專利名稱：用于基因治療的新的膠體合成載體的制作方法
技術領域：
本發明提供用于體外、局部和全身的核酸遞送的組合物和方法。
背景技術：
成功的基因治療的關鍵性要求是將治療性目的核酸遞送到靶組織和細胞且不大量分布到非靶組織中的能力。已經測定了許多合成分子將核酸遞送到細胞的能力，即合成載體。合成載體遞送的常規方法傾向于主要使用陽離子脂質或基于陽離子聚合物的體系。見例如Barron等人，Hum.Gene Ther.9315-323(1998)，；Gao等人，Gene Therapy 2710(1995)；Zelphati等人，J.Controlled Release 4199(1996))或陽離子聚合物(Boussif等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.927297(1995)；Goula等人，Gene Therapy 51291(1995)；Chemin，等人，J Viral Hepat 5369(1995)；Kwoh等人，Biochim.Biophys.Acta 1444171(1999)；Wagner，J.Controlled Release 53155(1998)；以及Plank等人，Hum.Gene.Ther.10319(1999))。
通常當復合物上的凈電荷是正的時(電荷比(+/-)大于1)，編碼蛋白質的質粒DNA與陽離子脂或陽離子聚合物的復合物(分別稱為“lipoplexes”和“polyplexes”)轉染細胞得到最有效的蛋白質表達。類似地，通常當復合物上的凈電荷是正的時，將帶有特異針對編碼蛋白質的mRNA的序列的反義或核酶寡核苷酸與類似的或相同的試劑復合，它們可以被遞送至培養的細胞中以得到最有效的對特定蛋白的抑制。研制的一些其它的用于核酸的制劑包括多聚陽離子例如聚賴氨酸與導向配體例如FGF2蛋白的綴合物，將核酸包封在內部俘獲的水相中的脂質體、與包封核酸的脂質體融合的有包膜病毒例如所謂的HVJ-脂質體、以及各種乳劑制劑(其中核酸被隔絕在乳劑或微粒的無水相中)。盡管存在各種制劑，但在大多數情況下，核酸是通過復合或被囊化的方法結合到膠體復合物中的。人們為了獲得所需要的藥理學效益已經進行了許多努力以制備可以為質粒、寡核苷酸及其它核酸形式提供遞送載體的組合物，但至今這些制劑仍然缺乏體內穩定性、針對靶組織和細胞的專一性、以及可在靶組織和細胞中提供適當水平的核酸活性的能力。使這些膠體復合物內在化的機理仍不清楚，但認為取決于復合物中的凈電荷，且假設復合物的表面正電荷和細胞的表面負電荷在復合物的細胞吸收以及復合物與生物學體系的許多其它相互作用中起舉足輕重的作用。
Lipoplex和polyplex的主要缺點是它們傾向于與多種細胞發生非專一的相互作用，這將導致一些不希望有的作用。另外，這些復合物可以與血清中帶負電荷的蛋白質及其它組分發生靜電相互作用，導致復合物的表面改性或不穩定及其它不利的作用或細胞干擾。
常規復合物的另外的問題是它們缺乏膠體穩定性。這種不穩定性導致復合物聚集為大的顆粒，特別是在或接近中性電荷比的情況下，因而導致長期保存的困難。人們已經嘗試用許多方法來克服這種問題。例如，一種最簡單的方法是通過立體聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)進行表面改性。(Scaria等人，1999，Program of the American Society of Gene Therapymeeting held at Washington D.C.on June 9-13，p221a，abs# 878，Meyer等人，1998，J.Biol.Chem.273，15621-15627；Choi等人，1998，Bioconjug.Chem.9，708-718；Choi等人，1998，J.Controlled Release54，39-48；Kwoh等人，1999，Biochim.Biophys.Acta 1444，171-190；Vinogradov等人，1998，Bioconjug Chem 9805-12；Zelphati等人，1998，Gene.Ther.5，1272-1282；Phillips，1997，International BusinessCommunications meeting held at Annapolis，Maryland on June 23-24，1997；以及Woodle等人，1992，Biophys.J.61，902-10；E.Schacht等人，WO 9819710)。復合物表面上的立體包被物可以提高膠體穩定性。
這種立體包被物還可最小化與靶和非靶組織及細胞以及血清組分的相互作用，就靶組織和細胞來說這是不被希望的作用。然而，用PEG修飾lipoplex和polyplex(PEG化(PEGylation))對復合物的生物活性具有顯著的不利影響。除了具有所希望的抑制與細胞表面的非特異性的和不希望有的結合的作用外，使用立體表面可以不利地影響與靶組織和細胞的結合。此外，它可以不利地影響一旦與靶細胞的結合發生后DNA遞送過程中的隨后步驟。例如PEG化導致由復合物的DNA組分編碼的蛋白的總表達水平很差(Scaria和Philips同上)。
Schacht等人(WO 9819710)指出了一種特別有利的構建方法，包括逐步的構建，首先構建核酸與陽離子聚合物分子的復合物，而后在第二步中陽離子聚合物分子與親水聚合物嵌段或一個或多個導向部分和/或其它生物活性分子共價結合在一起。自組裝的親水聚合物包被物是用A-B型線性嵌段共聚物構建的，而這種包被物可以提供穩定化，盡管由此形成的復合物仍然經常相當迅速地不穩定化。因此，Schacht描述了用于組裝復合物的2-步驟方法，其中親水聚合物和導向部分或其它生物活性分子與先前存在的膠體即顆粒共價地連接。另外，還使用具有多價的共價連接物的聚合物進行親水聚合物的共價連接以便交聯發生在復合物的表面包被物中。這種復合物具有許多局限性。重要地，這種構建不可避免地導致許多在它們的活性上具有顯著差別的不同化學結構，這些活性包括所需要的和不希望的那些。此外，即使可能，控制所制備的每個結構的量也是困難的。重要地，第一個親水聚合物偶聯事件形成了基本的立體包被物，其減少了另外的偶聯反應的發生，以使該過程受到自我限制。當需要的表面結合聚合物的量比自我限制的偶聯所允許的量大時，形成的包被物是不充分的。此外，當在先前存在的顆粒表面上形成綴合物時，即使可能的話，按照形成何種化學種類對偶聯反應進行完全控制是很難的。另外的困難是需要防止不希望有的與核酸組分的反應或綴合，但這不是容易完成的。進行2-步法復合物的制備仍然存在其它的困難，即需要在表面正電荷下制備核心復合物。
最后，當復合物順利地達到靶組織和細胞，它必須能夠與靶組織和細胞膜有效地結合，并有效地將核酸內容物遞送到可以發揮其活性的細胞內區室。常規的復合物傾向于僅僅不充分地進行這些步驟，導致基因表達的效率低和/或水平不充分。
因此顯而易見的是，非常需要具有改進的靶專一性和體內穩定性以及雖然由化學定義的種類組成但相對均質的基因遞送載體。特別地，具有可提供提高的靶專一性、體內膠體穩定性、以及提高的靶專一性的改進了的外部立體層的穩定基因遞送載體是需要的。此外，需要載體顯示出改善的細胞進入和細胞內運輸，以許可提高核酸的治療活性，例如基因表達。

發明內容
因此本發明的一個目的是提供一種用于基因治療的非天然存在的載體，其由化學定義的試劑組成，其中載體是自組裝的，且其中載體包含(1)包括核酸的核心復合物和(2)至少一種復合物形成試劑，其中載體具有融合活性。載體任選地可以含有允許與細胞膜融合和允許核吸收的試劑。載體還可以含有錨定在核心復合物上的外殼部分，借此外殼穩定復合物，保護它不受不希望有的干擾并提高向靶組織或細胞的核酸遞送。外殼任選地可以是可脫落的，即可以將其如此設計以致于它可在進入靶細胞或組織時與載體分離。
本發明的另一個目的是提供制造這些載體的方法，包含載體的藥物組合物，以及使用該載體和藥物組合物治療患者的方法。
根據這些目的，本發明提供了一種包含內殼的非天然存在的基因治療載體，所述內殼包含(1)包括核酸的核心復合物和(2)至少一種復合物形成試劑，其中載體具有融合活性。載體可以進一步包含融合部分。融合部分可以包含一個固定在核心復合物上的殼，或融合部分可以直接摻入核心復合物中。
在另一實施方案中，載體包含一個穩定載體和減少與蛋白質和細胞的非特異性結合的外殼部分。外殼部分可以包含一種親水聚合物。
在另一實施方案中，載體包含融合部分。可以將外殼部分固定到融合部分上，或可以將其固定到核心復合物上。
在另一實施方案中，載體可以包含至少兩種外殼試劑的混合物。這些外殼試劑每個都可以包含一種可減少與蛋白質和細胞的非特異性結合的親水聚合物，且其中這些聚合物具有實質上不同的尺寸。
在另一實施方案中，載體可以含有一種提高載體與靶組織和細胞群體結合的靶向部分。靶向部分可以包含在外殼部分中。
在另一實施方案中，復合物形成試劑選自脂、聚合物、和精胺類似物復合物。復合物形成試劑可以是選自示于圖2.1和2.2中的脂的脂。特別地，構成復合物的脂劑可以選自磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，二油?；字Ｒ掖及?DOPE)，二油?；字Ｄ憠A(DOPC)，膽固醇及其它甾醇，N-1-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)，1，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，磷脂酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，包含兩個含有約14-22個碳原子的任選不飽和的烴鏈的糖脂，鞘磷脂，鞘氨醇，N-脂酰鞘氨醇，萜烯，膽固醇半琥珀酸酯，膽固醇硫酸酯，二酰甘油，1，2-二油?；?3-二甲基丙二醇銨(DODAP)，雙十八基二甲基溴化銨(DODAB)，雙十八基二甲基氯化銨(DODAC)，雙十八基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1，3-二油?；趸?2-(6-羧基精胺基(spermyl))丙酰胺(DOSPER)，2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽(DOSPA或lipofectamine 7)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，二甲基雙十八基溴化銨(DDAB)，1，2-雙十四烷基氧基丙基3-二甲基羥基乙基溴化銨(DMRIE)，二棕櫚酰磷脂酰基乙醇戊基精胺(DPPES)，二辛基胺甘氨酸精胺(C8Gly-Sper)，雙十六烷基胺-精胺(C18-2-Sper)，氨基膽固醇-精胺(Sper-Chol)，1-[2-(9(Z)-十八烯?；趸?乙基]-2(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)，雙十四?；?3-三甲基銨-丙烷(DMTAP)，1，2-雙十四酰-sn-甘油基-3-乙基磷脂酰膽堿(EDMPC或DMEPC)，賴氨酰磷脂酰乙醇胺(Lys-PE)，膽甾烯基-4-氨基丙酸酯(AE-Chol)，亞精胺(spermadine)膽甾烯基氨基甲酸酯(Genzyme-67)，2-(雙棕櫚酰-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DPIm)，2-(二油酰基-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DOIm)，2-(膽甾烯基-1-丙胺氨基甲酸酯)咪唑(ChIm)，N-(4-吡啶基)-雙棕櫚酰-1，2-丙二醇-3-胺(DPAPy)，3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)，3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(TC-CHOL-γ-d3)，1，2-二油?；?sn-甘油基-3-琥珀酸酯，1，2-二油?；?sn-甘油基-3-琥珀酰-2-羥乙基二硫化物鳥氨酸綴合物(DOGSDSO)，1，2-二油?；?sn-甘油基3-琥珀酰-2-羥乙基己基鳥氨酸綴合物(DOGSHDO)，N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕櫚?；?TM-TPS)，3-十四烷基氨基-N-叔丁基-N’-十四烷基丙脒(vectamidine或雙C14-脒)，N-[3-[2-(1，3-二油酰氧基)丙氧基羰基]丙基)-N，N，N-三甲基碘化銨(YKS-220)，和O，O′-雙十四酰-N-(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。
復合物形成試劑還可以是式I的化合物；和它們的藥學可接受的鹽。
其中m是3或4；Y表示-(CH2)n-基團，其中n是3或4，或還可以表示-(CH2)n-基團，其中n是5到16的整數，或如果R2是基團-(CH2)3-NR4R5，且m是3，還可以表示-CH2-CH＝CH-CH2-基團；R2是氫或低級烷基，或如果m是3，R2還可以表示-(CH2)3-NR4R5基團；R3是氫或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5且m是3，R3還可以表示-CH2-CH(-X’)-OH基團；X和X′，各自獨立地表示氫或烷基；基團R，R1，R4和R5，各自獨立地是氫或低級烷基；條件是如果m是3且Y表示-(CH2)3-，則基團R，R1，R2，R3和X不能同時表示氫或甲基。
在進一步的實施方案中，復合物形成試劑包含至少兩種復合物形成試劑的混合物。
在更進一步的實施方案中，復合物形成試劑具有一或多種選自細胞結合、生物膜融合、內體破裂、和核靶向的附加活性。
在其它實施方案中，核酸選自重組質粒，復制缺陷型質粒，小質粒，重組病毒基因組，線性核酸片段，反義劑，線性多核苷酸，環狀多核苷酸，核酶，細胞啟動子，和病毒基因組。
核心復合物還可以進一步包含可提高核的結合和/或吸收的核靶向部分。核靶向部分可以選自核定位信號肽，核膜轉運肽，和類固醇受體結合部分?？梢詫⒑税邢虿糠止潭ǖ胶诵膹秃衔镏械暮怂嵘稀?br> 在更進一步的實施方案中，融合部分包含至少一個選自以下的部分病毒肽、兩親性肽、融合聚合物，融合聚合物-脂綴合物，可生物降解的融合聚合物，和可生物降解的融合聚合物-脂綴合物。融合部分可以是選自MLV env肽、HA env肽、病毒包膜蛋白的胞外結構域、病毒包膜蛋白近膜域的膜去穩定化肽、病毒融合蛋白的疏水域肽片段的病毒肽，及含有兩親性域的肽，其中含有兩親性域的肽選自蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、來自流感嗜血菌(H.influenza)血凝素(HA)蛋白的融合片段、HIV 1 gp41的胞質尾區的HIV片段I、和病毒env膜蛋白質的兩親片段。
在更進一步的實施方案中，其中復合物形成試劑是具有以下結構的聚合物 其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，其中R1和R3可以相同或不同；且R2是低級烷基。復合物形成試劑還可以是具有以下結構的聚合物 其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，其中R1和R3可以相同或不同；且R2和R4獨立地是低級烷基。
在其它的的實施方案中，融合部分是具有以下結構的聚合物 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴；R2是低級烷基；且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。融合部分還可以是具有以下結構的聚合物 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴；R2和R4獨立地是低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。融合部分還可以是膜表面活性劑聚合物-脂綴合物。表面活性劑聚合物-脂綴合物可以選自ThesitTM，Brij 58TM，Brij 78TM，Tween 80TM，Tween 20TM，C12E8，C14E8，C16E8(CnEn＝烴聚(乙二醇)醚，其中C代表碳長度N的烴，而E代表聚合度為N的聚(乙二醇))，Chol-PEG900，含有聚唑啉或其它親水聚合物替代PEG的類似物，和具有碳氟化合物替代烴的類似物。
在更進一步的實施方案中，內殼是通過化學還原或巰基處理可降解的共價鍵固定到外殼部分的。內殼是可以通過pH值6.5或以下可降解的共價鍵固定到外殼部分的。共價鍵可以選自
在其它的實施方案中，外殼包含保護性聚合物綴合物，其中聚合物顯示在極性和非極性的溶劑中都可溶解。在保護性立體聚合物綴合物中的聚合物可以選自PEG，聚縮醛聚合物，聚唑啉，帶有端基綴合物的聚唑啉聚合物嵌段，水解的葡聚糖聚縮醛聚合物，聚唑啉，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚甲基丙烯酰胺，聚乙基唑啉，聚甲基唑啉，聚二甲基丙烯酰胺，聚乙烯基甲基醚，聚羥丙基甲基丙烯酸酯，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚羥乙基丙烯酸脂，聚羥乙基唑啉，聚羥丙基唑啉和聚天冬酰胺，及聚乙烯醇。
在更進一步的實施方案中，載體含有選自受體配體，抗體或抗體片段，靶向肽，靶向碳水化合物分子或凝集素的靶向元件。靶向元件可以選自血管內皮細胞生長因子，FGF2，促生長素抑制素和促生長素抑制素類似物，鐵傳遞蛋白，促黑激素，ApoE和ApoE肽，馮·維勒布蘭德氏因子(vonWillebrand’s factor)和馮·維勒布蘭德氏因子肽；腺病毒尾絲蛋白和腺病毒尾絲蛋白肽；PD1和PD1肽，EGF和EGF肽，RGD肽，葉酸，吡哆?；屯僖核?LewisX和化學類似物。
根據本發明的另一個目的，提供了式I的化合物和它們的藥學可接受的鹽
其中m是3或4；Y表示-(CH2)n-基團，其中n是3或4，或還可以表示-(CH2)n-基團，其中n是5到16的整數，或如果R2是基團-(CH2)3-NR4R5，且m是3，可以還表示-CH2-CH＝CH-CH2-基團；R2是氫或低級烷基，或如果m是3，還可以表示-(CH2)3-NR4R5基團；R3是氫或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基團且m是3，還可以表示-CH2-CH(-X′)-OH基團；X和X′，各自獨立地表示氫或烷基；且基團R，R1，R4和R5，各自獨立地是氫或低級烷基；條件是如果m是3且Y表示-(CH2)3-，基團R，R1，R2，R3和X不能同時表示氫或甲基。
在本發明的另外的方面中提供了一種包含如上所述的載體和藥學可接受的稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
根據本發明的另一方面提供了用于構成如上所述類型的自組裝核心復合物的方法，其中該方法包含以下步驟在靜態混合器中加入核酸的溶液流和構成核心復合物的部分的溶液流，其中將液流分成內部的和外部的螺旋流，它們在若干不同的點相交以形成湍流，并由此促進混合導致物理化學組裝相互作用。
根據本發明的另一方面，提供了治療患者的疾病的方法，包括給予患者治療有效量的上述載體。
根據本發明的另一方面提供了一種非天然存在的包含內殼的基因治療載體，其包含(1)核心復合物，包括核酸和至少一種復合物形成試劑；(2)核靶向部分；(3)融合部分；和(4)外殼，包含(i)穩定載體和減少與蛋白質和細胞的非特異性結合的親水聚合物，和(ii)提供與靶組織和細胞結合的靶向部分，其中外殼是通過可斷裂的鍵連接的，這使外殼能夠脫落。
從下面的詳述本發明的其它目的，特征和優點將是明顯的。然而應該理解，這些詳細說明和具體實施例，盡管指出了本發明的優選實施方案，但僅僅是以舉例說明的方式給出的，因為從這些詳細的說明來說在本發明的精神和范圍內的各種改變和修飾對于本領域技術人員都是顯而易見的。


