專利名稱：一種用于玻璃體切割手術的灌注液及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于玻璃體切割手術的灌注液。
背景技術：
白內障是玻璃體切割手術后的最常見并發癥，是引起術后視力下降的重要原因，其形成機制目前尚不確定。在現代玻璃體切割術中，眼內灌注是必不可少的，由于灌注液為眼科平衡鹽溶液(BSS溶液)，在生產和使用過程當中與空氣飽和，氧分壓相對較高，約為21％×760mmHg(21.2kPa)。所以，在玻璃體切割術中，由于灌注液對玻璃體和前房液的置換，晶狀體長時間與灌注液接觸而暴露在高氧分壓環境下，引起晶狀體內氧分壓水平顯著增高，這一改變可能導致晶狀體內生化代謝的紊亂，導致術后白內障的發生。

發明內容
本發明的目的是提供用于玻璃體切割手術的能防止術后白內障形成的灌注液。
本發明所提供的用于玻璃體切割手術的灌注液，為眼科平衡鹽溶液，其中，在37℃下，眼科平衡鹽溶液中氧氣分壓為2kPa-10kPa。優選的，氧氣分壓為2kPa，該氧氣分壓接近于生理水平，使用時更能減少晶狀體上皮細胞的凋亡，從而能進一步降低玻璃體切割術后白內障的發生率。
在本發明中，眼科平衡鹽溶液為目前常用的各種眼科平衡鹽溶液，優選的，眼科平衡鹽溶液每1ml含如下含量的組分CaCl2·2H2O 0.48mg，MgCl2·6H2O 0.30mg，CH3COONa·3H2O 3.90mg，C6H5O7Na3·2H2O 1.7mg，NaCl6.4mg，KCl 0.75mg；溶劑為注射用水。
本發明灌注液的制備方法，是將氧氣分壓為2k-10kPa的混合氣體通入裝有眼科平衡鹽溶液的容器中，同時加熱容器至37℃后將容器置于37℃恒溫箱中，眼科平衡鹽溶液與混合氣體充分飽和后，得到所述灌注液。
其中，混合氣體由氧氣和氦氣組成，氦氣是惰性氣體，化學性質穩定，且沒有細胞毒性，不會影響灌注液的使用安全性。
本發明通過提供一種具有低氧分壓的眼科平衡鹽溶液，降低了其中氧分壓(2kPa-10kPa)，以該灌注液作用于眼睛晶狀體時，能減少晶狀體上皮細胞凋亡的數量，從而降低玻璃體切割術后白內障的發生率。


圖1為實驗組和對照組處理后晶狀體平均密度的變化曲線；圖2為TUNEL法檢測晶狀體上皮細胞凋亡照片；圖3A為正常晶狀體上皮細胞照片；圖3B為實驗組處理12h后晶狀體上皮細胞照片；圖3C為對照組處理12h后晶狀體上皮細胞照片。
具體實施例方式
實施例1、灌注液的制備將氧分壓為2％×760mmHg(2kPa)的混合氣體(由氧氣和氦氣組成，氦氣是惰性氣體，化學性質穩定，且沒有細胞毒性)通入裝有眼科平衡鹽溶液(BSS溶液，愛爾康公司產品)的實驗用透明玻璃瓶中，同時加熱容器至37℃后將容器置于37℃恒溫箱中，以防止溫度變化對氧分壓的影響。BSS溶液與混合氣體充分飽和，即得到本發明灌注液。
該BSS溶液每1ml含如下含量的組分CaCl2·2H2O 0.48mgMgCl2·6H2O 0.30mgCH3COONa·3H2O3.90mgC6H5O7Na3·2H2O(檸檬酸鈉) 1.7mgNaCl 6.4mgKCl 0.75mg溶劑為注射用水實施例2、灌注液處理晶狀體實驗一、實驗對象新西蘭大白兔30只，體重2.5-3.0kg，年齡，雌雄不限。
二、實驗試劑BSS溶液(愛爾康公司產品)，TUNEL試劑盒、DAB和0.3％H2O2甲醇溶液均購自北京中衫金橋生物技術有限公司，枸櫞酸鈉購自天津化學試劑廠，TritonX-100購自北京鼎國生物技術有限責任公司，氯胺酮和氯丙嗪購自北京醫藥股份有限公司。氧分壓為2％×760mmHg(2kPa)的混合氣體購自北京天昊氣體有限公司。
三、實驗儀器前節分析儀(德國Oculus公司Pentacam照相系統)，電熱恒溫培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司)，HS10D-22880Wedel型手術顯微鏡(德國HAAG-STREIT公司)，LEICA DM 4000B生物顯微鏡(德國LEICA公司)，透射電鏡(日本電子100CX-II)。
