專利名稱：：人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及人谷胱苷肽-S-轉移酶pi的新用途，具體涉及采用His-tag重組蛋白純化技術純化的人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥藥物中的應用。二、
背景技術：
1985年，Coris首先提出全身炎癥反應綜合征(systemicinflammationresponsesyndrome,SIRS)是由不同疾病，包括微生物感染、創傷、燒傷等感染性疾病所引起的全身性的非特異性炎癥反應，最終導致機體對炎癥反應的失控。根據臨床表現分為全身感染或膿毒癥、敗血癥綜合征、早期感染性休克、難治性感染性休克、多器官功能障礙綜合征以及死亡6期。最近的臨床資料表明，革蘭氏桿菌所致全身炎癥反應綜合征的主要死亡原因是內毒素的作用。SIRS是一動態發展、連續的過程，治療得當可使病情早期得到控制，避免其進一步發展。目前臨床治療措施有1、抗介質制劑治療。目前國外巳將包括單克隆腫瘤壞死因子(TNF-a)抗體、重組人類白介素-1受體拮抗劑、TNF受體、內毒素單克隆抗體等抗炎介質應用于臨床。2、CRRT治療。通過體外循環清除血液中的代謝產物、內源性抗體、異常血漿成分及蓄積體內的藥物或毒物。3、核因子-kB(NF-kB)抑制劑治療。NF-KB抑制劑有糖皮質激素、IL-10等，糖皮質激素通過活化的糖皮質激素受體與調節它們表達的轉錄子結合而抑制炎癥基因的表達；而IL-10可抑制與輔助T淋巴細胞1(Thl)反應相關的許多細胞因子基因的轉錄。4、基因治療。利用脂質體轉基因技術制成病毒疫苗傳遞某些必要的基因，可對抗過強的炎癥反應，現己成功地給實驗動物轉入抗炎因子基因IL-4、IL-IO，抗氧化劑和抗蛋白酶等基因調節免疫應答，增強細胞的反應性、耐受性。目前的抗炎藥物一定程度上都存在缺陷，很多藥物抗炎療效并不理想或不良反應較大，在減輕組織炎癥損傷的同時亦削弱了機體免疫力，不利于炎癥的治療。提高抗炎藥物的療效和降低藥物對機體正常免疫力的影響是各國科學家一直不斷努力的研究目標。1961年，Boouh首先發現了谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)，該酶是由2個同源酶二聚體亞基組成的一個超基因家族，有a、ii、pi3種，在體內主要催化外源性和內源性親電子有毒物質與谷胱苷肽結合，形成親水性強的物質而起到解毒作用。目前研究最多的是pi亞型，已有研究表明谷胱苷肽-S-轉移酶pi(GSTpi)與腫瘤的耐藥性/腫瘤的發生發展有密切關系。目前尚未發現GSTpi在抗炎方面的應用。另外，未見應用重組蛋白純化技術表達、純化GSTpi的相關報道。三、
發明內容1、發明目的本發明的目的是提供一種人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制藥中的新用途，即提供一種人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥反應綜合癥以及由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應用。2、技術方案本發明為人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥反應綜合征疾病藥物中的應用。本發明為人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應用。為了更好地理解本發明的實質，下面將用重組蛋白純化技術得到人谷胱苷肽-S-轉移酶pi(GSTpi)的方法以及GSTpi的藥理藥效試驗的結果來說明其在制藥領域中的新用途。(1)人谷胱苷肽-S-轉移酶pi的表達純化方法方法一、第一步將含表達載體pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,瓊脂15g,用去離子水定容至1升，37'C振蕩培養12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g,用去離子水定容至l升，37"C振搖培養16h，然后取lmL接種到100mLLB液體培養基，37t)振搖培養24h，006。。達到0.50.6時，加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM，繼續振搖培養4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的結合緩沖液重懸誘導表達后收集的菌體沉淀，經超聲破碎后，12,500g，4'C離心15min后取上清，上清與經結合緩沖液預平衡過的IDA-N廣樹脂在4'C結合40min，用以上結合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HC1,60mM咪唑，PH7.9的洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5MNaCl,20rnMTris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5MNaCl,20mMTris-HC1,PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析測定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM1(1^卩04的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割Hise標簽。