專利名稱：：布魯氏菌分子標記和毒力缺失弱毒疫苗及制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種布魯氏菌弱毒疫苗及生產(chǎn)工藝，尤其是提供一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗，用于能區(qū)分人與動物是疫苗接種還是自然感染；本發(fā)明還公開了上述疫苗的生產(chǎn)方法，屬于免疫疫苗生產(chǎn)
技術領域：
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背景技術：
：布魯氏菌病(Brucellosis)是由小球桿狀布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，在世界各地都有廣泛流行。每年因此造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元，而且此病還會對人類健康造成嚴重威脅。從上個世紀90年代起，人與動物發(fā)病率又有上升的趨勢。當前的布魯氏菌疫苗種類較多。重組蛋白疫苗與DNA疫苗保護性能有限，滅活疫苗保護期短。目前人和動物多用弱毒疫苗，弱毒疫苗較前幾種疫苗保護作用及效果好，但它同樣存在著缺陷，致使人們不敢、不愿也不能對其廣泛應用。主要原因是其一，接種后人們無法區(qū)別自然感染和人工接種免疫。如果廣泛應用這樣的疫苗就給該病流行病學調査，探查疫源產(chǎn)生很大的障礙。許多國家與地區(qū)限制用血清學方法檢測布魯氏菌病呈陽性地區(qū)的肉制品、奶制品進口，對國際貿(mào)易產(chǎn)生嚴重的影響；其二，毒性大，返祖現(xiàn)象嚴重，會對人與動物機體造成傷害，甚至發(fā)病。所以研制一種能區(qū)分是自然感染還是人工主動免疫，保護性能好，毒力弱、安全性能好的布魯氏菌病弱毒疫苗具有重要的實踐意義。所以構建一株能區(qū)分是自然感染還是人工接種免疫，保護性能好，毒力弱的布魯氏菌弱毒疫苗是本發(fā)明的任務。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是公開一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗△S19-1和AS19-2，解決了常規(guī)的布魯氏菌疫苗不能區(qū)分人與動物是人工免疫接種還是野生菌感染、病毒強，容易至使接種的人與動物不良反應、甚至發(fā)病的問題。本發(fā)明還公開了該布魯氏菌弱毒疫苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。一種布魯氏菌弱毒疫苗AS19-l,特征在于:布魯氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成AS19-1。一種布魯氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于AS19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。本發(fā)明的技術解決方案如下為了本發(fā)明的目的，首先以布魯氏菌的弱毒疫苗株S19為起始材料，以PCR的方法從S19的染色體中擴增出要改造的目的基因Bp26的引導序列，并把它克隆到T載體上，進行基因改造。而后把這個經(jīng)改造的引導序列克隆到pBK-CMV上而成重組質粒pBK-BP26-Luc，并在pBK-Bp26-Luc合適的位置上，克隆上sacB基因，最終成為同源重組載體(自殺性質粒)pBLs。用同樣的方法得到布魯氏菌毒力基因B卿8的引導序列，克隆到T載體上，進行基因改造，并把它連接到pBluescriptSK+重組質粒，最終成為同源重組載體pBBs,用電轉化法把自殺性質粒pBLs轉化到布魯氏菌S19中，由于同源重組載體(自殺性質粒)不能在布魯氏菌中自主復制，因此轉入受體菌細胞內的超螺旋的自殺質粒便會被線性化。因自殺質粒上含有受體菌基因的同源序列，它便會插入受菌體S19的染色體中，接著線性化的質粒與Bp26基因發(fā)生置換，也就是通常所說的單交換同源重組事件的發(fā)生。只有置換到S19染色體上被線性化的自殺質粒才能隨著染色體的復制而存在。把受體菌涂布在含有篩選標記的肝湯瓊脂平板上，因自殺質粒上帶有篩選藥品抗性基因，所以很容易的篩選出單交換子。由于單交換是整個載體序列(含篩選藥物抗性基因和sacB基因)都置換到染色體上，因此，我們必須篩選僅有經(jīng)改造的目的基因整合到染色體上的雙交換子。將獲得的同源重組單交換子液體培養(yǎng)物涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落即為陽性同源重組雙交換子。因為如果布魯氏菌雙交換子染色體上存在sacB基因等載體序列，在蔗糖存在的情況下將會導致細菌死亡，只有在5%蔗糖肝湯培養(yǎng)基上生長的菌落才是發(fā)生2次重組的雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)，即得到本發(fā)明的厶S19-1。用同樣的方法把自殺性質粒pBBs轉化到AS19-1中去得到本發(fā)明的AS19-2。用這樣的方法首先得到布魯氏菌弱毒疫苗株S19的Bp26基因突變缺失株△S19-l，而后得到AS19-1毒力基因Bmpl8缺失株AS192。本發(fā)明的具體制備方法主要包括以下步驟(1)以布魯氏菌弱毒疫苗基因組為模板，設計引物，用PCR的方法，擴增出分子標記目標基因的同源重組引導序列，而后克隆到T載體上對目標基因改造；(2)用(1)得到的基因片段與復制啟動子為pUCoir的載體相連，而后將sacB基因連接到這個載體的適當位置，構建成同源重組載體(自殺性質粒)；(3)使步驟(2)得到的重組載體轉化到布魯氏菌中去；利用同源重組載體自帶的篩選標記篩出同源重組單交換子，利用sacB基因篩選出同源重組的雙交換子，得到本發(fā)明的分子標記疫苗株AS19-1;(4)重新設計引物，從布魯氏菌基因組中，擴增出目標毒力基因的同源重組引導序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本發(fā)明的分子標記、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案:所說的弱毒疫苗株為S19。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案:所說的分子標記目標基因為Bp26。