圖1顯示非天然存在的載體的簡圖，其包括(1)核心復合物(包含核酸和至少一種復合物形成試劑和可選地提供與細胞膜融合和核吸收的試劑)，和(2)可選的固定到核心復合物上的可選地帶有可斷裂的片段的外殼，及(3)可選的固定到核心復合物或外殼上的暴露的配體(結構E)。
圖2.1-2.2顯示陽離子脂的化學結構。
圖3.1-3.5顯示由取代的氨基乙醇及核酸形成的結構的圖解。
圖4表示由取代的氨基乙醇和核酸形成的復合物的粒徑分布和均一性。
圖5表示對小鼠靜脈內給予如下核心復合物后由體內組織的轉染導致的螢光素酶表達，所述核心復合物由商業上得到的陽離子脂形成、由取代的氨基乙醇形成，以及由商業上得到的(ExGen)或合成的(Lp500)線性PEI陽離子聚合物形成。
圖6表示對小鼠靜脈內給予由商業上得到的陽離子脂形成的核心復合物后由體內組織轉染導致的GM-CSF表達。
圖7表示對小鼠靜脈內給予如下核心復合物后由體內組織轉染導致的螢光素酶表達，所述核心復合物由商業上得到的陽離子脂形成并帶有通過包含融合表面活性劑(含有低分子量的-小于2000道爾頓的親水PEG聚合物)或立體表面活性劑(含有高分子量-等于或大于2000道爾頓的親水PEG聚合物)而形成的殼。
圖8表示通過向聚賴氨酸核心復合物添加來源于HA蛋白的融合肽(K14-Fuso)而得到的提高的表達。
圖9表示在酸性pH值下腙鍵的斷裂。
圖10A表示用于在有效負載核酸中結合NLS的一些方法的圖解，圖10B表示其上結合了PNA連接的NLS的線性DNA與單獨的線性DNA相比較的提高的表達。
圖11表示粒徑分布對PEI/DNA和PEI-PEG5000/DNA復合物的電荷比的依賴性。誤差線代表粒徑分布的標準差。DNA(鮭魚精子)濃度100μg/ml；復合物中的PEG Mol％5.0圖12表示含有100μg/ml鮭精DNA的PEI-PEG5000/DNA復合物的粒徑穩定性；電荷比1(+/-)，復合物中5Mol％PEG5.0。誤差線代表粒徑分布的標準差。
圖13表示在血清存在下PEG對PEI/DNA復合物聚集的影響。在用10％血清孵育前后的PEI或含有不同mole％PEG的PEI-PEG/DNA復合物的粒徑。在測定粒徑之前，將與血清在37℃孵育30分鐘的樣品用1,000,000MW截斷值的透析袋作大量透析。誤差線是分布的標準差。
圖14示意性表示不同分子量的PEG對蛋白介導的帶正電荷的PEI/DNA復合物的聚集的作用。
圖15A表示具有固定的PEG或聚唑啉聚合物的I125-DNA復合物在小鼠中的血液清除率的延長，圖15B表示具有固定的I125-PEG或聚唑啉聚合物的DNA復合物在小鼠中的肺吸收的減少。
圖16表示PEI-ss-PEG5000/DNA復合物的粒徑。柱1表示由PEI-ss-PEG5000(含有11mol％PEG的PEI-ss-PEG5000)以1∶1的電荷比與250μg/ml DNA(鮭魚精子)復合得到的顆粒的平均尺寸。柱2表示除了將PEI-ss-PEG5000在復合之前用10mM DTT處理外同樣制備的樣品。
圖17表示與鮭精DNA在電荷比3(+/-)復合的PEI和PEI-ss-PEG5000的ζ電位。
圖18表示一種含有250μg/毫升鮭精DNA的可斷裂的PEI-ss-PEG5000/DNA復合物的粒徑穩定性；電荷比1(+/-)，復合物中的PEGMol％10.0。誤差線代表粒徑分布的標準差。
圖19表示PEI/DNA和PEI-PEG和PEI-ss-PEG/DNA復合物的螢光素酶活性。將細胞(BL6)在無血清培養基中用0.5μg/孔(96孔板)與PEI，PEI-PEG和PEI-ss-PEG以電荷比5復合的質粒DNA轉染3小時。轉染24小時后測定螢光素酶活性。
圖20表示PEI/DNA和PEI-PEG/DNA復合物的螢光素酶活性。將細胞(BL6)在無血清培養基中用0.5μg/孔(96孔板)與PEI或PEI-PEG以電荷比5復合的質粒DNA轉染3小時。轉染24小時后測定螢光素酶活性。
圖21表示PEG對復合物表面性質的影響。
圖22表示PMOZ對復合物表面性質的影響。以電荷比4∶1配制復合物，并在10mM鹽水中測定ξ電勢。
圖23表示PMOZ對血清穩定性的影響(用0到3.2％(以0.8為一級)的不同量的PMOZ制備4∶1電荷比復合物，并在含有10％FBS的PBS中在37℃孵育2h之前和之后用于粒徑的研究)。
圖24表示PMOZ對PEI核心復合物的表達的影響。
圖25表示通過向lipofeetin核心復合物添加肽配體(K14RGD)而得到的提高的表達。
圖26表示通過向核心復合物添加肽配體(SMT或促生長素抑制素)而得到的提高的表達。
圖27A表示用位阻二硫化物與聚乙基唑啉(PEOZ)一端(PEOZ另一端綴合有肽配體RGD)綴合的線型PEI的合成。
圖27B表示用位阻二硫化物與聚乙基唑啉(PEOZ)的一端(PEOZ另一端綴合有肽配體SMT)綴合的線型PEI的合成。
圖28表示通過向與PEI綴合的PEG的遠端添加肽配體(RGD)以電荷比6與PEI復合的Rh-寡核苷酸在Hela細胞中的細胞吸收提高。
圖29螢光素酶質粒通過新膠體載體向RA 1191細胞的遞送和在其中的表達與劑量和電荷比的相關性。在DNA劑量為0.1，0.2，0.4，0.6和0.8μg/20,000細胞下相對電荷比4，6和8表示螢光素酶的表達水平(pg/20,000細胞)。
圖30.螢光素酶質粒通過新膠體載體向RA 1191細胞的遞送和在其中的表達與配體和電荷化的相關性。螢光素酶表達水平(pg/20,000細胞)相對電荷比0.4，1，2，4和8來表示。
本發明提供了遞送治療性核酸的改善的組合物和方法。改善的復合物包含具有1)內部基因核心復合物和2)固定到內核復合物上的外殼部分的穩定基因遞送載體。外殼部分提供改善的核酸遞送，靶專一性，體內生物學穩定性，和膠體的或物理的穩定性?；蚝诵膹秃衔锖小坝行ж撦d”核酸部分，至少一種核心復合物形成試劑，且有利地含有便于細胞進入，核靶向和進入靶組織和細胞后核酸部分的核進入的附加功能元件。核心復合物為其中核酸定位在很大程度上無“大塊水”的區室中的核心復合物。因此，核心復合物與例如脂質體的組合物不同，脂質體俘獲相對稀釋的核酸溶液并且其中核酸在內部四處“漂浮”。核心復合物確實含有許多與核酸水合的水分子，但沒有象在脂質體中發現的大“俘獲”體積的水分子。
基因核心復合物可以包含作為核心復合物的一個整體部分的融合部分，或融合部分可以包含載體的一個單獨的層或殼。在此較后的實施方案中，融合部分是固定到核心復合物上的，其中錨包含共價鍵，靜電鍵，疏水鍵，或這些力的組合。核心復合物和融合層之間的錨定鍵的性質是一旦載體進入靶細胞的細胞質，該錨可以與核酸分離，由此提高有效負載核酸的生物活性。同樣地，核心復合物形成試劑是如此的以致核酸可被釋放并能夠在細胞核中或在它可顯示出其所需要的活性的其它細胞區室中自由發揮其生物活性。
有效負載核酸部分含有一或多種DNA或RNA分子或化學類似物。在一個實施方案中，該部分可編碼治療性肽，多肽或蛋白。該有效負載還可以直接或間接地抑制靶組織和細胞中的內源性基因的表達。例如，該有效負載可以為編碼治療性RNA分子或反義RNA的DNA分子，或可以為反義寡核苷酸，核酶，抑制基因表達的雙鏈RNA，雙鏈RNA/DNA雜合分子，病毒基因組，或其它核酸形式。
有利地，便于核酸進入靶組織和細胞后的核靶向的功能元件是核定位信號。然而，本領域技術人員將認識到，可以使用可提高核心復合物向靶組織和細胞的細胞核遞送的其它部分。例如，功能元件還可以是提高核遞送的病毒核心肽，多肽，或蛋白，或可以是核膜轉運肽(又名核定位信號(NLS))，或類固醇或類固醇類似物部分(參見Ceppi等人，Program ofthe American Society of Gene Therapy meeting held at Washington D.C.on June 9-13，第217a頁，abs# 860(1999))。
在一個實施方案中，基因遞送載體具有立體隔離外層或殼，可為復合物提供改變的表面特征，由此減少非特異性的相互作用，該相互作用為使用常規的載體系統所引起的顯著問題。立體層還具有抑制在對宿體給藥后宿主對載體的免疫應答的優點。有利地，外層僅僅在復合物附著和進入靶組織和細胞之前保護復合物。在一個實施方案中，外層然后脫落，提供有效負載核酸的最佳生物活性。為實現這個目的，在復合物的表面上提供了立體包被物，這種立體包被物還可最小化與血清組分和非靶組織和細胞的相互作用。以一定的形式將包被物固定到核心復合物上以致立體包被物可在有益于細胞相互作用的點從復合物上脫落或裂開。例如，一個這種點可以在復合物附著到靶組織和細胞之后，但在核心復合物釋放到細胞質中之前出現。另一個這種點在靶組織的細胞外間隙內。還有另一個這種點在預先確定的時間后。還有另外的這種點在曝露于外部信號或影響力例如熱或聲能的靶組織中。細胞進入之后事件的序列可保證有效負載的遞送不被阻礙，或否則被立體層抑制。在另外的實施方案中，可對立體層進行設計和固定以使其可抑制非特異性的相互作用，但允許實現與靶組織和細胞結合、細胞進入、以及在不切除錨的情況下核酸的功能遞送。
外層有益地含有可提高載體與靶組織和細胞之間相互作用的親合性的靶向部分。當靶向部分的存在可使與非靶組織和細胞相比在靶組織和細胞的表面載體的結合增加時，該靶向部分被認為提高了載體對靶細胞群的親合性。靶向部分的實例包括，但不局限于蛋白質，肽，凝集素(碳水化合物)，和小分子配體，其中每個靶向部分都與細胞上的互補分子或結構，例如受體分子結合。
本發明的具體特征在以下詳細地描述。
有效負載核酸部分本發明的載體可以用來遞送實質上任何具有治療或診斷價值的核酸。核酸可以是DNA，RNA，核酸同系物例如形成三股螺旋的寡核苷酸或肽核酸(PNA)，或可以是這些的結合。適宜的核酸可以包括，但不局限于，重組質粒，復制缺陷型質粒，缺乏細菌序列的小質粒，重組病毒基因組，編碼治療性肽或蛋白的線型核酸片段，雜種DNA/RNA雙鏈，雙鏈RNA，反義DNA或化學類似物，反義RNA或化學類似物，轉錄為反義RNA或核酶的線型多核苷酸，核酶，和病毒基因組。很清楚，在以下使用的術語“治療性蛋白”，除非另有陳述，包括肽，多肽和蛋白質。
當人們希望核酸在宿主細胞的基因組的特異位點整合時，編碼治療性蛋白質的核酸序列的側翼可以是和宿主基因組中的序列同源的序列段。這些序列便于通過同源重組的方法向宿主基因組中的整合。用于實現同源重組的載體是本領域已知的。當核酸以此位點特異性方式整合到宿主基因組中時，核酸的表達可能能夠處于內源性表達控制系統的功能控制之下。然而更可能的是，需要提供驅動核酸表達的外源性控制元件。有利地，控制元件為細胞特異的，由此可提高核酸表達的細胞特異性質，盡管這不是必要的。適宜的表達控制元件，例如啟動子和增強子序列(細胞特異的和非特異性的)是本領域所熟知的。見例如，Gazit等人，Can.Res.59，3100-3106(1991)；Walton等人，Anticancer Res，18(3A)1357-60(1998)；Clary等人，Surg-Oncol-Clin-N-Am.7565-74(1998)；Rossi等人Curr-OpinBiotechnol.9451-6(1998)；Miller等人，Hum-Gene-Ther.8803(1997)；Clackson，Curr.Opin.Chem.Biol.1210-218(1997)。適宜的啟動子包括，但不局限于，組成型啟動子例如EF-la，CMV，RSV，和SV40大T抗原啟動子；組織特異性啟動子例如白蛋白，肺表面活性劑蛋白(surfactantprotein)，組織特異性生長因子受體；病理組織特異性啟動子例如甲胎蛋白腫瘤特異性啟動子，腫瘤特異性蛋白質，炎癥級聯蛋白質(inflammatorycascade protein)，壞死應答蛋白質(necrosis response protein)；可調節的啟動子和例如四環素活化啟動子和類固醇受體活化啟動子；或工程化啟動子，和染色質元件例如支架結構相關區域或基質附著部位(SAR或MAR)，核小體元件，隔離物(insulator)和增強子。
用于本發明的適宜的表達質粒和小質粒為本領域所熟知。(Prazeres等人，Trends-Biotechnol.17169(1999)；Kowalczyk等人，Cell-Mol-Life-Sci.55751(1999)；Mahfoudi，Gene Ther.Mol.Biol.2431(1998))。質?？梢园c啟動子元件內含子序列和聚腺苷酸化信號序列可操作地連接的可譯框序列。當核酸部分為質粒時，它將有利地缺乏那些允許在細菌中復制的核酸元件。因此，例如，質粒將缺乏細菌的復制起點。最有利地，質粒將相對地沒有細菌來源的序列。用于制備這些質粒的方法是本領域所熟知的(Prazeres同上)。
當核酸來源于病毒時，適宜的病毒部分包括，但不局限于，重組腺病毒基因組DNA(有和沒有末端蛋白)，和來源于例如MLV或HIV env-病毒粒的逆轉錄病毒核心。還可以使用重組甲病毒RNA進行細胞質表達和復制。其它病毒基因組包括皰疹病毒，SV-40，痘苗病毒和腺伴隨病毒?？梢允褂镁幋a病毒基因組的質粒DNA或PCR產生的DNA?？梢允褂闷渌《緛碓吹暮怂?。
當核酸是合成來源的時，適宜的部分包括，但不局限于，PCR片段DNA，帶有端基化學修飾或綴合的DNA，反義和核酶寡核苷酸，線性RNA，線性RNA-DNA雜合體?？梢允褂闷渌鼇碓吹暮铣珊怂峄蚝怂犷愃莆?。
復合物形成試劑適用于本發明中的復合物形成試劑必須能夠與核心核酸以允許核酸核心復合物組裝的方式結合。復合物形成試劑可以是，例如，脂，合成聚合物，天然聚合物，半合成聚合物，脂的混合物，聚合物的混合物，脂和聚合物的組合，或精胺類似物復合物，但技術人員將認識到可以使用其它試劑。復合物形成試劑優選具有足夠的親合性，以足以在用于制備的條件下使復合物能夠形成，并足以在貯存期間和在給藥后的條件下維持復合物，但該親合性不足以在靶細胞的細胞質或細胞核中的條件下保持復合物。常用復合物形成試劑的例子包括允許與核心核酸部分在適宜的混合條件下自發復合的陽離子脂和聚合物，但也可以使用中性的和帶負電的脂和聚合物。其它例子包括組合的脂和聚合物，其中一些為本質上陽離子的，而其它的在該組合中為本質上是中性的或陰離子的，以致聯合在一起可獲得具有期望的穩定性平衡的復合物。在其它例子中，可以使用具有非靜電的相互作用但仍然能使具有所需要的穩定性平衡的復合物形成的脂和聚合物。例如，所需要的穩定性平衡可以通過與核酸堿基和主鏈部份相互作用(如結合形成三股螺旋的寡核苷酸或“肽核酸”)來實現。在其它的例子中可以單獨和以組合方式使用綴合的脂和聚合物。
用于本發明的適宜的陽離子脂在例如美國專利U.S.5,854,224和5,877,220中描述，它們在此完全并入作為參考。適宜的脂典型地含有至少一個疏水性的部分和一個親水的部分。其它適宜的脂包括小泡構成脂或小泡相容的脂，例如磷脂，糖脂，甾醇或脂肪酸。包括在此類中的有磷脂，例如磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰肌醇(PI)，和糖脂，例如鞘磷脂(SM)，其中這些化合物典型地含有兩個特征性地約14-22個碳原子長的烴鏈，且該烴鏈可以含有不飽和的碳-碳鍵。一類優選的疏水性部分包括烴鏈和甾醇。其它種類的疏水性部分包括鞘氨醇，神經酰胺，和萜烯(聚異戊二烯)例如法尼醇，苧烯，植醇，角鯊烯和視黃醇。適合于本發明的脂的具體實例包括陰離子的，中性的或兩性離子的脂，例如磷脂酰乙醇胺，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或膽固醇(Chol)，膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)，膽固醇硫酸酯，和甘油二酯。陽離子脂的具體實例包括N-1-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)，1，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，1，2-雙油?；?3-二甲基丙二醇銨(DODAP)，雙十八基二甲基溴化銨(DODAB)，雙十八基二甲基氯化銨(DODAC)，雙十八基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1，3-二油?；趸?-(6-羧基精胺基(spermyl))丙酰胺(DOSPER)，2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽(DOSPA或Lipfectamine TM)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，二甲基-雙十八基溴化銨(DDAB)，1，2-雙十四烷基氧基丙基3-二甲基羥基乙基溴化銨(DMRIE)，二棕櫚酰磷脂?；掖嘉旎?DPPES)，二辛基胺甘氨酸精胺(C8Gly-Sper)，雙十六烷基胺-精胺(C18-2-Sper)，氨基膽固醇-精胺(Sper-膽固醇)，1-[2-(9(Z)-十八烯?；趸?乙基]-2(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)，雙十四酰基-3-三甲基銨-丙烷(DMTAP)，1，2-雙十四酰-sn-甘油基-3-乙基磷脂酰膽堿(EDMPC或DMEPC)，賴氨酰磷脂酰乙醇胺(Lys-PE)，膽甾烯基-4-氨基丙酸酯(AE-Chol)，亞精胺(spermadine)膽甾烯基氨基甲酸酯(Genzyme-67)，2-(雙棕櫚酰-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DPIm)，2-(二油酰基-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DOIm)，2-(膽甾烯基-1-丙胺氨基甲酸酯)咪唑(ChIm)，N-(4-吡啶基)-雙棕櫚酰-1，2-丙二醇-3-胺(DPAPy)，3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)，3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(TC-CHOL-γ-d3)，DOTMA和DOPE的1∶1混合物(Lipofectin 7)，1，2-二油?；?sn-甘油基-3-琥珀酸酯，1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-琥珀酰-2-羥乙基二硫化物鳥氨酸綴合物(DOGSDSO)，1，2-二油酰基-sn-甘油基3-琥珀酰-2-羥乙基己基鳥氨酸綴合物(DOGSHDO)，N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕櫚酰基精胺(TM-TPS)，3-十四烷基氨基-N-叔丁基-N’-十四烷基丙脒(vectamidine或雙C14-脒)，N-[3-[2-(1，3-二油酰氧基)丙氧基羰基]丙基]-N，N，N-三甲基碘化銨(YKS-220)，和O，O′-雙十四酰-N-(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。(見Lasic，Liposomes in GeneDelivery，1997，CRC Press，Boca Raton FL.，Tang等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.242141(1998)；Obika等人，Biol-Pharm-Bull.22187(1999)。
注意可以使用一種陽離子脂與一種中性脂的混合物，以及多種陽離子脂加中性脂的混合物包括3∶1wt/wt DOSPA∶DOPE(lipofectamine7)，1∶1wt/wt DOTMA∶DOPE(lipofectin7)，1∶1摩爾/摩爾DMRIE∶膽固醇(DMRIE-CTM)，1∶1.5摩爾/摩爾TM-TPS∶DOPE(CellfectinTM)，1∶2.5wt/wt DDAB∶DOPE(LipofectACE7)，1∶1wt/wt DOTAP∶Chol，和這些的許多變體。
還要注意這些陽離子脂試劑，以及缺乏疏水性部分的其它陽離子試劑，可以用以下方式與核酸結合起來，該方式使得核酸摻入低極性環境中，所述環境包括由甘油三酯和/或甾醇形成的油，由油與兩親性穩定劑例如脂肪酸和溶血磷脂相結合形成的乳劑、微乳，立體相脂(Cubic phase lipid)。一個具體的實施方案使用了多價陽離子脂例如DOGS與甘油三酯和磷脂酰膽堿∶溶血卵磷脂(2∶1或控制粒徑所需的其它比值)的組合。這些組合物可用于構成核心顆粒，其中固定是通過加入大的疏水性部分(具有極低的水溶性)例如十八烷基(C18)和更長的烴、植烷酰基(phytanoyl)烴，或多個部分，或其它這樣的部分產生的。另一具體的實施方案使用了多價陽離子脂例如DOGS與烴-氟烴“榫釘(dowel)”(C16F17H17)，碳氟化合物“油”(例如C16F34)和磷脂酰膽堿∶溶血卵磷脂(2∶1或控制粒徑所需的其它比值)的組合。這些組合物可用于構成核心顆粒，其中通過加入可以插入氟烴“油”的碳氟化合物或烴-碳氟化合物片段進行固定。
有許多其它陽離子脂適合于構成核心復合物，它們在下面的專利或專利申請中描述US 5,264,618，US 5,334,761，US 5,459,127，US 5,705,693，US 5,777,153，US 5,830,430，US 5,877,220，US 5,958,901，US5,980,935，WO 09640725，WO 09640726，WO 09640963，WO 09703939，WO 09731934，WO 09834648，WO 9856423，WO 09934835。例如，專利或專利申請US 5,877,220，US 5,958,901，WO 96/40725，WO 96/40726，和WO 97/03939中描述的十四種試劑是可從Promega Biosciences[以前為JBL Scientific Subsidiary of Genta Inc.](San Louis Obisbo，CA)商購的，它們的結構示于圖2.1-2.2。疏水性部分在甾醇(膽固醇)到兩個或四個長度17或18個碳的烴鏈的范圍變化。帶正電荷的部分(親水的頭部基團)變化極大，但通常含有可離子化的氮(胺)。每個分子上正電荷的數目在1到13間變化，分子量在650到4212間變化。
有益地，核心復合物可以用GC-030或GC-034制備，該制備既可以不使用任何附加的組分，也可以使用附加的組分例如膽固醇或含有親水聚合物部分的表面活性劑?；蛘撸部梢允褂肎C-029，GC-039，GC-016，GC-038，它們既可以單獨使用，也可以與例如膽固醇或表面活性劑等成分形成混合物的形式使用。眾多的其它脂的結構在US 5,877,220，US 5,958,901，WO 96/40725，WO 96/40726，和WO 97/03939中加以描述，它們可以用于本發明。最有用的具體脂可以使用四種檢定法來確定1)具有將核酸構成小的，膠體穩定的顆粒的能力，2)具有提高核酸內化為組織培養細胞中的內體的能力，3)具有提高核酸在組織培養細胞中的細胞質釋放的能力，以及4)當局部或全身給藥時具有通過體內組織引起質粒表達的能力。
適宜的陽離子化合物還包括取代的氨基乙醇和它們的鹽，其具有通式I
其中m是3或4；Y表示基團-(CH2)n-，其中n是3或4，或還可以表示基團-(CH2)n-，其中n是5到16的整數，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基團且m是3，還可以表示-CH2-CH＝CH-CH2-基團；R2是氫或低級烷基，或如果m是3，還可以表示-(CH2)3-NR4R5基團；R3是氫或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基團且m是3，還可以表示-CH2-CH(-X’)-OH基團；X和X′，各自獨立地表示氫或烷基；且基團R，R1，R4和R5，各自獨立地是氫或低級烷基；條件是如果m是3且Y表示-(CH2)3-，基團R，R1，R2，R3和X不能同時表示氫或甲基。
以上和以下使用的一般術語在本申請的上下文中具有下面的意義前綴“低級”表示具有至多且包括7，和優選至多且包括3個碳原子的基團。
低級烷基是，例如，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，新戊基，正己基或正庚基。在一個實施方案中，低級烷基優選是乙基且尤其是甲基。在另外的實施方案中，低級烷基是烴部分的碳氟化合物類似物。在另一個實施方案中，低級烷基是氟烴和烴的組合。
烷基是例如C1-C30-烷基，優選C1-C16-烷基；烷基優選是直鏈的烷基，但也可以是支鏈的，且是例如，如以上所定義的低級烷基，正辛基，正壬基，正癸基，正十二烷基，正十四烷基，正十六烷基或2，7-二甲基辛基。在另外的實施方案中，烷基是烴部分的碳氟化合物類似物。在另一個實施方案中，烷基是氟烴和烴的組合。
鹵素表示例如氟或碘，特別是溴且尤其是氯。
根據本發明的化合物的鹽基本上是藥學可接受的，無毒的鹽。例如含有3或4個堿性中心的式I化合物可以構成酸加成鹽，例如與無機酸，例如氫鹵酸例如鹽酸和氫碘酸，與硫酸或磷酸成的鹽，或與適當的有機羧酸或磺酸，例如乙酸，三氟乙酸，富馬酸，草酸，甲磺酸或對甲苯磺酸成的鹽；或例如與酸性氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸成的鹽。當與式I的化合物相聯系時，術語”鹽”包括單鹽和聚合鹽兩者。
對于分離或提純，也可以使用藥學不適合的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。對于治療用途，只可以使用藥學可接受的鹽，且因此它們是優選的。
根據結構的數據，本發明的化合物可以以異構體混合物或以純的異構體的形式存在。
式I的化合物可以按照已知的方法制備，由此例如(a)將式II的化合物 其中m，Y，R，R1，R2和R3如式I的定義，其中氨基-NRR1，-NR2R3和可選地在基團R2＝-(CH2)3-NR4R5中的-NR4R5是可選地被適當的保護基保護的；與式III的化合物反應 其中X為式I的定義，且如有必要，將氨基保護基再次斷裂，或(b)為了制備式I的化合物，其中m是3，R2是-(CH2)3-NR4R5基團，R3是-CH2-CH(-X′)-OH基團，將式IV的化合物 其中Y，R，R1，R4和R5如式I的定義，且其中氨基-NRR1和-NR4R5是可選地被適當的保護基保護的；與式III的化合物反應，其中X為式I的定義，且如有必要，將氨基保護基再次斷裂，或(c)為了制備式I的化合物，其中R，R1，R2和R3表示氫且Y是基團-(CH2)n-，其中n是3或4，將式V的化合物還原 其中m和X如式I所定義且n是3或4，或(d)為了制備式I的化合物，其中m是3，R2表示基團-(CH2)3-NH2且R和R1表示氫，將式VI的化合物還原 其中X，Y和R3如式I的定義；和/或如果需要，可以將得到的式I化合物轉變為其它的式I化合物，和/或如果需要，可以將得到的鹽轉變為游離的化合物或其它的鹽，和/或如果需要，可以將得到的具有構成鹽的性質的游離式I化合物轉變為鹽，和/或可以將得到的式I的異構體化合物的混合物分離成單獨的異構體。
在隨后的對a)到d)方法更詳細的說明中，除非另有說明，符號m，n，X，X′，Y，R和R1到R5具有式I中所給出的意義。
方法(a)氨基-NRR1，-NR2R3和可選地-NR4R5優選被保護基保護。保護基，例如氨基保護基起作用的方式，其引入和裂解是本身已知的并在如下文獻中描述J.F.W.McOmie，“有機化學中的保護基”，Plenum出版，London and New York 1973，以及T.W.Greene，“有機合成中的保護基”，Wiley，New York 1984。氨基保護基，特別是適合于聚胺例如精胺、亞精胺等等的氨基保護基，在例如Acc.Chem.Res.19105(1986)以及Z.Naturforsch.41b，122(1986)中描述。
優選的一價氨基保護基是酯基，例如低級烷基酯并尤其是叔丁氧羰基(BOC)，或苯基低級烷基酯例如芐氧基羰基(芐氧羰基，Cbz)；或?；?，例如低級烷?；螓u代低級烷?；?，例如特別是乙?；?，氯乙?；蛉阴；换蚧酋；鶊F，例如甲基磺酰基，苯磺?；蚣妆?4-磺?；炦x的二價氨基保護基是二?；缣岬亩；?鄰苯二甲酰)，它們與待保護的氮原子一起形成苯二酰亞氨基。
氨基保護基的裂解可以通過例如，或許在酸性介質中例如與鹽酸，或以堿性的方式例如與氫氧化鈉溶液發生水解，或也可以通過加氫進行。
叔丁氧羰基特別優選作為該氨基保護基，并可以例如通過使游離的胺與2-(叔丁氧羰基氧亞氨基)-2-(苯基乙腈[叔丁基-O-C(＝O)-O-N＝C(苯基)-CN]或與二(叔丁基)碳酸氫鹽反應來引入。叔丁氧羰基的裂解是例如在酸性介質，特別是草酸或草酸二水合物，鹽酸或甲苯-4-磺酸或甲苯-4-磺酸一水合物中實現的。
同樣地優選作為氨基保護基的是芐氧羰基，它們可以通過使游離的胺與氯甲酸芐基酯反應引入。芐氧羰基的裂解優選通過加氫實現，例如在活性碳上的鈀存在下加氫。
作為氨基保護基，甲苯-4-磺?；彩莾炦x的，它可以通過游離的胺與甲苯-4-磺酰氯反應，并可選地使用輔助堿例如三乙胺加以引入。甲苯-4-磺?；牧呀鈨炦x在酸性介質中例如與濃硫酸或在冰醋酸和苯酚中的30％氫溴酸反應，或也可以在堿性條件下例如與LiAIH4反應實現。
也可以優選鄰苯二甲酰作為末端伯氨基的保護基，它優選通過與N-乙氧羰基鄰苯二酰亞胺反應引入。這種保護基的裂解可通過例如與肼反應進行。
式II和III的原料化合物是已知的，或可以用類似于已知化合物的方法制備。所討論的式II化合物特別是，亞精胺，高亞精胺，降亞精胺，精胺，脫氫精胺或N，N’-雙(3-氨基丙基)-α，ω-亞烷基二胺[見例如，J.Med.Chem.7，710(1964)](它們以游離的形式或被保護的形式存在)，及其衍生物。
式III的化合物，其中X表示烷基，可以以外消旋或旋光的形式存在。如果它們以純的對映體用于根據方法(A)[或(B)]的反應，將得到相應的具有旋光性的式I化合物。類似地，如果它們與式VII或VIII的化合物反應[見下文方法(c)和(d)]，將得到具有旋光性的式V或VI的化合物。
根據方法(a)的反應可以在有或沒有溶劑的存在下進行。
方法(b)方法(b)相當于方法(a)，兩者區別在于方法(b)在式IV的原料化合物中雙重引入基團-CH2-CH(-X或-X’)-OH。而且這里-NRR1，-NR4R5優選是被保護基保護的。
式IV的原料化合物是已知的，或可以用類似于已知化合物的方法制備。所討論的式IV化合物特別是，精胺，脫氫精胺或N，N′-雙(3-氨基丙基)-α，ω-亞烷基二胺(它們以游離的形式或被保護的形式存在)，及其衍生物。
方法(c)根據方法(c)的還原可以例如在適宜的催化劑，例如阮內鎳的存在下與氫氣反應實現。另外，還原也可以用絡合的金屬氫化物，例如LiAlH4或NaBH4進行。一種優選的還原式V化合物的體系是在乙醇和氨水或乙醇和氫氧化鈉的存在下H2/阮內鎳。
可以通過例如將式VII的化合物與式III的化合物反應，得到式V的原料化合物NC-(CH2)m-1-NH-(CH2)n-1-CN(VII)式VII的化合物又可以通過例如氨水與式Hal-(CH2)2或3-CN(Hal＝鹵素)的化合物反應獲得[見C.A.63，2642b(1963)或J.Med.Chem.15，65(1972)]。式VII的不對稱化合物可以例如根據C.A.63，2642b(1963)，通過NC-(CH2)3-NH2與丙烯腈反應得到。
方法(d)根據方法(d)的還原是以與方法(c)同樣的方式進行的。使用與(c)中相同的還原劑。
可以通過例如將式VII的化合物與式III的化合物反應，得到式VI的原料化合物
反過來，通過例如二胺H2N-Y-NHR3與丙烯腈的反應可獲得式VIII的化合物。
可以按照已知的方法將式I的化合物轉變為其它的式I化合物。例如，式I的化合物(其中R，R1和R2和R3(或R4和R5)表示氫)，可以通過與醛或酮例如甲醛，在還原性條件下例如在碳載鈀存在下與氫氣反應進行低級烷基化，由此得到例如式I的化合物，其中R，R1和R2和R3(或R4和R5)表示低級烷基。此外，舉例來說，式I的化合物，其中m是3，R3表示氫，R2是基團-(CH2)3-NR4R5且氨基-NRR1和-NR4R5是被保護基保護的，可以與烷化劑例如鹵代烷或二烴基硫酸鹽起反應形成類似的式I化合物，其中R3表示烷基。
根據這種方法獲得的具有鹽形成性質的游離式I化合物，可以以已知的方式轉化為其鹽。因為游離的式I化合物含有堿性基團，因此可以通過用酸處理將它們轉變為其酸加成鹽。
由于游離形式與鹽形式的式I化合物之間的密切關系，因此在上文中和在下文中游離的化合物或它們的鹽可以理解為是也指其相應的鹽或游離化合物。
化合物，包括它們的鹽，也可以以它們的水合物的形式得到，或它們的晶體可以包括例如被用來結晶的溶劑。
根據本發明可獲得的異構體混合物可以以已知的方式分離成單獨的異構體，外消旋物例如通過與旋光純的成鹽試劑形成鹽并例如通過分級結晶分離由此獲得的非對映異構體混合物。
上述反應可以在已知的反應條件下，在沒有或通常有溶劑或稀釋劑(優選對所使用的試劑是惰性的且可溶解它們的那些)存在下，在沒有或有催化劑、縮合劑或中和劑的情況下，根據反應的類型和/或反應組分在降溫，常溫或升溫下(例如在大約-70℃到190℃的溫度范圍，優選-20℃到150℃，例如在所使用的溶劑的沸點溫度下)，在大氣壓或在密閉容器中，可選地在壓力下和/或在惰性氣體中(例如在氮氣下)進行。
在有些情況下，取代的氨基乙醇呈現具有通過一個疏水體連接的兩個親水的極性頭(圖3)，且被稱為雙頭脂。因為位于兩邊的兩個親水的頭部可以面向水溶液，所以這些化合物可以在水中形成單層，而不是由帶著一頭基團的脂形成的雙層(圖3)。
在取代的氨基乙醇的另外的實施方案中，可以使用不同于如上所述的雙頭脂，其中取代的氨基乙醇具有帶有不同靜電荷的極性頭，例如一個正的和另一個負的或中性的，且它們可用于與核酸復合形成帶有陽離子電荷凈過量的核心復合物，但形成的該復合物具有中性或負的表面電荷。這種不同的極性雙頭脂可以用正的一頭與DNA結合，用負的或中性的一頭圍繞DNA在外部形成單層外殼，且因此具有優選的負或中性的表面電荷。而且，負的或中性頭部為固定載體其它組分提供了優選的部分。這些圖解表示在圖3.1-3.4中。
兩個頭部可以具有相同的或不同的電荷狀態、或pK值基本上不同的形式，例如伯胺和咪唑。頭部具有不同的電荷狀態的雙頭脂制劑具有獨特的性質。具有一個正性頭部和另一個負的或中性頭部的雙頭脂可使正性頭部與核酸結合，而負的或中性的頭部形成復合物面向水溶液的外表面(圖3)。使用核酸作為復合物形成的模板，正性的頭部結合并環繞它形成單層，導致形成帶有陰離子或中性表面的單層脂質體/核酸復合物。這種雙頭脂可以將質粒DNA，其它核酸，或任何帶負電荷的物質高效地密閉在內，得到負的或中性表面電荷，這可避免不利的生物學相互作用例如導致毒性的那些。
雙頭脂可以以其它方法修飾以便每個頭部基團具有不同的性質。例如，一頭可以與立體聚合物、與靶向配體、與融合部分，或與部分的組合例如在遠端帶有靶配體的立體聚合物綴合。圖3)。
第三類雙頭脂的兩頭都是負性的或都是中性的。這些可圍繞物質形成對于控制藥物動力學和生物分布有用的脂單層，如同使用例如脂質體和乳劑一樣。
適宜的陽離子化合物也包括精胺類似物。與精胺類似物形成的核心復合物優選包含膜破裂劑。在另外的實施方案中，與精胺類似物形成的核心復合物包含陰離子劑，以便使核心復合物具有負表面電荷。
用于本發明的適宜的聚合物包括聚乙烯亞胺(PEI)，且有利地為線型的PEI，聚賴氨酸，聚酰胺型胺類(PAMAM樹枝狀物(dendrimer)聚合物，US專利5,661,025)，線型聚酰胺型胺類(Hill等人，線型聚(酰胺型胺類)與DNA的物理化學相互作用和生物學特性，公開在Vector TargetingStrategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold SpringHarbor Laboratory 1999 meeting)，1999，第27頁))，硫酸魚精蛋白，多鹽(polybrine)，脫乙酰殼多糖(Leong等人J Controlled Release 1998 Apr；53(1-3)183-93)，聚甲基丙烯酸酯，聚胺(US專利5,880,161)和精胺類似物(US專利5,783,178)，聚丙烯酸甲酯及其衍生物例如聚[甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯](PDEAMA)(Asayama等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.26，#6236(1999)和Cherng等人，Eur JPharm Biopharm 47(3)215-24(1999))和聚(甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)(PDMAEMA)(van de Wetering等人，J Controlled Release 53145-53(1998))，聚(有機)磷腈(US專利5,914,231)，在此將它們全部并入作為參考。其它可以用于復合物的聚合物包括聚賴氨酸，(聚(L)，聚(D)，和聚(D/L))，含有兩親性氨基酸序列的合成肽例如“GALA”和“KALA”肽(Wyman TB，Nicol F，Zelphati O，Scaria PV，Plank C，Szoka FC Jr，Biochemistry 1997，363008-3017；Subbarao NK，Parente RA，Szoka FCJr，Nadasdi L，Pongracz K，Biochemistry 1987 262964-2972)和含有非天然的氨基酸包括D氨基酸和化學類似物例如peptoid的形式，含有咪唑的聚合物，以及完全合成的聚合物，它們可以結合和凝聚核酸。對于顯示這些性質的聚合物的分析包括使用物理測定方法例如DLS(動態光散射)和電子顯微鏡進行的對質粒DNA凝聚為微粒的測定。
在本發明中用作核心形成試劑的其它試劑包括具有以下通式結構的聚合物
其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，且R2是低級烷基；或通式結構 其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，且R2和R4獨立地是低級烷基。
在本發明中用作核心形成試劑的另外的試劑包括具有混合的陽離子和陰離子基團，以及在有些情況下負電荷過量的試劑，以致形成的復合物具有凈負電荷。這些試劑的實例是具有以下通式結構的那些 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，R2是低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴；或具有以下結構的試劑 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，R2和R4獨立地是低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。
核靶向部分外源性的核酸部分進行有效的轉錄和隨后的表達的主要障礙是需要核酸進入靶細胞的細胞核。有利地，當核酸有效負載的預定生物活性是在細胞核內時，本發明的核酸是“核靶向的”，即，它含有便于核酸通過核膜進入宿主細胞的細胞核的一個或多個分子，即核定位信號(“NLS”)。這種核靶向可以通過在核心復合物中引入核膜轉運肽，或核定位信號(“NLS”)肽，或提供相同NLS功能的小分子來實現。適宜的肽在以下文獻中描述，例如，US專利5,795,587和5,670,347和專利申請WO 9858955，它們在此全部引入作為參考，以及Aronsohn等人，J.Drug Targeting 1163(1997)；Zanta等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 9691-96(1999)；Ciolina等人，通過與核定位信號肽化學偶聯使質粒DNA靶向α-importin，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstractsfrom Cold Spring Harbor Laboratory 1999meeting)，1999，第20頁；Saphire等人，J Biol Chem；27329764(1999)。核靶向肽可以是核定位信號肽或核膜轉運肽，且它可以由天然氨基酸或非天然的氨基酸包括D氨基酸和化學類似物例如peptoid組成。NLS可以由氨基酸或它們的類似物以天然序列或反向序列組成。其它實施方案由結合類固醇受體的NLS部分組成，該部分激活受體從細胞質向核運輸，其中此運輸攜帶帶有受體的核酸進入細胞核(Ceppi同上)。
在另外的實施方案中，NLS是用使核心復合物指向細胞核的方式固定在核心復合物上的，其中NLS允許核酸進入細胞核。
在一個實施方案中，NLS通過與核酸結合并入載體中，且此結合在細胞質內得以保留。這使由于與核酸的分離造成的NLS功能的損失最小，且可確保將高水平的核酸遞送到細胞核。此外，當遞送核酸后，與核酸的這種結合并不抑制核酸在核內的預定生物活性。
在另一實施方案中，核酸有效負載的生物活性的預定靶是細胞質或細胞質中的細胞器，例如核糖體，高爾基體或內質網。在這種實施方案中，定位信號包括在核心復合物中或固定在核心復合物上，以致它可指導核酸進入到核酸能發揮其活性的預定位置?？梢詫崿F這種靶向的信號肽是本領域已知的。
融合部分融合層可促進載體與靶細胞的細胞膜融合，便于核酸有效負載進入細胞。如上所述，融合部分可以直接地并入在核心復合物本身中，或可以被固定到核心復合物上。在一種實施方案中，融合層包含促進融合的元件。這種元件以允許大分子或顆粒跨膜運動的方式，或以允許膜破裂以致通過膜隔離的含水相可以自由地混合的方式與細胞膜或內體膜相互作用。適宜的融合部分的實例包括膜表面活性劑肽例如病毒融合蛋白質例如流感病毒的血凝素(HA)，或來源于毒素例如PE和篦麻毒素的肽。其它實例包括允許細胞運輸的序列例如HIV TAT蛋白和觸角足(cantennapedia)或來源于眾多其它物種的序列，或顯示pH值敏感性質的合成聚合物例如聚(乙基丙烯酸)(Lackey等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.1999，26，#6245)，N-異丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物(Meyer等人，FEBSLett.42161(1999))，或聚(酰胺型胺類)，(Richardson等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.1999，26，#251)，和當與靶細胞或內體結合時被釋放在水相中的脂類試劑。適宜的膜表面活性劑肽包括流感病毒血凝素或病毒融合肽例如Moloney鼠白血病病毒(“MoMuLV”或MLV)包膜(env)蛋白或水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白。
有利地，可以使用MoMuLV env蛋白的鄰近膜的細胞質域。該域在多種病毒中是保守的且含有膜誘導的α-螺旋。
對于本發明適宜的病毒融合肽包括來自病毒包膜蛋白胞外結構域的融合肽，病毒包膜蛋白近膜域的使膜去穩定的肽，所謂的病毒“融合”蛋白的疏水域肽片段，和含有兩親性區域的肽。適宜的含有兩親性區域的肽包括蜂毒肽，爪蟾抗菌肽，來自流感嗜血菌血凝素(HA)蛋白的融合片段，來自HIV1 gp41的胞質尾區的HIV片段，和來自于病毒env膜蛋白質的兩親性片段，包括來自禽白血病病毒(ALV)，牛白血病病毒(BLV)，馬傳染性貧血病病毒(EIA)，貓免疫缺陷病毒(FIV)，肝炎病毒，單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白H，人呼吸道合胞體毒(hRSV)，Mason-pfizen猴病毒(MPMV)，勞氏肉瘤病毒(RSV)，副流感病毒(PINF)，脾壞死病毒(SNV)和水泡性口膜炎病毒(VSV)的兩親性片段。其它適宜的肽包括微生物的和爬行動物的細胞毒素肽。最有用的具體肽或其它分子可以使用以下四種分析確定1)破壞由細胞膜脂或細胞膜碎片組成的脂質體和誘導水性標記物從其中滲漏的能力，2)誘導由細胞膜脂或細胞膜碎片組成的脂質體融合的能力，3)具有誘導被加入到組織培養細胞中的顆粒的細胞質釋放的能力，以及4)當局部或全身給藥時具有通過體內組織提高質粒表達的能力。
融合部分還可以由聚合物組成，包括肽和合成聚合物。在一種實施方案中，肽聚合物包括含有兩親性氨基酸序列的合成肽例如“GALA”和“KALA”肽(Wyman TB，Nicol F，Zelphati O，Scaria PV，Plank C，Szoka FC Jr，Biochemistry 1997，363008-3017；Subbarao NK，ParenteRA，Szoka FC Jr，Nadasdi L，Pongracz K，Biochemistry 1987 262964-2972或Wyman同上，Subbarao同上)。其它肽包括非天然的氨基酸，包括D氨基酸和化學類似物例如peptoid，含有咪唑的聚合物。適宜的聚合物包括帶有間歇的羧酸官能團的有氨基或咪唑部分的分子，例如在內或外部形成“鹽-橋”的那些，包括其中的橋是pH值敏感的形式?？梢允褂玫钠渌酆衔锇ɑ蛘咴诰酆衔飪然蛘咴诰酆衔镩g具有二硫橋鍵的那些聚合物，由此二硫橋阻斷融合，然后該橋在組織或細胞內區室內斷裂以使在所需要的位置表達融合的性質。例如，與帶正電荷的融合聚合物形成弱靜電相互作用中和了正電荷的聚合物，可以通過這兩個分子之間的二硫橋固定在適當位置，而這些二硫化物在內體內斷裂以致這兩個分子分離釋放出正電荷和融合活性。這類融合劑的其它形式具有定位在同一分子的不同片段上的兩種性質，因此橋是分子內的以致使其裂解會導致分子中的結構改變。這類融合劑的另一個形式具有pH值敏感的橋。
其它可以使用的聚合物包括帶有間歇的羧酸官能團含有氨基或咪唑部分的分子，例如在內或外部形成“鹽-橋”的那些，包括其中的橋是pH值敏感的形式。在一種實施方案中，聚合物具有如下所示的化學結構。

