼續添加超純水，總計添加150L超純水。清洗完成后，將抽濾后的發 酵液，倒入夾料套筒中，打幵電源，開啟冷凝回流裝置。超濾流速為15 mL/s，壓力差為 4.2kg/cm2，濃縮液出口管，接入夾料套筒，在透析液出口管處進行收集。b、凝膠過濾:將處 理好的Sephadex G-25裝入0.8cm X 90cm規格的層析柱中，用超純水將超濾膜分離后得到的 高抗氧化活性組分配制成10mg/mL的溶液，上樣量2mL，流速為30mL/h用超純水進行洗脫。紫 外檢測器在210nm下進行檢測，重復收集各洗脫峰，冷凍干燥后，以DPPH清除率為指標，比較 各洗脫峰的抗氧化活性，篩選出抗氧化活性強的組分。c、制備型RP-HPLC:色譜條件： PURIFLASH450型色譜儀，Interchim Soft ? 0a工作站；色譜柱：SePaFlash C18反向硅膠快速 分離柱，流動相：乙腈、超純水，上樣量200mL，流速60mL/min，檢測波長為210nm; (5) 利用質譜鑒定化合物的結構:利用MicroTOF-QII串聯質譜儀，對分離純化后的抗氧 化組分F2d和F2e進行鑒定。通過MSI對分子離子峰的分析，分別得到F2d和F2e的分子量，再 經MS2對碎片離子峰的分析，得到MS的化學結構。得到F2d為含10個氨基酸的多肽，序列為 VAEEELGGNR(SEQ ID N0.1)，F2e為含 11 個氨基酸的多肽，序列為LDPEGTGTFPP(SEQ ID N0.2)〇
[0010] 米渣是大米淀粉糖生產、有機酸發酵和味精生產的副產物，蛋白質含量高達40%以 上，價格低廉，產量巨大，是非常理想的蛋白質資源。米渣蛋白不溶于水，易溶于強堿、強酸， 成為其應用的一大難題。米渣制取抗氧化產物是以米渣中為單獨的發酵基質，以米渣中的 多聚糖和糊精為碳源，蛋白質為氮源，接種霉菌菌種。通過前期發酵和后期發酵過程，使霉 菌產生的蛋白酶系和糖化酶系水解米渣中的蛋白質、糊精、多聚糖，生成具有抗氧化活性的 小分子肽。本發明首次利用黑曲霉固態發酵制備抗氧化活性產物，分析其發酵產物的成分， 使用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、? 0H自由基清除法測定發酵產物的體外抗氧 化性，并通過現代分離技術以及最新的質譜技術對米渣霉菌發酵產生的抗氧化肽進行分離 鑒定。利用霉菌固態發酵米渣制取抗氧化產物，可極大降低米渣綜合利用的生產成本，豐富 了米渣作為食品原料的應用范圍，提高了米渣綜合利用的技術水平和商品價值，并且為天 然抗氧化產物的研究幵辟了新途徑。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1 在前期發酵階段，分別稱取20g米渣于錐形瓶中，加入9g蒸餾水混合，使米渣充分浸潤。 而后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌30min，待冷卻后，將活化后的黑曲霉接種于不同錐 形瓶中。接種后，在恒溫恒濕培養箱中32°C培養3天，待米渣表面菌絲生長旺盛且產生大量 孢子，即為成曲。在后發酵階段，83.4ml/10g無菌水加入成曲中，于霉菌培養箱內40.4°C下， 培養5.5天。發酵液經抽濾后，冷凍干燥成粉，備用。
[0012] 采用福林酚法測定發酵產物總酚含量；用甲醛滴定法測定游離氨基酸含量，凱氏 定氮法測定總蛋白質含量，然后計算水解度;參照國標GB/T 12456-2008測定總酸。發酵產 物進行體外抗氧化活性分析，然后超濾膜分離:將卷式膜芯裝入膜管內，關閉夾料套筒排水 閥門，10L超純水倒入夾料套筒中，打開電源，將流速設置為18mL/s，壓力差4.8kg/cm 2，將出 口管接入夾料套筒，循環清洗30min，將出口管放入排水池，將流速調至15mL/s，壓力差為 4.2kg/cm 2,進行一次性清洗。當夾料筒中的超純水液面低于3L時，繼續添加超純水，總計添 加150L超純水。清洗完成后，將抽濾后的發酵液，倒入夾料套筒中，打幵電源，開啟冷凝回流 裝置。超濾流速為15 mL/s，壓力差為4.2kg/cm2，濃縮液出口管，接入夾料套筒，在透析液出 口管處進行收集。b、凝膠過濾:將處理好的Sephadex G-25裝入0.8cm X 90cm規格的層析柱 中，用超純水將超濾膜分離后得到的高抗氧化活性組分配制成10mg/mL的溶液，上樣量2mL， 流速為30mL/h用超純水進行洗脫。紫外檢測器在210nm下進行檢測，重復收集各洗脫峰，冷 凍干燥后，以DPPH清除率為指標，比較各洗脫峰的抗氧化活性，篩選出抗氧化活性強的組 分。制備型RP-HPLC:色譜條件：PURIFLASH450型色譜儀，Interchim Sof t ? 0a工作站；色譜 柱：SePaFlash C18反向硅膠快速分離柱，流動相：乙腈、超純水，上樣量200mL，流速60mL/ min，檢測波長為210nm〇
