專利名稱：：腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥提取物及其相關(guān)藥品的化學(xué)分析方法，具體的說是中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：中藥腫節(jié)風(fēng)是金粟蘭科植物草珊瑚Sarca"c/mg/a&m(Thunb.)Nakai的全草，又稱草珊瑚、九節(jié)風(fēng)、接骨茶等；味苦、辛、性平；具清熱涼血，活血消斑，祛風(fēng)通絡(luò)等功效；是我國常用的中草藥，用于治療血熱紫斑、紫癜、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等癥。腫節(jié)風(fēng)的水或不同濃度的乙醇提取物制成的單方制劑，如腫節(jié)風(fēng)片、腫節(jié)風(fēng)注射液、清熱消炎寧片、清熱消炎寧膠囊，或與其他中藥提取物制成復(fù)方制劑，如復(fù)方草珊瑚含片、新癀片、力'通炎康片，用于流行性感冒、咽喉炎、肺炎、急性胃腸炎、菌痢等。但是，到目前為止，對于腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑的鑒別方法僅包括試管定性反應(yīng)及正相薄層色譜中與標(biāo)準(zhǔn)品異嗪皮啶對照實(shí)驗(yàn)；而含量測定方法也僅有關(guān)于異嗪皮啶含量的相關(guān)規(guī)定。浙江大學(xué)程翼宇教授和國家中央藥檢所林瑞超教授等雖先后對腫節(jié)風(fēng)提取物的指紋圖譜進(jìn)行了考察，但均僅指認(rèn)了其中一個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即異嗪皮啶。(杲永江等"中國中藥雜志"，2005，30:67-69;王鋼力等"中草藥"，2005，36:1801-1803。)由于異嗪皮啶尚沒有抗炎活性相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此僅以其作為指標(biāo)成分，無法全面評(píng)價(jià)中藥材腫節(jié)風(fēng)提取物的質(zhì)量。根據(jù)2010年藥典編制大綱提出中成藥及中藥材應(yīng)"逐步由單一指標(biāo)性成分定性定量測定，向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分和指紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化"，有必要建立一種方法簡便、穩(wěn)定、精密度高的多成分和特征指紋圖譜，并制定其中活性成分的定量方法，用以科學(xué)、有效地控制中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題與不足，本發(fā)明的主要目的在于建立一種簡便、穩(wěn)定、精密度高的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的還在于提供該質(zhì)量控制方法的用途，即控制含有腫節(jié)風(fēng)提取物的單方或復(fù)方中藥產(chǎn)品的質(zhì)量。。本發(fā)明的主要目的通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，采用反相高效液相色譜法建立的腫節(jié)風(fēng)提取物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包含十二個(gè)色譜峰，其中十個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)，以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為新綠原酸0.24±0.01、綠原酸0.39±0.01、0.41±0.01、隱綠原酸0.44±0.01、咖啡酸0.49士0.01、嗪皮素0.56±0.02、異嗪皮啶0.70±0.02、迷迭香酸-4-0-^-D-葡萄糖苷0.90±0.02、槲皮素-3-0-盡D-葡萄糖醛酸苷0.97±0.02、迷迭香酸1.00、山奈酚-3-O+D-葡萄糖醛酸苷1.09±0.02、1.15±0.02;提取物及其制劑的供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.65。以上的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，具體包括以下的步驟a、腫節(jié)風(fēng)提取物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立取中藥腫節(jié)風(fēng)干燥地上部分500g，用10倍量水回流兩次，每次兩小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后冷凍干燥，即得腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物51.28;取上述腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物以適量水溶解，制成每lmL水中含有腫節(jié)風(fēng)提取物5.0mg的溶液，過0.45/mi濾膜后，即得腫節(jié)風(fēng)提取物的供試品溶液；取迷迭香酸對照品，以適量甲醇溶解，制成每lmL甲醇中含有迷迭香酸lmg的溶液，即得迷迭香酸對照品溶液；分別精密取上述供試品及對照品溶液10//L，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖；以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算的各色譜峰的相對保留時(shí)間，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；b、腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的指紋圖譜的建立取腫節(jié)風(fēng)提取物或其制劑，以適量水溶解，過0.45;mi濾膜，取濾液作為供試液；迷迭香酸對照品按步驟a所述制備；按步驟b所述條件對供試品和對照品溶液進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖；以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，得到指紋圖譜；c、提取物及其制劑的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.65。上述步驟a和b中，發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確立了較佳的色譜條件采用十八烷基硅氧鍵合硅膠為固定相；以含有0.2%醋酸的甲醇一水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速為0.8mL/min;檢測波長為330nm;色譜柱溫度為35。C;以迷迭香酸計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于20000。