四、實驗方法1.分離晶狀體肌注氯胺酮(35mg/Kg)和氯丙嗪(5mg/Kg)對兔子進行麻醉，常規消毒鋪巾，摘除眼球，生理鹽水沖洗3次，從眼球后壁剪開鞏膜，不完全去除玻璃體(玻璃體對晶狀體有保護作用，防止外界大氣中的氧氣進入晶狀體；同時保留部分玻璃體可以使晶狀體免受機械損傷)。然后，鈍性離斷晶狀體懸韌帶，將晶狀體迅速移入事先已準備好的玻璃容器中。分離晶狀體的操作均在手術顯微鏡下進行，防止對晶狀體的機械損傷。
2.處理晶狀體2.1實驗組將晶狀體迅速移入裝有實施例1所得灌注液的容器中，蓋上橡膠蓋子并用醫用凡士林將容器密封(此操作于37℃恒溫箱中完成)。此時計為0時，隨后于1、4、8和12h各取出一容器，取其中的晶狀體測量密度和用TUNEL法檢測細胞凋亡。晶狀體的分配按隨機原則，每組6個，共4組。
2.2對照組將裝有BSS的實驗用透明的玻璃容器敞口與空氣充分接觸，加熱容器至37℃后將容器置于37℃恒溫箱中，以防止溫度變化對氧分壓的影響。BSS與空氣充分飽和后氧分壓約為21％×760mmHg(21.2kPa)。按以上步驟分離晶狀體，將晶狀體迅速移入容器中，蓋上橡膠蓋子并用醫用凡士林將容器密封(此操作于37℃恒溫箱中完成)。此時計為0時，隨后于1、4、8和12h各取出一容器，取其中的晶狀體測量密度和用TUNEL法檢測細胞凋亡。晶狀體的分配按隨機原則，每組6個，共4組。
3.晶狀體密度的測量于0、1、4、8、和12h用前節分析儀分別測量每個晶狀體的密度，測量方法取晶狀體軸與水平線垂直時測量晶狀體密度，選取每個晶狀體的前極、后極和兩端位于赤道上的點共四個點來測量密度，相加每個點的密度除以4計算出不同觀察時間點兩組晶狀體的平均密度，繪制出時間—平均晶狀體密度曲線。對兩組的晶狀體平均密度進行統計學分析，采用t檢驗。
4.TUNEL法檢測細胞凋亡現在普遍認為，晶狀體上皮細胞凋亡是所有人類和動物非先天性白內障形成的共有的細胞學基礎。晶狀體上皮細胞的凋亡，引發了白內障，因此檢測晶狀體上皮細胞凋亡是判斷是否發生早期白內障的可靠指標。
沿赤道部剪開晶狀體囊，將前囊連同上皮細胞一起撕下，平鋪在載玻片上，上皮細胞層面朝上。經空氣干燥后用4％的多聚甲醛室溫固定30min，PBS洗片后，與0.3％H2O2甲醇溶液室溫孵育30min。PBS洗片后，與通透液(0.1％TritonX-100溶于0.1％枸櫞酸鈉溶液中)在冰浴中孵育2min。PBS洗片后與試劑盒提供的TUNEL反應混合液37℃孵育60min，PBS洗片后，加入轉化劑POD(辣根過氧化物酶)，37℃孵育30min，PBS洗片，再與DAB室溫孵育10min。蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。在生物顯微鏡下，每個標本隨機選取4個視野，每個視野計數200個細胞，計算凋亡細胞百分數。用SPSS10.0統計軟件包處理，采用t檢驗。
5.鏡樣品制備及觀察在觀察時間為12h時，取實驗組和對照組各6個晶狀體做電鏡觀察。將晶狀體前囊膜連同上皮細胞于3％戊二醛中固定2h后，至4℃保存。1％鋨酸固定1h，丙酮逐級脫水，包埋劑包埋，80℃聚合過夜。定位于視軸，萊卡ULTRACUT型超薄切片機切片，鈾鉛雙重染色，電鏡下觀察并拍照。
五、實驗結果1、晶狀體密度的變化隨著觀察時間的延長，實驗組(氧氣分壓為2kPa)和對照組(氧氣分壓為21.2kPa)晶狀體的平均密度逐漸增加，在1、4、8和12h有統計學差異，結果如圖1所示。由圖1可見，在1、4、8和12h時，實驗組的晶狀體平均密度明顯高于對照組，有統計學差異(p＜0.05)。