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案所說的分子標記目標基因是指用限制性內切酶切除其中500bp，而后在這個位置上連接上LucNF+報告基因。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案所說目標蛋白是BP26蛋白。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案所說的目標毒力基因是Bmpl8基因。本發(fā)明的優(yōu)選實驗方案所說目標毒力基因改造是指用限制性內切酶切除其中的200bp，而后使之相聯(lián)。其中所說分子標記突變株在本發(fā)明中被命名為AS19-1，分子標記、毒力缺失弱毒疫苗突變株被命名為AS19-2用AS19-2接種動物，根據(jù)動物所表現(xiàn)的臨床癥狀分析，AS19-2毒力明顯比接種其親本菌株S19。用PCR的方法從布魯氏菌S19中擴增出Bp26基因，把它克隆到pET28a+上面成重組質粒pETBp26。把它轉化到大腸桿菌中表達并純化出融合蛋白His-BP26。以His-BP26為包被抗原，用ELISA的方法檢測動物的血清，就容易區(qū)分開動物是其它布魯氏菌感染還是AS19-2接種的。基因打靶是基于DNA同源重組技術發(fā)展起來的在分子水平上改造、剔除或取代某個特定基因，能達研究基因改造后個體的表型進而研究目標基因的功能。一般來說，由于外源DNA與宿主細胞DNA自然發(fā)生同源重組的機率非常低，因此對成功地進行了基因打靶是一件非常困難的工作。本發(fā)明中構建的自殺性質粒的復制起始位點為pUCori，可以在￡coh'存活并復制，但不能在布魯氏菌中存活與復制，所以該載體在布魯氏菌中為自殺質粒。因此，在載體構建過程中涉及到此復制子需在￡中操作，它帶有篩選標記便于同源重組單交換子的篩選。為了獲得不帶抗性標記的工程菌株，必須篩選雙交換子。如果用抗性基因作為負篩選標記，必須逐個驗證是否丟失抗性，工作煩瑣而容易出現(xiàn)假陽性。用sacB基因作為正篩選標記。該基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大分子量的果聚糖，在G—細菌周質空間(極少數(shù)0+細菌的假周質空間結構)累積，導致細胞停止生長或死亡，因此，含有該基因的G—宿主菌對蔗糖高度敏感，可以用來作為同源重組雙交換的正篩選標記，只細菌在該培養(yǎng)基上生長，它就是丟失抗性基因的雙交換子，工作簡便可靠將LucNF+報告基因代替了Bp26基因部分片段。LucNF+基因是經(jīng)基因工程改進的螢火蟲螢光素酶基因，使其在構建螢光素酶N端融合蛋白時具有最大的靈活性。蛋白不需要翻譯后加工，立即產(chǎn)生報告活性。本發(fā)明用PCR的方法擴增出Bp26基因，經(jīng)過克隆、亞克隆，最后連接到到pET-28a上，轉化到大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導表達。結果37。C誘導4個小時，用SDS-PAGE分析，高效表達出帶有His-tag標簽的融合蛋白BP26蛋白，經(jīng)Western-blot免疫鑒定，它具有免疫活性。為了評價本發(fā)明的基因工程構建的布魯氏工程弱毒疫苗AS19-2的正確性，分別在分子標記目標基因與毒力基因的引導序列上設計引物，以親本菌株S19為對照，比較擴增基因片段的大小，驗證基因改造情況，經(jīng)凝膠電泳分析，結果與理論值相符，見圖廣圖2。為了檢定本發(fā)明的基因工程構建的布魯氏工程菌AS19-2的毒力，本發(fā)明以小鼠為實驗動物，用AS19-2接種動物，以S19注射為對照組，檢測接種小鼠脾臟不同時候的AS19-2與S19含菌量，用不同高濃度的AS19-2與S19接種小鼠，觀察小鼠的臨床癥狀及最小致死數(shù)量，比較分析了它們的毒力強弱。其結果表明△S19-2比其親本S19弱很多。詳細的方法與步驟及數(shù)據(jù)見實施例4。用本發(fā)明制取的His-Bp26融合蛋白做包被抗原，用ELISA方法成功區(qū)分了是S19接種的小鼠還是AS19-2接種的小鼠。詳細的方法與步驟及數(shù)據(jù)見實施例5。以上實驗結果證實所構建的布魯氏弱毒疫苗AS19-2具有分子標記，毒力相對缺失的特點。本發(fā)明構建了這兩個基因缺失株，實驗研究進一步證實，本發(fā)明的基因工程菌株接種動物后能與其它菌株感染動物用ELISA方法區(qū)分開來。通過接種小鼠進行毒力測試，其毒力明顯比S19株弱。本發(fā)明的積極效果在于提供布魯氏菌分子標記、毒力缺失弱毒活疫苗AS19-2株，及提供基于所說的突變株疫苗的方法，特別是進一步提供了能區(qū)分人與動物是疫苗接種還是野生菌感染的方法。這對布魯氏菌病監(jiān)測、診斷、凈化和控制具有重要意義，具有廣泛的應用實踐價值。圖1、同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換PCR檢測；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源載體插入后的S19;3.AS19-2。圖2、改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子正確性的PCR檢測；M.lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。圖4、自殺性質粒pBBs的構建過程。圖5、PCR擴增凝膠回收后驗證。圖6、重組質粒酶切電泳；l.pBb26/XhoI;2.pBmpl8/XbaI;3.pSacB/(BamHI+SalI);4.pB即18/(XbaI+SacII);5.pBK-Bp26-Luc/EcoRI;M.lkbpDNALadderMarker。圖7、同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換PCR檢測；M.lkbpDNALadderMarker;1.S19;2.同源載體插入后的S19;3.AS19-2。圖8、改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子正確性的PCR檢測；M,lkbpDNALadderMarker;1.AS19-2;2.S19。