其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，R2是如上所述的低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。在一種實施方案中聚合物被設計成帶有過量的正電荷，例如當R1含有胺或胍鹽且R3含有羧基、其中X與Y大約相等或大于Y時，或當R1含有咪唑且R3含有羧基、其中X大于Y時。在另外的種實施方案中聚合物被設計成帶有過量的負電荷，所以典型地Y大于X。在又一個實施方案中聚合物被設計成帶有接近中性的凈電荷，且相應地調節X與Y的比值。
在另外的實施方案中，聚合物具有如下所述的化學結構。
其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，R2和R4獨立地是如上所述的低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。在一種實施方案中聚合物被設計成帶有過量的正電荷，例如當R1含有胺或胍鹽且R3含有羧基、其中X與Y約相等或大于Y時，或當R1含有咪唑且R3含有羧基、其中X大于Y時。在另外的種實施方案中聚合物被設計成帶有過量的負電荷，所以典型地Y大于X。在又一個實施方案中聚合物被設計成帶有接近中性的凈電荷，且相應地調節X與Y的比值。
融合部分還可以包含膜表面活性劑聚合物-脂綴合物。適宜的綴合物包括ThesitTM，Brij 58TM，Brij 78TM，Tween 80TM，Tween 20TM，C12E8，C14E8，C16E8(CnEn＝烴聚(乙二醇)醚，其中C代表碳長度N的烴，而E代表聚合度為N的聚(乙二醇))，Chol-PEG900，含有聚唑啉或其它親水聚合物替代PEG的類似物，和具有碳氟化合物替代烴的類似物。有利地，聚合物將或是可生物降解的或是具有足夠小的分子量，以致它可以不用新陳代謝進行排泄。技術人員將認識到在沒有偏離本發明的精神的情況下也可以使用其它融合部分。
核心復合物的組裝有利地，當在適當的條件下混合組分時，核心復合物將是自組裝的。制備核心復合物的適宜條件通常允許在混合結束時以電荷摩爾過量出現的帶電荷成分在混合中一直過量。例如，如果最終的制劑是凈負電荷過量的，那么將陽離子試劑混合到陰離子試劑中以使形成的復合物決不具有凈過量的陽離子試劑。制備核心復合物的其它適宜條件使用連續混合方法，包括在靜態混合器中混合核心組分。靜態混合器在流入和流過固定裝置的兩股或多股液流中產生湍流以及優選地低剪切力混合，導致存在于裝置中的液體混合。對于核心復合物，當核酸易受剪切力破壞時，低剪切力混合是格外重要的。具體地，將核酸的水溶液和核心復合物形成部分(例如陽離子脂)一起加進靜態混合器中(例如，可以從American Scientific Instruments，Richmond，CA獲得)，在混合器中液流被分成內部和外部螺旋液流，它們在若干不同的點相交形成湍流且由此促進混合。使用可商購的靜態混合器可保證得到的結果是與操作者無關的，且是可按比例放大的(scalable)，可重復的和可控制的。這樣產生的核心復合物顆粒是均勻的，穩定的和可以無菌過濾的。當希望核心復合物包含核靶向部分和/或融合部分時，這些組分可以直接地加入到進入靜態混合器的液流中，以便在核心復合物形成時它們自動地結合進核心復合物中。
組分的液流在混合器中相交，由此引起DNA和聚合物的剪切和混合，由此形成DNA和聚合物的復合物顆粒?？梢允褂美鏑oulter N4 PlusSubmicron Particle Sizer(Coulter公司，Miami，Florida)通過動態光散射對得到的制劑的納米級平均粒徑和分布加以測定。平均粒徑和標準差可以通過單眾數(unimodal)和粒徑分布方法(SDP)或“強度”方法測定。
在上述方法中，激光對準通過顆粒制劑。動態光散射是以顆粒的布朗運動的結果進行測量的。然后使測定的動態光散射與粒徑建立相關性。在單眾數方法中，粒徑分布通過將粒徑置于高斯曲線上測定。在SDP方法中，粒徑分布通過叫做CONTIN的FORTRAN程序確定。這些方法在CoulterN4 Plus Submicron Particle Sizer參考手冊(1995年十一月)中還有進一步描述。
當融合部分不是直接地引入到核心部分時，它典型地以一種圍繞或包圍核心復合物的殼的狀態呈現。在此情況中，融合殼是通過靜電、共價或疏水相互作用、或通過這些力的組合被固定到核心復合物上的。當融合部分是通過靜電固定的時，它通過電荷-電荷相互作用或與核酸，或與復合物形成試劑，或與兩者的電荷基團相互作用。多價靜電相互作用的存在提供了結合穩定性，并且適應于在靶組織和細胞內的適當釋放。一種具體的形式是融合肽序列與陽離子肽序列偶聯在一起，其中陽離子序列可確保肽在核心復合物形成時結合進入核心復合物中，或在核心復合物形成之后使它結合到帶負電荷的核心復合物的表面上。這類部分及其并入的實例是將由14個賴氨酸殘基的線性序列組成的肽包括在內，且該序列與來自流感嗜血菌HA蛋白的融合域的短疏水性氨基酸序列偶聯，如實施例46所示。其它實例包括合成的陽離子聚合物的使用，例如與融合片段聚合物偶聯的PEI，例如聚[甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯](PDEAMA)或N-異丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物。
當融合部分是用疏水性相互作用固定的時，它包含與核心復合物以一定的方式相連接的片段或部分，以致該連接可減少與水溶液的接觸并由此減少固定復合物的能量。在一種實施方案中，固定疏水性相互作用是在融合部分的烴部分和核心復合物的烴部分之間發生的。一種使用疏水性固定的具體形式是二?；c融合部分綴合，其中脂部分與使用陽離子脂形成的核心復合物產生強烈相互作用。在另外實施方案中，固定疏水相互作用是在融合部分的碳氟化合物部分和核心復合物的碳氟化合物部分之間發生的。使得能進行適合固定的其它形式疏水相互作用力是可以的。
當融合部分與核心復合物共價連接時，發生與以下物質的共價偶聯(1)復合物形成試劑；(2)在復合物形成的時候可結合進復合物的化合物；(3)預先形成的復合物的表面；或(4)與預先形成的復合物的表面相連的化合物。在一種實施方案中優選在載體進入靶組織或細胞時使該鍵斷裂。可以通過使用可斷裂的鍵來錨定融合層，實現該斷裂。實例包括(1)對酸敏感的鍵，例如席夫堿或腙或乙烯醚；(2)可還原的鍵例如二硫鍵；或(3)如下所述用于連接外部立體層的銜接物的一種。對酸敏感的銜接物在靶組織或細胞內區室，例如內體結構(在通過大多數機制進行細胞吸收后載體將首先被運輸至其中)中常占優勢的酸性條件下斷裂。在一種實施方案中，融合層具有疏水性質，因此它形成了其中水被大量地排除的一層。當在核心復合物上形成這種層時，它可以通過眾多可能的方法產生，例如與復合物形成試劑一起加入，其中該層通過自組裝形成，或在核心復合物已經形成后在第二步中加入。在一種實施方案中，該層是在核心復合物形成的同時形成的，如實施例38-43的舉例說明。在另外的實施方案中，該層是通過第二混合步驟形成的，其中核心復合物在第一混合步驟中形成，然后該層通過隨后核心復合物和在預存在的復合物上形成該層的試劑之間的混合步驟加入。
在本發明的一種實施方案中，優選使用表面電荷是負性的或中性的核心復合物。在此實施方案中，外殼賦予被靶組織和細胞結合和吸收的性質，這與陽離子復合物-陰離子細胞靜電結合機理不同，一般認為靜電結合機理提供了通過正電荷核心復合物的結合和吸收。通過允許使用具有中性或負性表面電荷的核心復合物，可以實現很多好處。與正表面電荷載體膠體的靜電相互作用的減少或消除可以減少或除去導致吞噬細胞清除、非靶組織和器官中的毒性和靶組織和器官中的細胞毒性的非特異性相互作用。
應該理解本發明不限于治療任何特定的疾病或病癥。
可以體內給予動物包括編碼治療劑的核酸序列的顆粒，作為基因治療法的有效性研究的動物模型的一部分?？梢砸圆煌膭┝繉ν瑯游锓N的不同動物給予顆粒，由此該顆粒將在動物中轉染細胞。然后對動物進行關于所需治療劑在動物體內的表達的評價。人們可以從這些評價中獲得的數據確定給予人類患者的顆粒的量。
在另一實施方案中，可以使用顆粒體外轉染細胞?，F已包括了編碼治療劑的核酸序列的細胞，可以給予例如在上文描述的宿主，以便在宿主中表達治療劑和/或提供治療效果?？梢员晦D染的細胞和給藥的方法可以選自在上文中描述的那些。
也可以使用本發明的顆粒來體外轉染器官的細胞?，F已包括了包含編碼治療劑的核酸序列的動物細胞的器官，可以被移植到動物中，借此移植器官在動物中表達治療劑和/或在動物中提供治療效果。動物可以是哺乳動物，包括人和非人類的靈長類。
也可以使用本發明的顆粒來體外轉染細胞，所述細胞包含在含有細胞混合物的細胞培養物中。在體外轉導細胞后，細胞在體外產生治療劑或蛋白。然后可以通過為本領域技術人員所知的方法從細胞培養物中獲得治療劑或蛋白。
也可以使用該顆粒來體外轉染細胞，以便研究體外細胞遺傳工程的機理。
外殼部分人們知道聚乙二醇(PEG)，一種不帶電的親水聚合物，可以為寡核苷酸/陽離子脂復合物提供立體屏障(Meyer等人，J.Biol.Chem.27315621(1998)；Scaria同上，Philips同上)。本發明通過提供固定到核心復合物上的屏障，對常規使用的立體屏障加以改進。該屏障也可以可選地包含提高載體與靶組織和細胞結合的靶向部分，該靶向部份還可以可選地經由一種連接固定，該連接在靶組織或當細胞吸收后載體典型地首先被運輸到其中的細胞內區室中斷裂。
在將核心復合物固定到融合殼部分的實施方案中，外部立體層又被固定到核心復合物、融合殼、或兩者上，如下所述。在融合部分直接地結合在核心復合物中的實施方案中，立體層是被直接固定到核心復合物上的。
外部立體層優選包含親水的可生物降解的聚合物。如果聚合物不是可生物降解的，那么使用相對低分子量的(＜30k道爾頓)聚合物。聚合物也可以在極性和非極性的溶劑兩者中顯示出溶解性。適合聚合物包括為本領域所熟知的PEG(各種分子量的)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和聚乙烯醇，聚乙烯基甲基醚，聚甲基丙烯酸羥丙基酯，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚丙烯酸羥乙基酯，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，聚乳酸，聚乙二醇，聚甲基唑啉，聚乙基唑啉，聚羥乙基唑啉，聚羥丙基唑啉，或聚天冬酰胺(US專利5,631,018)。
其它適宜的聚合物包括可在膠體顆粒上形成至少5納米“厚”或更厚的(通過ζ電位降低(Woodle等人，Biophys.J.61902(1992))或其它此類分析確定的)立體屏障的那些聚合物。另外適宜的聚合物包括包含支鏈的聚合物。在一種實施方案中，將葡萄糖部分的羥基官能團用于綴合多個立體聚合物，其中一個立體聚合物被固定到核心復合物上。在另外的實施方案中，將賴氨酸的胺官能團用于綴合兩個立體聚合物，且羧基官能團與立體聚合物銜接物一起用于綴合在核心復合物上。
當用PEG作為親水聚合物綴合物時，PEG優選具有約1,000到約50,000道爾頓的分子量。典型地，PEG鏈具有約2,000到約20,000道爾頓的分子量。還可以使用混合分子量，這對于將發現在聚合物中最好的立體性質(例如阻斷細胞相互作用)與發現在小聚合物中最好的立體性質(例如阻斷小蛋白質相互作用)加以結合具有特定的優點。當使用在末端沒有配體的PEG偶聯時，PEG在其游離端包含隋性甲氧基，并通過反應性的化學基團與連接的片段偶聯在一起。制備這種連接物的方法是為本領域所熟知的，如在有關綴合的最近的教科書中所概括的(Greg T.Hermanson，Biconjugate techniques，Academic Press Inc.，San Diego，1996)。
可供選擇的聚合物包括，但不局限于，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基丙烯酰胺，聚乙基唑啉，聚甲基唑啉，聚二甲基丙烯酰胺，聚乙烯基甲基醚，聚甲基丙烯酸羥丙基酯，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚丙烯酸羥乙基酯，聚羥乙基唑啉，聚羥丙基唑啉，或聚天冬酰胺。如以上對于PEG所述的，當在末端沒有配體時用于偶聯時，這些親水聚合物每個都優選在其游離端的具有不起反應的基團或羥基，且通過反應性的化學基團與連接的片段偶聯在一起。
固定是通過靜電的，共價的或疏水性的相互作用提供的，或是通過這些力的組合提供的。當外殼是通過靜電固定的時，它通過電荷-電荷相互作用與位于核酸或復合物形成試劑上的電荷基團相互作用，或與兩者都發生相互作用。多價靜電相互作用的存在不但提供了結合穩定性，并且可允許在靶組織和細胞內的適當的釋放。當外殼是通過疏水性相互作用固定的時，它包含與核心復合物以可減少與水溶液的接觸并由此減少固定復合物的能量的方式相連接的片段或部分。在一種實施方案中，固定用疏水性相互作用是在外殼的烴部分和核心復合物的烴部分之間發生的。在另外的實施方案中，固定用疏水性相互作用是在外殼的碳氟化合物部分和核心復合物的碳氟化合物部分之間發生的。使得能進行適當固定的其它形式疏水相互作用力是可以的。在一種實施方案中，這種疏水性的錨由可結合和插入脂雙層的肽序列組成例如包括來自膜蛋白質例如細胞色素b5的序列(Thr-Asn-Trp-Val-Ile-Pro-Ala-Ile-Ser-Ala-Val-Val-Val-Ala-Leu-Met-Tyr-Arg-Ile-Tyr-Thr-Ala)或跨膜序列的膜錨定域。
當外殼是與核心復合物以共價鍵聯系的時，這是通過與復合物形成試劑的共價偶聯，或者通過與在復合物形成的時候可結合進復合物的化合物的共價偶聯，或者通過與預先形成的復合物的表面的共價偶聯，或者通過與和預先形成的復合物的表面相連接的化合物的共價偶聯來實現的。在一種實施方案中優選該鍵在載體進入靶組織或細胞時斷裂。這種斷裂可以通過將外殼經由可裂的鍵固定來實現，這些鍵的例子有酸不穩定鍵，例如席夫堿或腙、乙烯醚，或可還原的鍵例如二硫鍵，或如下所述用于連接外部立體層的銜接物的一種。對酸敏感的銜接物在靶組織或細胞內區室，例如通過大多數機制被細胞吸收后載體首先被運輸進其中的內體結構中占優勢的酸性條件下斷裂。在一種實施方案中，融合層具有疏水性，因此它形成了其中水被大量排除的一層。當這種層在核心復合物上形成時，它可以通過眾多可能的方法產生，例如與復合物形成試劑一起加入且該層通過自組裝形成，或在核心復合物已經形成后在第二步中加入。
在另一實施方案中，聚合物和配體一起使用。配體由用于與靶組織和細胞結合以致核酸有效負載可發揮其生物活性的分子組成。適宜的配體包括蛋白質，肽，和它們的化學類似物，碳水化合物，和小分子。在一種實施方案中，配體是以類似于融合部分或立體聚合物的方式與核心復合物連接的。在另外的實施方案中，配體與末端和核心復合物偶聯的立體聚合物連接。配體的適宜連接包括穩定的共價鍵，可斷裂的鍵，和可在所需要的結合事件發生以前保留配體的非共價連接。
靶向部分為提高載體與靶組織或細胞的結合，外殼層有利地包括至少一種可使載體與靶組織或細胞發生高度專一的相互作用的靶向部分。更具體地說，在一種實施方案中，載體優選將包括附著于外層的未屏蔽的配體，該配體可有效地使配體專一性地與在靶組織和細胞表面上的受體分子結合。(Woodle等人，Small molecule ligands for targeting long circulatingliposomes，in Long Circulating LiposomesOld drugs，new therapeutics，Woodle and Stormed.，Springer，1998，第287-295頁)在另外的實施方案中，載體優選將包括連接在外層內或核心復合物的表面的屏蔽的配體，當外層在確定的組織或靶條件下失去時，露出配體以使它可以與靶組織或細胞結合。根據作為靶的細胞類型，載體可以包括兩個或多個靶向部分。使用多個(兩個或多個)靶向部分可以為細胞靶向提供額外的選擇性，以及可以有助于載體與靶細胞以較高的親合性和/或親合力結合。當在載體上存在一個以上靶向部分時，靶向部分的相對摩爾比可以進行改變以提供最佳的靶向效率。用這種方式最佳化細胞結合和選擇性的方法是本領域已知的。技術人員也將意識到，測定細胞選擇性和結合的親合性及效率的方法是本領域已知的，且可使用這些方法最佳化靶向配體的性質和數量。
適宜的配體包括，但不局限于用于靶向內皮細胞的血管內皮細胞生長因子；用于靶向血管損傷和腫瘤的FGF2；用于靶向腫瘤的促生長素抑制素肽；用于靶向腫瘤的鐵傳遞蛋白；用于腫瘤靶向的促黑激素(αMSH)肽；用于低密度脂蛋白受體靶向的ApoE和肽；用于靶向暴露的膠原的馮·維勒布蘭德氏因子和肽；用于靶向柯薩奇-腺病毒受體(CAR)表達細胞的腺病毒尾絲蛋白和肽；用于靶向Neuropilin 1的PD1和肽；用于靶向EGF受體表達細胞的EGF和肽；以及用于靶向整聯蛋白表達細胞的RGD肽。
其它實例包括(i)葉酸，其中該組合物旨在治療具有細胞表面葉酸受體的腫瘤細胞，(ii)吡哆?；?，其中該組合物旨在治療病毒感染的CD4+淋巴細胞，或(iii)唾液酸-Lewis°，其中該組合物旨在治療炎癥區域。其它肽配體可以使用例如噬菌體展示(F.Bartoli等人，分離針對組織特異性細胞表面受體的肽配體，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic GeneDelivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p4)和微生物展示(Georgiou等人，從展示在微生物表面的文庫通過FACS篩選出的超強親合性抗體，in Vector Targeting Strategies forTherapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring HarborLaboratory 1999 meeting)，1999，p3.)的方法鑒定。用這樣的方式確定的配體適合于在本發明中使用。
在特定的實施方案中，靶向配體可以是促生長素抑制素或促生長素抑制素類似物。促生長素抑制素具有序列AGCLNFFWKTFTSC，且在半胱氨酸殘基之間包含二硫橋。許多與促生長素抑制素受體結合的促生長素抑制素類似物是本領域已知的，且適合于在本發明中使用。見例如US專利5,776,894，其在此全部作為參考引入。可用于本發明的具體促生長素抑制素類似物是具有以下通式結構的類似物F*CY-(DW)KTCT，其中DW是D-色氨酸，F*表示可能具有D-或L-絕對構型的苯丙氨酸殘基。作為促生長素抑制素本身，這些化合物由于在半胱氨酸殘基之間的二硫鍵而是環狀的。有利地，這些類似物可以在苯丙氨酸殘基的游離氨基處衍生，例如用多陽離子部分例如賴氨酸殘基鏈進行衍生。熟練的技術人員將承認本領域已知的其它促生長素抑制素類似物可以有利地用于本發明。
此外，已經研制了形成可引起強的和選擇性的與靶組織和細胞的結合的新肽序列的方法，例如“DNA改組”(W.P.C.Stremmer，通過DNA改組定向進化酶和途徑，in Vector Targeting Strategies for TherapeuticGene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999meeting)，1999，p.5.)且這些新序列肽是本發明適宜的配體。配體的其它化學形式是適合于本發明的，例如以許多形式存在而且是細胞通常使用的配體的天然碳水化合物(Kraling等人，Am.J.Path.1501307(1997)以及新的化學物種，其中一些可以是天然的配體的類似物例如D-氨基酸和擬肽(peptidomimetics)，其它是通過藥物化學技術例如組合化學確定的(P.D.Kassner等人，通過表達鑒定配體(LIVEV)從組合文庫中直接篩選靶向配體，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p8.)。
靶向層是由暴露在復合物表面、或者核心復合物表面、融合層的表面或保護性立體層的表面的可提供對所需要的組織和細胞進行專一性結合的配體組成的。配體是共價地附著于膠體的，以致它們的暴露對于組織和細胞結合是足夠的。固定是通過與復合物形成試劑的共價偶聯，或者通過與在復合物形成的時候可結合進復合物中的化合物的共價偶聯，或者通過與預先形成的復合物的表面的共價偶聯，或者通過與預先形成的復合物的表面的相連結化合物的共價偶聯來實現的。
例如肽配體可以被共價地偶聯到立體聚合物例如聚唑啉上，該聚合物在其遠端與多聚陽離子例如線型的PEI共價偶聯。PEI將與核酸有效負載形成分層的膠體復合物，形成一種肽配體暴露在表面上的立體聚合物表面殼。做為選擇，該相同的肽綴合物可以與多聚陽離子例如線型的PEI或陽離子脂在含水溶液中結合，然后用于將核酸有效負載凝聚到分層的膠體中，配體暴露在表面立體聚合物殼上。
做為選擇，該相同的肽綴合物可以與核酸有效負載的帶負電荷的復合物復合，該核酸有效負載使用多聚陽離子或陽離子脂至少部分凝聚，得到分層的膠體，配體暴露在表面立體聚合物殼上。類似地，肽配體可以與立體聚合物例如聚唑啉共價偶聯，該聚合物是與脂在其遠端共價偶聯的，且該綴合物可以按以上所述與包含核酸有效負載的多聚陽離子和/或陽離子脂和/或中性或負性脂膠體一起使用。
在外層上存在的靶分子的數目將根據以下因素而不同，例如配體-受體相互作用的親合力，受體在靶組織和細胞表面的相對豐度，以及靶組織和細胞的相對豐度。然而，在每個載體的表面上有25-100個靶向分子通?？商峁┻m宜的對細胞靶向的增強作用。
靶向部分的存在導致與靶組織和細胞的結合獲得所需要的增強。用于這種結合的適當的分析法可以是ELISA平板分析法，細胞培養物表達分析法，或任何其它的結合分析法。結合的一個實例見實施例48以及圖25和26。
外殼部分的固定如上所述，外殼部分的外部立體層可以被固定到內部的融合層，或核心復合物，或兩者上。這種固定可以是通過靜電的，共價的或疏水性的相互作用，或這些力的組合實現的。當外殼是通過靜電固定的時，它通過電荷-電荷相互作用或與核酸，或與復合物形成試劑，或與兩者的電荷基團發生相互作用。多價靜電相互作用的存在提供了結合穩定性，并且可允許在靶組織和細胞內的適當的釋放。當外殼是用疏水性相互作用固定的時，它包含與核心復合物以可減少與水溶液的接觸并由此減少固定復合物的能量的方式相連結的片段或部分。
在一種實施方案中，這些錨由連結并插入脂雙層的肽序列組成，例如包括來自膜蛋白質例如細胞色素b5的序列(Thr-AsnTrp-Val-Ile-Pro-Ala-Ile-Ser-Ala-Val-Val-Val-Ala-Leu-Met-Tyr-Arg-Ee-Tyr-Thr-Ala)或跨膜序列的膜錨定域。在一種實施方案中，固定用疏水性相互作用是在外殼的烴部分和核心復合物的烴部分之間發生的。在另外的種實施方案中，固定用疏水性相互作用是在外殼的碳氟化合物部分和核心復合物的碳氟化合物部分之間發生的。使得能進行適當固定的其它形式疏水相互作用力是可以的。
當外殼是與核心復合物以共價鍵連接的時，發生以下共價偶聯(1)與復合物形成試劑；(2)與在復合物形成的時候可結合進復合物的化合物；(3)與預先形成的復合物的表面；或(4)與預先形成的復合物的表面的相連接化合物進行的共價偶聯。
當外殼通過共價鍵固定到融合層上時，該鍵可以是穩定的，且在這種實施方案中，外層將與融合層一起在細胞進入時脫落。穩定的鍵的一個實例是氨基甲酸酯鍵。在另外的實施方案中，優選鍵在載體進入靶組織或細胞時斷裂。在一種實施方案中，融合層具有疏水性，因此它形成了其中水被大量排除的一層。當這種層在核心復合物上形成時，它可以通過眾多可能的方法產生，例如與復合物形成試劑一起加入，其中該層通過自組裝形成或在核心復合物已經形成后在第二步中加入。
當外層直接地固定到核心復合物上時，優選它在內體中占優勢的條件下是可斷裂的。該斷裂可以通過借助于可斷裂的鍵例如對酸敏感的鍵或可還原的鍵例如二硫鍵固定外殼來實現。對酸敏感的銜接物在靶組織或細胞內區室，例如細胞吸收后載體首先被運輸進其中的內體結構中占優勢的酸性條件下斷裂。適宜的可斷裂的鍵包括二硫鍵，以及對酸敏感的鍵例如席夫堿、或腙、或乙烯醚。例如，核心復合物可以包含游離的胺基，且立體層可以包含側醛基。將核心復合物與立體層組分混合將導致在核心復合物和立體層之間希夫堿的形成。做為選擇，例如，二硫鍵可以在分別存在于核心復合物和立體層上的游離的巰基之間形成。在優選的實施方案中，可斷裂的鍵層包含pH值敏感的共價鍵。更優選，該pH值敏感的共價鍵選自 載體的給藥方法載體是通過全身和局部注射途徑胃腸外給藥的，它們也可以離體給藥。
載體的體外和體內試驗本發明載體的體外試驗方法是為本領域所熟知的。例如，可以如實施例35和44中所述的測定它們向培養物中細胞和組織進行遞送的能力，或可以如實施例40和42中所描述的測定它們的膠體和物理化學性質。
本發明載體的體內效果的測定方法是為本領域所熟知的。例如，當載體用于治療哺乳動物的疾病時，載體的效果可以通過研究該疾病的一或多種癥狀的改善確定。有利地，體內效果可以使用對疾病的進程或程度特征性的規定臨床終點(clinical end poit)進行的測定。
在本發明的意義內如果基因遞送載體能夠將核酸轉移到體外或體內的細胞或組織中，則它表現出體外或體內的“融合活性”。然而，融合活性也可以通過不依賴于對通過載體轉移的核酸的測定的本領域已知方法評價。例如，在下面文獻中使用的方法Lackey等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.1999，26，#6245；Meyer等人，FEBS Lett.42161(1999)以及Richardson等人，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.1999，26，#251，可以用來評價本發明載體的融合活性。作為本領域技術人員的一般參考書，當考慮與膜融合有關的期刊時，將會考慮以下文獻H.Hilderson和S.Fuller編，系列編輯J.Robin Harris，生物膜的融合和相關問題SubcellularBiochemistry Vol.34.，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York 2000。在該卷中特別參考H.Kubista，S.Sacre，和S.E.Moss，膜聯蛋白和膜融合，p73-131；P.Collas和D.Poccia，核膜組裝過程中的膜融合事件，第273-302頁；Y.Gaudin，融合蛋白構象改變的可逆性彈狀病毒誘導的膜融合中的有趣事件，379-408頁。此外，P.Collas和D.Poccia，Dev Biol.1995 May；169(1)123-35以及P.Collas和D.Poccia，Methods Cell BioL 1998；53417-52描述了融合活性的測定。使用共振能量轉移來監測膜融合進一步地在下面文獻中描述Pecheur EI，Martin I，Ruysschaert JM，BienvenueA，Hoekstra D.Biochemistry 37，2361-2371(1998)以及Struck DK，Hoekstra D，Pagano RE.Biochemistry 20，4093-4099(1981)。如果用FRET技術來評價本發明載體的融合活性，優選與非融合的對照載體相比，測到的輸出信號增加至少2倍、更優選至少3倍，以及更優選至少4倍。
如果將細胞與載體接觸能夠導致轉移的核酸在所述細胞或組織中體外或體內表達，則基因遞送載體顯示了體外或體內的“生物活性”。本發明載體的融合活性和/或生物學活性的測定方法是為本領域所熟知的，且進一步在下文的實施例中描述。特別地，依賴于對載體遞送的標志基因所編碼的基因產物進行直接或間接鑒定的方法適于評價本發明的載體是否顯示出了生物學活性。優選至少5％與本發明的載體在體外接觸的細胞表達標志基因。更優選表達率為與本發明的載體體外接觸的細胞的至少20％，50％和80％。如果用本發明的載體體外或體內處理組織，優選至少5％的細胞，優選至少20％，50％和80％所述組織的實質細胞表達標志基因。任何編碼可檢測的基因產物的基因均可以充當適宜的標志基因。適宜的標志基因的選擇被認為是在本領域技術人員常規能力范圍之內。
本發明的這些及其它特征和優點將通過下面的實施例得到更全面的地了解，實施例僅僅是為了舉例說明性的目的而提供的，沒有意圖限制本發明的范圍。
下面的實施例舉例說明本發明；溫度以攝氏溫度給出。使用下面的縮寫BOC＝叔丁氧羰基；THF＝四氫呋喃；己烷＝正己烷；醚＝乙醚。
關于命名法當給不同的氮原子編號時，末端氨基氮被當做末端碳原子的取代基，而非末端氮原子被解釋為CH2基團的氮雜取代且被相應地編號。因此例如在精胺中的4個氮原子被指定為N1，N4，N9和N121 4 9 12H2N-CH2-(CH2)2-NH-(CH2)4-NH-(CH2)2-CH2-NH2(1，12-二氨基-4，9-二氮雜十二烷)實施例1N4-[(2-羥基)-正十四基]-亞精胺三鹽酸鹽將6克(0.1646摩爾)氯化氫的50毫升乙酸乙酯溶液在攪拌下，在室溫下，加入到8.8克(0.0158摩爾)N1，N8-二-BOC-N4-[(2-羥基)-正-十四基]-亞精胺的50毫升乙酸乙酯溶液中。攪拌1.25小時后，過濾從反應混合物中沉淀出的晶體。將吸濕的粗產物溶于水，然后在裝有Amberlite XAD 1180吸附劑樹脂的柱上層析(水中)，由此首先以水洗脫然后以水與異丙醇(9∶1或3∶1)的混合物洗脫。將包含產品的組份合并，在水噴真空(water jetvacuum)下濃縮，然后在高真空下冷凍干燥。以含水量4.25％的冷凍干燥物形式獲得標題化合物，Rf0.25[薄層色譜板硅膠60F254；溶劑二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(10∶3.5∶1)]。
如下制造原料化合物a)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥基)-正-十四基]-亞精胺將12.49克(0.05摩爾)的1，2-十四烯氧化物(85％)加入到17.27克(0.05摩爾)N1，N8-二BOC-亞精胺的200毫升乙醇溶液中。將反應混合物在回流下加熱2小時，然后進一步地加入3.44克(0.01377摩爾)1，2-十四烯氧化物。在回流下加熱16.5小時之后，將反應混合物通過蒸發濃縮。通過快速層析在粒徑0.04-0.063毫米的硅膠上提純油狀的粗產物。將已經用二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1)洗脫的包含產品的組份合并通過在真空下蒸發濃縮。以油的形式獲得標題化合物，Rf0.80[溶劑二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(40∶10∶1)]。
b)N1，N8-二BOC-亞精胺在0-5℃氮氣下于2小時內在攪拌下將221.67克(0.90摩爾)2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯基乙腈的630毫升四氫呋喃溶液滴加到65.34克(0.45摩爾)亞精胺的630毫升四氫呋喃溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，然后通過真空蒸發濃縮，然后將油狀的殘余物在乙醚與稀鹽酸(pH值3)之間分配。用30％氫氧化鈉溶液(pH值10)將包含鹽酸的相處理為堿性，將想要的產品用乙醚提取，用飽和氯化鈉溶液洗滌乙醚提取物，用硫酸鈉干燥有機相，并通過在真空下蒸發濃縮。從乙醚-己烷將殘余物重結晶之后，得到標題化合物，熔點85-86℃。通過濃縮母液，得到第二批標題化合物，熔點78-82℃。
實施例2N4-[(2-羥基)-正-十四基]-亞精胺三草酸鹽將10.17克(0.08067摩爾)的草酸二水合物在90毫升水中的溶液攪拌下加入到15克(0.02689摩爾)的N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥基)-正-十四基]]-亞精胺(實施例1a)的30毫升乙醇溶液中。在90℃下攪拌反應混合物5小時，然后在真空下濃縮。冷卻到0℃后，標題化合物從與乙醇混合的濃縮物中以結晶形態沉淀出來，熔點180℃(分解)。
實施例3N5-[(2-羥基)-正癸基]-高亞精胺三鹽酸鹽將1.276克(0.035摩爾)氯化氫的10毫升乙酸乙酯溶液在室溫攪拌下加入到2.89克(0.0056摩爾)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正癸基]-高亞精胺的10毫升乙酸乙酯溶液中。在室溫下攪拌20分鐘，然后在0℃攪拌20分鐘。將沉淀的產品過濾，用冷的乙酸乙酯洗后溶于水并用水在裝有Amberlite XAD 1180吸附劑樹脂的柱上層析。將合并的包含產品的組份冷凍干燥后，得到含水量4.5％的標題化合物，Rf0.28(溶劑同實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正-癸基]-高亞精胺將2.63克(0.0168摩爾)的1，2-癸烯氧化物加入到5.03克(0.014摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺的50毫升乙醇溶液中。將反應混合物在回流下沸騰22小時，然后進一步地加入0.52克(0.00333摩爾)1，2-癸烯氧化物，繼續在回流下加熱18小時，然后通過真空蒸發濃縮混合物。在硅膠上通過快速層析提純油狀的粗產物。用二氯甲烷和甲醇含量1％、或2.5％、或5％、或10％的二氯甲烷/甲醇混合物進行洗脫。以油的形式獲得標題化合物，Rf0.39[溶劑二氯甲烷/甲醇(9∶1)]。
b)N1，N9-二BOC-高亞精胺將17克活性碳上的鈀(10％Pd)加入167.7克(0.373摩爾)N5-芐基-N1，N9-二BOC-高亞精胺(Bergerone等人，Synthesis 1982689)在1200毫升甲醇和31.9毫升濃鹽酸的混合物中的溶液，然后在30℃下進行氫化，直到氫的吸收結束。過濾和將濾液蒸發至干后，將晶狀的殘余物(標題化合物的鹽酸鹽)溶于2升水，然后將水溶液(pH值4)通過增添4N鹽酸調節為pH值3。用乙醚洗產品，通過加入30％氫氧化鈉溶液調節水相pH值為10，然后用三份乙醚，每份500毫升提取油產品。用濃氯化鈉水溶液洗滌合并的乙醚相后，用硫酸鈉干燥并真空蒸發，以油形式得到標題化合物，其逐步結晶，熔點42-46℃。
實施例4N5-[(2-羥基)-正-癸基]-高亞精胺三草酸鹽將4.54克(0.036摩爾)的草酸二水合物在30毫升水中的溶液攪拌下加入到6.19克(0.012摩爾)的N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正-癸基]]-高亞精胺(實施例3a)的30毫升乙醇溶液中。將反應混合物在回流下加熱23小時，而后通過真空蒸發濃縮。粗產品用類似于實施例1的方法在AmberliteXAD 1180吸附劑樹脂上提純[洗脫液H2O和H2O/異丙醇(19∶1或4∶1)]。冷凍干燥后，得到含水量3.8％的標題化合物，Rf0.28(溶劑同實施例1)。
實施例5N5-[(2-羥基)-正十六烷基]-高亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)將21.48克(0.0358摩爾)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正十六烷基]-高亞精胺和20.43克(0.1074摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物在120毫升水中的混合物在70℃攪拌加熱11.5小時，隨后濃縮到大約30毫升的體積。將濃縮液用類似于實施例1的方法在Amberlite XAD 1180吸附劑樹脂上提純[洗脫液H2O和H2O/異丙醇(4∶1或3∶2)]。以冷凍干燥物的形式得到含水量2.8％的標題化合物，Rf0.32(溶劑同實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正十六烷基]-高亞精胺將15.91克(0.0562摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到13.48克(0.0375摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺(實施例3b)的150毫升乙醇溶液中，將反應混合物在回流下沸騰20小時，而后將其通過真空蒸發濃縮。將油狀的粗產品用快速層析在硅膠上提純，由此使用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶2或1∶1)和乙酸乙酯作為洗脫液。得到油形式的標題化合物，Rf0.45(溶劑同實施例3a)。
實施例6N5-[(2-羥基)-正己基]-高亞精胺三草酸鹽將4.6克(0.0365摩爾)草酸二水合物的40毫升水溶液加入到5.6克(0.01218摩爾)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正己基]-高亞精胺的20毫升乙醇溶液中，將反應混合物在回流下加熱4.5小時，而后通過真空蒸發濃縮。將得到的粗產品溶于甲醇并通過滴加乙醚將其沉淀出來。進行過濾，并從乙醇/水中重結晶標題化合物，熔點85-90℃。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正己基]-高亞精胺將1.80克(0.018摩爾)1，2-己烯氧化物加入到4.31克(0.012摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺(實施例3b)的40毫升乙醇溶液中，將反應混合物回流下沸騰22小時，而后將其通過真空蒸發濃縮。將油狀殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(99∶1或19∶1或9∶1)在硅膠上通過快速層析純化。得到油形式的標題化合物，Rf0.32(溶劑同實施例3a)。
實施例7N5-[(2-羥基)-正丁基]-高亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)將6.39克(0.0148摩爾)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正丁基]-高亞精胺和8.45克(0.0444摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物在30毫升水中的混合物在75℃下攪拌加熱3.5小時，隨后將其冷卻后用1N氫氧化鈉溶液調節pH值至6，然后真空濃縮。將濃縮液用類似于實施例1的方法在AmberliteXAD 1180吸附劑樹脂上提純[洗脫液水和水/異丙醇(9∶1)]。以冷凍干燥物的形式得到含水量1.4％的標題化合物，Rf0.14(溶劑同實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正丁基]-高亞精胺將1.51克(0.021摩爾)1，2-丁烯氧化物加入到5.39克(0.015摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺(實施例3b)的50毫升乙醇溶液中。將反應混合物在80℃下加熱5小時，然后進一步地加入0.36克(0.005摩爾)1，2-丁烯氧化物，繼續在80℃下加熱15小時，然后將混合物通過真空蒸發濃縮。將粗產品用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或20∶1或10∶1)在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.20(溶劑同實施例3a)。
實施例8N5-[(2-羥基)-正辛基]-高亞精胺三草酸鹽將3.64克(0.0289摩爾)草酸二水合物的36毫升水溶液在攪拌下加入到4.7克(0.00963摩爾)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正辛基]-高亞精胺的12毫升乙醇溶液中，將反應混合物在90℃下加熱4.5小時，而后通過真空蒸發濃縮。從乙醇中將殘余物重結晶之后，得到水含量2.2％的標題化合物，熔點83-85℃。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羥基)-正辛基]-高亞精胺將2.31克(0.018摩爾)1，2-辛烯氧化物加入到5.39g(0.015摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺(實施例3b)的50毫升乙醇溶液中。將反應混合物在80℃下加熱15小時，然后進一步地加入0.39克(0.00304摩爾)1，2-辛烯氧化物，繼續在80℃下加熱8小時，然后將混合物通過真空蒸發濃縮。用與實施例7a類似的方法提純粗產物。得到油形式的標題化合物，Rf0.35(溶劑同實施例3a)。
實施例9N5-[(2-羥基)-正十六烷基]-N1，N1，N9，N9-四甲基高亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)將11.8ml(0.15摩爾)35％甲醛水溶液和0.75克活性碳上的鈀(10％Pd)加入2.83克(0.003摩爾)N5-[(2-羥基)-正十六烷基]-高亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)(實施例5)的20毫升水溶液中。在室溫下進行氫化，直到氫氣的吸收結束。實施過濾，將濾液通過真空蒸發濃縮，然后將殘余物在2N氫氧化鈉溶液和乙酸乙酯之間分配。將用濃氯化鈉水溶液洗滌和用硫酸鈉干燥的有機相通過蒸發濃縮，將殘余物溶于甲醇，然后通過加入2N鹽酸調節該甲醇溶液pH值至3。真空蒸發后，從甲醇/乙醚中將殘余物重結晶，得到標題化合物，熔點236-239℃。
實施例10N4-[(2-羥基)-正癸基]-N1，N1，N8，N8-四甲基亞精胺三草酸鹽將1.6克(0.002745摩爾)N4-[(2-羥基)-正癸基]-亞精胺三草酸鹽(實施例27)按照類似于實施例9的方法與11.8毫升(0.15摩爾)35％甲醛水溶液反應。通過蒸發濃縮后，將殘余物從乙腈中結晶。從甲醇/乙腈中重結晶之后，得到含水量1.69％的標題化合物，熔點118-121℃。
實施例11N1，N4-雙(3-氨基丙基)-N1，N4-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯-三草酸鹽將2.7克(0.00306摩爾)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1，N4-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，1.16克(0.0092摩爾)草酸二水合物和30毫升水的混合物按照類似于實施例13的方法反應(反應持續時間18小時)。從水/乙腈中再次重結晶的標題化合物含有2.3％的水，熔點165℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1，N4-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯將2克(0.005摩爾)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，3.54克(0.0125摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)和40毫升乙醇的混合物在回流下沸騰24小時，隨后通過真空蒸發濃縮。將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(100∶1或25∶1)在硅膠上通過快速層析純化后，得到油形式的標題化合物，其在短時間后固化為晶體形式，熔點85-87℃。
b)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，4-二氨基-反式-2-丁烯和N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯在氮氣下，在3小時過程內將46.18克(0.1875摩爾)2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯基乙腈的150毫升THF溶液在攪拌下滴加入冷卻到0-5℃的15.02克(0.075摩爾)N1，N4-雙(3-氨基丙基)-1，4-二氨基-反式-2-丁烯的100毫升THF溶液中。將反應混合物在室溫下再攪拌3.5天，而后通過真空蒸發濃縮，然后將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(39∶1或9∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25或10∶5∶1)的混合物在硅膠上通過快速層析分離。由此得到油形式的第一個標題化合物，N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，Rf0.87(溶劑如實施例1a)，還得到油形式的第二個標題化合物，N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，Rf0.26(溶劑如實施例1a)。
實施例12N1，N4-雙(3-氨基丙基)-N1-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯-四草酸鹽由1.58克(0.00213摩爾)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，1.075克(0.00853摩爾)草酸二水合物和20毫升水，按照類似于實施例11的方法得到標題化合物。熔點185℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯由2.5克(0.005摩爾)N1，N4-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，和1.77克(0.00626摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)，按照類似于實施例11a的方法得到油形式的標題化合物。Rf0.59(溶劑如實施例3a)。
實施例13N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-N9-辛基-精胺四草酸鹽將1.08克(0.00143摩爾)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-N9-正辛基-精胺，0.721克(0.00577摩爾)草酸二水合物和20毫升水的混合物在回流下加熱16小時，隨后與乙腈混合(直到出現輕微的混濁)。過濾在冷卻下沉淀的產物，用乙腈洗滌并在高真空下在100℃干燥。得到含有1.6％水的標題化合物，熔點170-180℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-N9-正辛基-精胺將1.3克(0.00202摩爾)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，0.444克(0.0023摩爾)1-溴辛烷，1.1克(0.00796摩爾)碳酸鉀和20毫升乙腈的混合物回流下加熱16小時。將0.089克(0.00046摩爾)1-溴辛烷進一步加入到反應混合物中，并在回流下繼續再加熱6小時。進一步加入0.089克(0.00046摩爾)1-溴辛烷并回流下加熱14小時后，將反應混合物通過真空蒸發濃縮。將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或9∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25)的混合物在硅膠上通過快速層析進行提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.76[溶劑甲苯/異丙醇/30％氨水溶液(70∶29∶1)]。
b)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺和N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺將3.21克(0.01136摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到3.98克(0.00989摩爾)N1，N12-二BOC-精胺的40毫升乙醇溶液中，將反應混合物在回流下沸騰20小時，而后通過真空蒸發濃縮。將粗混合物在硅膠上層析，使用二氯甲烷/甲醇混合物(100∶1或9∶1)洗脫，首先洗脫出N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，Rf0.31(溶劑如實施例3a)，而后使用二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25或40∶10∶0.5)的混合物，洗脫出N1，N12-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，Rf0.07(溶劑如實施例13a)。
c)N1，N9，N12-三BOC-精胺和N1，N12-二BOC-精胺在氮氣下攪拌將50克(0.2471摩爾)精胺溶于300毫升THF中，而后在0-5℃于一小時過程內滴加134g(0.544摩爾)2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯基乙腈的500毫升THF溶液。將反應混合物在室溫下再攪拌16小時，通過真空蒸發濃縮。用二氯甲烷，二氯甲烷/甲醇混合物(97.5∶2.5或9∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或20∶10∶1)的混合物在硅膠上通過快速層析分離反應混合物，得到下面的化合物油狀的N1，N9，N12-三BOC-精胺[見J.Org.Chem.50，5735(1985)]，Rf0.78(溶劑如實施例1a)，略不純的N1，N12-二BOC-精胺，熔點86-88℃和純的N1，N12-二BOC-精胺，熔點91-92℃。
d)N1，N12-二BOC-精胺，還可以按下面方法制備將18.4克(0.0196摩爾)N1，N4，N9，N12-四(芐氧羰基)-N1，N12-二BOC-精胺溶于200毫升甲醇。在加入1.8克活性碳上的鈀(10％Pd)之后，在室溫下進行氫化直到氫氣的吸收結束。過濾溶液，然后將濾液通過真空蒸發濃縮。該油狀標題化合物，Rf0.09(溶劑如在實施例1a)，逐漸變成結晶狀態，與根據實施例13C得到的N1，N12-二BOC-精胺相同。
e)N1，N4，N9，N12-四(芐氧羰基)-N1，N12-二BOC-精胺將0.57克(0.00466摩爾)4-二甲基氨基吡啶和11.24克(0.0515摩爾)的二-(叔丁基)-碳酸氫鹽的25毫升乙腈溶液在攪拌下加入到17.3克(0.0234摩爾)N1，N4，N9，N12-四(芐氧羰基)-精胺的40毫升乙腈溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌18小時，隨后通過蒸發濃縮。然后將殘余物用己烷/乙酸乙酯混合物(4∶1或3∶1或2∶1或1∶1)在硅膠上通過快速層析純化。得到油形式的標題化合物，Rf0.38[溶劑乙酸乙酯/己烷(1∶1)]。
f)N1，N4，N9，N12-四(芐氧羰基)-精胺在室溫下，用一小時的時間將82.82毫升(0.25摩爾)氯甲酸芐基酯(50％甲苯溶液)滴加加入到攪拌好的10.12克(0.05摩爾)精胺和39.75克(0.375摩爾)碳酸鈉的200毫升水溶液中。將反應混合物攪拌4小時，過濾并分離有機相。將有機相用水和用濃氯化鈉水溶液洗滌，用硫酸鈉干燥，并通過真空蒸發濃縮。將殘余物用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶2或1∶1)在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.37[溶劑乙酸乙酯/己烷(2∶1)]。
實施例14N5-(2-羥乙基)-高亞精胺三草酸鹽按照類似于實施例8的方法，由2.6克(0.00644摩爾)N1，N9-二BOC-N5-(2-羥乙基)-高亞精胺和2.435克(0.0193摩爾)草酸二水合物得到標題化合物。熔點127-130℃。
如下制造原料化合物a)N1，N9-二BOC-N5-(2-羥乙基)-高亞精胺用大約20分鐘的時間將3.2克(0.0726摩爾)環氧乙烷通入冷卻到5℃的7.19克(0.02摩爾)N1，N9-二BOC-高亞精胺的25毫升甲醇溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌21小時，隨后通過真空蒸發濃縮。將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(30∶1或10∶1或5∶1)在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.07(溶劑同實施例3a)。
實施例15N4，N9-雙[(2-羥基)-正辛基]-精胺四草酸鹽將1.26克(0.01摩爾)草酸二水合物的10毫升水溶液加入到1.65克(0.0025摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正辛基]-精胺的5毫升乙醇溶液中。將反應混合物在90℃下攪拌9小時，然后通過真空蒸發濃縮，然后將殘余物從甲醇/乙醚中結晶。得到熔點126-129℃的標題化合物。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[2-羥基]-正辛基]-精胺將1.01克(0.0025摩爾)N1，N12-二BOC-精胺、0.96克(0.0075摩爾)1，2-辛烯氧化物和15毫升乙醇的混合物在85℃下攪拌21小時，隨后通過真空蒸發濃縮。將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1或9∶1)在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.23(溶劑同實施例3a)。
實施例16N4，N9-雙[(2-羥基)-正癸基]-精胺四草酸鹽將3.73克(0.0296摩爾)草酸二水合物的10毫升水溶液加入5.3克(0.00741摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正癸基]-精胺的10毫升乙醇溶液中。將反應混合物在90℃下攪拌10小時，然后通過蒸發濃縮，并將殘余物從甲醇/乙醚中結晶。得到175-177℃熔解的標題化合物。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正癸基]-精胺將3.22克(0.008摩爾)N1，N12-二BOC-精胺，3.75克(0.024摩爾)1，2-癸烯氧化物和32毫升乙醇的混合物在80℃下攪拌19小時，隨后通過真空蒸發濃縮。將殘余物用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或19∶1或9∶1)在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.25(溶劑同實施例3a)。
實施例17N4，N9-雙[(2-羥基)-正十二烷基]-精胺-四草酸鹽按照類似實施例15的方法，但維持反應10小時，由1.7克(0.0022摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-N-十二烷基]-精胺和1.11克(0.0088摩爾)草酸二水合物得到標題化合物。熔點187℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十二烷基]-精胺將1.01克(0.0025摩爾)N1，N12-二BOC-精胺和1.38克(0.0075摩爾)1，2-十二烯氧化物按照類似于實施例15a的方法反應(反應持續時間22小時)。在硅膠上通過快速層析純化[洗脫液二氯甲烷/甲醇(99∶1或19∶1)]，以油的形式獲得標題化合物，Rf0.27(溶劑如實施例3a)。
實施例18N4，N9-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-精胺四草酸鹽按照類似實施例15的方法，但保持反應11.5小時，使1.82克(0.0022摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-精胺和1.11克(0.0088摩爾)草酸二水合物反應。從甲醇/水中結晶后，標題化合物在170℃分解。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-精胺將1.01克(0.0025摩爾)N1，N12-二BOC-精胺和1.874克(0.0075摩爾)1，2-十二烯氧化物(85％)按照類似于實施例15a的方法反應(反應時間18.5小時)。在硅膠上通過快速層析純化[洗脫液二氯甲烷/甲醇(99∶1或49∶1或19∶1或9∶1)]，以油的形式獲得標題化合物，Rf0.30(溶劑如實施例3a)。
實施例19N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺四草酸鹽將3.53克(0.004摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，3.04克(0.016摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物和20毫升水的混合物在70℃下攪拌19小時，隨后通過真空蒸發濃縮，然后將殘余物在2N氫氧化鈉溶液和氯仿之間分配。將有機相用濃氯化鈉溶液洗滌后，用硫酸鈉干燥然后通過真空蒸發濃縮，得到粗的N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，將其溶于32毫升乙醇，并在攪拌下與2.0克(0.016摩爾)草酸二水合物的32毫升乙醇溶液混合，由此使標題化合物以晶體形式沉淀出來。將晶體用乙醇洗滌并在高真空下干燥，其在140℃熔化分解。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺將2.02克(0.005摩爾)N1，N12-二BOC-精胺和4.24克(0.015摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)按照類似于實施例15a的方法反應(反應持續時間8小時)。用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶2或1∶1)，用乙酸乙酯和用乙酸乙酯/甲醇混合物(19∶1)在硅膠上通過快速層析純化，得到以油形式存在的標題化合物，Rf0.31(溶劑如實施例3a)。
實施例20N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺-四(甲苯-4-磺酸鹽)將5.94克(0.008摩爾)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，6.09克(0.032摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物和35毫升水的混合物按照類似于實施例5的方法反應(反應持續時間2.5小時)。在AmberliteXAD 1180吸附劑樹脂上使用水和水/異丙醇混合物(9∶1或4∶1或3∶2)提純后，得到水含量2.24％的冷凍干燥物形式的標題化合物，Rf0.07(溶劑如實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-精胺N4-[(2-羥基-正癸基)-精胺四草酸鹽將5.02克(0.01摩爾)N1，N9，N12-三BOC-精胺和4.24克(0.015摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)按照類似于實施例15a的方法反應(反應持續時間10.5小時)。使用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶1)和使用乙酸乙酯在硅膠上通過快速層析純化，以油的形式獲得標題化合物，Rf0.52(溶劑如實施例3a)。
將4.05克(0.00615摩爾)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羥基)-正癸基]-精胺，3.1克(0.0246摩爾)草酸二水合物，8毫升乙醇和8毫升水的混合物按照類似于實施例15的方法反應(反應持續時間12.5小時)。從乙醇/乙醚中結晶后，得到在135-155℃分解的標題化合物。
如下制造原料化合物a)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羥基)-正癸基]-精胺將4.02克(0.008摩爾)N1，N9，N12-三BOC-精胺，1.875克(0.012摩爾)1，2-癸烯氧化物和40毫升乙醇的混合物在80℃下攪拌20小時，隨后通過真空蒸發濃縮。使用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或19∶1或9∶1)將殘余物在硅膠上通過快速層析純化后，以油的形式得到標題化合物，Rf0.40(溶劑如實施例3a)。
實施例22N4-[(R)-(2-羥基)-正十六烷基]-精胺四草酸鹽將5.6克(0.00754摩爾)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(R)-(2-羥基)-正十六烷基]-精胺，3.8克(0.03016摩爾)草酸二水合物和50毫升水的混合物按照類似于實施例13的方法反應(反應持續時間18小時)。得到的標題化合物在200-205℃分解，[α]D20＝-7.4±1.7°(c＝0.5％，在H2O中)。
如下制造原料化合物a)N1，N9，N12-三BOC-N4-[R-(2-羥基)-正十六烷基]-精胺將7.04克(0.014摩爾)N1，N9，N12-三BOC-精胺，4.06克(0.0169摩爾)(R)-1，2-十六碳烯氧化物(Nippon Mining Company，Ltd.)和30毫升乙醇的混合物在80℃下攪拌15小時，隨后通過真空蒸發濃縮。使用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1)將殘余物在硅膠上通過快速層析純化后，以油的形式得到標題化合物，Rf0.52(溶劑如實施例3a)。
實施例23N4-(2-羥乙基)-亞精胺三草酸鹽將2.73克(0.007摩爾)N1，N8-二BOC-N4-(2-羥乙基)-亞精胺，2.65克(0.021摩爾)草酸二水合物，10毫升乙醇和30毫升水的混合物在90℃下攪拌4.5小時。將仍然溫熱的反應混合物與乙醇混合(直到輕微的混濁出現)，然后將其冷卻到0℃，由此得到結晶形態的標題化合物，熔點153-156℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N8-二BOC-N4-(2-羥乙基)-亞精胺按照類似于實施例14a的方法，在將粗產品在硅膠上使用二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1或9∶1或4∶1)純化之后，由6.91克(0.02摩爾)N1，N8-二BOC-亞精胺和3.2克(0.0726摩爾)環氧乙烷，得到以油的形式存在的標題化合物。Rf0.76(溶劑如實施例1a)。
實施例24N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)將6.21克(0.0106摩爾)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥乙基)-正十六烷基]-亞精胺，6.05克(0.0318摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物，和30毫升水的混合物在75℃下攪拌2小時。將反應混合物在Amberlite XAD 1180吸收劑樹脂上通過層析[洗脫液水和水/異丙醇(4∶1或3∶2)]純化后，隨后冷凍干燥含有產物的組分，得到以冷凍干燥物形式存在的水含量2.2％的標題化合物，Rf0.26(溶劑如實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-亞精胺將10.61克(0.0375摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到8.64克(0.025摩爾)N1，N8-二BOC-亞精胺的100毫升乙醇溶液中。將反應混合物在回流下沸騰15小時，然后再加入1.7克(0.006摩爾)1，2-十六碳烯氧化物，將混合物在回流下再沸騰7小時，然后通過真空蒸發濃縮。將粗產品用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶2或1∶1)和用乙酸乙酯在硅膠上通過快速層析提純。得到油形式的標題化合物，Rf0.85(溶劑同實施例1a)。
實施例25N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-降亞精胺-三(甲苯-4-磺酸鹽)按照類似實施例24的方法，由5.72克(0.01摩爾)N1，N7-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-降亞精胺和5.71克(0.03摩爾)甲苯-4-磺酸一水合物得到以冷凍干燥物形式的水含量1.4％的標題化合物。Rf0.24(洗脫液如實施例1)。
如下制造原料化合物a)N1，N7-二BOC-N4-[(2-羥基)-正十六烷基]-降亞精胺將6.56克(0.0232摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到6.4克(0.0193摩爾)N1，N7-二BOC-降亞精胺(Hansen等人，Synthesis 1982404)的75毫升乙醇溶液中，將反應混合物在回流下沸騰17.5小時。再加入2.55克(0.009摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)后，將反應混合物再次回流下沸騰22小時，而后按照類似于實施例24a的方法操作。得到油形式的標題化合物，Rf0.79(溶劑同實施例1a)。
實施例26N4-[(2-羥基)-正癸基]-降亞精胺三草酸鹽按照類似實施例13的方法，由3.2克(0.00656摩爾)N1，N7-二BOC-N4-[(2-羥基)-正癸基]-降亞精胺，2.48克(0.0197摩爾)草酸二水合物和25毫升水得到標題化合物。熔點174-179℃(分解.)。
如下制造原料化合物a)N1，N7-二BOC-N4-[[(2-羥基)-正癸基]-降亞精胺按照類似于實施例22a的方法，由2.49克(0.0075摩爾)N1，N7-二BOC-降亞精胺，1.47克(0.0094摩爾)1，2-癸烯氧化物和25毫升乙醇得到油形式的標題化合物。在短時間后該化合物固化為結晶形態，熔點52-54℃。
實施例27N4-[(2-羥基)-正癸基]-亞精胺-三草酸鹽將3.19克(0.00636摩爾)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥基)-正癸基]-亞精胺，2.405克(0.01908摩爾)草酸二水合物和25毫升水的混合物在回流下沸騰15小時，隨后通過真空蒸發濃縮。將殘余物從丙酮中重結晶之后，得到水含量1.9％的標題化合物。熔點170-173℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羥基)-正癸基]-亞精胺按照類似于實施例22a的方法，由2.59克(0.0075摩爾)N1，N8-二BOC-亞精胺，1.47克(0.0094摩爾)1，2-癸烯氧化物和25毫升乙醇得到油形式的標題化合物。Rf0.50(溶劑如實施例3a)。
實施例28N4，N9-雙[(S)-(2-羥基)-正癸基]-精胺四草酸鹽將2.72克(0.0038摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(S)-(2-羥基)-正癸基]-精胺，1.916克(0.0152摩爾)草酸二水合物和30毫升水的混合物在回流下沸騰15小時。將丙酮加入到還是熱的反應混合物中(直到輕微的混濁出現)，然后將混合物慢慢地冷卻到0℃，由此沉淀出結晶形態的標題化合物。過濾后，用丙酮洗滌結晶，然后在高真空下干燥，得到標題化合物，熔點175-177℃(分解)，[α]D20＝+13.1°±0.7°(c＝1.47％，H2O)。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(S)-(2-羥基)-正癸基]-精胺將2.013克(0.005摩爾)N1，N12-二BOC-精胺，2.34克(0.015摩爾)(S)-1，2-癸烯氧化物和20毫升乙醇的混合物在回流下沸騰15小時，隨后通過真空蒸發濃縮。使用二氯甲烷/甲醇混合物(99∶1或49∶1或19∶1或9∶1)將殘余物在硅膠上通過快速層析純化后，以油的形式得到標題化合物，Rf0.25(溶劑如實施例3a)，[α]D20＝+52.84°(c＝1.552％，己烷)。
實施例29N4，N9-雙[(R)-(2-羥基)-正癸基]-精胺四草酸鹽按照類似于實施例28的方法，由2.72克(0.0038摩爾)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(R)-(2-羥基)-正癸基]-精胺和1.916克(0.0152摩爾)草酸二水合物得到標題化合物。熔點175-177℃(分解)，[α]D20＝-14.1°±0.7°(c＝1.43％，H2O)。
如下制造原料化合物a)N1，N12-二BOC-N4，N9-雙[(R)-(2-羥基)正癸基]-精胺按照類似于實施例28a的方法，由2.013克(0.005摩爾)N1，N12-二BOC-精胺和2.34克(0.015摩爾)(R)-1，2-癸烯氧化物得到油形式的標題化合物，Rf0.25(溶劑如實施例3a)，[α]D20＝-52.84°(c＝1.268％，己烷)。
實施例30N1，N8-雙(3-氨基丙基)-N1-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷四草酸鹽按照類似于實施例13的方法，但反應時間為20小時，由2.84克(0.00355摩爾)N1，N8-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-N8-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷，1.79克(0.0142摩爾)草酸二水合物和30毫升水，得到標題化合物。熔點165-170℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-N8-[(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷將4.8克(0.00859摩爾)N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，8-二氨基-辛烷和2.91克(0.0103摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)在30毫升乙醇中按照類似于實施例21a的方法反應(反應持續時間16小時)。使用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(20∶1)在硅膠上通過快速層析純化后，以油的形式得到標題化合物，Rf0.60(溶劑如實施例3a)。
b)N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，8-二氨基-辛烷和N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，8-二氨基-辛烷在氮氣下，在1.5小時過程內將36.94克(0.15摩爾)2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯基乙腈的120毫升THF溶液在攪拌下滴加入冷卻到0-5℃的15.51克(0.06摩爾)N1，N8-雙(3-氨基丙基)-1，8-二氨基-辛烷[見Pestic.Sci.，485-490(1973)]的100毫升的THF溶液中。將反應混合物在室溫下再攪拌16小時，而后通過真空蒸發濃縮，將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(100∶1或50∶1或20∶1或10∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或90∶15∶0.5或40∶10∶1)的混合物在硅膠上通過快速層析分離。由此得到下面的化合物第一個標題化合物，N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，8-二氨基-辛烷，以油的形式，Rf0.81(溶劑如實施例1a)；以及第二個化合物，N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，8-二氨基-辛烷，熔點67-70℃，Rf0.26(溶劑如實施例1a)。
實施例31N1，N8-雙(3-氨基丙基)-N1-[(R)-(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷四草酸鹽按照類似于實施例13的方法，但維持反應21小時，由3.71克(0.00464摩爾)N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-N8-[(R)-(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷，2.34克(0.01856摩爾)草酸二水合物和35毫升水，得到標題化合物。熔點165-170℃(分解)，[α]D20＝-7.2°±1.6°(c＝0.5％，H2O)。
如下制造原料化合物a)N1，N8-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-N8-[(R)-(2-羥基)-正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷由5克(0.00895摩爾)N1，N8-雙[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，8-二氨基-辛烷(實施例30b)，2.58克(0.01073摩爾)(R)-1，2-十六碳烯氧化物和30毫升乙醇，按照類似于實施例30a的方法得到油形式的標題化合物。Rf0.60(溶劑如實施例3a)。
實施例32N1，N12-雙(3-氨基丙基)-N1，N12-雙([2-羥基)-正十六烷基]-1，12-二氨基-十二烷四草酸鹽按照類似于實施例13的方法，但維持反應40小時，由1.3克(0.001305摩爾)N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-1，12-二氨基-十二烷，0.66克(0.00523摩爾)草酸二水合物和20毫升水，得到標題化合物。熔點115-118℃。
如下制造原料化合物a)N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十六烷基]-1，12-二氨基-十二烷將1.1g(0.002137摩爾)N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷和1.45克(0.00513摩爾)1，2-十六碳烯氧化物(85％)在25毫升乙醇中按照類似于實施例15a的方法反應(反應持續時間18小時)。使用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或25∶1或10∶1)在硅膠上通過快速層析純化，以油的形式獲得標題化合物，Rf0.91(溶劑如實施例1a)。
b)N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，12-二氨基-十二烷和N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷在室溫和氮氣下攪拌下將36.1毫升(0.195摩爾)5.4摩爾甲醇鈉的甲醇溶液加入到23.9克(0.0519摩爾)1，12-雙(3-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷-四鹽酸鹽[J.Med.Chem.7，710(1964)]的130毫升THF懸浮液中。攪拌20分鐘后，將反應混合物冷卻到0℃，然后用1小時的時間，與38.39克(0.1559摩爾)2-(BOC-氧亞氨基)-2-苯基乙腈的130毫升THF溶液混合。在室溫下繼續攪拌15小時，過濾溶液并通過真空蒸發濃縮濾液。將殘余物用二氯甲烷/甲醇的混合物(50∶1或25∶1或16∶1或10∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或90∶15∶0.5或40∶10∶1)的混合物在硅膠上通過快速層析分離。由此得到下面的化合物第一個標題化合物，N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，12-二氨基-十二烷，以油的形式，Rf0.85(溶劑如實施例1a)；以及第二個標題化合物N1，N12-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷，熔點77-80℃，Rf0.48(溶劑如實施例1a)。
實施例33N1，N4-雙(3-氨基丙基)-N1，N4-雙[(2-羥基)-正癸基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯-三草酸鹽將1.65克(0.002314摩爾)N1，N4-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1，N4-雙[(2-羥基)-正癸基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，0.875克(0.00694摩爾)草酸二水合物和15毫升水的混合物在回流下沸騰16小時，隨后通過真空蒸發濃縮。從甲醇中將殘余物結晶之后，得到水含量3.5％的標題化合物，熔點163-165℃(分解)。
如下制造原料化合物a)N1，N4-雙(3-BOC-氨基丙基)-N1，N4-雙[(2-羥基)-正癸基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯按照類似于實施例11a的方法，用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1)進行快速層析，由2克(0.005摩爾)N1，N4-雙(3-BOC-氨基丙基)-1，4-二氨基-反式-2-丁烯(實施例11b)，2.34克(0.015摩爾)1，2-癸烯氧化物和20毫升乙醇(時間的反應15小時)，得到油形式的標題化合物。Rf0.49(溶劑如實施例3a)。
實施例34N1，N12-雙(3-氨基丙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷四草酸鹽將0.45克(0.00357摩爾)草酸二水合物的20毫升乙腈溶液在攪拌下加入到0.66克(0.000893摩爾)N1，N12-雙(3-氨基丙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷的20毫升甲醇溶液中。將混合物冷卻到0℃，過濾，用乙腈洗滌殘余物然后在高真空下干燥。由此得到標題化合物，熔點87-89℃。
如下制造原料化合物a)N1，N12-雙(3-氨基丙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷將0.81克(0.0011摩爾)N1，N12-雙(2-氰乙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷溶于10毫升11％氨的乙醇溶液，與0.4克阮內鎳混合并氫化，直到氫氣的吸收結束。過濾后，通過真空蒸發濃縮濾液，然后將殘余物用二氯甲烷/甲醇混合物(40∶1或10∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或40∶10∶1.5)的混合物在硅膠上通過快速層析純化，得到油形式的標題化合物，Rf0.34(溶劑同實施例1a)，該化合物逐漸固化為結晶形態。
b)N1，N12-雙(2-氰乙基)-N1，N12-雙[(2-羥基)-正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷將11.99克(0.048摩爾)1，2-十四烯氧化物(85％)加入到6.13克(0.02摩爾)N1，N12-雙(2-氰乙基)-1，12-二氨基-十二烷[J.Med.Chem.7，710(1964)]的60毫升乙醇溶液中。將反應混合物在回流下加熱40小時，再加入2.54克(0.01016摩爾)十四烯氧化物(85％)，將反應混合物在回流下再沸騰6小時，然后通過真空蒸發濃縮。將粗產品用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(40∶1或20∶1)在硅膠上通過快速層析提純。將含有產物的組分通過真空蒸發濃縮后，從乙腈中將殘余物結晶，得到標題化合物，熔點37-38℃。
實施例35帶有取代的氨基乙醇的質粒核酸核心復合物的制備和它們的生物活性。
可以用有或者沒有長鏈烴(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇進行核酸核心復合物的制備。
將缺乏長鏈烴(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇用于把質粒DNA壓縮在水中的膠態分散體中。對于加入的陽離子(胺)與陰離子(DNA磷酸鹽)的不同電荷比，測定所制備的膠態分散體的尺寸和ζ電位，且它們在表1和圖4中顯示。制備的膠態分散體可使DNA壓縮在適合于本發明的核心復合物中。
我們還用帶有長鏈烴(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇將質粒DNA壓縮在水中的膠態分散體中。在一些情況下，在細胞培養中或當給動物用藥后，單獨這些核心復合物就足以進行基因遞送。該作用在以下的結果中舉例說明(表2和3)。
表1.取代的氨基-乙醇-DNA復合物的粒徑和ζ電位
帶有長鏈烴(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇的基因送遞能力通過培養細胞的轉染而后通過靜脈注射在體內加以研究(表2和3)。取代的氨基乙醇具有兩個與一個疏水體相連的親水極性頭，取名為雙頭脂。推薦使用雙頭脂構成單層膜。
取代的氨基乙醇(陽離子化合物)是按照實施例1-34中所描述的方法制備的。它們的基因送遞能力用標準方法通過靜脈注射在體內研究(表1和2)。將制劑通過尾部靜脈注射給小鼠，然后在5小時后測定基因表達。雌性CD-1小鼠，13-15克，由Charles River公司購買。將四十微克的pCILuc與GC脂或GC脂Chol分散體按指出的重量比復合。5小時后處死小鼠，收集器官。將器官在0.5毫升裂解緩沖液中勻漿，然后將20μl上清液用于螢光素酶測定。螢光素酶活性以四只小鼠的相對光單位(RLU)的平均數表示。脂即可以單獨使用，也可以與膽固醇組合，并與螢光素酶報道基因質粒通過標準程序在重量和電荷比的范圍內復合。對于在體內的篩選，將40μg pCILuc與制劑復合并注射到小鼠中。
還進行了結構和基因送遞功能的關系的研究。我們發現脂肪酸鏈的數量和長度影響它們的基因送遞能力。如果脂僅僅具有一個鏈，無論酸鏈的長度如何都觀測不到轉染活性。如果兩個鏈的長度短于C14，也觀測不到轉染活性。如果脂具有一個短鏈(＜C14)和一個長鏈(＞C14)，它不能遞送基因。然而，帶有較長的鏈如C14和C16的脂顯示體外以及體內轉染活性。體外轉染活性甚至比可商購脂制劑例如Lipofectamine 7的更高。
當在兩個親水極性頭中的銨基之間的碳鏈長度由C4提高到C12，脂在水中的構象可以從典型的帶有單頭的脂變為在分子的兩個末端帶有兩個頭的形式。相應地，這些脂在此是指雙頭脂，且這示于圖3中。
取代的氨基乙醇CGP44015和CGP47204(其化學結構示于圖3.4)，分散在水中形成直徑約10-20nm的非常小同質微團。它們與質粒DNA結合，形成具有依賴于陽離子化合物與DNA電荷比的粒徑的核心復合物。在此方面它們是與核酸形成小的，相對同質和穩定的復合物的取代的氨基乙醇類化合物的代表，如圖4中用不同的化合物作的舉例說明。當電荷比大于1時，顆粒是同質的，直徑小于100納米。它們的轉染活性隨著電荷比提高而提高，直到電荷比達到4。體外最佳的電荷比是4。轉染活性隨電荷比的進一步增加而減少。體內轉染活性和電荷比的關系與體外的相似，但最佳的電荷比是4-10(表1和2)。總的說來，具有相同帶電荷的頭基團的化合物顯示良好地與質粒DNA的復合和體外以及體內基因送遞。
這里檢驗的取代的氨基乙醇表現出具有兩個通過一個疏水體(圖3)相連的親水的極性頭，被稱為雙頭脂。因為各在一邊的兩個親水的頭可以面對水溶液，這些化合物可以在水中形成一單層而非由具有單頭基團的脂形成的雙層(圖3.1)。
這些結果顯示良好的基因轉移能力。在優選的脂中，CGP44015A和CGP47204A形成顯示出體內表達的核心復合物。CGP44015和CGP47204在兩頭具有相同的正電荷。雙頭脂不但在體外而且在體內都顯示出具有高的基因轉移能力。
表2
表3
表3續