[0013]利用MicroTOF-QII串聯質譜儀，對分離純化后的抗氧化組分F2d和F2e進行鑒定。 通過MSI對分子離子峰的分析，分別得到F2d和F2e的分子量，再經MS2對碎片離子峰的分析， 得到MS的化學結構。得到F2d為含10個氨基酸的多肽，序列為￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e為含 11 個氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇 [0014] 實施例2 在前期發酵階段，分別稱取20g米渣于錐形瓶中，加入9g蒸餾水混合，使米渣充分浸潤。 而后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌30min，待冷卻后，將活化后的黑曲霉接種于不同錐 形瓶中。接種后，在恒溫恒濕培養箱中32°C培養3天，待米渣表面菌絲生長旺盛且產生大量 孢子，即為成曲。在后發酵階段，100ml/10g無菌水加入成曲中，于霉菌培養箱內41°C下，培 養9天。發酵液經抽濾后，冷凍干燥成粉，備用。
[0015]采用福林酚法測定發酵產物總酚含量；用甲醛滴定法測定游離氨基酸含量，凱氏 定氮法測定總蛋白質含量，然后計算水解度;參照國標GB/T 12456-2008測定總酸。發酵產 物進行體外抗氧化活性分析，然后超濾膜分離:將卷式膜芯裝入膜管內，關閉夾料套筒排水 閥門，10L超純水倒入夾料套筒中，打開電源，將流速設置為18mL/s，壓力差4.8kg/cm 2，將出 口管接入夾料套筒，循環清洗30min，將出口管放入排水池，將流速調至15mL/s，壓力差為 4.2kg/cm 2,進行一次性清洗。當夾料筒中的超純水液面低于3L時，繼續添加超純水，總計添 加150L超純水。清洗完成后，將抽濾后的發酵液，倒入夾料套筒中，打幵電源，開啟冷凝回流 裝置。超濾流速為15 mL/s，壓力差為4.2kg/cm2，濃縮液出口管，接入夾料套筒，在透析液出 口管處進行收集。b、凝膠過濾:將處理好的Sephadex G-25裝入0.8cm X 90cm規格的層析柱 中，用超純水將超濾膜分離后得到的高抗氧化活性組分配制成10mg/mL的溶液，上樣量2mL， 流速為30mL/h用超純水進行洗脫。紫外檢測器在210nm下進行檢測，重復收集各洗脫峰，冷 凍干燥后，以DPPH清除率為指標，比較各洗脫峰的抗氧化活性，篩選出抗氧化活性強的組 分。制備型RP-HPLC:色譜條件：PURIFLASH450型色譜儀，Interchim Sof t ? 0a工作站；色譜 柱：SePaFlash C18反向硅膠快速分離柱，流動相：乙腈、超純水，上樣量200mL，流速60mL/ min，檢測波長為210nm〇
[0016]利用MicroTOF-QII串聯質譜儀，對分離純化后的抗氧化組分F2d和F2e進行鑒定。 通過MSI對分子離子峰的分析，分別得到F2d和F2e的分子量，再經MS2對碎片離子峰的分析， 得到MS的化學結構。得到F2d為含10個氨基酸的多肽，序列為￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e為含 11 個氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇
[0017] 實施例3 在前期發酵階段，分別稱取20g米渣于錐形瓶中，加入9g蒸餾水混合，使米渣充分浸潤。 而后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌30min，待冷卻后，將活化后的黑曲霉接種于不同錐 形瓶中。接種后，在恒溫恒濕培養箱中32°C培養3天，待米渣表面菌絲生長旺盛且產生大量 孢子，即為成曲。在后發酵階段，60ml/ 10g無菌水加入成曲中，于霉菌培養箱內38 °C下，培養 6天。發酵液經抽濾后，冷凍干燥成粉，備用。