圖9、目的基因的擴增；1:Bp26(694bp);2:DNAmarkerDL2000圖10、重組質粒pMDBp26;1:pMDBp26;2:1Kbmarker。圖ll、重組質粒pETBp26酶切鑒定圖；Fig.3-3RestrictionmapofrecombinantplasmidpETBp26。圖12、融合蛋白SDS-PAGE檢測；1:LowMRproteinmarker;l-3:pETBp26肌21inducedfor2,3,4hrespectively;4:pET28a/BL21inducedfor4h。圖13、表達產(chǎn)物的薄層掃描結果。圖14、純化蛋白質SDS-PAGE檢測。圖15、融合蛋白Bp26Westernblot檢測。1:RabbitserumagainstrecombinedBp26:2:LowMRproteinmarker;3:pET28a/BL21inducedfor4h。具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍內。實施例1同源重組載體(自殺性質粒)的構建1材料與方法1.1菌株、質粒、載體布魯氏菌S19株、DH5a、pBluescriptSK+本研究室保存；pBK-CMV購自Stratagene公司;pSP-LucNF+購自P簡ega公司;pIB279南京農(nóng)業(yè)大學蔣建東博士惠贈；pMD18-Tsimplevector購自TakaRa公司。1.2試劑限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)，大腸桿菌DNA聚合酶I，LA-TaqDNApolymerase、lkbpDNALadderMarker、質粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；螢光素酶檢測系統(tǒng)購自Promega公司。1.3PCR擴增1.3.1含有Bp26基因同源重組指導序列的擴增根據(jù)Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pBK-CMV噬菌粒載體特點分別設計5'端含有限制性內切酶XhoI的上游引物與含有XbaI酶切位點的下游引物。上游引物GAATTCTTTAGTCCATCCGACCCAAGTTTACG;下游引物CTCGAGTGAACACTGACCATACGCTG了GAAGAAG。反應條件95。C預變性5min;94。C變性2min，60。C退火2min，72。C延伸5min，30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。從布魯氏菌S19的基因組中擴增。1.3.2含有Bmpl8基因同源重組指導序列的擴增設計在5'端加有XbaI酶切位點上游引物CTAGACCAGCACCACACCGCGCGAG;加有SacII酶切位點引下游物CCGCGGTCATTGGCGAGGACAAGGTCCACTT。反應條件95。C預變性5min;94。C變性2min，64。C退火2min，72。C延伸5min，30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。從布魯氏菌S19的基因組中擴增。1.3.3LucNF+基因的擴增設計一對上下游都含有BssHII酶切位點的引物GCGCGCATGGTCACCGACGCCAAAAAC與GCGCGCTTACACGGCGATCTTTCCGC，以95。C預變性5min;94。C變性80s，63。C退火80s，72。C延伸100s;最后72。C延伸10min，從質粒pSP-lucNF+擴增出LucNF+基因片段。1.3.4sacB基因的擴增分別設計5'端含有限制性內切酶BamHI的上游引物與含有SalI酶切位點的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAGACAT;下游引物GGATCCTGGGATTCACCTTTATGTTGATAAG，以95。C預變性5min，94。C變性75s，60。C退火75s，72。C延伸90s反應條件，最后72。C延伸10min，以質粒pIP279為模板，擴增sacB基因。1.4自殺性質粒的構建1.4.1含有Bp26基因同源序列自殺質粒pBLs的構建自殺質粒pBLs構建的過程見圖3。把1.4.1中的擴增出的長度4300bp的基因片段(其中包含Bp26基因)，與pMD18-T相連得到重組質粒pBb26。把1.4.3擴增出的LucNF+與pMD18-T相連而成重組質粒pLUC。把1.4.4擴增出sacB基因片段與pMD18-T相連而成重組質粒pSacB。用限制性內切酶BssHII分別消化重組質粒pBb26與pLUC，并把回收的LucNF+與pBb26相連而成重組質粒pBb26-Luc。再用限制性內切酶XbaI與XhoI分別消化質粒pBK-CMV與pBb26-Luc，并把Bp26-LucNF+基因片段與線性化的pBK-CMV相連而成重組質粒pBK-Bp26-Luc。再用限制性內切酶BamHI與SalI分別消化重組質粒pBK-Bp26-Luc與pSacB，并把sacB基因片段與連接到線性化的pBK-Bp26-Luc而成自殺質粒pBLs。1.4.2含有Bmpl8基因同源序列自殺性質粒pBBs的構建自殺性質粒pBBs構建的過程見圖4。把1.4.2中的擴增出的長度2700bp的基因片段(其中包含Bmpl8基因)，與pMD18-T相連得到重組質粒pB即18。用限制性內切酶NruI與SacI消化重組質粒pBmpl8，并把消化過的pB卿18用DNAPolymeraseI處理后再用T4DNALigase使之連接，再用XbaI與SacII消化它，凝膠回收目標片段，使之與用XbaI與SacII消化過的pBluescriptSKII(+)相連而成重組質粒pBb即18。再用限制性內切酶BamHI與SalI分別消化重組質粒pBbmpl8與pSacB，并把sacB基因片段與線性化的pBb卿18相連而成自殺質粒pBBs。2結果2.1PCR擴增結果從布魯氏菌S19株基因組擴增出含有Bp26基因在內的4300bp大小的基因片段，凝膠純化后待用；從布魯氏菌基因組擴增出含有Bmpl8在內的2700bp大小的基因片段，凝膠純化后待用；從質粒pSP-LucNF+擴增出1700bp大小的LucNF+基因片段，凝膠純化后待用；從質粒pIP279擴增出1400bp大小sacB的基因片段，凝膠純化后待用。它們經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，均可觀察到與理論值大小相符條帶，見圖3。