此條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包含十二個(gè)色譜峰(圖l)，發(fā)明者還利用公知的現(xiàn)代色譜分離手段，富集并分離得到了該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的十個(gè)主要色譜峰，并利用核磁共振波譜、多級(jí)質(zhì)譜等手段，結(jié)合文獻(xiàn)，鑒定了上述十個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間及色譜峰對應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)依次是1號(hào)峰0.24±0.01(新綠原酸)；2號(hào)峰0.39±0.01(綠原酸);3號(hào)峰0.41士0.01;4號(hào)峰0.44±0.01(隱綠原酸)；5號(hào)峰0.49±0.01(咖啡酸);6號(hào)峰0.56±0.02(嗪皮素);7號(hào)峰0.70±0.02(異嗪皮啶)；8號(hào)峰0.90±0.02(迷迭香酸-4-0-y9-D-葡萄糖苷)；9號(hào)峰0.97±0.02(槲皮素-3-0-々-D-葡萄糖醛酸苷);10號(hào)峰:1.00(迷迭香酸);ll號(hào)峰1.09±0.02(山奈酚-3-0-yff-D-葡萄糖醛酸苷)；12號(hào)峰1.15±0.02。上述化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)的色譜峰的峰面積總和占總峰面積的89%。發(fā)明者進(jìn)而利用體外抗炎活性模型，確定綠原酸類成分、咖啡酸以及迷迭香酸類成分，能夠不同程度的抑制15-LO的活性，是中藥腫節(jié)風(fēng)中的抗炎活性成分。發(fā)明者還建立了與活性相關(guān)的腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑中抗炎成分的含量測定方法，用以控制中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑的質(zhì)量；所述活性物質(zhì)包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸-4-0-yff-D-葡萄糖苷、迷迭香酸或由它們中兩種以上組成的混合物。本發(fā)明的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法的用途包括1、對中藥腫節(jié)風(fēng)提取物以及該提取物與藥學(xué)上所允許的藥用輔料或載體按照常規(guī)方法制成的制劑進(jìn)行質(zhì)量控制；2、利用腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的高效液相指紋圖譜和其中一種或幾種已被指認(rèn)的色譜峰，采用工作曲線法測定腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑中相應(yīng)活性物質(zhì)的含量。上述制劑包括散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酊劑、膏劑或噴霧劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果提供了一種采用反相高效液相色譜法建立的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜控制產(chǎn)品質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中包括十個(gè)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)了化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征色譜峰，其中六個(gè)為抗炎活性成分；此外，還利用工作曲線法建立了多種抗炎活性成分的含量測定方法。利用該方法可以有效地控制中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、精密度優(yōu)異且操作方法簡便。圖l是中藥腫節(jié)風(fēng)提取物的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；圖2是中藥腫節(jié)風(fēng)提取物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中十個(gè)主要色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)；其中I是新綠原酸、II是綠原酸、，III是隱綠原酸、IV是咖啡酸、V是嗪皮素、VI是異嗪皮啶、VII是迷迭香酸-4-0弄D-葡萄糖苷、VIII是槲皮素-3-0弄D-葡萄糖醛酸苷、IX是迷迭香酸、X是山奈酚-3-0-"-D-葡萄糖醛酸苷；圖3是腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物的HPLC指紋圖譜穩(wěn)定性；圖4是腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物的HPLC指紋圖譜相似度；圖5是相同條件下，各色譜峰單體化合物的HPLC圖譜；圖6是咖啡酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7是迷迭香酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8是市售含有腫節(jié)風(fēng)提取物中藥制劑的HPLC指紋圖譜相似度。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式并不局限于此。實(shí)施例1腫節(jié)風(fēng)提取物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立取中藥腫節(jié)風(fēng)干燥地上部分500g，用10倍量水回流兩次，每次兩小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后冷凍干燥，即得腫節(jié)風(fēng)提取物51.2g。取上述腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物以適量水溶解，制成每lmL水中含有腫節(jié)風(fēng)提取物5.0mg的溶液，過0.45/mi濾膜后，即得腫節(jié)風(fēng)提取物的供試品溶液。取迷迭香酸對照品，以適量甲醇溶解，制成每lmL甲醇中含有迷迭香酸lmg的溶液，即得迷迭香酸的對照品溶液。分別精密取上述供試品及對照品溶液10^L，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖(見圖l)。液相色譜條件為采用十八垸基硅氧鍵合硅膠為固定相；以含有0.2%醋酸的甲醇一水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速為0.8mL/min;檢測波長為330nm;色譜柱溫度為35°C。獲得的腫節(jié)風(fēng)提取物的高效液相標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜有十二個(gè)色譜峰，以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為0.24±0.01、0.39±0.01、0.41±0.01、0.44±0.01、0.49±0.01、0.56±0.02、0.70±0.02、0.90±0.02、0.97±0.02、1.00(迷迭香酸)、1.09±0.02、1.15±0.02。以迷迭香酸計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于20000。實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜重現(xiàn)性考察精密稱取腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物25mg共6份，分別以水溶解定容于5mL容量瓶中，過0.45/mi濾膜后，取濾液作為腫節(jié)風(fēng)提取物的供試液，采用實(shí)施例1中所述液相條件進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖(見圖3)。