方法二、第一步將含表達載體pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素IOOrag/L的LB固體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨IOg，酵母提取物5g,NaCl10g,瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37'C振蕩培養12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaCl10g,用去離子水定容至1升，37'C振搖培養16h，然后取1mL接種到100raLLB液體培養基，37'C振搖培養3h,OD咖達到0.50.6時，加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM,繼續振搖培養4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04的PBS緩沖液重懸誘導表達后收集的菌體沉淀，經超聲破碎后，12,500g，4t)離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C結合30min,PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50raMTris-HC1,pH8.0,10raM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次。第三步合并3次洗脫液上清，用PBS緩沖液透析。(2)人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在炎癥治療中的應用①LPS是大腸桿菌內毒素的主要成分，常作為致傷劑，用于誘導動物全身炎癥反應綜合征。當空腹注射37.5mg/Kg的LPS時，小鼠死亡率達70%;而注射LPS后30分鐘再注射2mg/kg的GSTpi，小鼠死亡率降為30%。實驗證明GSTpi非常顯著地對抗全身炎癥反應綜合征(SIRS)的致死作用，大大提高了動物的存活率。②一氧化氮(N0)含量的增加是全身炎癥反應綜合征(SIRS)的結果，NO在全身炎癥反應中的作用是降低血壓、產生氧自由基如0N000N00是NO致細胞毒性的主要物質，過量的氧化自由基導致細胞壞死、組織損傷和器官功能衰竭(鄒岡等.基礎神經藥理學，第二版.科學出版社1999，5.)本實驗測定LPS刺激后小鼠血清NO的水平。結果表明GSTpi通過抑制氧化自由基NO的增高來抵御全身反應綜合征(SIRS)的發展。③髓過氧化物酶(MP0)是白細胞中的一種炎性標志物，組織中MPO活性的增加反應了白細胞的浸潤。本實驗測定LPS刺激后肺組織中MP0的活性。結果表明GSTpi抑制肺組織中MP0的活性，說明其阻止全身反應綜合征(SIRS)的發展。④誘生型一氧化氮合酶(iN0S)是SIRS中N0產生的關鍵酶，巨噬細胞iN0S表達的增加是炎癥發展的標志，本實驗表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細胞系RAW264.7細胞iNOS的表達，表明其阻止炎癥反應的發展。⑤環氧化酶-2(C0X—2)是體內前列腺素合成的限速酶，與炎癥反應密切相關，本實驗表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細胞系RAW264.7細胞COX—2的表達，進一步表明其阻止炎癥反應的發展。3、有益效果本發明的有益效果是提供了用重組蛋白純化技術得到的人谷胱苷肽-S-轉移酶pi的新用途，為炎癥的治療特別是全身性炎癥反應綜合癥找到了一種新型有效藥物。人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在炎癥治療中的應用，不僅能有效控制炎癥，避免其進一步發展；而且對機體免疫系統的影響較小；作為一種內源性蛋白，給藥后不會引起免疫反應，副作用極小。四圖l、His-tag重組蛋白純化技術純化人谷胱苷肽-S-轉移酶pi圖2、GSTpi對LPS所致小鼠死亡率的影響圖3、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響圖4、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響圖5、WesternBlotting檢測GSTpi、Y7F對LPS誘導RAW264.7細胞iNOS合成的抑制作用圖6、WesternBlotting檢測GSTpi對LPS誘導RAW264.7細胞COX-2合成的抑制作用五具體實施方式實施例1、帶組氨酸標簽的人谷胱甘肽S-轉移酶(Hise-hGSTpi)重組蛋白的純化方法1)實驗儀器及材料菌株E.coh'DH5a和E.co7iBL21(DE3)，質粒pET-28a、HisBind蛋白純化試劑盒購自Novagen公司，恒溫振蕩培養箱，超聲破碎儀，4'C層析柜。2)實驗步驟方法一第一步將含表達載體pET-28a/hGSTpi的E.co力'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，36-38'C振蕩培養12h,挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g,用去離子水定容至l升，36-38'C振搖培養16h，然后取1mL接種到100mLLB液體培養基，37。