2.2幾個主要的重組質粒酶切電泳鑒定pBb26經(jīng)XhoI單酶切，在7100bp左右有一電泳帶，與預期值相符；pBmpl8經(jīng)XbaI單酶切，在5400bp左右有一電泳帶，與預期值相符；pSacB經(jīng)BamHI與SalI雙酶切，可以在1400bp和2700bpd左右有兩條帶，與預期值相符；剔除部分200bp基因后的pBmpl8經(jīng)XbaI與SacII雙酶切，在2400bp與2700bp左右出現(xiàn)兩條帶與理論值相符；pBK-Bp26-Luc經(jīng)EcoRI單酶切，在12000bp左右有一條帶，與預期值相符，見圖4。實施例2布魯氏菌分子標記、毒力缺失疫苗株AS19-2的構建1.1試劑螢光素酶檢測系統(tǒng)購自Promega公司，其它試劑同實施例一。1.2肝湯培養(yǎng)基取新鮮的牛肝去脂肪、筋膜后絞碎，秤取500g，加自來水1000mL與之混合，置鍋中煮沸l(wèi)h，過濾，加水補足原量，加入NaC15g，蛋白胨10g。肝湯瓊脂配制取上述肝湯培養(yǎng)基1000mL，加入瓊脂20g，高壓滅菌備用1.3電轉化1.3.1感受態(tài)的制備取240mL對數(shù)生長前中期(6^。。=0.15)布魯氏菌液體培養(yǎng)物放入預冷的250mL離心管中，迅速將培養(yǎng)物置于冰水混和物中15~30min,不時的緩慢搖勻保證內容物充分冷卻。然后4'C1000Xg離心15rain，回收細胞，倒去培養(yǎng)液，用冰冷10%的丙三醇重懸沉淀，以1000Xg離心15min洗滌細胞3次。最后用3mL10%的丙三醇重懸沉淀制成感受態(tài)。1.3.2電轉化操作步驟取0.5yg自殺質粒加入100uL上述制作的布魯氏菌電轉感受態(tài)中混勻，加入電擊杯中，以E=12.5kv/cm電擊，然后立即加入37。C預熱的1mL的肝湯培養(yǎng)基中。放入搖床以37°C180r/min振蕩培養(yǎng)24h。取出200mL涂布于含有篩選標記的肝湯瓊脂平板上，3d后篩選出重組子，挑選出單菌落，進一步培養(yǎng)鑒定。1.4同源重組子的篩選1.4.l單交換子的篩選把電轉化受體菌涂布在含有篩選標記(Amp100mg/L,Kan50mg/L)的肝湯瓊脂平板上，因同源重組載體上帶有篩選標記基因，所以很容易的篩選出單交換子。1.4.2雙交換子的篩選將獲得的同源重組單交換子液體培養(yǎng)3d，適當稀釋，涂布于添加5%蔗糖的肝湯培養(yǎng)基平板上，37'C培養(yǎng)4d。因自殺質粒上含有sacB基因，該基因編碼的果糖蔗糖酶，能將蔗糖水解為果糖并生成大相對分子量質的果聚糖，在G-細菌周質空間(極少數(shù)G+細菌的假周質空間結構)累積，導致細胞停止生長或死亡，挑取單菌落即為陽性同源重組雙交換子(丟失sacB基因和抗性等載體序列)。1.5雙交換子的驗證1.5.1PCR方法的驗證在自殺質粒LucNF+基因外側，Bp26基因的同源臂上設計上游引物GAATTCCAGAGAAGCAGAACAGGCAC與下游引物CTCGAGAAATCGTTCGTCGTTACCGC，在雙交換重組子基因組中擴增LucNF+基因片段；在Bmpl8剔除片段的兩側的同源臂上設計上游引物GAATTCACCTCACCGTGGACATAAAG與下游引物CTCGAGTGCCGTCGCAATTGATGAT同時在S19與雙交換子AS19-2基因組中擴增B卿18基因片段，比較其大小。1.5.2應用螢光素酶報告基因檢測取90uL布魯氏菌AS19-2培養(yǎng)物，加入10pLlmol/LK2HP04(pH7.8)，20mmol/LEDTA，用干冰快速冷凍混合物，然后將細胞轉移到室溫并置于室溫水浴中。加入300uL新鮮配制的裂解混合物，混均后于室溫孵育10min。用20^L細胞裂解液加入裝有螢光素酶檢測試劑的螢光光度計試管中，吹打混合。將螢光光度計的程序設置為2s延遲及10s螢光素酶活性測量讀數(shù)。2結果2.1PCR法法驗證同源載體pBLs插入S19染色體上與AS19-2雙交換子正確性用PCR方法分別從S19、同源載體插入后的S19、AS19-2的基因組中分別擴增出不同片段，見圖12。l是從S19中擴增出包含Bp26在內的長為1740bp的基因片段；2是從同源載體插入后的S19不僅擴增出包含Bp26在內的長為1740bp基因片段，同時擴增出了與Bb26-Luc長度相符的2980bp的基因片段，與理論相符；3是從AS19-2只擴增出的Bb26-Luc，證明了AS19-2雙交換子只含有Bb26-Luc基因。見圖5。2.2PCR方法驗證改造后的Bmpl8基因在AS19-2雙交換子的正確性用PCR方法分別從S19基因組中擴贈出包含Bmpl8在內的長為2730bp基因片段；2是從AS19-2擴增出的包含改造的Bmpl8長為2470bp基因，1與2相比較少了260bp，這與我們剔除的基因長度相符，見圖6。2.3螢光素酶報告基因在布魯氏菌中表達結果在螢光光度計中連續(xù)三次的讀數(shù)分別為5.570、5.438和5.304。2.4AS19-2遺傳穩(wěn)定性分析將AS19-2傳至20代，用PCR驗證，結果同上述(2.4PCR方法驗證)，用螢光素酶表達驗證，結果也同上述(2.5螢光素酶驗證)相符。證明AS19-2具有遺傳穩(wěn)定性。實施例3:△S19-2毒力的鑒定在本發(fā)明實施例2中，我們缺失了S19的主要的毒力基因之一Bmp18，構建了AS19-2突變株。理論上講，AS19-2的毒力比S19弱。本發(fā)明以小鼠為實驗動物，檢測接種小鼠脾臟不同時候的AS19-2與S19含菌量，用不同高濃度的AS19-2與S19接種小鼠，觀察小鼠的臨床癥狀及最小致死數(shù)量，比較分析了它們的毒力強弱。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株見實施例21.2方法1.2.1細菌計數(shù)法(1)48小時的布魯氏菌培養(yǎng)物，用無菌生理鹽水洗下，用標準比濁制成10億/mL菌懸液。(2)然后作10倍連續(xù)稀釋每mL為1億、1千萬、1百萬、10萬、1千、1百、IO個菌。(3)每個稀釋度取0.3mL，接種3塊平皿，每個平皿0.lmL，涂勻。每個稀釋度換一支吸管。(4)然后將平皿置37r溫箱中培養(yǎng)，35d觀察菌落數(shù)。(5)取菌落數(shù)介于30300的平板進行計數(shù)，計算每個稀釋度3個平皿的平均菌落數(shù)。推算出實際菌數(shù)。1.2.2細菌的處理用無菌生鹽水洗三次，再分別稀釋到每mL5億、l千萬、l百萬個菌。