獲得的HPLC指紋圖譜中，十二個(gè)色譜峰的相對保留時(shí)間均符合實(shí)施例1中的相關(guān)要求，各色譜峰的相對保留時(shí)間的相對偏差均小于1.0%(見表1)，表明實(shí)施例1獲得的HPLC指紋圖譜具有較好的重現(xiàn)性。利用藥典委員會(huì)提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件計(jì)算，6份腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物供試液的HPLC指紋圖譜的相似度大于0.991(見圖4)。表1腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物HPLC指紋圖譜相對保留時(shí)間穩(wěn)定性第一份第二份第三份第四份第五份第六份平均值RSD(%)10.24330.24180.24150.24010.23860.23780.24050.866920.39310.39190.39140.38900.38670.38580.38960.756730.41670.41530.41420.41160.40880.40770.41240.881940.44330.44240.44200.44010.43780.43720,44050.57390.49770.49720.49680.49510.49300.49250.49540.447360.55660.55620.55680.55670.55680.55660.55660.03490.70230.70190.70140.69980.69860.69800.70030.253680.90000.90000.89990.89980.89960.89940.89980.027490.97560.97630.97700.97750.97780.97830.97710.104410l扁O1.0000l細(xì)Ol細(xì)Ol扁Ol細(xì)O1.0000-111.10241.10281.1037l.翻1.10421.10461.10360.0770121.15491.15461.15531.15511.15531.15541.15510.0252實(shí)施例3色譜峰的富集及結(jié)構(gòu)鑒定取中藥腫節(jié)風(fēng)干燥地上部分4kg，用10倍量水回流兩次，每次兩小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后冷凍干燥，即得腫節(jié)風(fēng)提取物(ZJF)460g。將其混懸于適量水中，采用大孔樹脂DiaionHp-20開放柱色譜，分別以水、30%乙醇-水、50%乙醇-水和95%乙醇-水洗脫。分別減壓回收溶劑，得水洗脫物(ZJF-I)340g、30%乙醇-水洗脫物(ZJF-n)70g、50%色譜，以甲醇-水(10,30，50,100%)梯度洗脫。其ODS柱下10%甲醇洗脫部分(ZJF-IA)經(jīng)反相高效液相分離(15-20%甲醇-水，含0.2%醋酸)得到化合物I、II、III。對ZJF-II采用ODS柱色譜，以甲醇-水(10，30,50,100%)梯度洗脫。其ODS柱下30。/。甲醇洗脫部分(ZJF-IIB)經(jīng)反相高效液相分離(30-40%甲醇-水，含0.2%醋酸)得到化合物IV、VII、IX。對ZJF-III采用ODS柱色譜，以甲醇-水(10,30,50,100%)梯度洗脫。其ODS柱下30%甲醇洗脫部分(ZJF-IIB)經(jīng)反相高效液相分離(25-30%甲醇-水，含0.2%醋酸)得到化合物V、VI。其ODS柱下50%甲醇洗脫部分(ZJF-IIC)經(jīng)反相高效液相分離(40-50%甲醇-水，含0.2%醋酸)得到化合物VIII、X。通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(MS、NMR)，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定了它們的結(jié)構(gòu)(見圖2)。化合物II為白色粉末，ESI-MS(positive)給出m/z399[M+2Na-H]+,775[2M+2Na-H]+，ESI-MS(negative)給出w/z353[M-H]—，提示該化合物的分子量為354。結(jié)合BC-NMR給出16個(gè)碳信號(hào)，推測化合物II的分子式為C16H1809，計(jì)算不飽和度為8，提示可能存在苯環(huán)。在化合物II的^-NMR(DMSO-^，400MHz)譜中，低場區(qū)一組ABX偶合的芳香質(zhì)子信號(hào)<5H7.03(lH,brs,H-2')，6.96(1H，brd,J:7.7Hz,H-6')和6.76(1H,d,/=7.7Hz,H-5')提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)1，2,4-三取代苯環(huán)，相互偶合的烯氫質(zhì)子信號(hào)^7.42(lH,d,J^6.0Hz,H-7')和6.15(lH,d,J46.0Hz，H-8')，提示結(jié)構(gòu)中與吸電基團(tuán)相連的反式雙鍵的存在，進(jìn)一步結(jié)合HSQC及HMBC相關(guān)信息，提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)咖啡酰基。其余質(zhì)子信號(hào)&1.78(1H,m,H-2a)，2.02(lH，m,H陽2b)，5.08(1H,brs，H-3)，3.54(1H,brd,7=4.7Hz，H隱4)，3.93(1H,brs,H-5)和1.94(2H，m,H-6)在'H」HCOSY譜中順次相關(guān)，結(jié)合HSQC及HMBC相關(guān)信息提示，結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)奎寧酸結(jié)構(gòu)片斷。由于奎寧酸中H-3顯著向低場位移，表明咖啡酰基連接在奎寧酸的3位上。化合物I1的^和"C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(C/zew/欲少o/Wa^ra/Co附/ow"成2006,42(5),567-570)報(bào)道一致(見表2)，從而鑒定化合物II為奎寧酸-3-咖啡酸酯，即綠原酸(chlorogenicacid)，其結(jié)構(gòu)式如下表2化合物II的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-c4,400MHzforRefCompoundIIposition"HCHC173.673.521.7-2.1(2H,m)37.21.78(1H,m，H陽2a),2.02(1H，m，H-2b)37.235.08(1H,brd乂二5Hz)68.35.08(1H,brs)68.343.55(lH,brd,/=4Hz)70.63.54(lH,brd，J=4.7Hz)70.63.94(1H,brs)70.93.93(lH,brs)70.961.98(2H,m)36.51.94(2H,m)36.67174.9173.9r125.6125.52,7.03(1H,d,2.0Hz)114.77.03(1H,brs)114.73,145.5145.54,148.3148.35'6.77(1H,d，《/=8.0Hz)115.76.76(1H,d,7.7Hz)115.76,6.98(1H,dd，《7=8.0,2.0Hz)121.26.96(1H,brd,7.7Hz)121.27,7.42(1H,d,J^6.0Hz)144.87.42(1H,d,16.0Hz)144.88,6.15(1H,d,16.0Hz)114.36.15(1H,d,16.0Hz)114.39,165.7165.8化合物I、III均為白色粉末，ESI-MS(positive)給出m/z399[M+2Na-H]+，775[2M+2Na-H]+，ESI-MS(negative)給出w々353[M-H『，提示它們與化合物II一樣，分子量也為354。