專利名稱：：以抗survivin核酶為基礎(chǔ)的治療細(xì)胞增殖亢進(jìn)癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用來(lái)抑制存活素(survivin)在細(xì)胞中表達(dá)的錘頭狀核酶為基礎(chǔ)的材料和方法，來(lái)治療包括癌癥在內(nèi)的細(xì)胞增殖亢進(jìn)性疾病。
背景技術(shù)：
：由于抗凋亡基因的激活和/或促凋亡基因的失活引起的凋亡障礙是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特點(diǎn)之一[l]。抗凋亡因子存活素(SURVIVIN)[2]雖在正常細(xì)胞中不表達(dá)，在所有的癌癥中均過(guò)量表達(dá)，呈高度的腫瘤特異性，并通過(guò)干預(yù)凋亡，有絲分裂，血管生成和應(yīng)激反應(yīng)等生命過(guò)程的信號(hào)通路而對(duì)腫瘤學(xué)行為作出貢獻(xiàn)[3,4]。例如，SURVIVIN與caspase-9[5]相互作用或與從線粒體釋放出的Smac/DIABLO相結(jié)合[6]而抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平上的調(diào)控，SURVIVIN在G2/M期量為最高，確保細(xì)胞有絲分裂過(guò)程的正常進(jìn)行。除了可以作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，SURVIVIN已成為的小分子藥物，分子拮抗劑，疫苗和基因療法的抗癌治療手段的重要靶標(biāo)[4,12]。過(guò)度表達(dá)SURVIVIN的不能被有絲分裂激酶p34cdc2磷酸化的Thr34Ala突變體(顯性負(fù)調(diào))能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13，14]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和臨床I期試驗(yàn)中抗SURVIVINmRNA的反義寡聚核苷酸可抑制SURVIVIN的表達(dá)并有抗腫瘤效應(yīng)[15，16]。其他有效的方法還包括RNA干擾[17，18]或錘頭狀的核酶[19-22]。核酶是一種新的能夠特異有效地減少細(xì)胞中RNA水平的手段[23]。錘頭狀核酶是最小且研究最為深入的核酶。它由三部分組成一個(gè)約為13個(gè)序列保守的頸環(huán)結(jié)構(gòu)樣的催化域和兩個(gè)能夠和目標(biāo)RNA互補(bǔ)位于催化域的兩側(cè)的臂區(qū)，錘頭狀核酶在目標(biāo)mRNA的NUH序列后切開(kāi)(N為任一核苷酸，H是除G外的核甘酸)從而抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá)[24]。底物的特異性是由核酶臂區(qū)的與靶RNA的序列互補(bǔ)性來(lái)確定的。有較有非靶效應(yīng)的siRNA[26-28]底物特異性極高的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明者已經(jīng)在試管內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)和活體內(nèi)系統(tǒng)中全面地分析抗SURVIVIN的錘頭狀核酶的抑制SURVIVIN表達(dá)繼而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)調(diào)亡的能力。所述的核酶系統(tǒng)是一腺病毒載體的形式提供，可用于抗腫瘤等細(xì)胞增殖亢進(jìn)有關(guān)的疾病，并且最終完成了這一發(fā)明。本發(fā)明第一個(gè)方面涉及到一種合成的或分離的核酶，所述核酶切割SEQIDNO:l所示的存活素的mRNA，其中所述核酶包含一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和接在所述催化結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的第一和第二核酶結(jié)合臂，其中所述第一和第二核酶結(jié)合臂包含選自下組的SEQIDNO:1的區(qū)域互補(bǔ)的序列(1)+53-60禾B+62-69;(2)+75-82禾口+84-91;(3)+224-231和+233-240;(4)+350-357和+359-366。本發(fā)明另一方面涉及一種載體，它包含編碼上述核酶的RNA的序列。本發(fā)明另一方面提供了一種用于治療存活素相關(guān)疾病的藥物組合物，它包含上述的合成的或分離的核酶或載體。本發(fā)明另一方面提供了一種治療與存活素相關(guān)的疾病或與存活素表達(dá)升高相關(guān)的病情的方法，該方法包括給有需要的對(duì)象有效量的上述的合成的或分離的核酶、載體、或藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供了一種促進(jìn)表達(dá)存活素的組織或細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括給予所述組織或細(xì)胞有效量的上述合成的或分離的核酶、載體或藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供了一種提高癌細(xì)胞對(duì)化療或放療的敏感性的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與有效量的上述合成的或分離的核酶、載體或藥物組合物接觸。本發(fā)明還有一方面涉及了上述合成的或分離的核酶或載體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療與存活素相關(guān)的疾病或與存活素基因表達(dá)升高相關(guān)的病情。