1.2.3接種小鼠脾臟細菌的計數(shù)取16只小鼠隨機分成兩組，每組8只，分別用AS19-2與S19每只小鼠接種1千萬個菌，14d后，麻醉小鼠無菌取脾臟，用無菌研磨器研磨，用無菌生理鹽水稀釋后，涂布于肝湯瓊脂培養(yǎng)基上，37'C溫箱中培養(yǎng)5天，計數(shù)菌落數(shù)。1.2.4接種小鼠的癥狀觀察取2億、l億、1千萬菌體接種的AS19-2與S19，分別觀察接種后2d、5d、8d小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，以此分析AS19-2與S19毒力的強弱。2結果2.1接種10萬AS19-2和S19菌體，比較7d后小鼠脾臟分離的菌體數(shù)，從AS19-2接種小鼠分離菌體數(shù)，明顯少于的S19接種的，具體數(shù)據(jù)見表5-1。_表5-1從接種小鼠脾臟里分離的細菌數(shù)_小鼠編號(以發(fā)現(xiàn)在接種AS19-2小鼠接種S19小鼠的菌數(shù)量為先后)的脾臟發(fā)現(xiàn)的細菌數(shù)脾臟發(fā)現(xiàn)的細菌數(shù)14172413331243123116297278272.2接種不同細菌量、不同時期的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)2.21用l百萬菌體接種的小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀，見下表5-2。表5-2接種1百萬菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)小鼠隨機編號用S19接種小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀用AS19-2接種小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀2d5d8d2d5d8d1ABCCCC2ABCcCC3AACcCC4AACcCC5AACccC6ADCccC7ADcccC8ADcccC注A.精神不振、B.所好轉、C.恢復正常D.無明顯表化2.2.2用1億菌體接種的小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀見表5-3表5-3接l億菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注A.伏地、聚群、畏寒;B.有所好轉;C.無明顯變化2.2.3用2億菌體接種的小鼠表現(xiàn)的性狀5-4表5-4接種2億菌體的小鼠臨床癥狀表現(xiàn)小鼠隨接種S19小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀接種AS19-2小鼠表現(xiàn)的臨床癥狀機編號2d5d8d2d5d8d1AABCDE2AABCDEAAFcDE4AFcDEAFcDE6AFcDE7FcDE8FcDE:A.伏地、聚群、畏寒、行走困難;B.伏地、畏寒；C.精神不振、聚群、寒；D.精神不振;E.明顯好轉;F.死亡3小結布魯氏菌病實驗動物模型十分重要，通常要選擇能造成類似于人和大動物的病理損害的動物模型較難。理想的動物模型應具備四個條件，即能經(jīng)相同的自然途徑感染，敏感性一致，類似的臨床體征和病理學改變。本實驗初步對AS19-2的毒力進了研究。與S19相比AS19-2毒力明顯減弱。即使用AS19-2高濃度接種小鼠，所引發(fā)的癥狀與未接種小鼠相比不太明顯。實施例4:布魯氏菌BP26蛋白基因的克隆、表達及純化布魯氏菌BP26蛋白是一種具有強免疫原性的外周漿蛋白。它由細胞內向外釋放，具有可溶性，相對于固定的外膜蛋白易于檢測。有報道顯示在感染布魯氏菌的牛、羊、山羊和人類中都可以檢測到BP26蛋白抗體的存在。使用BP26蛋白作為檢測抗原，應該有較高的準確性。本發(fā)明克隆了布魯氏菌的BP26蛋白基因，并進行了表達，表達產(chǎn)物通過親和層析進行了純化。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株與、質粒、載體布魯氏菌S19、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21和pET28a+本研究室保存；pMD18-Tsimplevector購自TakaRa公司。1.1.2儀器分光光度計Lambda3B(UV/V/S)，Perkin-ELMER;脫色搖床TY-80B,南京大學；其它儀器同前二章。1.1.3限制性內切酶及其它試劑限制性內切酶Ndel、EcoRI、Sacl、HindIII、SalI和T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司。DNA回收試劑盒同第一章；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體購自鼎國生物公司；RNase購于華美生物工程公司；IPTG及TMB購自Sigma公司；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；丙烯酸胺、雙甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司；布魯氏菌陽性牛血清本室研制，辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG購自鼎國生物公司；金屬鰲合層析介質S印harose-4-B購自Pharmacia公司。1.1.4主要試劑的配制1.1.4.1SDS-PAGE試劑30%(w/v)Acrylamidel00mL:稱取29gAcrylamidelgBIS置于100mL燒杯中，加入約80mL的去離子水后，加熱使之溶解，加去離子水將溶液定容至100mL，用0.45um過濾膜過濾除雜質，于棕色瓶中4。C保存。