C振搖培養2~4h，ODMO達到0.50.6時,加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM，繼續振搖培養4-5h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的結合緩沖液重懸誘導表達后收集的菌體沉淀，經超聲破碎后，12,500g，4。C離心15min后取上清，上清與經結合緩沖液預平衡過的IDA-N;T樹脂在4°C結合40min，用以上結合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HCl，60mM咪唑，PH7.9洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，ffl7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析測定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM10^04的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割Hise標簽，獲得純化的人谷胱甘肽S-轉移酶hGSTpi。方法二第一步將含表達載體pET-28a/hGSTpi的E.co7iBL21/DE3菌株接種于含卡那霉素IOOmg/L的LB固體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨IOg,酵母提取物5g，NaCl10g,瓊脂15g，用去離子水定容至1升，36-38""C振蕩培養12h,挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養基，每升培養基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用去離子水定容至l升，36-38'C振搖培養16h，然后取1mL接種到100raLLB液體培養基，37。C振搖培養24h，OD朋。達到0.50.6時，加異丙基P-半乳糖苷至終濃度為0.4mM,繼續振搖培養4-5h,12，500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04的PBS緩沖液重懸誘導表達后收集的菌體沉淀，經超聲破碎后，12,500g,4'C離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C結合30min，PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50mMTris-HC1:pH8.0，10raM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次。第三步合并3次洗脫液上清，用PBS緩沖液透析。3)實驗結果由圖l可以看出，釆用以上方法純化得到的人谷胱甘肽S-轉移酶(hGSTpi)重組蛋白純度高、產量高，且空氣氧化形成的無活性二聚體少。實施例2、GSTpi對LPS所致小鼠死亡率的影響1)實驗儀器與材料LPS(Sigma)使用時用IXPBS配制，GSTpi(本實驗室純化)使用時用IXPBS配制；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫科大學。2)實驗步驟取雄性20土2gICR小鼠腹腔注射LPS(37.5mg/kg)后30min，分別腹腔給藥GSTpi(2mg/kg)，觀察并記錄LPS組和LPS+GSTpi組小鼠的存活率。3)實驗結果由圖1可以看出GSTpi可以提高LPS引起小鼠炎癥后的存活率。LPS刺激40小時后，LPS組小鼠存活率僅有30X而腹腔給予GSTpi后，小鼠存活率提高到了60%(LPS+GSTpi組)。表l.QSTpi別t"LPS引起炎近巨后<、鼠存活^^的影響(％)0510152025303540455055606570LPS100100100958080707070707070707070LPS+GSTpi100100100957545353030303030303030動物數每組20只。實施例3、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響1)實驗儀器與材料LPS(Sigma)使用時用1XPBS配制，GSTpi(本實驗室純化)使用時用1XPBS配制；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫科大學；NO試劑盒(硝酸還原酶法)，購于南京建成生物。2)實驗步驟取雄性20士2gICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8和12小時眼眶取血采集小鼠血液樣本，1000rpm/min離心取血清，參照NO試劑盒方法，檢測血清中NO含量。3)實驗結果由圖2可以看出，LPS引起動物炎癥反應后，血清中NO含量顯著升高且隨著LPS刺激時間的延長，NO含量持續升高。GSTpi可以抑制NO的分泌，在12小時顯示了顯著的抑制效果；相反，GSTpi的4M變體則不具有這種抑制作用，該組動物血清中NO含量與LPS組無顯著差異。^\-__^間(h)4812LPS112.42±86.181061.11±33.921884.7±40.87LPS+GSTpi265.62±46.551123.40±64.931327.45±131.77*LPS+GSTpi4Mmutant229.80±14.461052.81±106.901688.37±100.39結果由均值土標準差表示，*P<0.05，與LPS組比較，n=5。