進(jìn)一步在負(fù)離子模式下，以m/z353[M-H]-為母離子，進(jìn)行多級(jí)解離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物I、II的多級(jí)碎片離子解離方式一致均在二級(jí)質(zhì)譜中丟失162u的中性碎片，產(chǎn)生碎片離子191(咖啡酸上的酯氧鍵斷裂)，并進(jìn)而在三級(jí)質(zhì)譜中丟失18u的中性碎片，產(chǎn)生碎片離子173;而化合物III的碎裂方式與化合物H略有不同，在二級(jí)質(zhì)譜中除產(chǎn)生碎片離子191外，還可以丟失174u的中性碎片，產(chǎn)生碎片離子179(奎寧酸上的烷氧鍵斷裂)。采用文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件，對化合物I、II、III進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)以化合物II(綠原酸)的保留時(shí)間為1，則化合物I和m的相對保留時(shí)間分別為0.64，1.06，分別與文獻(xiàn)ajgn'c.Food0^w.,2008，56(3),1084-1090)報(bào)道的0.65(新綠原酸)，1.06(隱綠原酸)一致，故將化合物I和III分別鑒定為新綠原酸(neochlorogenicacid)和隱綠原酸(cryptochlorogenicacid)，它們的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>化合物IV為淡黃色粉末，ESI-MS(negative)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z179[M-H]'，推測其分子量為180，結(jié)合碳譜中的9個(gè)信號(hào)，推測分子式C9Hs04，計(jì)算不飽和度為6，提示可能存在苯環(huán)。化合物IV的^H-NMR(MeOH-fl4,400MHz)譜中，低場區(qū)一組ABX偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號(hào)7.02(1H,</=2.0Hz,H-2)，6.92(1H,dd，/=8.0,2.0Hz,H-6)和6.77(1H,d，/=8.0Hz,H-5)，提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)1,2，4-三取代苯環(huán)，相互偶合的烯氫質(zhì)子信號(hào)&7.52(lH,d，J=16.0Hz,H-7)和6.21(1H,d,J^6.0Hz，H-8)提示結(jié)構(gòu)中與吸電基團(tuán)相連的反式雙鍵的存在。結(jié)合分子式信息，推測化合物IV為咖啡酸。與咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品共薄層，兩者的Rf.值完全相同，核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(云南植物研究,2004,26(5),536-538)報(bào)道的咖啡酸一致(見表3)，由此推斷化合物IV為咖啡酸，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>表3化合物IV的NMR數(shù)據(jù)(MeOH-A,400MHzfor'H)positionRefCompoundIVHCHC1127.8127.827.03(lH,s)112.57.02(1H,d'/^.OHz)112.53146.7146.74149.4149.46.77(1H,d,7.8Hz)115.16.77(lH，dHz)115.166.92(1H,d,7.8Hz)122.86.92(1H,dd,8.0，2.0Hz)122.877.52(1H,d,/=16.0Hz)146.97.52(1H，d,/=16.0Hz)147.086.22(1H,d,16.0Hz)116.56.21(1H,d,16.0Hz)116.59171.6171.0化合物V為黃色粉末，在紫外燈(365nm)下呈藍(lán)色熒光，遇5%NaOH溶液變黃綠色，提示其可能為香豆素類成分。ESI-MS(positive)給出w/z231[M+Na]+，ESI-MS(negative)給出m/z207[M-H]—，推測其分子量為208，結(jié)合碳譜中的10個(gè)信號(hào)，推測其分子式為C1()H805，計(jì)算不飽和度為7，提示結(jié)構(gòu)中可能存在苯環(huán)。化合物V的^-NMR(DMSO400MHz)譜中，低場區(qū)相互偶合的烯氫質(zhì)子&6.01(1H,cU=9.1Hz,H-3)和7.78(lH,d,j=9.1Hz，H-4)，提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)與吸電基團(tuán)相連的順式烯鍵，^6.64(lH,s，H-5)提示結(jié)構(gòu)中五取代苯壞的存在，(5h3.75(3H，s，6-OCH3)表明結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)甲氧基J3C-NMR(DMSO-fi6，100MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(中國藥學(xué)雜志,2007,42(4),252-255)報(bào)道的秦皮素一致(見表4)，故鑒定此化合物V為6-甲氧基-7，8-二羥基香豆素，g卩秦皮素(fraxetin)，其結(jié)構(gòu)式如下表4化合物V的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-^，400MHzfor<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>化合物VI為黃色粉末，在紫外燈(365nm)下呈藍(lán)色熒光，遇5%NaOH溶液變黃綠色，提示其可能為香豆素類成分。ESI-MS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z245[M+Na]+，223[M+H]+，推測其分子量為222，結(jié)合碳譜中的ll個(gè)信號(hào)，推測其分子式為CuHu)05，計(jì)算不飽和度為7，提示結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。化合物VI的^-NMR(MeOH-c/4,400MHz)譜中，低場區(qū)相互偶合的烯氫質(zhì)子^6.22(lH,d,^9.6Hz,H-3)和7.84(1H，d，/=9.6Hz,H-4)，提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)與吸電基團(tuán)相連的順式烯鍵，&6.91(lH，s,H-5)提示結(jié)構(gòu)中五取代苯環(huán)的存在，&3.89(3H，s,6-OCH3)和3.89(3H,s,8-OCH3)表明結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)甲氧基。上述核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李媛，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文,2006,p149)報(bào)道的異嗪皮啶一致(見表5)，故鑒定化合物VI為6，8-二氧基-7-羥基香豆素，艮卩異嗪皮啶(isofmxidin)，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>表5化合物VI的NMR數(shù)據(jù)(MeOH-^，400MHzforpositionRef.CompoundVIHHC2163.436.16(1H,d,/=9.6Hz)6.22(1H，d，J二9.6Hz)112.847.79(1H,d,/=9.6Hz)7.84(IH，d，《/=9.6Hz)146.54a112.26.86(IH，s)6.91(1H,s)105.163.84(3H,s)3.89(3H，s)147.47145.783.89(3H,s)3.94(3H,s)144.78a145.76-OCH357.08-OCH361.6化合物VII為白色無定形粉末，ESI-MS(positive)給出w/z567[M+2Na-H]+，ESI-MS(negative)給出m/z521[M-H].