實施例36帶有陽離子脂的質粒核酸核心復合物的制備陽離子脂GC-001，GC-003，GC-016，GC-021，GC-025，GC-026，GC-029，GC-030，GC-033，GC-034，GC-035，GC-38，GC-039，and GC-071是從Promega Biosciences，San Luis Obispo，CA[原來為JBL Scientific，Inc/Genta]購買的。其它材料和方法按照實施例35中所描述的進行。在表3中概括了在所選的器官中的螢光素酶表達的測定值。
對所有化合物進行體內活性的評價。檢驗了兩個關鍵因素，有或者沒有膽固醇的制劑和陽離子脂與DNA的比值。在脂∶膽固醇的摩爾比1∶1下檢驗膽固醇。用與陽離子脂或脂∶膽固醇(1∶1摩爾比)復合的pCILuc，在40μg的劑量下對CD-1小鼠靜脈內注射以進行這些研究，而后在5小時以后測定不同的器官中的螢光素酶活性。第一個評價包括重量比為2和10(GC脂與DNA的比)的全部14個GC脂。通過四個單獨的實驗進行。每次用陽離子脂質體DOTAP:Chol作為標準對照。結果見表4。許多GC脂制劑顯示出在脾和肝中有大于2000RLU/20μl裂解物的螢光素酶活性。
用脂GC-030，GC-034和GC-029在比第一個實驗寬的重量比下重復測定。轉染方法與獲得表3中所示結果的方法相同。螢光素酶活性以四只小鼠的相對光單位(RLU)的平均數表示。WR是指GC脂與DNA的重量比。結果見表5。轉染活性由螢光素酶活性RLU/器官代表。GC-030在重量比20下顯示出高的轉染活性。轉染活性隨重量比(GC脂與DNA)的增加而增加。包含膽固醇可以改變基因表達在所檢驗的不同器官中的生物分布。例如，GC-030單獨可在脾中產生高的螢光素酶活性，而GC-030膽固醇可在肺中產生高的螢光素酶活性。然而對于GC-034沒有看到膽固醇的這種功能。GC-030在重量比為20時在脾中顯示出高的螢光素酶活性，事實上比DOTAP膽固醇標準物的高36倍。同樣地，GC-030膽固醇在肺中顯示出高的螢光素酶活性，比DOTAP膽固醇的高約5倍。這些結果表明GC脂形成了對于基因送遞載體良好的核心復合物。
表4.小鼠中通過靜脈內注射對GC脂的評價