1.5mol/L(pH8.0)Tris-HC1緩沖液18.17gTris加入90mol/LdH20使之溶解，用濃HC1調pH值至8.0，最后加dH20定容至IOOmL;1.0mol/L(pH6.8)Tris-HCl緩沖液2.llgTris加入90mL朋20使之溶解，濃HC1調pH值至6.8，最后加dH20定容至100mL;10%SDS:稱取電泳級SDS10g，加入90mLdH20使之溶解，調pH值至7.2，最后加dH20定容至IOOmL;10鬼(w/v)過硫酸胺lmL:稱取100g過硫酸胺，加入lraL的去離子水后，充分攪拌溶解，于4'C保存，不宜久放；IOX電極緩沖液3gTris、14.4g甘氨酸、lgSDS，dH20定容至1000mL;2XSDS上樣緩沖液2.0mL甘油、lmL2-巰基乙醇、0.6gSDS、1.OmL1%溴酚藍、2.5mL1.Omol/LpH6.8Tris-HCl，dH20定容至10mL;考馬斯亮藍R-250染色液稱取lg考馬斯亮藍R-250，置于IOOOraL燒杯中，加入250mL的異丙醇，100mL冰醋酸，650mL去離子水后，充分攪拌溶解，過濾除去顆粒物質后，室溫保存；脫色液量取50mL的乙醇、100mL冰醋酸、850mL去離子水，置于IOOOmL燒杯中，充分混合后待用。1.1.4.2Westernblot檢測試劑轉移緩沖液甘氨酸2.9g、Trisbase5.8g、SDS0.37g、甲醇200mL,調pH8.3加水至1000mL;封閉液含3%BSA的TBS;洗滌液TBST(O.05%Tween-20):稱取8.8gNaCl，加入于800mL去離子水，充分溶解后，加入20mLpH8.01.0mol/LTris-HC1、0.5mLTween20，定容至1000mL。1.1.5培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基在950mldH20中加入細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨10g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaCl10g,完全溶解后用5mol/LNaOH調節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，12rC高壓下蒸汽滅菌20min，4'C保存。LB固體培養(yǎng)基在1LLB液體培養(yǎng)基中加入30g的瓊脂粉，高壓滅菌。1.2方法1.2.1目的基因的擴增與克隆根據(jù)Bp26基因的序列以及pMD18-Tsimplevector和pET28a+表達載體的特點分別設計兩端含有限制性內切酶NdeI、SalI酶切位點的引物上游5'-CATATGCAGGAGAATCAGATGACGACG-3'下游5'-GTCGACTTACTTGATTTCAAAAACGACATT-3'用PCR的方法從S19基因組中擴增出Bp26基因片段。PCR條件為95'C預變性5min;94。C變性2min，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，30個循環(huán)；最后72。C延伸10min。回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-Tsimplevector相連構建重組質粒pMDBp26，重組質粒pMDBp26送上海生工生物公司進行測序。1.2.2重組表達質粒pETBp26的構建用限制性內切酶NdeI與SalI同時消化pMDBp26與pET28a+，分別凝膠回收純化Bp26與pET28a+基因片段。取目的片段l叱、載體3ul混合后，加10XLigationbuffer2ul，T4DNA連接酶lul，加無菌去離子水到20叱。混勻后置4。C連接過夜。在無菌條件取連接產(chǎn)物10u1，加入到200mLfco"'.DH5a感受態(tài)細胞中進行轉化(涂板時加IPTG、X-gal)。1.2.3表達質粒轉入BL21表達菌將質粒快速轉化受體菌將1叱質粒加入到冰浴的己融化的BL21感受態(tài)細菌中，輕輕混勻。繼續(xù)冰浴30min，42。C熱休克90s后，立即冰浴3min。將處理過的全部感受態(tài)菌鋪到預先在37。C預熱的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均勻涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37-C孵箱過夜培養(yǎng)。1.2.4融合蛋白BP26-His的表達。取單個轉化菌落接種到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培養(yǎng)液中。于搖床中37'C，轉震蕩培養(yǎng)4h至0De。。值達0.38。取出lmL未誘導的培養(yǎng)物，轉移到另一管中，12000轉離心lmin，棄上清，保留菌體作為未誘導的對照。剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度lmmol/L進行誘導，37。C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。4h后，收集菌體。1.2.5SDS-PAGE電泳(1)洗凈玻璃板，固定在電泳槽上。按分子克隆的配方配制12y。的分離膠20mL，迅速注入兩玻璃板之間，膠頂覆蓋lmL雙蒸水。待分離膠凝固后傾出覆蓋層液體，用去離子水沖洗凝膠頂部數(shù)次，倒置空干液體，加入5mL5%的積層膠溶液，插上梳子，垂直放置電泳槽使其凝固。(2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩沖液，將電源負極與上槽相連。(3)將細菌沉淀重懸于100ul1XSDS凝膠加樣緩沖液中，煮沸15min。取20叱上樣，用55V電壓電泳至浪酚藍進入分離膠，把電壓提高到110V，繼續(xù)電泳至澳酚藍到達凝膠底部。(4)染色取下凝膠用蒸餾水沖洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍染色液(45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0.25g考馬斯亮藍)浸泡凝膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。(5)脫色用含30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過夜，其間更換脫色液34次，待藍色背景完全脫凈后，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。1.2.6Western-blot免疫鑒定1.2.6.1制膜當SDS-PAGE行將結束時，切8張濾紙和1張PVDF膜，其大小略小于凝膠。用剪刀在濾膜一角作好標記。把硝酸纖維素濾膜漂浮于一盤去離子水中，借毛細作用使之從下往上濕潤后，將之浸沒于水中，浸泡5rain以上以驅除留于濾膜上的氣泡。