，推測其分子量為522，結(jié)合碳譜中的24個(gè)信號(hào)，推測與分子式C24H26013，計(jì)算不飽和度為12，提示結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)苯環(huán)。化合物VII的'H-NMR(DMSO-4,400MHz)譜中，低場區(qū)兩組ABX偶合的芳香質(zhì)子信號(hào)&7.04(1H，brs,H-2)，7.01(1H，bO8.0Hz,H-6),6.98(1H，d,7=8.0Hz，H-5)，及6.76(1H，brd,J=8.0Hz,H-5')，6.74(lH，brs,H-2')，6.63(lH,d,J-8.0Hz,H-6')提示結(jié)構(gòu)中兩個(gè)1,2,4-三取代苯環(huán)的存在。相互偶合的烯氫的質(zhì)子信號(hào)&7.42(lH，d,J-16.0Hz，H隱7)和6.23(1H，d,/=16.0Hz,H-8)提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)與吸電基團(tuán)相連的反式雙鍵。其余氫信號(hào)中，&4.61(1H，d，J=7.0Hz，H-r)為糖端基質(zhì)子，表明結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)六碳糖基。化合物VII的13C-NMR(DMSO-4，100MHz)譜圖中給出24個(gè)碳信號(hào)，其中(5C102.4(C-l")、73.3(C-2")、75.8(C-3")、69.8(C-4")、77.1(C-5")、60.7(C-6")提示結(jié)構(gòu)中葡萄糖的存在。其余碳信號(hào)，顯示出一個(gè)咖啡酸和一個(gè)3，4-二羥基苯基乳酸的特征，結(jié)合分子式信息，推測化合物VII為迷迭香酸葡萄糖苷。上述核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(云南植物研究，1987,9(4)，407-411)報(bào)道一致(見表6)，故鑒定化合物VII為迷迭香酸-4-(9-;ff-D-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)式如下OHVII表6化合物VII的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-^，400MHzfor'H)positionRefCompoundVIIHCHC12346789r7.05(1H,d,/=2.0Hz)7.01(1H,d,8.0Hz)7.00(1H,dd,/=2.0，8.0Hz)7.46(1H,d,7=16.0Hz)6.23(1H,d,16.0Hz)125.33113.2146.4148.6115.7121.6145.6116.9170.7131.2147.04(1H,brs)6.98(1H,d,8.0Hz)7.01(lH,brd，/-8.0Hz)7.42(IH，d,J-16.0Hz)6.23(1H,d,J=16.0Hz)125.4113.2146.4148.5115.8121.3145.6116.8165.9131.2116.56.74(1H，brs)116.63,1461464,144.21445'6.76(1H，d,8.0Hz)114.96.76(1H,d,J-8.0Hz)114.86,6.65(1H，dd，^2.0,8.0Hz)120.16.63(1H,brd,/=8.0Hz)119.97,3.04(1H,dd,J二4.0,14.0Hz)36.13.04(1H,m)36.42.96(1H，dd乂-8.5，14.0Hz)2.90(1H,m)8,5.07(1H,dd,/=4.0,8.5Hz)72.65.01(1H，d,5.0Hz)72.69,171.4171.4r'4.62(1H,d,J-7.5Hz)102.34.61(1H，d,7.0Hz)102.42"73.373.375.875.84"69.869.85"77.177.16"60.760.7化合物VIII為黃色無定形粉末，在甲醇溶液中，與Mg-HCl反應(yīng)顯淡紅色，薄層斑點(diǎn)顯亮黃色(氨熏)，放置在空氣中顏色很快褪去，提示該化合物可能為黃酮類化合物。ESI-MS(positive)給出附/z523[M+2Na-H]+，ESI-MS(negative)給出w/z477[M-H]-，推測其分子量為478，結(jié)合碳譜中的21個(gè)信號(hào)，推測其分子式C21H18013，計(jì)算不飽和度為13，提示結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)苯環(huán)。化合物VIII的^-NMR(DMSO-af6,400MHz)譜中，低場區(qū)芳香質(zhì)子<5H7.89(lH,brs，H-2')，6.82(1H,d,/=8.4Hz,H-5')和7.46(1H，brd,J-8.4Hz,H-6')提示結(jié)構(gòu)中含有1，2,4-三取代的苯環(huán)。c5H6.40(lH,brs,H-8)，6.20(lH,brs,H-6)提示存在1，2，3，5-四取代苯環(huán)。&5.36(lH,d,-5.7Hz，H-r)的糖端基質(zhì)子提示結(jié)構(gòu)中六碳糖的存在。由碳譜中給出的碳信號(hào)c5c103.8(C-r'),73.9(C-2")，76.2(C-3")，71.5(C-4")，75.6(C-5")及170.0(C-6")，推測結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)葡萄糖醛酸。化合物VIII的&和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(C&m.P/w/m￡w〃.，55(2),334-336)報(bào)道一致(見表7)，從而推斷化合物VIII為槲皮素-3-0-/-0-葡萄糖醛酸苷，其結(jié)構(gòu)式如下VIII表7化合物VIII的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-^，400MHzforpositionRefCompoundVIIIHCHC2344a6788a1'2'3'4'6'r2"3"4"6.21(lH,d,2.0Hz)6.41(1H，d,2.0Hz)7.53(1H，d，^2.0Hz)6.84(1H,d,/=8.8Hz)7.61(lH，dd,/=8.4，2.0Hz)5.51(1H,d,J=7.2Hz)156.4133.8177.5103.8161.098.8164.493.6157.5120.5115.3144.8148.4117.8120.5102.874.576.571.66.20(1H,brs)6.40(1H,brs)7.89(1H,brs)6.82(1H,d,/=8.4Hz)7.46(1H,b08.4Hz)5.36(1H，d，J-5.7Hz)157.0133.5177.3103.8161.098.8164.393.6156.3121.1115.3144.8148.5117.8120.6102.873.976.271.55〃75.675.66"171.1170.1化合物IX為白色無定形粉末，ESI-MS(positive)給出w/z405[M+2Na-H]+，ESI-MS(negative)給出m/z359[M-H]—，推測其分子量為360，結(jié)合碳譜中的18個(gè)信號(hào)，推測與分子式C18H1608，計(jì)算不飽和度為11，提示結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)苯環(huán)。