表4續


表5.小鼠中評價所選的GC脂



實施例37線形PEI的制備由聚乙基唑啉聚合物(PEOZ)通過酸水解為聚胺制備分子量22kDa的線形PEI。通過用甲苯磺酸甲基酯和500當量的2-乙基-2-唑啉按照該基本上與先前報道的方法相同的方法聚合制備PEOZ，所述方法見Zalipsky等人J.Pharm.Sci.；85133-137(1996)。有必要使用2-乙基2-唑啉代替2-甲基-2-唑啉，因為后者以分子量16,200在乙腈中沉淀。而且需要較長的反應時間。
分子量49,500kDa的聚(2-乙基-2-唑啉)的制備在螺旋帽管中進行聚合反應，所用的管在使用之前在真空下加熱干燥。向管中裝上剛對KOH蒸餾過的5.05毫升2-乙基-2-唑啉和5毫升無水乙腈。將491毫克剛蒸餾過的甲苯磺酸甲基酯溶于10.55ml無水乙腈，然后將0.4毫升此溶液轉入含有該單體的管中。轉移后將管用氬氣吹掃，密封并在油浴中在80℃下攪拌112小時。冷卻到室溫后，將2毫升KOH(0.5M)的甲醇溶液加入到聚合混合物中，而后在25℃下攪拌5小時。加入0.2毫升冰醋酸，然后將混合物濃縮為固體，將其在50毫升水中再溶解，然后放入截斷值3500分子量的Spectral/Por透析膜中(Spectrum，LosAngeles，CA)。用50mM NaCl(1×4L)和水(3×4L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，再在真空下干燥，得到4.51g白色固體(91％)。質譜分析(MALDI-TOF)顯示在m/z 45,000-65,000處的峰簇，并集中在m/z 52,395(預期m/z 49,500)。
1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.11-1.12(m，CH3CH2C＝O)，2.31-2.41(m，CH3CH2C＝O)，3.46(m，CH2N)13C NMR(100MHz CDCl3)δ9.2(bs，CH3CH2C＝O)，25.82(s，CH3CH2C＝O)，43.54-47.27(m，CH2N)，173.79-174.40(m，C＝O)分子量22kDa的線形聚乙烯亞胺的制備在螺旋帽管中進行酸水解。向管中裝上0.1克MW 49,500kDa的聚(2-乙基-2-唑啉)和10毫升3.3M HCl水溶液。將溶液脫氣，用氬氣吹掃，密封并在油浴中在100℃下攪拌65小時。較高酸濃度會導致在100℃的水解期間產生沉淀。冷卻后將混合物濃縮成固體，在水中再溶解并再次濃縮成固體。在1毫升水中再溶解，然后加入2.5M NaOH水溶液調節pH值至12-13。將線形的聚乙烯亞胺的沉淀通過離心收集，再用水(2×1ml)洗滌，得到43毫克白色固體(100％)。1H NMR(360MHz，CD3OD)δ2.73(br，CH2N)實施例38將50μg/ml濃度鮭精DNA的液流和聚乙烯亞胺的液流加入HPLC靜態混合器中，靜態混合器包括三個50μl串接的柱體。在制作每種顆粒制劑中，以相同的流速將每個液流裝入混合器中，且當得到的合并的DNA和聚合物的液流流過柱體時也保持該流速。流速在250μl/分鐘到5,000μl/分鐘之間。在所設定的流速下所制備的每種制劑的顆粒大小在以下的表6中給出。
表6粒徑

