本發(fā)明屬于基因治療和免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種提高dc疫苗抗肝癌效果的基因靶標(biāo)、抑制劑和dc腫瘤疫苗。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬患者被診斷出患有肝細(xì)胞癌。目前，對于肝細(xì)胞癌的治療主要是手術(shù)切除、肝臟移植、放化療等，但僅有20％的患者能夠被治療。我國肝細(xì)胞癌年死亡率占腫瘤死亡率的第2位。肝細(xì)胞癌的病因及發(fā)病機制尚未確定，因此，尋找新的肝細(xì)胞癌的治療靶點和藥物是研究重點。基于dc的生物治療格外引人矚目。理論上說，dc是激發(fā)適應(yīng)性免疫最有效的apc，將其在體外荷載腫瘤抗原后回輸，荷肽dc通過mhc/抗原肽-tcr的相互作用激活特異性t細(xì)胞，從而啟動抗瘤免疫應(yīng)答，預(yù)防或者清除腫瘤。這種方法安全而少副作用，對微小和轉(zhuǎn)移病灶更有傳統(tǒng)手段無可比擬的高度靶向性。但實際運用時，僅僅荷肽的dc往往并不能激發(fā)足夠強大的抗瘤免疫應(yīng)答，所以治療效果不如預(yù)期理想。這是由于為躲避宿主免疫系統(tǒng)攻擊，腫瘤發(fā)展出多種多樣的逃逸機制，在抗原提呈階段，就可能存在腫瘤抗原免疫原性低下、mhc分子表達(dá)減少、協(xié)同刺激分子缺如、分泌抑制性細(xì)胞因子等因素。因此，為提高疫苗的效能，就必須采取一定的方法來修飾、處理dc，增強其抗原提呈能力。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種提高dc疫苗抗肝癌效果的基因靶標(biāo)、抑制劑和dc腫瘤疫苗。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術(shù)方案如下：基因socs2作為靶標(biāo)在制備dc肝癌疫苗方面的應(yīng)用。基因socs2的抑制劑在制備dc肝癌疫苗方面的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抑制劑為抑制基因socs2表達(dá)的sirna或含抑制基因socs2表達(dá)的sirna序列的載體。優(yōu)選地，所述抑制劑為seqidno.1所示的外源肽。優(yōu)選地，所述外源肽n和/或c末端被化學(xué)修飾。優(yōu)選地，所述外源肽的n末端被乙酰化修飾，c末端被酰胺化修飾。優(yōu)選地，所述外源肽為游離形式或藥學(xué)上可以接受的成鹽形式，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和酒石酸鹽。一種生物制品，含有上述抑制劑。上述生物制品在制備dc肝癌疫苗方面的應(yīng)用。一種dc肝癌疫苗，其dc細(xì)胞的socs2基因低表達(dá)。本發(fā)明的突出優(yōu)點：本發(fā)明證明，通過sirna抑制dc中socs2表達(dá)可以顯著提高dc疫苗的體內(nèi)抑瘤效果，而本發(fā)明提供的外源肽為dc中socs2表達(dá)的有效抑制劑，具有與sirna相似的功能，可以顯著提高dc疫苗的體內(nèi)抑瘤效果。使用socs2的表達(dá)抑制劑和本發(fā)明提供的外源肽可以用于制備更優(yōu)抗肝癌效果的dc肝癌疫苗。附圖說明圖1為各組成熟dc中socs2mrna的相對表達(dá)量；圖2為各組成熟dc接種20天后對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤率(％)。具體實施方式下面就結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細(xì)，凡是實驗中未詳細(xì)描述的部分均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)操作。一、實驗材料人肝細(xì)胞株瘤細(xì)胞株hhcc購于美國atcc，并有本公司保存。將hhcc細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有10％fbs的rpmi-1640，貼壁細(xì)胞用0.25％的胰酶消化。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。balb/c小鼠購于南京君科生物工程有限公司。本發(fā)明外源肽通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)多肽固相合成技術(shù)合成，采用芴甲氧羰基(fmoc)n端保護策略。按照樹脂固相合成的方法依次連接相應(yīng)氨基酸，期間依次脫去fmoc-保護基團，然后切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)c18柱分離純化，hplc和ms檢測確證了本發(fā)明外源肽的結(jié)構(gòu)，且純度均≥98％。