在一淺托盤中加入250ml轉移緩沖液，把濾紙浸泡于其中。戴上手套按如下方法安裝轉移裝置平放底部電極(為陽極)，石墨電極朝上。在這一電極上放置3張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙，逐張疊放，精確對齊，然后用一玻璃移液管作滾筒以擠出氣泡。把PVDF膜放在濾紙上，要保證精確對齊，而且在3mra濾紙與硝酸纖維素濾膜之間并不留有氣泡。從電泳槽上撤出放置SDS聚丙烯酰胺凝膠的玻璃，把凝膠轉移到一盤去離子水中略微漂洗一下，然后準確平放于PVDF膜上。把凝膠左下角置于PVDF膜的標記角上，排除所有氣泡。把最后3張3S1濾紙放在凝膠上方，同樣須確保各層精確對齊并不留氣泡。1.2.6.2轉膜將陰極放于濾紙上，石墨一邊朝下。接電源(將陽極導線接于底部石墨電極)，根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm接通電流，4'C轉膜過夜，拆卸轉移裝置。1.2.6.3封閉把PVDF膜放入覆蓋有塑料膜的小托盤中，根據(jù)濾膜面積以O.lmL/cm2的量加入封閉液，平放在平緩搖動的搖床上，于室溫搖動1.5h。1.2.6.4與第一抗體的結合按0.1mL/cm2的量加入第一抗體。將濾膜平放在平緩搖動的搖床上，于4'C溫育2h。1.2.6.5與第二抗體的結合用50mlTBST洗滌3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(l:5000稀釋)，于室溫平緩搖動2h。1.2.6.6顯色用50mlTBST洗滌4次，每次10min。加入O.4mlTMB顯色至目的條帶清晰，加蒸餾水終止反應。1.2.7親和層析純化重組蛋白1.2.7.1菌體的裂解每克菌(濕重)加入3ml裂解緩沖液(pH7.920mmol/LTris-HC1，5mmol/Limidazole,0.5mmol/LNaCl)，重懸細菌沉淀。按每毫升裂解緩沖液加入10u1MgS04(lmol/L)，10ii1Dnase(2mg/mL)，2iUPMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三種試劑，冰上孵育30min5000轉離心15min收集沉淀，按每克菌濕重加入5ml結合緩沖液的比例，將沉淀用結合緩沖液重懸，-7(TC放置過夜。將-7(TC放置的菌液冰上融化后，超聲破碎菌體。5000rpm，4。C離心15min，收集上清。-7(TC保存或立即用于純化。1.2.7.2親和層析柱的準備準備好層析柱，用記號筆做好標記。用磷酸鹽緩沖液充滿35cm柱高，封閉出口。懸浮親和層析介質，把它裝入柱內。讓柱開始流動并加入更多的介質，一直到介質水平達到合適的柱高。打開出口，加磷酸鹽緩沖液，增加流速使介質下沉，持續(xù)沖洗直到柱床高度恒定為止。將2個柱體積的20mmol/LNiS(^金屬離子溶液勻速通過層析柱。用5個柱床體積的蒸餾水洗柱。用5個柱床體積的結合緩沖液沖洗柱。1.2.7.3重組蛋白的親和層析樣品的吸附與洗滌將待純化的樣品加到金屬鰲合的柱中，并以最佳流速讓其流過柱床。用洗滌緩沖液洗柱，一直到流出樣品的紫外監(jiān)測值為基線水平。目的蛋白的洗脫加入洗脫緩沖液，待紫外監(jiān)測儀數(shù)值上升時開始接樣，隨數(shù)值上升可分段接樣。直到數(shù)值回落后一段時間停止接樣。清洗和再生層析結束后，用50mmol/LEDTA，l國ol/LNaCl，pH78清洗柱使金屬離子解離下來。然后用新鮮的金屬離子再生后開始下一輪的純化。2結果2.1Bp26基因的擴增與克隆2.1.l用PCR方法從布魯氏菌基因組中擴增出630bp條帶，與Bp26理論大小值相符，如圖9;2.1.2把目標基因克隆到T載體上，提取質粒，與環(huán)形pMDBp26理論大小值相符，見圖IO。2.2重組表達質粒pETBp26的鑒定重組質粒pETBp26用NdeI+SalI酶切消化后可見與pET28a及Bp26基因大小相符的條帶，如圖ll。1:DNAmarkerDL2000;2:recombinantplasmidpETBp26digestedwithNdeI+SalI(694bp)3:1Kbmarker2.3Bp26蛋白在大腸桿菌BL21中表達2.3.1SDS-PAGE分析把重組質粒pETBp26轉化到大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆，培養(yǎng)到0K38時，加入IPTG到最終濃度lmmol/L，分別誘導2、3、4小時，觀察Bp26蛋白在大腸桿菌BL21中表達情況，分析認為誘導4個小時的表達量最高。SDS-PAGE結果見圖12。2.3.2Bp26蛋白在大腸桿菌體總蛋白含量的測定將待檢菌體蛋白樣品進行12%SDS-PAGE電泳，脫色完全后用CS-9000雙薄層掃描儀分別對電泳條帶進行掃描(圖13)，結果，表達的重組蛋白Bp26占上清總蛋白量的23.25%。2.4融合蛋白親合層析純化SDS-PAGE分析純化的BP26蛋白可見只有一條帶，如圖14所示，凝膠薄層掃描分析純度為89%。2.5免疫印跡在29kDa左右出現(xiàn)了特異性帶，如圖15所示。實施例5布魯氏菌S19與AS19-2鑒別診斷方法的建立用純化的BP26蛋白可以區(qū)別開野毒株感染與AS19-2接種動物。為了進一步驗證這一理論，用S19與AS19-2接種小鼠實驗，初步建立了這一診斷方法。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株布魯氏菌S19本研究室保存；AS19-2見第二章。1.1.2ELISA試劑配制(1)包被液碳酸鹽緩沖液Na2C03(無水碳酸鈉)1.6g，NaHC03(碳酸氫鈉)2.9g，加去離子水至lOOOmL。(2)洗滌液PH9.2磷酸鹽緩沖液(Tween-20)Na2HP0412H202.9g，KC10.2g，KH2P040.2g，NaCl18g，吐溫-200.5mL加去離子水至lOOOmL(3)甲液0.lmol/L檸檬酸4.2g/200mL，乙液0.2mol/LNa臭12H2014.3g/200mL，取甲液24.3mL與乙液25.7mL混合，臨用前加20mg鄰苯胺(OPD)，加過氧化氫(HA)0.02mL。(4〉終止液2mol/LH2S04溶液取分析純濃硫酸110mL，加去離子水至100mL。1.1.3實驗動物昆明鼠購自長春市生物制品所1.2方法1.2.1布魯氏菌接種小鼠前的處理用PBS洗兩次，然后用生理鹽水稀釋到1億/mL。