實施例39除了將DNA和聚乙烯亞胺的液流裝入到含有三個150μl串接的柱體的HPLC混合器中，且流速在500μl/分鐘到7,000μl/分鐘變化外，重復實施例38的程序。在所設定的流速下所制備的每種制劑的顆粒大小在以下的表7中給出。
表7粒徑

實施例38和39的結果表明粒徑可以通過改變混合柱體的尺寸和通過改變流速加以調節。由此人們可以選擇能提供顆粒所需大小和均一性的條件。
實施例40除了在DNA和聚合物混合后將不同濃度氯化鈉加入到DNA和聚合物中外，重復實施例38的程序。在所給定的鹽濃度下所制備的每種制劑的平均顆粒大小在以下的表8中給出。
表8粒徑

以上結果表明粒徑可以用加入鹽控制，而且這些顆粒保持大小一致。
實施例41除了DNA濃度為100μg/ml，且流速在500μl/分鐘到4,000μl/分鐘之間變化外，重復實施例38的方法。在所設定的流速下所制備的每種制劑的顆粒大小在以下的表9中給出。
表9粒徑

當將以上結果與實施例38的相比較時，表明粒徑可以通過改變DNA的濃度而改變。
實施例42重復實施例38的程序，不同的是混合器含有一個250μl柱體，且將Tween 80去污劑以按體積0.25％的量在與聚乙烯亞胺液流混合之前加入到DNA液流中，且對于DNA和Tween 80液流流速在210μl/分鐘到8,400μl/分鐘間變化。當將DNA和Tween 80液流和聚合物液流最初注入到混合器中時，DNA和Tween80液流的流速是聚合物液流的1.4倍。當將DNA和Tween80及聚合物的合并液流通過柱體時，合并液流的流速是DNA和Tween80液流和聚合物液流初始流速的平均值。例如，如果DNA和Tween80液流具有初始流速4,900μl/分鐘而聚合物液流具有流速3。500μl/分鐘，通過柱體的合并液流的流速是4,200μl/分鐘。在所設定的流速下所制備的每種制劑的顆粒大小在以下的表10中給出。
表10粒徑

*DNA和Tween80液流的初始流速以上制劑包括通常具有約10納米到約20納米尺寸的微團。微團的尺寸以上面給出的測定的平均粒徑計算。這些微團是從Tween 80去污劑形成的，可以在其使用或貯存之前通過超濾作用從制劑中除去。
由此，在另外的實驗中，如在上文中描述制備的具有顆粒和微團的制劑(其中DNA/Tween液流的初始流速為4,900μl/分鐘，聚合物液流的初始流速是3,500μl/分鐘，且具有20.8μg/毫升的DNA濃度)，具有下面的平均顆粒大小和粒徑分布。
單眾數平均值 -42.6nm單眾數標準差 -19.6標準差％ -46SDP平均值-75.5
SDP標準差-32.6標準差％ -43通過0.2μ濾器過濾制劑，而后通過帶有同質異能結構的Amicon聚砜(分子量500Kda)膜(Millipore公司，Bedford，MA)在300μl/分鐘的流速下超濾濃縮。在為了除去微團而進行的濃縮和過濾后，制劑具有450μg/毫升的DNA濃度。將制劑存儲7天，并在貯存的開始時，12小時，2天，3天，7天16天，和43天測定平均顆粒大小和分布。顆粒大小在以下的表11中給出。
表11粒徑

以上結果表明根據該實施例所述方法制備的顆粒制劑隨著時間流逝是保持穩定的，因為其粒徑基本上保持恒定。
實施例43重復實施例42的程序，不同的是使DNA和Tween80和聚乙烯亞胺流過50μl柱體，而后流過兩個包含在混合器中的150μl柱體，且DNA和Tween80液流的初始流速在250μl/分鐘到3,500μl/分鐘之間變化。在所設定的流速下所制備的每種制劑的顆粒大小在以下的表12中給出。
表12粒徑

*DNA和Tween80液流的初始流速，該流速為聚合物液流流速的1.4倍。
從上表可知，選擇可提供均勻的制劑的最理想的條件。用這些條件制備了獨立的三批。
然后將以上程序重復兩次，DNA和Tween80液流的初始流速是1,500μl/分鐘。以1,500μl/分鐘流速進行的最初實驗(實驗38)和重復實驗(實驗39和40)的結果在以下的表13中給出。
表13粒徑