化合物IX的^-NMR(DMSO-A，400MHz)譜中，低場區(qū)兩組ABX偶合的芳香質(zhì)子信號(hào)(5H7.05(1H，brs,H-2)，6.99(1H,brd,J:7.5Hz，H陽6)，6.77(1H,d,J:7.5Hz,H-5)，及6.67(1H，brs,H-2')，6.62(1H,b07.5Hz,H-5')，6.51(1H，d，/=7.5Hz,H國6')提示結(jié)構(gòu)中兩個(gè)1,2，4-三取代苯環(huán)的存在。相互偶合的烯氫的質(zhì)子信號(hào)&7.43(lH，d,J-16.0Hz，H-7)和6.22(1H,d，《/=16.0Hz,H-8)提示結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)與吸電基團(tuán)相連的反式雙鍵。化合物IX的13C-NMR(DMSO-4,100MHz)譜圖中給出18個(gè)碳信號(hào)，顯示出一個(gè)咖啡酸和一個(gè)3，4-二羥基苯基乳酸的特征，結(jié)合分子式信息，推測化合物IX為迷迭香酸。上述核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(云南植物研究，1987,9(4)，407-411)報(bào)道一致(見表8)，故鑒定化合物IX為迷迭香酸，其結(jié)構(gòu)式如下0HIX表8化合物IX的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-^,400MHzforRef.CompoundIXposition_^_^_^_^_1125.4125.427.04(1H,brs)114.97.05(1H，brs)114.93145.9145.64148.6148.656.76(1H,d，J-8.0Hz)115.86.77(1H，d,J=7.5Hz)115.867.00(lH，brd,/=8.0Hz)121.66.99(1H,brd,J:7.5Hz)121.477.44(lH,d乂46.0Hz)145.67.43(1H，d，J-15.8Hz)145.686.23(lH,d，J"-16.0Hz)113.36.22(1H,d,J二15.8Hz)113.6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>化合物X為黃色無定形粉末，在甲醇溶液中，與Mg-HCl反應(yīng)顯淡紅色，薄層斑點(diǎn)顯亮黃色(氨熏)，放置在空氣中顏色很快褪去，提示該化合物可能為黃酮類化合物。ESI-MS(positive)給出m/z507[M+2Na-H〗+，ESI-MS(negative)給出—461[M-H]、推測其分子量為462，結(jié)合碳譜中的21個(gè)信號(hào)，推測其分子式C21H18012，計(jì)算不飽和度為13，提示結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)苯環(huán)。化合物X的iH-NMR(DMSO-t4，400MHz)譜中，低場區(qū)芳香質(zhì)子&8.02(2H，d乂二8.7Hz，H-2'，H-6')，6.85(2H,d,/=8.7Hz，H-3',H-5')提示結(jié)構(gòu)中含有1，4-二取代的苯環(huán)。(5H6.38(1H，brs,H-8),6.16(1H，brs,H-6)提示存在1,2,3,5-四取代苯環(huán)。<5H5.47(lH，d，《7=7.1Hz,H-r)的糖端基質(zhì)子提示結(jié)構(gòu)中六碳糖的存在。由碳譜中給出的碳信號(hào)(5clOU(C-l〃)，73.9(C-2"),76.0(C陽3")，71.6(C-4")，75.1(C-5")及170.0(C-6")，推測結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)葡萄糖醛酸。化合物X的'H和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(李媛，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文,2006,p149)報(bào)道一致(見表9),從而推斷化合物X為山奈酚-3-0-;6-0-葡萄糖醛酸苷，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>表9化合物X的NMR數(shù)據(jù)(DMSO-漆，400MHzfor'H)positionRefCompoundXHCHC2156.3156.33133133.14177.2177.34a103.9103.9161.116166.20(1H,d，力=2.2Hz)98.86.16(1H,brs)98.77164.3164.386.42(1H,d，,=2.2Hz)93.76.38(1H,brs)93.783156.3156.3r120.6120.62,8.02(1H,=8.5Hz)130.98.02(1H,d,8.7Hz)130.93,6.86(1H,:8.5Hz)115.16.85(1H,d,/=8.7Hz)1154,1601605'6.86(1H,d,,=8.5Hz)115.16.85(1H，d，J^8.7Hz)1156,8.02(1H,d,/:=8.5Hz)130.98.02(1H,d,/=8.7Hz)130.91"5.46(IH，d，,=7.5Hz)1015.47(1H,d,/=7.1Hz)101.12"73.973.93"75.876.04"71.571.65"75.775.16"170.4170.0上述分離得到的各單體化合物，采用實(shí)施例1中建立的色譜條件，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖(見圖5)。實(shí)施例4綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸等成分的對15-LO的抑制活性1、藥品及儀器脂加氧酶抑制劑篩選試劑盒(LipoxygenaseInhibitorScreeningAssayKit,760700)購自Cayman公司；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國，Biotek)。各測試樣品以DMSO溶解并稀釋至合適濃度，-20°〇保存?zhèn)溆谩?、溶液配制AssayBuffer:0.1MTris-HCl,pH7.4顯色劑Chromogen:使用前等體積混合DevelopingRegent1(Cayman,760711)和DevelopingRegent2(Cayman,760712)既得。15國脂加氧酶使用前取10nl15-脂加氧酶(15-LO,Cayman,760714)加入990piAssayBuffer,混勻置于冰上備用。底物取底物亞油酸溶液(Linoleicacid,Cayman,760716)25pl，加入0.1MKOH溶液(Cayman,760713)25^1，渦旋混合后，加入950|al去離子水稀釋，備用。3、脂加氧酶活性的測定原理15-脂加氧酶(15-LO)是最主要的脂加氧酶，其通常作用底物為亞油酸鹽和花生四烯酸鹽。本實(shí)驗(yàn)利用純化的15-脂加氧酶作用于亞油酸，測定反應(yīng)過程中的產(chǎn)物過氧化物的含量，反映相應(yīng)的脂加氧酶的活性。4、脂加氧酶活性的測定方法實(shí)驗(yàn)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，設(shè)定空白對照組，100%酶活性組及測試樣品組，每組設(shè)兩個(gè)平行孔。空白對照組每孔加入100piAssayBuffer。100%酶活性組每孔加入90nl相應(yīng)的脂加氧酶，10nl溶解樣品用的DMSO。測試組每孔加入90pl相應(yīng)的脂加氧酶，10nl測試樣品。以上所有孔中各加入10pl配制好的亞油酸底物溶液，開始反應(yīng)，將96孔酶標(biāo)板置于水平搖床上振搖5min。