1.2.2實驗小鼠的接種把布魯菌S19與AS19-2培養(yǎng)到對數(shù)生長期，用生理鹽水洗滌三次；用生理鹽水稀釋到目的濃度；對小鼠采用腹腔注射。1.2.3被檢動物血清的制備對用S19與AS19-2免疫14天的小鼠斷尾采血，血樣在4'C冰箱放置3個小時后，5000rpm離心5min，取上清即為制備血清。1.2.4檢測方法(1)ELISA檢測按常規(guī)方法進行，將純化的目的蛋白IO倍稀釋后包被酶標板，用被檢動物血清l:IOO稀釋作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGl:200稀釋作為二抗。同時用標準陰性和標準陽性血清作對照。(2)操作過程用微量移液器向每個孔內加IOO化包被液稀釋的蛋白樣品，置濕盒內于37°0直溫培養(yǎng)箱中l(wèi)h，然后于4'C冰箱中包被過夜。次日，用洗滌液洗滌二次，甩去洗滌液，倒置在紗布上輕輕拍扣使孔內的液體充分流出，每次間隔3min。向孔內分別加入用稀釋液稀釋好的1:100陽性血清、陰性血清0.lmL,置濕盒內于37'C恒溫箱中反應lh后，甩去血清，用上面的方法洗滌3次，再加入稀釋好的1:200酶標記兔抗牛IgG0.lmL，置于濕盒內于37"C恒溫箱靜置，甩去殘留的酶標記物溶液，以同法洗滌三次。加入底物溶液10014VmL，置濕盒內于37。C恒溫箱中靜置30min，取出后立即向孔內加入0.02mL終止液，終止反應。(3)結果判定將培養(yǎng)板放入分光光度計讀取450吸收波的OD值。2結果2.1用BP26蛋白區(qū)分接種10萬S19與AS19-2菌體，7d后的小鼠將純化的BP26蛋白作抗原，用ELISA法檢測S19與AS19-2接種7d的小鼠血清中是否含有BP26蛋白的抗體，很易容區(qū)分S19和AS19-2接種的小鼠。具體ELISA讀數(shù)如表4-l。表4-1S19與AS19-2接種小鼠7d后ELISA檢測血清結果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>32000.9450.8700.8410.4790.0640.0560.0610.0620.05564000.5200.5950.6230.2360.0420.0430.0500.0460.056128000.2420.4150.2900,1690.0380.0280.0360.0250,050256000.1660.2000.1530.0960.0600.0170.0230.0100.0452.3結果判讀從2.1、2.2中的可以明顯分辨出S19與AS19-2接種的差異。權利要求1.一種可區(qū)分自然感染或野毒感染的布魯氏菌弱毒疫苗ΔS19-1，特征在于布魯氏菌需弱毒疫苗株S19的Bp26基因缺失而成ΔS19-1。2、根據(jù)權利要求1所述的布魯氏菌弱毒疫苗AS19-2，特征在于:△S19-1毒力基因Bmpl8缺失而成弱毒疫苗株AS19-2。3.根據(jù)權利要求1或2限定的疫苗制備方法，其特征在于根據(jù)布魯氏菌基因組序列，設計PCR引物，擴增出分子目標基因Bp26同源重組的引導序列，在T載體上對其進行改造，在它的中間用限制性內切酶去除其中的500bp，在這個位置上連接上LucNF+基因，破壞了Bp26的原有序列，然后把改造好的基因片段連入自殺性的質粒上pBLs。4、根據(jù)權利要求3限定的疫苗制備方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)以布魯氏菌弱毒疫苗基因組為模板，設計引物，用PCR的方法，擴增出分子標記目標基因的同源重組引導序列，而后克隆到T載體上對目標基因改造；(2)用(1)得到的基因片段與復制啟動子為pUCoir的載體相連，而后將sacB基因連接到這個載體的適當位置，構建成同源重組載體(自殺性質粒)；(3)使步驟(2)得到的重組載體轉化到布魯氏菌中去；利用同源重組載體自帶的篩選標記篩出同源重組單交換子，利用sacB基因篩選出同源重組的雙交換子，得到本發(fā)明的分子標記疫苗株AS19-1;(4)重新設計引物，從布魯氏菌基因組中，擴增出目標毒力基因的同源重組引導序列，使用(1)(3)的方法使AS19-1的毒力缺失，得到本發(fā)明的分子標記、毒力缺失弱毒疫苗株AS19-2。5、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說的弱毒疫苗株為S19。6、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說的分子標記目標基因為Bp26。7、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說的分子標記目標基因是指用限制性內切酶切除其中500bp，而后在這個位置上連接上LucNF+報告基因。8、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說目標蛋白是BP26蛋白。9、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說的目標毒力基因是Bmpl8基因。10、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所說目標毒力基因改造是指用限制性內切酶切除其中的200bp，而后使之相聯(lián)。全文摘要本發(fā)明涉及布魯氏菌疫苗，特別是涉及了布魯氏菌疫苗株的分子標記與毒力基因缺失。本研究通過構建自殺質粒，采用定向同源重組的方法(基因打靶)，將螢光素酶改造基因(LucNF+)代替了布魯氏菌弱毒疫苗S19株Bp26基因部分片段，破壞了其免疫原性蛋白BP26的表達，構建了布魯氏菌Bp26基因缺失突變株ΔS19-1。BMP18蛋白是布魯氏菌主要的毒力因子之一。采用相同的方法剔除了ΔS19-1的Bmp18基因，使其不表達Bmp18蛋白，構建成了布魯氏菌毒力基因缺失突變株ΔS19-2。本發(fā)明解決了常規(guī)的布魯氏菌疫苗不能區(qū)分人與動物是人工免疫接種還是野生菌感染、病毒強，容易使接種的人與動物發(fā)病的問題。對布魯氏菌的監(jiān)測、診斷、凈化各控制具有重要意義和實際應用價值。文檔編號A61K39/10GK101185756SQ20071005600公開日2008年5月28日申請日期2007年8月29日優(yōu)先權日2007年8月29日發(fā)明者王興龍,閆廣謀申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所