以上結果表明該方法具有可重復性，因為在將DNA和聚合物的水溶液以恒定流速不斷地按恒定的聚合物與DNA的電荷比混合時，可一致地得到DNA和聚合物的同質顆粒制劑，其中每種制劑包括具有相似的平均粒徑的顆粒。因此，本發明的方法與操作者無關。其它方法，例如手工混合和移液，依賴于操作者的技術。
以流速1,500μl/分鐘重復以上程序，不同的是將這種方法按比例放大以便注入各20毫升的每種液流通過混合器。通過單眾數平均值和強度平均值測定的平均顆粒大小如下單眾數平均值88.3nm單眾數標準差38.2％標準差43SDP平均 117nmSDP標準差 37.3％標準差32通過0.2μ濾器過濾此制劑，而后如實施例42中的描述通過Amicon聚砜(分子量500Kda)膜在300μl/分鐘的流速下超濾濃縮，其中不同的是在濃縮和過濾后，制劑具有250μg/μl的DNA濃度。通過單眾數平均和強度平均測定的平均顆粒大小如下單眾數平均 102.9nm單眾數標準差37.6％標準差37SDP平均 115.5nmSDP標準差 23.9％標準差21通過0.2μ濾器再次過濾制劑，而后用Amicon聚砜(分子量500kdaKda)膜在300μl/分鐘的流速下濃縮，此后制劑具有870μg/μl的DNA濃度。通過單眾數平均和強度平均測定的平均顆粒大小如下單眾數平均值108.6nm單眾數標準差37.6％標準差35SDP平均值 117.5nmSDP標準差 25.2％標準差21
這樣，以上結果表明顆粒制劑的超濾可提供均勻的DNA和聚合物顆粒分散體。另外，制造這種同質顆粒制劑的能力與批的大小無關。
實施例44帶有線形PEI的核心復合物的制備及其生物活性將線形PEI溶于去離子水中以得到最終濃度為100mM的胺，最終濃度是通過溴化乙錠替換檢定法測定的。在此檢定法中1mmol被定義為完全中和1mmol DNA磷酸鹽所需要的PEI胺的量。由2.72毫克/毫升儲備溶液中取質粒DNA(pCIluc)221μl，與110μl 45.46％的葡萄糖溶液和597μl水結合。將72μl PEI溶液加入到該混合物中，然后充分地渦旋20秒，以制備具有4∶1+/-比的復合物。將二百微升復合物通過尾靜脈對CD-1小鼠注射。由5個動物組成的每組接受相同的劑量。5小時后將小鼠安樂死，采集它們的器官，磨碎，裂解和按先前描述的對螢光素酶表達進行分析。
結果見圖5。它們表明核心復合物顯示出具有提供體內基因轉移的活性，但對于一些治療應用此活性可以通過添加多層膠體載體的其它特征而加以改善。
實施例45用陽離子脂和基于PEG的融合劑表面活性劑及基于PEG的立體表面活性劑制備具有外殼的核心復合物和它們的生物活性陽離子脂分散體的制備將包括表面活性劑的制劑的全部脂溶于有機溶劑例如環己烷中，且以所需要的比值混合在一起，而后冷凍至干燥。例如，對于DOTAP膽固醇和GC030膽固醇分別使用45毫克DOTAP和25毫克膽固醇，或10毫克GC-030和4.74毫克膽固醇。將重蒸水加入到脂餅中以得到最后濃度為10毫克/毫升的陽離子脂(膽固醇是一種中性脂，其不用于脂分散體濃度或以后與DNA的電荷比的計算)，然后使之在70℃下水合1小時。將脂分散體擠壓通過100納米孔的碳酸鹽膜(Avanti Polar Lipids公司)或在室溫下渦旋1分鐘。
脂復合物的制備
將四十微克pCILuc溶于100μl 10％葡萄糖中并手工與溶于100μl蒸餾水的不同量的脂分散體混合。葡萄糖的最后濃度為5％，通過向脂溶液中加入DNA溶液進行混合。在此混合物中脂與DNA的電荷比在本文中有指明。將200u1DNA/脂復合物溶液注射到小鼠尾部靜脈。每組有3-5只小鼠。五小時后處死小鼠。切除脾，肝，腎，心臟和肺，然后將它們放入2毫升離心管中(從Bio 101購買)。加入0.5毫升裂解緩沖液后，通過在Fasprep FP120(從Bio 101購買)中搖動40秒壓碎組織。將勻漿物在14，000rpm下在臺式離心機中離心5分鐘。將20μl上清液用于螢光素酶分析。螢光素酶活性通過Promega的螢光素酶分析體系試劑盒測定。
體內轉染體內試驗通過在小鼠或初生大鼠(3-10天大)的尾部靜脈注射200ulDNA/脂復合物溶液進行。每組有5只動物。五或8小時后，通過心臟穿刺收集血液，處死動物，然后將其它器官(例如，肺，肝，脾，腎，心臟)手術切除。通過離心凝固的血制備血清樣品。通過加入1毫升裂解緩沖液，并用Bio 101Fasprep FP120均質化40秒制備器官樣品。直接分析勻漿物的報道基因活性，或在微型管中在14000rpm下離心勻漿物10分鐘，將上清液用于蛋白活性分析。
結果見圖7。它們表明核心復合物顯示出具有提供體內基因轉移的活性(該結果是由不帶添加劑的DOTAP膽固醇得到的)；可以通過融合添加劑而改善該活性(該結果是加入Brij，Thesit和Tween得到的)；以及活性可以通過添加立體包被物添加劑而被抑制(該結果是使用Chol-PEG5000得到的)。這樣說明了多層膠體載體的一些特征。
實施例46用融合劑肽包被的核心復合物的制備及它們的生物活性材料全部肽是從商業的肽合成公司處獲得(Genemed Synthesis公司，SouthSan Francisco，CA)，純度至少85％。肽K14含有氨基酸序列KKK KKKKKK KKK KK。肽k14 Fuso含有來源于流感病毒血凝素的融合肽，具有氨基酸序列GLF GAI EGF IEN GWE GWI DGW YGC KCK KKK KKKKKK KKK K。Lipofectamine和lipofectin從BRL(Gaithersburg，MD)購買。
方法轉染在一天前將BL-6細胞以10000細胞/孔接種到96孔板的每個孔中。將0.5ug pCIluc2DNA和所示的不同量的肽(ug)或Lipofectin試劑(ul)獨立地加入到50ul無血清培養基中。然后將肽或含有Lipofectin試劑的培養基加入到含有DNA的培養基中。將混合物在室溫下孵育30分鐘，而后將其加到細胞中。孵育3小時后，除去轉染溶液并將培養基更換為含有血清的培養基。
于轉染后24小時，用Promega生產的螢光素酶分析試劑盒根據推薦的方法測量螢光素酶活性。
結果見圖8。它們表明核心復合物顯示出具有提供體外基因轉移的活性，該活性隨核心而變化。由K14和兩種商用的脂試劑得到的結果表明，由兩種脂形成的核心比由K14形成的核心得到實質上更大的表達。結果同樣表明由K14形成的核心的活性可以通過加入融合肽序列而改善，以得到表達的實質增加，相應于由兩種脂所得到的表達水平。這樣說明了多層膠體載體的某些特征。
實施例47腙鍵的制備和酸性pH值誘導的斷裂(合成，斷裂測定法，結果)1-乙酰基-2-對甲氧基苯腙的制備向攪拌的0.108g乙酰肼的0.2ml甲醇溶液中慢慢地加入0.33ml茴香醛。加入后將反應進一步攪拌48小時。取0.1ml反應混合物并將其加到0.4ml水中。然后用C8反相高壓液相色譜法純化0.085ml等分樣品(Vydac300A，10u，250mm×10mm)，其中用0.025M pH值7.5的磷酸鈉水溶液作為溶劑A，用甲醇作為溶劑B。以1ml每分鐘的流速使用55％到95％的溶劑B梯度洗脫35分鐘。由梯度洗脫在15分鐘的波峰處收集產物1-乙?；?2-對甲氧基苯腙，得到0.020g白色固體。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)顯示存在產物的兩種異構體，反式與順式幾何異構體的比值為1∶1.69。
主要的異構體δ2.17(s，CH3C＝O)，3.79(s，CH3O)，6.98(d，J＝8.8，Ar)，7.59(d，J＝8.6，Ar)，7.92(s，ArCH＝N)，11.105(s，NHAc)次要的異構體δ1.92(s，CH3C＝O)，3.795(s，CH3O)，6.99(d，J＝8.8，Ar)，7.61(d，J＝8.4，Ar)，8.08(s，ArCH＝N)，11.22(s，NHAc)對于酸水解的研究，將0.35mg 1-乙?；?2-對甲氧基苯腙的反式/順式混合物溶于2ml含有pH值為5的0.05M檸檬酸鈉/磷酸鉀的10％甲醇中。將混合物迅即用NaOH調節pH值至5，且保持反應在370C進行。以一定的時間間隔，抽出0.1ml，將0.3ml pH值為7.5的0.25M磷酸鉀加入到其中將pH值升至7.5。注入C8反相高壓液相色譜柱(Vydac 300A，10u，250mm×10mm)，用0.025M pH值7.5的磷酸鈉水溶液作為溶劑A，用甲醇作為溶劑B。以1ml每分鐘的流速使用55％到95％的溶劑B梯度洗脫35分鐘。水解的速度由4-甲氧苯甲醛和1-乙酰基2-對甲氧基苯腙波峰的峰面積測定。
以同樣方式用pH值5.5和6.1的緩沖液進行上述的酸水解研究。
結果見圖9。它們表明腙鍵可以在酸性pH值下水解，斷裂的速度取決于鍵的化學結構。由此說明了多層膠體載體的某些特征，其中由于暴露到酸性條件而使載體改變了物理狀態。由酸性條件引起的改變的一些用途包括立體保護層的失去和融合活性的誘導。
實施例48包被有配體肽的核心復合物的制備及它們的生物活性K14-RGD和K14-SST的合成包括肽配體綴合物的復合物的制備及配體介導的細胞結合和吸收材料K14RGD肽含有氨基酸序列KKK KKK KKK KKK KKS CRGDC，純度至少為90％，由Alpha Diagnostic International(San Antonio，TX)合成。K14SMT肽含有氨基酸序列KKK KKK KKK KKK KKA d-FCYd-WKT CT，且K14MST肽含有氨基酸序列KKK KKK KKK KKKKKA TDC RGE CF。SMT和MST肽都是由Genemed Synthesis公司，(CA，South San Francisco)合成的，并被氧化以制成環形肽。這些肽是由供給者純化到90％純度的。從Novartis Oncology(Dr.Friedrich Raulf)處獲得CHO(Sst+)細胞系。選擇細胞系以便可穩定表示人促生長素抑制素受體Sst2。
方法在轉染之前將20000 HUVEC細胞接種到96孔板的每個孔中，并培養12小時。將0或2ug K14RGD肽與含0.1ul到4ul的指示量的Lipofectin的50ul無血清培養基混合15分鐘。將混合物加入到50ul含有0.5ug pCIluc2DNA的無血清的培養基中。將聚lipoplex孵育30分鐘，而后將其加到細胞中。3小時后，除去轉染溶液并將含有血清的培養基加入到細胞中。
在轉染之前將10000 CHO(Sst2)細胞在96孔板的每個孔中在含有血清和0.4mg/ml G418的培養基中培養12小時。在轉染之前將培養基轉換為無血清的培養基。將肽以指示量由1ug到10ug/孔加入到此細胞中，并在將0.5ug pCIluc2加入到相同的培養基中以轉染細胞之前孵育30分鐘。用4ul的Lipofectin作為對照物。
于24小時，用Promega螢光素酶分析試劑盒根據推薦的方法測量螢光素酶活性。
結果結果見圖25和26。圖25表示通過向Lipofectin核心復合物添加肽配體(K14RGD)的提高的表達。圖26表示通過向聚賴氨酸核心復合物添加肽配體(促生長素抑制素或SMT)的提高的表達，當使用突變的促生長素抑制素序列(MST)時則觀測不到。這些圖表示核心復合物可以在這樣或那樣程度上顯示出活性，但不管怎樣核心的活性可以通過加入靶向配體以得到改善，使表達顯著增長。因此說明了多層膠體載體的某些特征。
實施例49與核酸偶聯的NLS部分的制備可使用若干方法將NLS部分偶聯到核酸上，其中一些在圖10A中舉例說明，包括直接與核酸綴合和通過另外的試劑間接的偶聯，該試劑以序列特異的或序列無關的方式與核酸結合。這些將NLS與核酸偶聯的方法所需要的試劑包括三鏈體寡肽(triplex oligopeptide)的合成，PNA-肽，PCR片段，質粒DNA，限制性內切酶片段，加帽試劑例如四股螺旋，以及間隔物例如PEG和聚唑啉。
與DNA結合的PNA-NLS肽含有來自pCIluc的編碼區的線型DNA片段通過PCR制備和擴大。反應的引物是如此設計的線形片段在其5′和3′端分別含有序列AAAGAGGG和GAGAGGAA。肽核酸(PNA)序列，X-O-O-TTTCTCCC-O-O-O-CCCTCTTT和Y-O-O-TTCCTCTC-O-O-O-CTCTCCTT是通過固相合成在Research Genetics(Hunstville，AL)合成的。這里C和T是胞嘧啶和胸腺嘧啶PNA類似物，而O是8-氨基-3，6-二氧雜辛酸銜接物。X代表SV40大T-抗原NLS序列PKKKRKVEDPY，而Y是羅丹明。用HPLC純化這兩個化合物并通過質譜分析。
將兩個PNA分子設計成與線型DNA片段的互補的5′和3′端形成一種“夾子”，如圖10A所舉例說明。DNA-PNA復合物是由20倍摩爾過量的兩個PNA分子與線型DNA混合，并在37℃下孵育1小時形成的。然后將復合物在Centricon分離器(MWCO＝10,000D)中與非結合的物質分離，然后通過1％瓊脂糖凝膠上電泳，而后通過紫外線照射顯現羅丹明標記以進行觀察。然后將凝膠在溴化乙錠中孵育，而后紫外線照射?？梢钥吹搅_丹明和DNA帶是重疊的，說明了它們的密切結合。隨后將該物質與PEI復合，如以前所描述，并將其用于以各種劑量轉染培養的SM1和HUVEC細胞。將細胞裂解然后在24小時后通過以前描述的方法評價螢光素酶表達。
轉染的結果清楚地表明含有PNA-NLS的線型DNA片段在轉染所檢驗的兩種細胞型時都遠為有效(圖10B)。在最高劑量下，在由PNA-NLS綴合的DNA和對照物片段獲得的表達水平之間沒有顯著差異，但當劑量由200ng減少到50ng時，含有NLS的DNA轉染細胞是更有效的。此結構對所檢驗的兩種細胞類型在此整個范圍內都維持其高轉染率，而對照物片段卻下降到僅僅高于背景水平?？赡艿囊环N解釋是在最高劑量時核酸的輸入機器被飽和，由此在兩個結構之間沒有顯著差異。當劑量降低，含有NLS片段的DNA被遠遠更積極地運載入細胞核中，因此能夠維持其轉染的高水平。
然而注意到這種缺乏PNA-NLS的結構含有游離的未加保護的末端且可能對外切核酸酶降解敏感是重要的。對于這種結構，不能排除觀測到較低的轉染水平的一種理由是在細胞內的DNA降解，特別在較低的劑量時，此時DNA的相當大部分可能是無用的。
線型DNA-NLS肽綴合物的合成策略通過PCR擴增由質粒DNA合成線型DNA片段，以致得到的線型DNA具有位于一末端的綴合物和可折疊成防止外切核酸酶作用的結構的序列。
5′XCAT GGC TCG ACA GAT CTT CAA TA 3′(FB1)(X帶有胺的C6銜接物)5′X1X2X2TGG GTT TTG GGT TTT GGG TTT TGG GTT TGGATCCGC TGT GGA ATG TG 3′(PB)(X1吖啶，X2，X3C9銜接物)PCR操作PCR擴增用標準操作方案進行。
反應混合物具有下面的試劑1.PCR母液混合物 50μl2.無菌蒸餾水32μl3.引物1(100ng/μl) 8μl4.引物2(100ng/μl) 8μl5.模板(1ng/μl，106拷貝)2μlPCR母液混合物含有PCR緩沖液1X，2.5U TaqPolym在Brij 35，0.005％(v/v)中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM，10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2PCR條件1.94℃ 1分鐘2.94℃(變性)1分鐘3.60℃(退火)1分鐘4.72℃(蔓延)1分鐘將步驟2-4重復38次5.72℃ 2小時將NLS肽通過PEG2000與DNA綴合帶有氨基酸序列，PKK KRK VED PYC的NLS肽是從GenemedSynthesis公司獲得的，并用固相方法用Fmoc化學合成。此肽是利用反相HPLC純化到＞90％純度的。在與DNA反應之前，將肽用20mM DTT處理。在G25凝膠過濾柱上用0.1％乙酸作為溶劑純化DTT處理的肽，以便除去游離的DTT。將肽保存在0.1％乙酸中直到其與PEG綴合的DNA反應。
用50,000MWCO透析管在4℃下在含有50mM NaCl的10mMHEPES中通過大規模的透析純化由PCR擴增得到的線形PCR DNA。將300μg PCR DNA溶于2毫升含有1.5M NaCl，pH值7.5的10mM HEPES中。將溶于0.1毫升DMSO(二甲亞砜)的1.5毫克N-羥基琥珀酰亞胺PEG乙烯砜(NHS-PEG2000-VS)(從Shearwater Polymers處獲得)，加入到DNA中，并在4℃下攪拌16小時。將反應混合物轉移到50,000 MWCO透析管中，在4℃下對含有1M NaCl的10mM HEPES透析，頻繁的更換緩沖液，以便除去未反應的PEG衍生物。
DNA溶液中的鹽濃度升至2M。將溶于10mM HEPES的1mg NLS肽加入到DNA溶液中并用稀釋的NaOH將此溶液的pH值調節到8.0。將反應混合物保持在4℃下攪拌16小時。然后將反應混合物對含有2M繼之以1M NaCl的10mM HEPES大規模地透析。將樣品保存在含有1M NaCl的10mM HEPES中。
實施例50PEI-PEG綴合物的合成和PEG化(PEGylation)對PEI/DNA復合物的大小及穩定性的影響材料和方法PEI(25kD)從Aldrich化學公司(Milwaukee，WI)處獲得，甲氧基聚(乙二醇)-硝基苯基碳酸酯(分子量5000)從Shearwater Polymers(BirminghamAL)處獲得。PEI溶液的濃度用TNBS檢定法對于伯胺含量進行檢定來測定，如下所述。DNA濃度通過分光光度法在260納米處用13,200mol-1cm-1每堿基對的摩爾消光系數測定(1OD＝50μg DNA)。膠體制劑的粒徑通過光散射測量法在Coulter N4顆粒篩上在90°角測定。要么通過假定顆粒單群體的單眾數分析(unimodal analysis)，或用假定多群體的SDP分析用廠家提供的軟件分析自相關函數。
TNBS檢定法試劑TNBS10mM水溶液，甘氨酸HCl或任何其它伯胺標準物10mM水溶液，碳酸鈉或碳酸氫鈉緩沖液，pH值9.0，*TNBS可以是以甲醇溶液(5％w/v)購買的。
方法以伯胺計算濃度范圍5μM到0.1mM的一組標準溶液如下制備(對于此目的可以使用甘氨酸HCl)。在100mM緩沖液中獲得300μl 0.1mM甘氨酸HCl。通過樣品的連續稀釋獲得若干樣品。(例如將200μl上述樣品加入100μl緩沖液中獲得濃度66.66M的樣品，將200μl上述樣品轉移到100μl緩沖液中得到44.44μM樣品等等。在獲得最后的樣品后從其中移去200μl以使全部樣品具有相等體積，即100μl)。在相同的緩沖液中制備100μl未知濃度的伯胺樣品一式兩份或三份。樣品的濃度應該在標準曲線的范圍內。在每個樣品中加入10μl TNBS，然后渦旋。在室溫下孵育30分鐘然后在420nm處讀出吸光度。從每個樣品的吸光度中減去空白(即在100μl緩沖液中稀釋的10μl TNBS)的吸光度。獲得甘氨酸濃度與420nm處吸光度的標準曲線。從此曲線圖的斜率和截距以及樣品的吸光度，可以計算伯胺的濃度。
PEI與PEG5000的綴合將10毫克PEI溶于100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg甲氧基PEG5000-硝基苯基碳酸酯(足夠修飾5％的PEI殘余物)并在4℃反應16小時。然后將反應混合物用截斷值10,000MW的透析袋對250mMNaCl而后對水進行大量透析。PEG350的PEI綴合物的合成是用與PEG5000所述相似的方法，使用PEG350的硝基苯基碳酸酯(從Fluka，Milwaukee，WI處獲得)進行的。PEG綴合的程度用復合物的重量和伯胺的濃度估計。
固定的DNA/PEI-PEG復合物的形成通過人工混合相等體積的DNA和PEI/PEI-PEG混合物，而后渦旋30到60秒，制備含有各種克分子濃度的PEG的DNA/PEI-PEG復合物。
細胞結合共聚焦顯微鏡PEG對PEI/DNA復合物的細胞吸收的影響通過熒光顯微鏡評價。用從Oligos Etc.，Wilsonville，Oregon獲得的3′-羅丹明標記的硫代磷酸寡核苷酸(5′-AAG GAA GGA AGG-3′-羅丹明)作為熒光標示物。將標記的寡核苷酸與PEI或PEI-PEG以4∶1(+/-)的電荷比復合，與六孔板中在顯微鏡蓋玻片上生長的HUVEC細胞，在無血清的培養基中孵育三小時。孵育三小時后，用無血清的培養基洗滌細胞，然后在生長培養基的存在下使其生長另外的20小時。然后將這些細胞用PBS洗滌，用4％多聚甲醛固定15分鐘，并放在懸滴顯微載玻片上，孔中含有PBS，細胞面對孔并與PBS接觸。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察載玻片。將10毫克PEI溶于100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg甲氧基PEG5000-硝基苯基碳酸酯(足夠修飾5％的PEI殘余物)并在4℃反應16小時。然后將反應混合物用截斷值10,000MW的透析袋對250mM NaCl而后對水大量地透析。PEG2000，PEG750和PEG350的PEI綴合物的合成是用與PEG5000所述相似的方法，使用相應的PEGs的硝基苯基碳酸酯(從Fluka獲得)進行的。PEG綴合的量通過比較復合物的重量和伯胺的濃度評價。
DNA/PEI-PEG復合物的形成用60x油浸物鏡顯微鏡(MRC 1000，Bio-Rad)。將用于羅丹明激發和發射的Ar/Kr激光源與濾光片裝置結合用于熒光影像的獲得。
生物活性轉染用含有通過CMV啟動子調節的螢光素酶報道基因的質粒DNA pCI-Luc研究PEI和PEI-PEG復合物的轉染效率。將細胞(BL6)以20000細胞/孔接種在96孔板中，并允許生長到80-90％匯合。然后將它們每孔與以電荷比5(+/-)和劑量0.5μg DNA的DNA制備的PEI或PEI-PEG/DNA復合物一起在無血清的培養基中在37℃下孵育3小時。在測定螢光素酶活性之前將細胞在生長培養基中生長另外的20小時。用可商購的試劑盒(Promega)測定依據相對光單位的螢光素酶活性，然后用96孔形式在發光計上讀數。
結果膠體穩定性圖11表示以各種電荷比制備的PEI/DNA復合物的粒徑分布受到的PEG綴合物(PEG化)的影響。未PEG化時，PEI/DNA復合物具有取決于電荷比的粒徑分布。在凈負電荷下，形成的顆粒是相當小的(約100納米)。然而在接近中性電荷比下，PEI/DNA復合物形成或聚集成大的顆粒。當電荷比升至凈正電荷時，粒徑降低，或許是由于表面電荷的相斥減少了結合。
使用PEG化的PEI時，甚至在比較高的DNA濃度下，并且甚至不用專用的混合技術DNA復合物也是小的，且尺寸都與電荷比無關。對于這些實驗，DNA是與PEG化的PEI復合的，其中約5％的PEI氨基殘基是與PEG5000綴合的。這看起來導致PEG在這些顆粒的表面上，從而有效地減少結合現象，甚至對于電荷中性的復合物也是這樣。在沒有任何理論束縛的情況下，可以認為這些效果可歸因于PEG在復合物表面上提供了立體屏障。
人們知道PEI/DNA復合物于幾小時和幾天內趨向聚集成大的顆粒。這種不穩定性是常規復合物的不希望有的性質。圖12表明可以通過PEI的PEG化使用1∶1電荷比制備的PEG-PEI/DNA復合物獲得在若干天內膠體的穩定性。平均顆粒大小甚至在若干天的期間仍保持是小的。這些數據表明PEG化提供了基因治療應用中成功地使用這些膠體制劑所需的長期穩定性。總而言之，PEI的少量PEG(5mol％)衍生化便于小微粒的形成且可提供復合物實質上的穩定性。
血清的影響普遍認為在血清存在下大多數的帶正電荷的DNA復合物將失去它們轉染細胞的能力。這種滅活作用可能涉及與帶負電荷的血清相互作用導致這些顆粒的聚集和/或復合物的去穩定。將PEG固定到DNA復合物上可用于解決此問題。圖13表示血清對于PEI/DNA和PEI-PEG/DNA復合物的粒徑分布的影響。
在與血清孵育時，常規的帶正電荷的PEI/DNA復合物基本上聚集，可以通過平均粒徑分布從約100納米增加到大于500納米(0m0l％PEG)證明。此可能歸因于血清蛋白在這些復合物表面上的結合介導了聚集作用。使用含有PEG5000 PEG化的PEI的固定復合物時，在大于1mol％的水平出現對聚集的防止。該效果到3mol％時似乎達到飽合。該效果取決于聚合物的分子量。PEG350對于防止血清介導的聚集作用(甚至直到檢驗的mol％極限)也是無效的，如圖13b所示。在沒有任何理論束縛的情況下，可能是聚合物的長度太短以致于不能對蛋白質結合提供任何顯著的立體屏障，或者此聚合物可能沒有形成一個表面層。
對固定的復合物的結構觀察可能見到延伸達到顆粒表面所吸附的蛋白殼之上的聚合物鏈，它為顆粒-顆粒結合提供了立體屏障(圖14A)。這樣，蛋白質吸收可以被減少，無變化，或者甚至被提高，且此額外的蛋白可以幫助形成防止聚集作用的屏障或者在此表面上增加的特異的蛋白質可能是有益的。
這些數據表明親水聚合物，例如PEG，可影響由PEI和DNA形成的陽離子顆粒的膠體和生物學性質。當通過與PEI的共價鍵將PEG固定在DNA復合物上時，在PEI/DNA復合物的表面上似乎形成了一種立體PEG包被物。這種包被物導致粒徑分布的減少，提高了膠體穩定性，并提高了血清穩定性，所有這些都是基因送遞系統所希望的性質。
生物學活性已知PEI/DNA復合物的生物活性依賴于復合物的電荷比(+/-)。在凈陽離子電荷比值下，PEI/DNA復合物，在沒有任何受體介導的相互作用的情況下，可以與細胞表面簡單地通過靜電相互作用結合。在較低的電荷比(+/-＜1)下，其中復合物是凈帶負電荷的且預計與細胞表面的靜電結合是最小的，這時這些復合物轉染細胞是十分無效的。在高電荷比(+/-＞1)下，其中復合物是凈帶正電荷的，與帶負電荷的細胞表面的靜電結合可能對于結合和隨后的通過胞吞作用或者相似的機理的細胞吸收是足夠的。
在顆粒表面上的PEG包被物可以調節復合物的相互作用。表面PEG的作用是減少靜電相互作用和形成一種立體隔層。對于體外轉染，得到的與細胞結合的降低可減少或消除吸收并抑制表達。對于體內體系的應用，降低的蛋白和細胞相互作用將增加血循環時間和最小化非特異性的相互作用，由此增加復合物達到靶組織的概率。
圖20表示在0到5摩爾百分數PEG化的PEI范圍內及對于不同分子量的PEG在電荷比為5時PEG化對PEI/DNA復合物的體外轉染效率的影響。以報道基因螢光素酶的質粒表達測定活性。在此電荷比下PEI/DNA復合物相當好地轉染細胞，如由高的螢光素酶表達所顯示的。在復合物中PEG的存在在某種意義上抑制了表達，這高度取決于PEG的分子量和mol％。此抑制歸因于對結合和/或隨后的復合物的胞內加工的抑制。分子量等于或者大于2000的PEG表現出當復合物中的PEG mol％增加時使表達減少。2000分子量的PEG的效果似乎在3mol％下達到飽和，而5000分子量PEG的效果在4mol％下達到飽和。不超過5％的PEG350或PEG750似乎對復合物的活性沒有顯著的影響。
PEG包被物的存在，如上所述，可以通過若干途徑影響復合物的生物活性。帶正電荷的顆粒上的聚合物包被物可以基本上起到屏蔽表面電荷的作用，由此減少通過靜電相互作用介導的結合。它還可以在表面上作為干涉結合過程的立體隔層。而且存在立體聚合物對內體逃離機制起作用的可能性。小分子量(短鏈長)聚合物看起來在不超過5m0l％下沒有效果。這很可能是這些小聚合物提供了不充分的屏蔽。然而不知道是屏蔽或是立體隔層，還是兩者都是不充分的。因此，理解PEG調節復合物的活性的機理是重要的。
實施例51在PEI/DNA復合物上可脫落的PEG包被物的制備除了其對DNA復合物的穩定作用外，固定的保護層的存在可以在DNA送遞過程中影響后面的步驟。特別地，立體層的存在可能對復合物從內體中的逃離是不利的，該過程可能需要在復合物和內體膜之間有緊密的相互作用。克服所有這些潛在的問題的一種方法是提供從復合物上用化學的或酶催的過程斷裂固定的立體包被物的方法。
本實施例表明可用可裂的二硫鍵使PEG和PEI綴合來產生在顆粒表面上的可脫落的包被物。實施例44表明立體PEG包被物可以在PEI/DNA復合物的表面上形成，對于制劑提供了改善的膠體穩定性。此實施例表明該立體包被物是可以裂開的，例如，在還原條件下裂開。
材料和方法PEI(25kD)是從Aldrich化學公司獲得的，甲氧基聚(乙二醇)-硝基苯基碳酸酯(MW 5000)和巰基聚乙二醇5000一甲基醚是分別從ShearwaterPolymers和Fluka獲得的。從用Coulter公司的Delsa 440SX測量的這些顆粒的電泳遷移率確定膠體顆粒上的表面電荷。其它實驗條件如實施例1中描述。
PEI與PEG5000的綴合將10毫克PEI溶于100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg甲氧基PEG5000-硝基苯基碳酸酯并在4℃反應16小時。然后將反應混合物用10,000MWCO的透析袋對250mM NaCl而后對水大量地透析。PEG的量從伯胺濃度和烘干樣品的重量來評價。
與PEG通過二硫鍵連接的PEI(PEI-ss-PEG)通過下面的方法合成。將20毫克PEI溶于250μl DMSO。將8mg SPDP加入到此溶液中并允許在4℃下反應16小時，在此期間反應混合物變成膠狀。將溶于2ml 10mMTris/pH8.0的100毫克巰基聚乙二醇5000一甲基醚加入到上述溶液中，然后反應兩天，在此期間凝膠溶解。將樣品用截斷值10,000MW的透析柱對水大量地透析3天，期間頻繁的換水。用兩種不同的方法評價綴合的百分率，其中或者(i)從伯胺濃度和烘干樣品的重量評價PEG的量；或(ii)將綴合物用DTT處理。用截斷值10,000MW的透析膜通過透析除去DTT后，伯胺與巰基的比值用TNBS(RDS#)和Ellman分析法測定。兩種方法得到十分相似的值。
DNA/PEI-PEG復合物的形成通過人工混合相等體積的DNA和PEI/PEI-PEG混合物，而后渦旋30到60秒，制備含有各種克分子濃度的PEG的DNA/PEI-PEG復合物。
細胞結合共聚焦顯微鏡通過熒光顯微鏡評價PEG對PEI/DNA復合物的細胞吸收的影響，用從Oligos Etc.，Wilsonville，Oregon獲得的3′-羅丹明標記的硫代磷酸寡核苷酸(5′-AAG GAA GGA AGG-3′-羅丹明)作為熒光標示物。將標記的寡核苷酸與PEI或PEI-PEG以4∶1(+/-)的電荷比復合，與六孔板中在顯微鏡蓋玻片上生長的HUVEC細胞，在無血清的培養基中孵育三小時。孵育三小時后，用無血清的培養基洗滌細胞，然后在生長培養基存在下使細胞生長另外的20小時。然后將這些細胞用PBS洗滌，用4％多聚甲醛固定15分鐘，并置于懸滴顯微載玻片上，在孔中含有PBS，細胞面對孔并與PBS接觸。用60x油浸物鏡在激光掃描共聚焦顯微鏡(MRC 1024，Bio-Rad)下觀察載玻片。將用于羅丹明激發和發射的Ar/Kr激光源與濾光片裝置結合用于熒光影像的獲得。
生物活性轉染用含有通過CMV啟動子調節的螢光素酶報道基因的質粒DNA pCI-Luc研究PEI和PEI-PEG復合物的轉染效率。將細胞(BL6)以20,000細胞/孔接種在96孔板中，并允許生長到80-90％匯合。然后將它們每孔與以電荷比5(+/-)和劑量0.5μg DNA的DNA制備的PEI或PEI-PEG/DNA復合物一起在無血清的培養基中在37℃下孵育3小時。將這些細胞在生長培養基中生長另外的20小時。將細胞裂解，然后用可商購的試劑盒(Promega，Madison，WI)以發光計用96孔形式分析(以相對光單位測定)螢光素酶活性。
結果實施例44表明將PEG固定到PEI給PEI/DNA復合物提供了長期的膠體穩定性并有助于獲得小顆粒。它還表明在復合物中立體保護層的存在，例如PEG，可減少與血清蛋白以及細胞表面的非特異性相互作用。如下所述的結果表明使用可斷裂的立體層對PEI/DNA復合物的物理化學的和生物學特性的影響。圖16表示PEI/DNA復合物的粒徑，其中PEI含有與PEG通過二硫鍵綴合的11％的PEI殘基。這些復合物是在電荷比(+/-)1下獲得的，其中常規顆粒的粒徑可能是十分大的(實施例44和圖11)。與十分大的尺寸相反，發現復合物是相對小的，具有平均150納米的尺寸。當在與DNA混合之前用10mM DTT預處理PEI-ss-PEG時，形成的顆粒是十分大的且在幾分鐘之內從溶液中沉淀出。這些數據表明了固定的立體表面(PEG)的穩定作用，以及通過還原斷裂PEG二硫化物銜接物可以除去表面PEG及其穩定作用。
為了使固定的立體隔層影響顆粒的聚集作用及減少非特異性的相互作用，它必須在顆粒的表面存在。當PEG化的PEI與DNA混合形成顆粒時，一些PEG分子可能被截留在復合物的疏水核內，且可能是不易化學或酶促斷裂的。然而，因為PEG是親水性聚合物，可以預期它的大部分是在表面上的。這種表面聚合物的切除可以顯著地影響顆粒的性質。在帶正電荷的顆粒的表面具有立體聚合物的后果之一是它可屏蔽表面電荷?？墒褂忙齐娢粶y量法探測表面上的聚合物層的存在。這種層將減少有效表面電荷，且減少的程度可能取決于聚合物的長度。
圖17表示與鮭精DNA以電荷比3(+/-)復合的PEI和PEI-ss-PEG5000的ζ電位。在此電荷比下PEI/DNA具有約24毫伏的正ζ電位。與PEI-ss-PEG以相同的電荷比復合的DNA顯示低得多的ζ電位(12毫伏)，表明了PEG遮蔽了表面電荷。這種復合物含有5mol％(相對于PEI上的總氨基)PEG。這種ζ電位與含有5mol％PEG的PEI/DNA復合物所得到的ζ電位十分相似，其中將PEG通過穩定的鍵連接到PEI上。用10mM DTT處理這種復合物導致ζ電位的增加(21毫伏)，指示從表面上除去了固定的立體PEG層。在與DNA復合之前用DTT處理PEI-ss-PEG得到的值類似于PEI/DNA復合物(22毫伏)的值。這些結果清楚地表明在復合物表面上PEG的存在以及其在還原條件下(當通過二硫化物連接時)的可裂解性。
膠體穩定性如下所示的結果表明可斷裂的錨的存在不會對PEG化的復合物的膠體穩定性有不利影響。
圖18表示以電荷比1制備的PEI-ss-PEG/DNA的長期穩定性。這種制劑的平均粒徑分布在長時間保持恒定。這與實施例44中針對PEI-PEG/DNA得到的結果一致。為了了解從復合物的表面上除去二硫化物連接的PEG的效果，將10mM DTT加入到樣品中。平均粒徑從88納米增加到104納米，并隨時間保持近乎無變化。
生物活性對于PEI/DNA，在沒有連接到復合物的配體的情況下，在DNA運輸過程中最初的細胞結合步驟是通過靜電相互作用介導的。復合物表面上的立體隔層(PEG)的存在，以至少兩種不同的方式影響其物理性能1)聚合物包被物可以物理地阻斷與細胞表面的相互作用以及2)它可以屏蔽表面電荷以使通過靜電相互作用介導的結合減少。這樣立體層可以被用于抑制非特異性的相互作用。使用立體表面(例如通過PEI/DNA復合物的PEG化)，可用于抑制不希望有的生物活性。這是很重要的，因為它提供了控制可導致毒性的非特異性相互作用的方法。
使用熒光標記的共聚焦顯微攝影表明，這種活性抑制的可能的原因是減少與細胞的結合。結合活性可以通過將細胞或組織特異的配體連在立體聚合物的遠端和/或通過化學的或酶催化的方式使立體聚合物從復合物表面裂開而得到恢復。后面的方法可以通過將PEG與PEI通過可裂的二硫鍵綴合來實現。
圖19表示在復合物中存在各種mol％PEG下PEI-ss-PEG/DNA和PEI-PEG/DNA的生物活性。在正電荷比下PEI/DNA可有效地轉染BL-6細胞。用PEI-PEG/DNA復合物轉染的細胞隨著復合物中PEG量的增加顯著地減少了活性。對于含有＞3m0l％PEG的復合物，活性基本上消除。在這種情況下PEG與PEI通過穩定的鍵綴合。然而，用PEI-ss-PEG/DNA轉染的細胞在甚至多達5mol％PEG下仍顯示高活性。盡管通過綴合的PEG提供了立體覆蓋物，但這些顆粒仍保留了它們的活性。通過穩定的或不穩定的鍵連接在復合物表面上的PEG的存在將預期會抑制細胞的結合和吸收。然而，PEI-ss-PEG/DNA復合物的高生物活性說明在PEI-ss-PEG/DNA中通過二硫鍵連接的PEG在孵育期間或在以后的DNA運輸過程中的步驟中裂解。
用與PEI或PEI-ss-PEG復合的熒光標記的寡核苷酸孵育的HUVEC細胞的共聚焦影像表明PEI/寡核苷酸復合物是十分有效地內在化的，正如通過細胞內的大量熒光所顯示的。相反，用PEI-ss-PEG/寡核苷酸復合物孵育的細胞顯示相當低的內部熒光。與在PEI-PEG/寡核苷酸復合物的情況下觀測到的一樣，結合和吸收大大地減低。
實施例52PEI-PMOZ綴合物的合成和綴合對表面性質和轉染活性的影響材料和方法4-硝基酚，碳酸雙(4-硝基苯基)酯，三乙胺，雙環己基碳二亞胺，無水乙腈和無水二氯甲烷是從Aldrich(St.Louis，MO)購買的。
PMOZ和PEOZ的合成帶有端基丙酸的聚(2-甲基-2-唑啉)(PMOZ丙酸)和帶有甲基端基的聚(2-乙基2-唑啉)(PEOZ)是如S.Zalipksy等人(J.Pharm Sci.85133(1996))的方法制備的。使用裝有順序安裝的G-3000PW和G-2500PW柱(Schimadzu)的Hewlett Packard 1100HPLC進行凝膠滲透色譜(GPC)的測定，并通過PEG標準品的水溶液校正。
在D2O中在360MHz下測定H-NMR譜(Spectral Data ServicesInc，Champaign，IL)。
PMOZ的活化-PMOZ-丙酸4-硝基苯基酯的制備將PMOZ-丙酸(分子量9100，0.129mmol的丙酸鹽端基)在10毫升無水乙腈中共沸干燥兩次。然后將聚合物溶于3毫升無水二氯甲烷中，然后加入4-硝基苯酚(2.87mmol)。將混合物冷卻到0℃，然后加入2.62mmol二環己基碳二亞胺(DCCI)的2毫升無水二氯甲烷溶液。30分鐘后，將混合物升溫至室溫，然后孵育16小時。然后將反應混合物在攪拌下滴加到300毫升無水乙醚中。丟棄上清液，將沉淀溶于無水乙腈，然后在乙醚中重復沉淀3次，得到PMOZ-丙酸的4-硝基苯基酯(0.545g)白色粉末。
PEOZ的活化-制備PEOZ的4-硝基苯基碳酸酯將PEOZ(M.W.8850，0.1mmol的羥基端基)和三乙胺(0.25mmol)溶于10毫升無水乙腈中。維持溫度在0℃，在攪拌下加入碳酸雙(4-硝基苯基)酯(2.5mmol)的10毫升無水乙腈溶液。然后將混合物升溫至室溫，然后繼續反應20小時。然后濃縮反應混合物，再溶于5毫升無水乙腈中，然后攪拌滴加加入到500毫升乙醚和10毫升二氯甲烷的無水混合物中。除去上清液，將沉淀溶于5毫升乙腈，然后在乙酸乙酯-二氯甲烷中再沉淀。收集PEOZ的4-硝基苯基碳酸酯(0.59克)的沉淀，為白色固體。在硅膠板上進行TLC檢驗(洗脫液乙酸乙酯)，顯示沒有碳酸雙(4-硝基苯基)酯。
PMOZ與PEI的綴合將43毫克PEI溶于0.1M pH值9.0的碳酸氫鹽緩沖液。加入545毫克活化的PMOZ，并在室溫下反應過夜。反應之后，通過加入濃HCl將pH值降低到5。通過氯仿抽提釋放出的硝基苯酚，處理5次。簡要地，將反應混合物與100毫升氯仿在分液漏斗中混合，用力搖動，然后靜置分成兩相。硝基苯酚優先地被攜帶進入氯仿相，將其除去，而后加入新鮮的氯仿，重復此過程。然后干燥此物質，并將其再溶于10毫升去離子水，而后對150mM NaCl透析，換2次緩沖液，而后對去離子水透析2天，換4次水。然后冷凍干燥產物，通過NMR測定PMOZ負載和氨基含量。
PEOZ與PEI的綴合將32.035毫克PEI溶于5毫升0.1M pH值8.0的硼酸鹽緩沖液。將590毫克活化的PEOZ溶于4毫升乙腈，然后攪拌將其加到PEI溶液中。5分鐘后觀察到沉淀，該沉淀在加入15毫升硼酸鹽緩沖液后消失。將反應混合物在室溫下反應過夜。反應之后，在旋轉蒸發器中干燥該物質，除去全部乙腈。然后通過加入濃乙酸將pH值降到5。如上所述，通過氯仿抽提釋放出的硝基苯酚。然后進一步地用乙酸乙酯萃取除去大部分殘余的硝基苯酚。然后干燥該物質，并將其再溶于10毫升去離子水，而后對0.1M乙酸透析，換2次緩沖液，而后對去離子水透析2天，換4次水。然后冷凍干燥產物，通過NMR測定PEOZ負載和氨基含量。
固定的DNA/PEI-PMOZ復合物的制劑復合物如先前所述形成。
生物活性轉染如實施例45中描述的在BL-6細胞中測定生物活性。
結果表面性質和膠體穩定性圖22表示PMOZ對復合物的表面性質的影響。以電荷比4∶1配制復合物，并在10mM鹽水中測定ζ電位。沒有PMOZ存在時，顆粒顯示高度正電荷的表面，如通過ζ電位為+30毫伏顯示的。僅在復合物中有1.6％負載的PMOZ時，就可將ζ電位減少到6.46毫伏。增加負載到3.2％導致進一步地降低到5.35毫伏。這些數據說明，在自組裝過程期間，親水的PMOZ分子優選出現在復合物的表面上而不是在疏水性的內部，由此起到立體隔層的作用，以減少表面上存在的表觀電荷。此親水的和不帶電的表面可預計能減少與大的血清組分例如蛋白質的相互作用。實際上觀測到這種現象，如圖23所示，其中用從0到3.2％(以0.8為一級)不同量的PMOZ制備電荷比4∶1的復合物，在37℃下在含有10％FBS的PBS中孵育2h之前和之后對其粒徑加以研究。復合物在血清中的穩定性(通過測定它們維持尺寸的能力)正比于存在于復合物中的PMOZ的量。這顯示了復合物在血清中是穩定的，這是靶向特異組織的決定性的要素。
非特異性轉染的阻斷圖24表示使用如上所述的復合物轉染培養的BL-6細胞得到的結果。在存在于復合物中的PMOZ的量和其轉染細胞的能力之間存在明確的關系。增加表面PMOZ的量減低這些細胞中螢光素酶的表達水平。正如以上的討論，PMOZ的存在通過起立體和靜電隔層的作用阻礙了復合物與細胞表面的非特異性的相互作用。相互作用的減低可降低核酸被吸收到細胞中，導致轉染水平降低。這使人們可設計出一種通過將配體連接到PMOZ的遠端對任何靶有選擇性的復合物。在此設計中，可向遠離顆粒表面的立體聚合物添加最佳數量的配體分子，實現與靶受體有效的相互作用。
實施例53帶有外部立體包被物的通過配體靶向的多層膠體復合物的制備PEI-PEG-RGD的制備合成和提純通過Cys側鏈環化，并用反相HPLC(C18柱)純化到＞90％的具有序列ACR GDM FGC A的RGD肽是從Genemed Synthesis，S.San Francisco處獲得的。將16.8毫克RGD肽溶于100mM pH值8.0的HEPES緩沖液。在攪拌下使用注射器泵慢慢地(于30分鐘內)向此溶液中加入溶于無水DMSO(100微升)的41毫克VS-PEG3400-NHS(Shearwater Polymers)。將反應混合物保持在室溫下攪拌另外的7小時。調節pH值到8.0后將5mgPEI溶液加入到上述反應混合物中。反應混合物的pH值升至9.5，然后在室溫下攪拌4天。在反應結束，將反應混合物冷凍干燥。
將樣品再溶解在pH值7.0的含有150mM NaCl的5mM HEPES中，并用含有5mM HEPES和150mM NaCl的洗脫緩沖液通過G-50凝膠過濾柱。將空體積部分用25,000MWCO的透析管對含有150mM NaCl的5mM HEPES大量透析。隨后將樣品用3500MWCO袋對水透析脫鹽。
肽綴合的評價在綴合物中肽的量用從Cys側鏈估計的巰基濃度來測定。將小部分的綴合物用20mM DTT處理以還原肽二硫鍵。然后將此樣品用25000MWCO滲析管對含有1mM EDTA的0.1M乙酸透析，以便除去過量的DTT。大量透析后，用Ellmen試劑測定巰基濃度，而用針對伯胺的TNBS分析測定由PEI導致的氨基濃度。根據這些分析，估計與PEI綴合的肽為10％。
DNA結合PEI-PEG-RGD2C與DNA復合的能力用凝膠電泳實驗證實。在或高于電荷比1下形成的復合物不能在凝膠中移動，顯示由于綴合物的結合完全中和了DNA的電荷。
粒徑和ζ電位為了促進DNA/多聚陽離子復合物的吸收，需要將DNA壓縮成可被細胞內吞的小顆粒。PEI-PEG-RGD2C將DNA壓縮成小顆粒的能力通過粒徑測量法研究。以下的表14表示在各種電荷比下的DNA/PEI-PEG-RGD2C的粒徑。表14還表示在各種電荷比下的DNA/PEI-PEG-RGD2C復合物的ζ電位值。在這些電荷比下保持低的ζ電位，表明形成了屏蔽復合物的表面電荷的立體包被物。
表14