每孔加入100)il顯色劑Chromogen終止酶反應(yīng)，用封板膜封板，置于水平搖床上振搖5min。取掉封板膜，測定500nm下的吸光值。根據(jù)As(x)計(jì)算測試樣品對15-LO的抑制率A500(sample)-A咖(blank)A500/min5minutes脂加氧酶活性0.21ml9.47mM一10.09ml抑制率(％)=100X100%脂加氧酶活性-樣品組脂加氧酶活性100%脂加氧酶活性4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表IO)表明，迷迭香酸及咖啡酸對15-脂加氧酶(15-LO)具有較強(qiáng)的抑制作用，綠原酸及迷迭香酸糖苷則具有一定的抑制作用。上述化合物均能夠抑制15-脂加氧酶的活性，從而發(fā)揮抗炎作用。表10活性組分對15-脂加氧酶(15-LO)的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例5咖啡酸、迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制配制咖啡酸和迷迭香酸對照品的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每樣品進(jìn)樣2次，每次10/^L，峰面積取其平均值。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(10，對照品濃度(Z)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得到CA的回歸方程為y=44.055義-3.436，r=0.9999("=10)。數(shù)據(jù)見表ll;曲線見圖6。得到RA的回歸方程為y=22.892X-21.122，r=0.9999("=10)。數(shù)據(jù)見表12;曲線見圖7。結(jié)果表明，CA在0.55522.2^g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；RA在2.595103.8^g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。表ll咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>4.44191.2188.5189.852.2294.79293.351.1145.946.1460.5552223.922.95表12迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)C(^g/mL)AlA2M6an103.82364.82397.82381.372.661617.61614.11615.8562.281402.213981400.151.91151.91179.61165.7541.52906.1928.1917.131.14696.2696.2696.220.76449.8440.7445.2510.38220.3216.1218.25.19106.2104.6105.42.59551.950.951.4實(shí)施例6市售含有腫節(jié)風(fēng)提取物的中藥制劑的質(zhì)量分析取市售含有腫節(jié)風(fēng)提取物的中藥制劑《腫節(jié)風(fēng)片》(廠家A，生產(chǎn)批號(hào)08011101)、《清熱消炎寧膠囊》(廠家B，生產(chǎn)批號(hào)z05069)、《血康膠囊》(廠家C，生產(chǎn)批號(hào)07070202)和《復(fù)方草珊瑚含片》(廠家D，生產(chǎn)批號(hào)0712032)藥物內(nèi)容物各lg，分別用水定容于10mL容量瓶中，超聲提取兩小時(shí)，過0.45/mi濾膜，取續(xù)濾液作為各制劑的供試液。分別精密取上述供試液10//L，采用實(shí)施例1中建立的色譜條件，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖。獲得的各含有腫節(jié)風(fēng)提取物的中藥制劑的色譜圖與腫節(jié)風(fēng)提取物的高效液相標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，四種中藥制劑至少檢出12個(gè)指標(biāo)色譜峰中的10個(gè)(見表13)，相對保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%;使用藥典委員會(huì)提供的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件計(jì)算，四種中藥制劑供試液HPLC色譜圖的相似度分別為0.921，0.858，0.662禾H0.700(見圖8)。表13市售含有腫節(jié)風(fēng)提取物的中藥制劑HPLC指紋圖譜相似度相對保留時(shí)間峰面積相對保峰號(hào)保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)提取物腫節(jié)風(fēng)清熱消炎寧血康膠囊復(fù)方草珊瑚留時(shí)間RSD(%)19.630.241135.126658，1479.991430.384638.1250.66215.230.391390.1581032.392684.298586.827773.5880.31316.390.4229.087250.166379.62783.514164.4920.28417.280.44982.204921.0772346.444451.778685.3250.419.000.482724.477198.181127.35851.10852.0830.29621.800.55255.639147.625545.94427.38845.3930.26727.560.704725.6582857.1676894.811770.845397.1740.04835.340.90645.531806.2852478.382348.586842.9540.11938.610.98166.87828.399172.807000.161039.321.003829.7582898.1596105.016393.4712949.240.111143.571.11206.60445.68480.93000.111245.581.16251.762248.102500.577212.83397.1130.08相似度—0.9210.8580.6620.700根據(jù)實(shí)施例5獲得的工作曲線，計(jì)算四種中藥制劑中，咖啡酸和迷迭香酸的含量，如表14所示。表14腫節(jié)風(fēng)提取物及相關(guān)中藥制劑中咖啡酸、迷迭香酸含量咖啡酸迷迭香酸峰面積C(//g/mlL)每克內(nèi)容物中含量(mg)峰面積C(wg/mL)每克內(nèi)容物中含量(mg)腫節(jié)風(fēng)198.1814.5764840.0462898.159127.52411.275清熱消炎寧127.3582.968880細(xì)6105.01267.61022.676血康膠囊51.1081.2380890.0246393.471280.21U5.604復(fù)方草珊瑚52.0831.260220.0132949.24129.75551.298標(biāo)準(zhǔn)提取物2724.47761.920620.6193829.758168.21951.684由表13和表14不難看出，多家生產(chǎn)的含有腫節(jié)風(fēng)提取物的中藥制劑，無論從所含成分、含量均有所不同。尤其是抗炎活性成分，綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸及其衍生物的含量波動(dòng)較大。采用本發(fā)明提供的反相HPLC方法，能夠有效的確定腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)中藥制劑中抗炎活性成分情況及其含量，從而可以有效的控制中藥腫節(jié)風(fēng)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量。