其氨基酸序列如下(n末端→c末端)，末端未經(jīng)化學(xué)修飾：qedlmgpnqtdgepc(seqidno.1)二、實驗方法1、細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤裂解物的制備人肝細(xì)胞株瘤細(xì)胞株hhcc購于美國atcc，并由本公司保存。將hhcc細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含有10％fbs的rpmi-1640，貼壁細(xì)胞用0.25％的胰酶消化。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。balb/c小鼠購于南京君科生物工程有限公司。腫瘤裂解物的制備：將hhcc細(xì)胞接種于含有10％fbs的rpmi-1640的培養(yǎng)瓶中，待貼壁達(dá)到80％時，取貼壁細(xì)胞，用pbs洗滌重懸至3×107/ml，經(jīng)-80℃/37℃反復(fù)凍融5次，超聲波裂解1次，離心收集上清即得腫瘤裂解物，冷凍干燥。2、bm-dc的培養(yǎng)參考garrigan等人方法：rpmi-1640沖洗小鼠長骨髓腔獲得骨髓細(xì)胞，tirs-nh4裂解去除紅細(xì)胞，用含10％fcs、20ng/mlrmgm-csf(r&d)的rpmi-1640完全培養(yǎng)基重懸至3×106細(xì)胞/ml，1ml/孔接種至24孔培養(yǎng)板，37℃、5％co2培養(yǎng)。每隔2-3d，輕輕吹打，3/4量換液以去除懸浮細(xì)胞，并補液至原體積。5～7d后，收集懸浮和松散貼壁的細(xì)胞即為未成熟的樹突狀細(xì)胞(idc)。3、外源肽和sirna沉默socs2基因表達(dá)sirna沉默組：收集培養(yǎng)第6天的idc，轉(zhuǎn)染有綠色熒光染料fam標(biāo)記、針對socs2mrna的sirna(委托上海吉瑪設(shè)計合成)，步驟如下：按每孔3μlfam-sirna、3μlgeneporter(genetherapysystems)、96μl無血清rpmi-1640混合，接種至12孔培養(yǎng)板，25℃孵育30min。隨后，用無血清rpmi-1640重懸idc至2×106細(xì)胞/ml，以1ml/孔加入孵育有轉(zhuǎn)染試劑的12孔培養(yǎng)板，37℃孵育4h；最后，每孔加入1ml含10％fcs、20ng/mlrmgm-csf的rpmi-1640完全培養(yǎng)基，37℃孵育8h。外源肽沉默組：收集培養(yǎng)第6天的idc，不轉(zhuǎn)染sirna，于12孔培養(yǎng)板中以含10％fcs、20ng/mlrmgm-csf的rpmi-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整成與sirna沉默組終體積相同、細(xì)胞濃度相同的培養(yǎng)體系，但是培養(yǎng)基中含終濃度為10μm的外源肽，37℃孵育8h。陰性對照組：同外源肽沉默組，但是培養(yǎng)基中不含外源肽，37℃孵育8h。4、dc荷載腫瘤裂解物與lps刺激成熟未沉默和沉默socs2的idc用含腫瘤裂解物(200μg/ml))、lps(100ng/ml)的rpmi-1640完全培養(yǎng)基重懸至2×106細(xì)胞/ml，1ml/孔接種至24孔板，37℃孵育24h以成熟。其中，未沉默socs2者標(biāo)記為nsi-dc，sirna沉默者標(biāo)記為ssi-dc，外源肽沉默者標(biāo)記為psi-dc。通過流式法檢測檢測cd11c、cd80、cd86的表達(dá)檢測dc純度和成熟度。5、rt-pcr檢測dc中socs2mrna表達(dá)用trizol法提取nsi-dc、ssi-dc、psi-dc的總rna。采用兩步法rt-pcr，參照takara公司amv反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄。cdna的pcr反應(yīng)體系如下：2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，5μl的10×pcrbuffer(mg2+free)，3μlmgcl2(25mmol/l)，4μl的dntpmixture(2.5mmol/l)，0.25μl的taq酶(5u/μl)，上下引物各1μl(l20μmol/l)，加滅菌蒸餾水調(diào)至50μl體系。選用小鼠gapdh作內(nèi)參，引物序列如下：socs2上游引物：5’-agctcggtcagacaggatgg-3’(seqidno.2)socs2下游引物：5’-ttcgaagattagttggtccagc-3’(seqidno.3)gapdh上游引物：5’-atatggtacgcgaggtgagg-3’(seqidno.4)gapdh下游引物：5’-gtgattttagggacgctcca-3’(seqidno.5)pcr產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，gv染色后紫外線投射儀下觀察結(jié)果，經(jīng)凝膠掃描成像系統(tǒng)拍照，用quantityone軟件半定量分析結(jié)果，即socs2mrna條帶的灰度值/gapdh條帶的灰度值，取平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。