實施例4、GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響1)實驗儀器與材料LPS(Sigma)使用時用IXPBS配制，GSTpi(本實驗室純化)使用時用IXPBS配制；3%戊巴比妥鈉；無菌注射器；雄性清潔級ICR小鼠購于南京醫科大學；'MPO試劑盒，購于南京建成生物。2)實驗步驟選取雄性20g左右ICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8、12和16小時麻醉動物打開胸腔，剪開左心房后經右心室注入100ml生理鹽水沖洗肺部，待沖洗干凈后摘取肺。玻璃勻漿器研磨后用超聲破碎儀破碎細胞，參照MPO試劑盒檢方法，測肺組織勻漿中MPO活性。3)實驗結果由圖3可以看出，LPS引起動物炎癥反應后，肺部MPO活性顯著升髙且隨著LPS刺激時間的延長，MPO活性持續升髙。GSTpi可以抑制MP0活性，LPS刺激動物后30min腹腔注射GSTpi后動物肺部MPO活性被抑制，在4、8、12和16小時均有顯著抑制效果。相反，GSTpi的4M變體的這種抑制作用要小的多，在LPS的刺激下，該組動物肺部MPO活性仍然趨于升高。表3.GSTpi對LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結果由均值士標準差表示，**P<0.01，與LPS組比較，n=5。實施例5:WesternBlotting檢測GSTpi、Y7F對LPS誘導RAW264.7細胞iNOS合成的抑制作用1)實驗儀器與材料電泳儀BioRad;LPS(Sigma)使用時用IXPBS配制，GSTpi(本實驗室純化)使用時用IXPBS配制，GSTpiY7F變體(本實驗室純化)使用時用IXPBS配制；培養液DMEM(GIBCO);血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細胞系購于中科院上海細胞所。2)實驗步驟將RAW264.7細胞以105個/孔的密度接種于24孔板。細胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(:02條件下培養。當細胞密度達到70-80%時，加入終濃度為100ng/ml的LPS,30分鐘后，加入終濃度分別為5ug/ml的GSTpi或Y7F,以未經處理的細胞為陰性對照組。繼續培養12小時后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting檢測iNOS蛋白量。3)實驗結果由圖4可以看出未經LPS處理的細胞無iNOS表達，經LPS處理后，細胞iNOS表達量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導的iNOS的表達，且表現為劑量依賴性；但是GSTpi變體Y7F由于7位的酪氨酸突變為苯丙氨酸，失去酶活，不能抑制LPS誘導的iNOS的合成。此實驗結果說明GSTpi抑制NO合成的機制是通過抑制LPS誘導的iNOS的表達且其抑制作用依賴本身酶活。實施例6:WesternBlotting檢測GSTpi對LPS誘導RAW264.7細胞COX-2合成的抑制作用1)實驗儀器與材料電泳儀BioRad;LPS(Sigma)使用時用IXPBS配制，GSTpi(本實驗室純化)使用時用IXPBS配制，培養液DMEM(GIBCO)，血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細胞系，購于中科院上海細胞所2)實驗步驟將RAW264.7細胞以105個/孔的密度接種于24孔板。細胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(]02條件下培養。當細胞密度達到70-80%時，加入終濃度為100ng/ml的LPS，分別于1、2、4、6、8、IO小時后，加入終濃度為5yg/ml的GSTpi，以未經處理的細胞為陰性對照組。繼續培養12小時后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting檢測COX-2蛋白量。3)實驗結果由圖5可以看出未經LPS處理的細胞無COX-2表達，經LPS處理后，細胞COX-2表達量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導的COX-2的表達。此實驗結果說明GSTpi可通過抑制COX-2表達來抑制前列腺素的分泌，從而抑制炎癥反應及組織損傷。權利要求1、人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥反應綜合癥疾病藥物中的應用。2、人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應用。全文摘要本發明涉及人谷胱苷肽-S-轉移酶pi的新用途，具體涉及采用His-tag重組蛋白純化技術純化的人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療全身炎癥反應綜合癥疾病以及由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應用。6xHis-tag標簽分子量小，不會影響被修飾蛋白質的生理pH值，在大部分情況下不會改變被修飾蛋白質的免疫原性，結構和功能，也不會干擾蛋白的分泌；人谷胱苷肽-S-轉移酶pi在制備治療炎癥藥物中的應用，不僅能有效控制炎癥，避免其進一步發展，而且對機體免疫系統的影響較小，作為一種內源性蛋白，給藥后不會引起免疫反應，副作用極小。文檔編號A61K38/45GK101239184SQ20071030623公開日2008年8月13日申請日期2006年7月19日優先權日2006年7月19日發明者泓張,殷志敏,沈佳胤,宇王,蘭羅申請人:南京師范大學