細胞結合和吸收用熒光標記的寡核苷酸用共聚焦顯微鏡研究PEI-PEG-RGD2C將核酸遞送到細胞的能力。共聚焦顯微鏡實驗如以前描述的進行(實施例51)。圖28顯示，在Hela細胞中通過向PEG綴合的PEI的遠端添加肽配體(RGD)使得Rh標記的寡核苷酸在電荷比6與PEI的復合物的細胞吸收增加。此圖表示了用PEI或PEI-PEG-RGD2C將熒光標記的寡核苷酸送遞到Hela和HUVC細胞。在帶有整聯蛋白受體的Hela細胞中，當通過PEI-PEG-RGD2C介導送遞時，與單獨用PEI相比較，內在化的寡核苷酸的量明顯增加。分布模式也是十分不同的。對于PEI，寡核苷酸被分配到細胞質的泡狀區室中，而對于PEI-PEG-RGD2C，大部分寡核苷酸位于細胞核中。
實施例54 帶有可脫落的外部立體包被物、通過配體靶向的多層膠體復合物的制備使用位阻的二硫化物與聚乙基唑啉(PEOZ)一端(PEOZ的另一端與肽配體RGD綴合)的線形PEI的合成如圖27所圖解。如圖27A所示，PEI-SS-PEOZ-RGD的制備包括2-乙基-2-唑啉單體與碘乙酸乙酯的聚合，隨后的甲醇KOH的水解，得到亞甲基羧化的PEOZ中間體I。將羧化的基團與1-氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]縮合，而后用戊二酐將末端羥基基團衍生化，然后將得到的羧化的端基與RGD肽的N-末端氨基縮合，得到2-吡啶基保護的-SS-PEOZ-RGD中間體IV。用25當量的二硫蘇糖醇在pH值5還原8小時，制備硫醇HS-PEOZ-RGD V，其可與2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的線形聚乙烯亞胺起反應得到PEI-SS-PEOZ-RGD。可改變此最后一步，用25當量的二硫蘇糖醇在pH值5下將2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的線形聚乙烯亞胺還原8小時，而后將得到線形聚乙烯亞胺上的硫醇與2-吡啶基保護的-SS-PEOZ-RGD中間體IV起反應得到相同的最終產物PEI-SS-PEOZ-RGD。
亞甲基羧化的PEOZ中間體(I，圖27A)的制備在螺旋帽管中進行聚合反應，所用的管在使用之前在真空下加熱干燥。向管中裝上剛對KOH蒸餾過的4毫升2-乙基-2-唑啉和4毫升無水乙腈。將0.85克剛蒸餾過的碘乙酸乙酯溶于8ml無水乙腈，然后將0.80毫升此溶液轉入含有單體的管中。轉移后將管用氬氣吹掃，密封并在油浴中在80℃下攪拌45小時。冷卻到室溫后，將2毫升KOH(0.5M)的甲醇溶液加入到聚合混合物中，而后在25℃下攪拌4小時。加入0.15毫升冰醋酸，然后將混合物濃縮為固體，將其在50毫升水中再溶解，然后放入截斷值3500分子量的Spetral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用100mM NaCl(1×3.5L)和水(3×3.5L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，再在真空下干燥，得到3.84g白色固體(98％)。
1H NMR(360MHz D2O)d 0.87-0.94(m，CH3CH2C＝O)，2.13-2.27(m，CH3CH2C＝O)，3.37-3.46(m，CH2N)樣品產生陽離子MALDI-TOF質譜，顯示在約m/z 8,000至13,000間有弱的，寬分布的可能的假分子離子，并集中在大約m/z 10,331(預期m/z 10,075)。
1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ中間體(II，圖27A)的制備將2g亞甲基羧化的PEOZ中間體(I，圖27)溶于100毫升水并用HCl水溶液調節pH值到6。將溶液在真空濃縮得到固體，然后將固體溶于6毫升無水二氯甲烷。加入0.273克1-羥基苯并三唑一水合物，0.208克二環己基碳二亞胺和0.253g1-氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]，然后攪拌48小時。將反應混合物過濾然后將濾液攪拌下滴加加入到1升的乙醚中。傾析后，將沉淀溶于5毫升二氯甲烷，并攪拌下再次被加到1L乙醚中。傾析后，將沉淀在50毫升水中溶解，然后放入截斷值3500分子量Spectral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用100mM NaCl(1×3.5L)和水(2×3.5L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，再在真空下干燥，得到1.77g白色固體(86％)。
將得到的固體用C18反相高壓液相色譜法(Jupiter 300A，10u，250mm×10mm)純化，其中用0.1％三氟乙酸水溶液作為溶劑A，用乙腈作為溶劑B。以5ml每分鐘的流速使用30％到45％的溶劑B梯度洗脫45分鐘。產物，1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ中間體(II，圖27A)，通過收集在梯度洗脫20分鐘時的峰的洗脫物，得到0.88克白色固體(43％)。
1H NMR(400MHz D2O)δ0.87-0.94(多三重峰，J＝7.2，CH3CH2C＝O)，1.16(bs，[CH3]2C)，2.13-2.28(多四重峰，J＝7.3，CH3CH2C＝O)，3.37-3.46(m，CH2N和CH2OH)，3.92(bs，NCH2C＝O)，7.67(bdd，J1/2+J2/2＝6.8，4-H吡啶基)，8.16(bd，J＝8.3，2-H吡啶基)，8.27(bdd，J1＝J2＝8.10，3-H吡啶基)，8.51(bd，J＝5.9，5-H吡啶基)1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯一元酸中間體(III，圖27A)的制備將0.05g1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ中間體(II，圖27A)溶于1毫升無水乙腈和2毫升無水甲苯中。將溶液在真空中濃縮得到固體。加入0.014克戊二酐的0.5毫升無水乙腈溶液，而后加入0.025毫升無水吡啶。將攪拌的混合物在80℃的油浴中放置24小時。冷卻后，將混合物在真空濃縮得到固體，再溶解在3毫升pH 6.5的0.2M乙酸鈉水溶液中，然后應用于精細SephadexTMG-25(柱直徑1.6厘米，高度65厘米)。用水從凝膠柱中洗脫產物，并收集在第一種餾份中，得到0.04克白色固體(80％)。
1H NMR(400MHz CD3OD)δ1.07-1.12(多三重峰，J＝7.3，CH3CH2C＝O)，1.31(bs，[CH3]2C)，1.85-1.89(m，OC＝OCH2CH2CH2CO2H)，2.18-2.25(m，OC＝OCH2CH2CH2CO2H)，2.36-2.47(多四重峰，J＝7.3，CH3CH2C＝O)，3.5-3.57(m，CH2N和CH2OH)，4.09(bs，NCH2C＝O)，4.23-4.26(m，CH2OC＝O)，7.21-7.23(m，4-H吡啶基)，7.76-7.81(m，2-H和3-H吡啶基)，8.42(m，5-H吡啶基)。
1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(IV，圖27A)的制備將0.03克1-酰氨基2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯一元酸中間體(III，圖27A)溶于0.25毫升無水氯仿中，并用0.002克N-羥基琥珀酰亞胺和0.003克二環己基碳二亞胺處理。將溶液在25℃下攪拌48小時而后過濾。將收集的濾液滴加到攪拌的100毫升無水乙醚中。傾析后，將沉淀溶于0.5毫升無水乙腈中，然后將其加到0.008克雙環化的GACDCRGDCWCG羧基封閉的酰胺肽中(GenmedSynthesis，South San Francisco)。加入0.003克1-甲基咪唑，然后將反應在25℃下攪拌48小時。加入pH值6.5的3毫升0.2M乙酸鈉水溶液，然后放入截斷值3500分子量Spectrol/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用100mM NaCl(2×3.5L)和水(3×3.5L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，然后進一步地真空干燥，得到1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(IV，圖27A)。
1-酰氨基-2-甲基-2-丙硫醇 亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(V，圖27A)的制備將0.02克1-酰氨基2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(IV，圖27A)溶于0.5毫升含有5mM EDTA，pH值5的0.2M乙酸鈉水溶液中。將溶液用氮氣吹掃，加入0.008克二硫蘇糖醇。攪拌8小時，然后施加到精細SephadexTMG-25(柱直徑1.6厘米，高65厘米)。將產物用0.10M乙酸水溶液從凝膠柱中洗脫下來，收集第一種餾份得到1-酰氨基-2-甲基-2-丙硫醇 亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(V，圖27A)。
2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的線型聚乙烯亞胺(VI，圖27A)的制備將來源于Pierce，Rockford IL的0.013克N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)的0.5毫升無水甲醇溶液加入到0.022克分子量22kDa的游離堿線型聚乙烯亞胺的0.25毫升無水甲醇溶液中，將反應在黑暗中攪拌16小時。加入pH值6.5的10毫升0.5M乙酸鈉水溶液，然后將得到的混合物放入截斷值3500分子量Spectral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用0.5M NaCl(2×2L)和水(3×2L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，再在真空下干燥，得到2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的線型聚乙烯亞胺(VI，圖27A)。
1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷二硫代(聚乙烯亞胺)亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(VII，圖27A)的制備將0.01克2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的線型聚乙烯亞胺(VI，圖27A)溶于0.1毫升含有0.1M氯化鈉和25mM EDTA、pH值5的0.2M乙酸鈉緩沖液。將溶液用氮氣吹掃。然后加入0.125克1-酰氨基2-甲基-2-丙硫醇亞甲基羧化的PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(V，圖27A)在0.5毫升含有0.1M氯化鈉和25mM EDTA的pH值5的0.2M乙酸鈉緩沖液中的溶液。將反應混合物攪拌8小時。偶聯的程度通過在343納米處測定所釋放出的吡啶-2-硫酮的吸光度來確定。在343納米下的摩爾消光系數＝8.08×103M-3cm-1。通過加入0.01克巰基乙醇將反應終止。繼續攪拌，直到釋放出全部的吡啶-2-硫酮。加入pH值4的10毫升0.5M乙酸鈉水溶液，然后將得到的混合物放入截斷值25,000分子量Spectral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用0.5M NaCl(2×2L)和水(3×2L)透析。將透析袋的內容物冷凍干燥，然后進一步地真空干燥，得到1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷二硫代(聚乙烯亞胺)亞甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸單酯肽基RGD中間體(VII，圖27A)。
將PEI-SS-PEOZ-RGD和PEI-SS-PEOZ以不同比例混合，得到含有不同克分子濃度的配體的分子。然后將這些混合物與如上所述的質粒DNA(pCIluc)相結合，以制備4∶1+/-比的復合物。將復合物在10mMNaCl，1mM EDTA溶液中稀釋，然后在DELSA440(Coulter Corp.Miami，FL)中測定ζ-電位以估算“表面層”的厚度。然后轉染HUVEC細胞，在轉染后24h，48h和72h分析螢光素酶活性以確定最佳的配體量以及表達-動力學的差異(如果有的話)。本實驗的對照物是缺乏靶向層的帶正電荷復合物。在與游離配體的競爭分析中以及在無受體的細胞中檢驗配體特異性。將這些復合物通過CD-1小鼠的尾部靜脈注射，分離各種器官和血管，然后檢驗螢光素酶表達以了解與對照物制劑的差異。
實施例55.向人滑膜細胞送遞基因以及通過其進行的表達。
將本發明中描述的陽離子脂，具體地為CGP 44015A，與質粒DNA(編碼GFP或表達螢光素酶)復合。在帶陽離子電荷的脂與帶陰離子電荷的質粒的比例不同的情況下制備復合物。將如此制備的復合物對培養中的分離的人滑膜細胞RA 1191在劑量范圍給藥。在孵育期后，洗滌細胞，并將細胞用新鮮的培養基維持。24小時后，通過流式細胞儀和熒光顯微鏡分析細胞的GFP表達。結果在表15和圖29中概括。這些結果表明新的膠體載體提供了向人滑膜細胞的基因送遞和在該細胞中的高水平表達。高效是指被轉染的細胞的高百分數和蛋白表達的高水平。載體引起蛋白表達的功能可通過調整電荷比和劑量最佳化。
表15

據認為滑膜細胞與類風濕性關節炎的發病機理有關(見例如，Pap T，Gay RE，Gay S.2000.Curr Opin Rheumatol 2000 May；12(3)205-10；Haidi Zhang，Yiping Yang，Jennifer L.Horton，Elena B.Samoilova，Thomas A.Judge，Laurence A.Turka，James M.Wilson，和YouhaiChen.1997.J.Clin.Invest.Volume 100，Number 8，October 1951-1957；Yao Q，Glorioso JC，Evans CH，Robbins PD，等人2000.J Gene Med 2000May-Jun；2(3)210-9；Evans CH，Rediske JJ，Abramson SB，RobbinsPD.1999.關于關節炎和相關疾病的基因治療的第一次國際會議Bethesda，MD，USA，2-3December1998.Mol Med Today Apr；5(4)148-51；NitaI，Ghivizzani SC，Galea-Lauri J，Bandara G，Georgescu HI，Robbins PD，Evans CH.1996.Arthritis Rheum May；39(5)820-8.Firestein GS，Yeo M，Zvaifler NJ.1995.J Clin Invest.1995Sep；96(3)1631-8)。這樣，在本發明的優選實施方案中，將滑膜細胞作為用基因治療方法治療類風濕性關節炎的靶。因此地，本發明考慮用基因療法治療類風濕性關節炎的方法，其中將包括治療基因的本發明載體以有效量對患者給藥，且其中所述治療性基因被優先地遞送到滑膜細胞?？梢酝ㄟ^研究該疾病的一或多種癥狀的改善確定效果。有益地，體內效果可以使用對規定的臨床終點的測定，該終點是類風濕性關節炎的進程或程度所特征性。給藥的確切劑量依賴于多種因素，包括患者的年齡，體重和性別的，以及要治療的病癥的嚴重程度。這種給藥可以是全身性給藥或通過將載體直接注射到受類風濕性關節炎影響的組織或體腔中進行。也可以將載體與可接受的藥物載體(Carrier)結合給藥。適宜的藥物載體的選擇對本領域技術人員來說是顯而易見的。
實施例56.帶有RGD肽的膠體載體—向人滑膜細胞的基因送遞以及通過該細胞的表達。
從研究說明使用暴露于表面的配體可得到進一步的改進，由此將RGD肽結合進新的膠體載體中。在不同的電荷比下制備具有和沒有RGD肽的復合物，并如實施例55中的描述測定對RA 1911細胞的轉染。結果見圖30。結果表示配體的加入降低了基因表達對陽離子表面電荷的依賴性。在電荷比0.4下表面電荷源自于復合物中負電荷的過量，而當此電荷比的膠體載體含有RGD配體時，載體與沒有配體的載體保持同樣的活性，且具有供給正電荷的電荷比。使用根據本發明制備的綴合到PEG修飾的多聚陽離子試劑上的RGD肽配體制備的新膠體，得到相似的結果。當膠體制劑是用或不用RGD肽配體制備的時，表達依賴于配體的存在。
通過如上所述的代表性的實施方案已經將本發明廣泛地公開和說明。
本領域技術人員將認識到在沒有離開本發明的精神和范圍的情況下，可對本發明進行各種改變。
權利要求
1.一種包括內殼的非天然存在的基因治療載體，內殼包括(1)包括核酸的核心復合物和(2)至少一種復合物形成試劑。
2.根據權利要求1的載體，進一步包括融合部分。
3.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分包括固定到所述核心復合物的殼。
4.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分是直接地摻入到所述核心復合物中的。
5.根據權利要求1的載體，進一步包括可穩定所述載體并減少與蛋白質和細胞的非特異性的結合的外殼部分。
6.根據權利要求5的載體，其中所述外殼部分包括一種親水聚合物。
7.根據權利要求5的載體，進一步包括融合部分。
8.根據權利要求7的載體，其中所述外殼部分是固定到所述融合部分上的。
9.根據權利要求7的載體，其中所述外殼部分是固定到所述核心復合物上的。
10.根據權利要求5的載體，包括至少兩種外殼試劑的混合物。
11.根據權利要求10的載體，其中每個所述外殼試劑包括可減少與蛋白質和細胞的非特異性的結合的親水聚合物，且其中所述聚合物具有實質上不同的尺寸。
12.根據權利要求1的載體，進一步包括提高所述載體與靶組織和細胞群體的結合的靶向部分。
13.根據權利要求5的載體，其中所述外殼包括可提高所述載體與靶組織和細胞群體的結合的靶向部分。
14.根據權利要求1的載體，其中所述復合物形成試劑選自脂，聚合物和精胺類似物復合物。
15.根據權利要求1的載體，其中所述復合物形成試劑是一種脂，選自圖2.1和2.2所示的脂。
16.根據權利要求15的載體，其中所述構成復合物的脂試劑選自磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，二油?；字Ｒ掖及?DOPE)，二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)，膽固醇及其它甾醇，N-1-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)，1，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，磷脂酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，包含兩個含有約14-22個碳原子的任選地不飽和的烴鏈的糖脂，鞘磷脂，鞘氨醇，N-脂酰鞘氨醇，萜烯，膽固醇半琥珀酸酯，膽固醇硫酸酯，甘油二酯，1，2-二油?；?3-二甲基丙二醇銨(DODAP)，雙十八基二甲基溴化銨(DODAB)，雙十八基二甲基氯化銨(DODAC)，雙十八基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1，3-二油?；趸?-(6-羧基精胺基(spermyl))丙酰胺(DOSPER)，2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨三氟醋酸鹽(DOSPA或lipofectamine7)，十六烷基三甲基-銨溴化物(CTAB)，二甲基-雙十八基銨溴化物(DDAB)，1，2-雙十四烷基氧基丙基3-二甲基-羥基乙基銨溴化物(DMRIE)，二棕櫚酰磷脂?；掖嘉旎?DPPES)，二辛基胺甘氨酸精胺(C8Gly-Sper)，雙十六烷基胺-精胺(C18-2-Sper)，氨基膽固醇-精胺(Sper-Chol)，1-[2-(9(Z)-十八烯酰基氧基)乙基]-2(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羥乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)，雙十四?；?3-三甲基銨-丙烷(DMTAP)，1，2-雙十四酰-sn-甘油基-3-乙基磷脂酰膽堿(EDMPC或DMEPC)，賴氨酰磷脂酰乙醇胺(Lys-PE)，膽甾烯基-4-氨基丙酸酯(AE-Chol)，亞精胺(spermadine)膽甾烯基氨基甲酸酯(Genzyme-67)，2-(雙棕櫚酰-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DPIm)，2-(二油?；?1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DOIm)，2-(膽甾烯基-1-丙胺氨基甲酸酯)咪唑(ChIm)，N-(4-吡啶基)-雙棕櫚酰-1，2-丙二醇-3-胺(DPAPy)，3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-膽固醇)，3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(TC-CHOL-γ-d3)，1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-琥珀酸酯，1，2-二油?；?sn-甘油基-3-琥珀酰-2-羥乙基二硫化物鳥氨酸綴合物(DOGSDSO)，1，2-二油?；?sn-甘油基3-琥珀酰-2-羥乙基己基鳥氨酸綴合物(DOGSHDO)，N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕櫚?；?TM-TPS)，3-十四烷基氨基-N-叔丁基-N’-十四烷基丙脒(vectamidine或雙C14-脒)，N-[3-[2-(1，3-二油酰氧基)丙氧基羰基]丙基]-N，N，N-三甲基碘化銨(YKS-220)，和O，O′-雙十四酰-N-(α-三甲基胺基乙?；?二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。
17.根據權利要求14的載體，其中所述復合物形成試劑是式I的化合物和它們的藥學可接受的鹽 其中m是3或4；Y表示基團-(CH2)n-，其中n是3或4，或也可以表示基團-(CH2)n-，其中n是5到16的整數，或如果R2是基團-(CH2)3-NR4R5且m是3，也可以表示基團-CH2-CH＝CH-CH2-；R2是氫或低級烷基，或如果m是3，也可以表示基團-(CH2)3-NR4R5；R3是氫或烷基，或如果R2是基團-(CH2)3-NR4R5且m是3，也可以表示基團-CH2-CH(-X’)-OH；X和X’各自獨立地表示氫或烷基；基團R，R1，R4和R5各自獨立地是氫或低級烷基；條件是如果m是3且Y表示基團-(CH2)3-，則基團R，R1，R2，R3和X不能同時表示氫或甲基。
18.根據權利要求14的載體，其中所述復合物形成試劑包含至少兩種復合物形成試劑的混合物。
19.根據權利要求1的載體，其中所述復合物形成試劑具有一或多種選自細胞結合，生物膜融合，內體破裂，和核靶向的附加活性。
20.根據權利要求1的載體，其中所述核酸選自重組質粒，復制-缺陷型質粒，小質粒，重組病毒基因組，線性核酸片段，反義試劑，線性多核苷酸，環狀多核苷酸，核酶，細胞啟動子，和病毒基因組。
21.根據權利要求1的載體，其中核心復合物進一步包含可提高核的結合和/或吸收的核靶向部分。
22.根據權利要求21的載體，其中所述核靶向部分選自核定位信號肽，核膜轉運肽，和類固醇受體結合部分。
23.根據權利要求21的載體，其中所述核靶向部分是固定到所述核心復合物中的核酸上的。
24.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分包含至少一個選自病毒肽，兩親性肽，融合聚合物，融合聚合物-脂綴合物，可生物降解的融合聚合物，和可生物降解的融合聚合物-脂綴合物的部分。
25.根據權利要求24的載體，其中所述融合部分是選自MLV env肽，HA env肽，病毒包膜蛋白的胞外結構域，病毒包膜蛋白近膜域的膜去穩定化肽，病毒融合蛋白的疏水域肽片段的病毒肽，及包含兩親性域的肽，其中所述包含兩親性域的肽選自蜂毒肽，爪蟾抗菌肽，來自流感嗜血菌血凝素(HA)蛋白的融合片段，來自HIV1 gp41的胞質尾區的HIV片段I，和病毒env膜蛋白質的兩親性片段。
26.根據權利要求1的載體，其中所述復合物形成試劑是具有以下結構的聚合物 其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，其中R1和R3相同或不同；且R2是低級烷基。
27.根據權利要求1的載體，其中所述復合物形成試劑是具有以下結構的聚合物 其中R1和R3獨立地是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴，其中R1和R3可以相同或不同；且R2和R4獨立地是低級烷基。
28.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分是具有以下結構的聚合物 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴；R2是低級烷基；且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。
29.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分是具有以下結構的聚合物 其中R1是烴或被胺，胍鹽，或咪唑部分取代的烴；R2和R4獨立地是低級烷基，且R3是烴或被羧基，羥基，硫酸鹽，或磷酸鹽部分取代的烴。
30.根據權利要求2的載體，其中所述融合部分是膜表面活性劑聚合物-脂綴合物。
31.根據權利要求30的載體，其中所述膜表面活性劑聚合物-脂綴合物選自ThesitTM，Brij 58TM，Brij 78TM，Tween 80TM，Tween 20TM，C12E8，C14E8，C16E8(CnEn＝烴聚(乙二醇)醚，其中C代表碳長度為N的烴，E代表聚合度為N的聚(乙二醇))，Chol-PEG900，含有聚唑啉或其它親水聚合物替代PEG的類似物，和具有碳氟化合物替代烴的類似物。
32.根據權利要求5的載體，其中所述內殼是通過共價鍵固定到所述外殼部分的，該共價鍵通過化學還原或巰基處理是可降解的。
33.根據權利要求32的載體，其中所述內殼是可以通過共價鍵固定到外殼部分的，該共價建在pH值6.5或以下是可降解的。
34.根據權利要求33的載體，其中所述共價鍵可以選自下面的基團
35.根據權利要求5的載體，其中所述外殼包含保護性聚合物綴合物，其中聚合物顯示在極性和非極性的溶劑中都具有溶解性。
36.根據權利要求5的載體，其中所述外殼包括一種保護性立體聚合物綴合物，其中聚合物選自PEG，聚縮醛聚合物，聚唑啉，帶有端基綴合物的聚唑啉聚合物嵌段，水解的葡聚糖聚縮醛聚合物，聚唑啉，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚甲基丙烯酰胺，聚乙基唑啉，聚甲基唑啉，聚二甲基丙烯酰胺，聚乙烯基甲基醚，聚甲基丙烯酸羥丙基酯，聚羥丙基甲基丙烯酰胺，聚丙烯酸羥乙基脂，聚羥乙基唑啉，聚羥丙基唑啉和聚天冬酰胺，及聚乙烯醇。
37.根據權利要求13的載體，其中所述靶向元件是受體配體，抗體或抗體片段，靶向肽，靶向碳水化合物分子或凝集素。
38.根據權利要求37的載體，其中所述靶向元件選自血管內皮細胞生長因子，FGF2，促生長素抑制素和促生長素抑制素類似物，鐵傳遞蛋白，促黑激素，ApoE和ApoE肽，馮·維勒布蘭德氏因子和馮·維勒布蘭德氏因子肽；腺病毒尾絲蛋白和腺病毒尾絲蛋白肽；PD1和PD1肽，EGF和EGF肽，RGD肽，葉酸，吡哆?；?，和唾液酸-Lewisx和化合物類似物。
39.具有式I的化合物和它們的藥學可接受的鹽 其中M是3或4；Y表示基團-(CH2)n-，其中n是3或4，或還可以表示基團-(CH2)n-，其中n是5到16的整數，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基團且m是3，還可以表示-CH2-CH＝CH-CH2-基團；R2是氫或低級烷基，或如果m是3，還可以表示-(CH2)3-NR4R5基團；R3是氫或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基團且m是3，還可以表示-CH2-CH(-X’)-OH基團；X和X′，各自獨立地表示氫或烷基；且基團R，R1，R4和R5，各自獨立地是氫或低級烷基；條件是如果m是3且Y表示基團-(CH2)3-，則基團R，R1，R2，R3和X不能同時表示氫或甲基。
40.一種包含根據權利要求1的載體和藥學可接受的稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
41.一種用于構成根據權利要求1的自組裝的核心復合物的方法，包含以下步驟在靜態混合器中送進核酸的溶液流和構成核心復合物的部分的溶液流，其中將液流分成內部的和外部的螺旋流，它們在若干不同的點相交，以形成湍流，并由此促進那些導致物理化學組裝相互作用的混合。
42.一種治療患者的疾病的方法，包括給予所述患者治療有效量的根據權利要求1的載體。
43.一種包括內殼的非天然存在的基因治療載體，其包括(1)核心復合物，包括核酸和至少一種復合物形成試劑；(2)核靶向部分；(3)融合部分；和(4)外殼，外殼包括(i)親水聚合物，它穩定所述載體和減少與蛋白質和細胞的非特異性結合和(ii)靶向部分，它提供與靶組織和細胞的結合，其中所述外殼是通過可裂開的鍵連接的，該鍵能夠使外殼脫落。
44.根據權利要求1的載體，其中所述載體顯示生物活性。
全文摘要
本發明提供了一種用于基因治療的非天然存在的載體，其由化學定義的試劑組成，其中載體是自組裝的，且其中載體包括(1)包括核酸的核心復合物和(2)至少一種復合物形成試劑，其中載體具有融合的活性。載體可選地可以含有允許與細胞膜融合和允許核吸收的試劑。載體還可以含有固定核心復合物的外殼部分，借此外殼以穩定復合物，保護它不受不希望有的干擾，并提高向靶組織或細胞的核酸送遞。外殼可選地可以是可脫落的，即可能將其如此設計以致于它可在進入靶細胞或組織時與載體分離。
文檔編號A61K47/42GK101041079SQ200710091359
公開日2007年9月26日 申請日期2000年12月28日 優先權日1999年12月30日
發明者M·伍德, 程城, P·斯卡里亞, K·蘇布拉馬尼亞, R·蒂特馬斯, 楊靜平, J·費賴, H·梅特, J·施塔內克 申請人:諾瓦提斯公司