權(quán)利要求1、一種腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于采用反相高效液相色譜法建立的腫節(jié)風(fēng)提取物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包含十二個(gè)色譜峰，其中十個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被準(zhǔn)確指認(rèn)，以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算得到的各色譜峰的相對保留時(shí)間，分別為新綠原酸0.24±0.01、綠原酸0.39±0.01、0.41±0.01、隱綠原酸0.44±0.01、咖啡酸0.49±0.01、嗪皮素0.56±0.02、異嗪皮啶0.70±0.02、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖苷0.90±0.02、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.97±0.02、迷迭香酸1.00、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1.09±0.02、1.15±0.02；腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.65。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于包括如下步驟a、腫節(jié)風(fēng)提取物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立取中藥腫節(jié)風(fēng)干燥地上部分500g，用10倍量水回流兩次，每次兩小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后冷凍干燥，即得腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物51.2g;取上述腫節(jié)風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)提取物以適量水溶解，制成每lmL水中含有腫節(jié)風(fēng)提取物5.0mg的溶液，過0.45pm濾膜后，即得腫節(jié)風(fēng)提取物的供試品溶液；取迷迭香酸對照品，以適量甲醇溶解，制成每lmL甲醇中含有迷迭香酸lmg的溶液，即得迷迭香酸的對照品溶液；分別精密取上述供試品及對照品溶液10AL，參照國家藥典附錄中規(guī)定的高效液相分析方法，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖；以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算的各色譜峰的相對保留時(shí)間，得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；b、腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的指紋圖譜的建立取腫節(jié)風(fēng)提取物或其制劑，以適量水溶解，過0.45^tm濾膜，取濾液作為供試液；迷迭香酸對照品溶液按步驟a所述制備;按步驟a所述條件對上述供試品和對照品溶液進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖；以迷迭香酸的色譜保留時(shí)間為1計(jì)算的各色譜峰的相對保留時(shí)間，得到指紋圖譜；c、腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.65。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述反相高效液相色譜法的條件是采用十八烷基硅氧鍵合硅膠為固定相；以含有0.2%醋酸的甲醇一水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速為0.8mL/min;檢測波長為330nm;色譜柱溫度為35。C;以迷迭香酸計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于20000。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于還可包括以下步驟d、建立指紋圖譜中一種或幾種色譜峰面積與其對應(yīng)活性物質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；e、通過步驟d所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相關(guān)活性物質(zhì)的含量。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述活性物質(zhì)包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸-4-0-々-D-葡萄糖苷、迷迭香酸或由它們中兩種以上組成的混合物。6、權(quán)利要求1所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法的用途，其特征在于包括對中藥材腫節(jié)風(fēng)提取物以及該提取物與藥學(xué)上所允許的藥用輔料或載體按照常規(guī)方法制成的制劑進(jìn)行質(zhì)量控制以及利用腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的高效液相指紋圖譜和其中一種或幾種已被指認(rèn)的色譜峰，采用工作曲線法測定腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑中相應(yīng)活性物質(zhì)的含且里。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫節(jié)風(fēng)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法的用途，其特征在于:聽述制劑包括散劑、片劑、膠囊劑、丸劑、栓劑、滴丸劑、腸溶劑、注射劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酊劑、膏劑或噴霧劑。全文摘要本發(fā)明涉及中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制方法，包括采用反相高效液相色譜法建立指紋圖譜、確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中包括十二個(gè)色譜峰，其中十個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確認(rèn)；提取物及相關(guān)制劑的供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度不小于0.65；此外，還利用工作曲線法建立了多種抗炎活性成分的含量測定方法。該方法可以有效的控制中藥腫節(jié)風(fēng)提取物及其相關(guān)制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性高，精密度優(yōu)異，且操作方法簡便。文檔編號(hào)A61K36/185GK101612173SQ20081002904公開日2009年12月30日申請日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者姚志紅,姚新生,毅戴,段營輝,潘明宇,烽趙申請人:暨南大學(xué)