[0018] 采用福林酚法測定發酵產物總酚含量；用甲醛滴定法測定游離氨基酸含量，凱氏 定氮法測定總蛋白質含量，然后計算水解度;參照國標GB/T 12456-2008測定總酸。發酵產 物進行體外抗氧化活性分析，然后超濾膜分離:將卷式膜芯裝入膜管內，關閉夾料套筒排水 閥門，10L超純水倒入夾料套筒中，打開電源，將流速設置為18mL/s，壓力差4.8kg/cm 2，將出 口管接入夾料套筒，循環清洗30min，將出口管放入排水池，將流速調至15mL/s，壓力差為 4.2kg/cm2,進行一次性清洗。當夾料筒中的超純水液面低于3L時，繼續添加超純水，總計添 加150L超純水。清洗完成后，將抽濾后的發酵液，倒入夾料套筒中，打幵電源，開啟冷凝回流 裝置。超濾流速為15 mL/s，壓力差為4.2kg/cm2，濃縮液出口管，接入夾料套筒，在透析液出 口管處進行收集。b、凝膠過濾:將處理好的Sephadex G-25裝入0.8cm X 90cm規格的層析柱 中，用超純水將超濾膜分離后得到的高抗氧化活性組分配制成10mg/mL的溶液，上樣量2mL， 流速為30mL/h用超純水進行洗脫。紫外檢測器在210nm下進行檢測，重復收集各洗脫峰，冷 凍干燥后，以DPPH清除率為指標，比較各洗脫峰的抗氧化活性，篩選出抗氧化活性強的組 分。制備型RP-HPLC:色譜條件：PURIFLASH450型色譜儀，Interchim Sof t ? Oa工作站；色譜 柱：SePaFlash C18反向硅膠快速分離柱，流動相：乙腈、超純水，上樣量200mL，流速60mL/ min，檢測波長為210nm〇
[0019]利用MicroTOF-QII串聯質譜儀，對分離純化后的抗氧化組分F2d和F2e進行鑒定。 通過MSI對分子離子峰的分析，分別得到F2d和F2e的分子量，再經MS2對碎片離子峰的分析， 得到MS的化學結構。得到F2d為含10個氨基酸的多肽，序列為￥ &141&-6111-6111-6111-1^11-Gly-Gly-Asn-Arg (V-A-E-E-E-L-G-G-N-R)(SEQ ID N0.1)，F2e為含 11 個氨基酸的多肽，序 ID N0.2)〇
【主權項】
1. 一種發酵制備米渣蛋白抗氧化肽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： (1) 利用霉菌對米渣進行固態發酵:在米渣中加入水，米渣和水的重量比為（15-25) :9， 攪拌浸潤，滅菌后接種霉菌于30-35Γ條件下進行前期發酵2-4天，得成曲；然后于40-42Γ 條件下進行后期發酵4-6天，得發酵產物； (2) 將發酵產物通過超濾膜、凝膠層析過濾、制備型RP-HPLC進行抗氧化產物的分離純 化；即得米渣蛋白抗氧化肽F2d和F2e，所述F2d序列如SEQ ID NO. 1所示，所述F2e序列如SEQ ID NO .2所示。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述霉菌為黑曲霉;所述前期發酵條 件為:32°C發酵3天;所述后期發酵條件為：向成曲中加入無菌水，并于40.4°C發酵5.5天，無 菌水的加入量為80-85mL/10g成曲。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述無菌水的加入量為83.4mL/10g成曲。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在對發酵產物進行抗氧化產物的分離純化 前，還包括對發酵產物進行成分分析和體外抗氧化活性分析的步驟。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述對發酵產物進行成分分析是采用福林酚 法測定發酵產物總酚含量；用甲醛滴定法測定游離氨基酸含量，凱氏定氮法測定總蛋白質 含量，然后計算水解度;參照國標GB/T12456-2008測定總酸。6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述對發酵產物進行體外抗氧化活性分析是 采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和· 0H自由基清除法。
【文檔編號】C07K1/34GK105821101SQ201610378598
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】梁盈, 黃萍, 林親錄, 田蔚, 吳偉, 馬酉初
【申請人】中南林業科技大學