2、TUNEL法檢測細胞凋亡如圖2，光鏡下觀察凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色(深色)，未凋亡細胞的細胞核呈藍色(淺色)。1h時，實驗組和對照組的凋亡細胞數量稀少，兩組的凋亡細胞百分比分別為2.16％和3.06％(p＞0.05)，未見統計學差異；隨著觀察時間的延長，實驗組和對照組在4、8和12h的凋亡細胞數量逐漸增多，凋亡細胞百分比也增加，且各時間點的p值均小于0.05，有統計學意義(如表1)；并且，4、8和12h時，實驗組的凋亡細胞數量少于對照組，且兩組的凋亡細胞百分比有統計學差異(p＜0.05)。
表1 不同氧分壓組不同時間晶狀體上皮細胞凋亡細胞百分率的比較(X±s，％)

3、透射電鏡觀察如圖3A，正常晶狀體上皮細胞為立方形，核為橢圓形，核膜清晰，染色質呈細顆粒狀均勻分布于核內，細胞器亞微結構清晰易辨。如圖3B和圖3C，12h后，實驗組和對照組的晶狀體上皮細胞均出現細胞體積變小，細胞外形極不規則，細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構，核染色質固縮、邊集，核膜模糊甚至破壞，胞漿濃縮，以上改變均符合細胞凋亡的形態學特征。但比較圖3B(實驗組)和圖3C(對照組)，對照組晶狀體上皮細胞破壞程度較實驗組嚴重。
本發明用TUNEL法觀察在不同氧分壓條件下晶狀體上皮細胞發生凋亡的變化，并通過透射電鏡對細胞凋亡情況進一步確認，發現高氧分壓組(對照組)的凋亡細胞百分比明顯高于低氧分壓組(實驗組)，差異有統計學意義(p＞0.05)；同時，還應用了前節分析儀檢測兩組晶狀體的密度，發現在各時間點均有統計學差異(p＜0.05)，高氧分壓組(對照組)比低氧分壓組(實驗組)的晶狀體密度高。以上結果表明，目前臨床中使用的灌注液(實驗組)所具有的高氧分壓因素對晶狀體是有損傷的，其對晶狀體的損傷表現為急性損傷和慢性損傷兩種高氧張力一方面可以引起晶狀體囊膜的功能障礙，使其通透性發生改變，水分和離子等物質進入晶狀體，短時間內引起晶狀體密度增高；另一方面通過加速晶狀體上皮細胞凋亡而使晶狀體發生核硬化的。相對于急性氧損傷，慢性氧損傷的這種毒性作用更為持久且為不可逆的。降低灌注液的氧分壓水平可以減少晶狀體上皮細胞凋亡的數量，從而有可能降低玻璃體切割術后白內障的發生率。
權利要求
1.一種用于玻璃體切割手術的灌注液，為眼科平衡鹽溶液，其特征在于在37℃下，眼科平衡鹽溶液中氧氣分壓為2kPa-10kPa。
2.根據權利要求1所述的用于玻璃體切割手術的灌注液，其特征在于所述氧氣分壓為2kPa。
3.根據權利要求1或2所述的用于玻璃體切割手術的灌注液，其特征在于所述眼科平衡鹽溶液每1ml含如下含量的組分CaCl2·2H2O 0.48mg，MgCl2·6H2O 0.30mg，CH3COONa·3H2O3.90mg，C6H5O7Na3·2H2O 1.7mg，NaCl 6.4mg，KCl 0.75mg；溶劑為注射用水。
4.權利要求1所述灌注液的制備方法，是將氧氣分壓為2k-10kPa的混合氣體通入裝有眼科平衡鹽溶液的容器中，同時加熱容器至37℃后將容器置于37℃恒溫箱中，眼科平衡鹽溶液與混合氣體充分飽和后，得到所述灌注液。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述混合氣體由氧氣和氦氣組成。
全文摘要
本發明公開了用于玻璃體切割手術的灌注液及其制備方法。本發明所提供的用于玻璃體切割手術的灌注液，為眼科平衡鹽溶液，其中，在37℃下，眼科平衡鹽溶液中氧氣分壓為2kPa－10kPa。優選的，氧氣分壓為2kPa。本發明通過提供一種具有低氧分壓的眼科平衡鹽溶液，降低了其中氧分壓(2kPa－10kPa)，以該灌注液作用于眼睛晶狀體時，能減少晶狀體上皮細胞凋亡的數量，從而降低玻璃體切割術后白內障的發生率。
文檔編號A61P27/02GK101062051SQ20071009964
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月25日 優先權日2007年5月25日
發明者梁建宏, 郭麗莉, 黎曉新 申請人:北京大學人民醫院