7、荷瘤動物的建模與治療balb/c小鼠于右背部皮下接種hhcc細(xì)胞1×106/只，接種2周后成瘤率100％，瘤徑約5mm。將成瘤裸鼠隨機分為4組：sirna沉默組、外源肽沉默組、陰性對照組和空白對照組，每組10只。從第15天開始，sirna沉默組、外源肽沉默組、陰性對照組每2天分別于皮下注射ssi-dc、psi-dc、nsi-dc的滅菌pbs懸液(1×106/50μl)，空白對照組注射等量滅菌pbs，連續(xù)注射4次。為了充分促進機體免疫反應(yīng)，每次注射dc或pbs后再腹腔注射lps，每只每次30μg/200μl。第25天開始(接種dc第10天)，游標(biāo)卡尺每2天測一次腫瘤體積。接種dc20天后，處死小鼠，剝離腫瘤塊，計算sirna沉默組、外源肽沉默組、陰性對照組相對于空白對照組的腫瘤抑制率(％)，公式：腫瘤抑制率(％)＝(空白對照組體積-sirna沉默組/外源肽沉默組/陰性對照組體積)/空白對照組體積×100％。8、數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用spss20.0軟件進行，數(shù)據(jù)表示方法為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗，p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。三、實驗結(jié)果1、各組dc純度和成熟度cd11c是小鼠髓系來源dc的特異性標(biāo)志，各組dc的cd11c均呈陽性表達(dá)，且純度在80％以上。cd80、cd86是與dc抗原呈遞相關(guān)的標(biāo)志分子，成熟前均低表達(dá)，但成熟后均顯著高表達(dá)，其中，成熟dc的cd80的純度均在80％以上，cd86的純度均在50％以上。結(jié)果表明，nsi-dc、ssi-dc、psi-dc均為成熟的dc細(xì)胞。2、各組成熟dc中socs2mrna表達(dá)與陰性對照組nsi-dc相比，sirna沉默組ssi-dc、外源肽沉默組psi-dc中的socs2mrna表達(dá)顯著下調(diào)(p<0.05)，各組socs2mrna相對表達(dá)量見表1和圖1。表1各組成熟dc中socs2mrna的相對表達(dá)量組別socs2mrna相對表達(dá)量陰性對照組1.24sirna沉默組0.32外源肽沉默組0.393、各組成熟dc對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤率(％)與陰性對照組nsi-dc相比，sirna沉默組ssi-dc、外源肽沉默組psi-dc對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤率顯著升高，腫瘤生長緩慢，具有明顯的抑制作用。各組成熟dc接種20天后對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤率(％)見表2和圖2。表2各組成熟dc接種20天后對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤率(％)組別體內(nèi)抑瘤率(％)陰性對照組35sirna沉默組73外源肽沉默組67實驗證明，通過sirna抑制dc中socs2表達(dá)可以顯著提高dc疫苗的體內(nèi)抑瘤效果，而本發(fā)明提供的外源肽為dc中socs2表達(dá)的有效抑制劑，具有與sirna相似的功能，可以顯著提高dc疫苗的體內(nèi)抑瘤效果。使用socs2的表達(dá)抑制劑和本發(fā)明提供的外源肽可以用于制備更優(yōu)抗肝癌效果的dc肝癌疫苗。上述實施例是對本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，不應(yīng)將本發(fā)明的保護范圍局限于上述具體的實施例。sequencelisting<110>南京蓋斯夫醫(yī)藥科技有限公司<120>一種提高dc疫苗抗肝癌效果的基因靶標(biāo)、抑制劑和dc腫瘤疫苗<130>1<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>15<212>prt<213>人工序列<400>1glngluaspleumetglyproasnglnthraspglygluprocys151015<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agctcggtcagacaggatgg20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ttcgaagattagttggtccagc22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4atatggtacgcgaggtgagg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gtgattttagggacgctcca20當(dāng)前第1頁12