這些合成的核酶和載體，比如以腺病毒載體為基礎(chǔ)的抗SURVIVIN核酶，在治療高細(xì)胞增殖癥方面有著廣泛的應(yīng)用，這里所指的高細(xì)胞增殖癥包括癌癥但是并不僅僅是癌癥。此外，本發(fā)明還詳細(xì)介紹了鑒定耐用的綞頭狀核酶能否在體內(nèi)切割任何給定的RNA的方法。圖1顯示了實(shí)驗(yàn)流程的示意圖。圖2顯示了切割S^TiT/vVmRNA的錘頭狀核酶。圖A描述了由MF0LD程序預(yù)測(cè)的SUVIVINmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。核酶Rl—R4各自在6Z^K/KZ^mRNA上的切割位點(diǎn)用圓圈標(biāo)出；圖B標(biāo)出^5ZWK/rZVmRNA序列以及被核酶切割的核苷酸；圖C展示了5Z^W^VmRNA底物和核酶(Rl到R4)，重點(diǎn)突出兩者的配對(duì)區(qū)和切割位點(diǎn)。圖3顯示了表達(dá)質(zhì)粒和腺病毒載體。圖A:用于表達(dá)錘頭狀核酶(ribozyme)的質(zhì)粒載體pGVaL。該載體含有兩個(gè)腺病毒小RNA基因VaI和VaII，和位于其上游的T7啟動(dòng)子(T7pro,用于試管內(nèi)的轉(zhuǎn)錄)或polIII(PolIIIpro,用于真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄)啟動(dòng)子。核酶序列可引入到位于以人為引進(jìn)的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的的環(huán)區(qū)(loop)的SalI和PstI位點(diǎn)，使核酶分子暴露于其和VaI的融合RNA分子。圖B:表達(dá)核酶的腺病毒載體。pGVaL-l—4的各自的BamHI和NheI片段分別插入pDC載體(Microbix腺病毒載體系統(tǒng))中，產(chǎn)生pDC-Rl—4。pDC-R134中按照標(biāo)出得順序依次導(dǎo)入了pGVaLRl，R3和R4中的BamHl/NheI片段。圖C為基礎(chǔ)由CMV和T7啟動(dòng)子指控由一編碼HA三肽段標(biāo)記的序列引導(dǎo)的5ZWWvVcDNA的表達(dá)載體HAS。在HAS的6Z況KiT7^序列的下游同框接上螢火蟲(chóng)的熒光素酶基因(luciferase)，而產(chǎn)生HASL。圖4顯示試管內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)各自核酶切割6Z/AT/WRNA的特異性和效率。圖A示出所預(yù)測(cè)的從核酶R1到R4的切割位點(diǎn)和用于引物延伸實(shí)驗(yàn)的引物的在5ZWW;V序列中的位置。圖B:用箭頭示出反映由Rl,R2，R3和R4特異性切割^5Z況K/Ki^RNA的位點(diǎn)的引物延伸片段在測(cè)序電泳的位置。用同一個(gè)引物的所進(jìn)行的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)(ACGU)同時(shí)示出。(-)和(+)分別指無(wú)核酶對(duì)照和核酶實(shí)驗(yàn)組。圖C，示出HASLRNA受核酶切割后再經(jīng)試管內(nèi)翻譯所產(chǎn)生的熒光素酶活性。"All":經(jīng)所有四種核酶處理的，control是無(wú)核酶對(duì)照。圖D顯示用HA抗體對(duì)HASL產(chǎn)物的Western分析的結(jié)果。帶的強(qiáng)度的相對(duì)于無(wú)核酶處理對(duì)照(100%)的比值在圖下示出。圖5顯示細(xì)胞內(nèi)核酶介導(dǎo)的5Z況KiT/yVmRNA切割效應(yīng)的以及其對(duì)肝癌細(xì)胞系，S麗C-7721的生存和凋亡的作用。圖A顯示了核酶腺病毒，空載體(GVal)腺病毒侵染的和未侵染的S顧C(jī)-7721細(xì)胞(它的值被認(rèn)為是1)MTT值。圖B顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時(shí)的細(xì)胞的凋亡標(biāo)記蛋白PARP(85kDa)的表達(dá)水平的Western分析結(jié)果。以PCNA蛋白的表達(dá)水平作為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖C顯示了5ZWF/K/7^mRNA和核酶表達(dá)水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌動(dòng)蛋白((3-actin)RNA做為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖D顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時(shí)的細(xì)胞的SURVIVIN表達(dá)水平的Western分析結(jié)果。以PCNA蛋白的表達(dá)水平作為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖E顯示了病毒感染干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。用劑量為MOI25的GVaL(空載體)和R3或R134病毒處理過(guò)的細(xì)胞的熒光免疫檢測(cè)。并用微管蛋白(tubulin)抗體染色(綠色；b，b，和b")，ACA(中心粒)抗體(紅色；a，a，和a")以及DNA染料T0T03(藍(lán)色；c，c'和c")。核酶處理導(dǎo)致破壞的有絲分裂細(xì)胞被觀察到多級(jí)的紡錘體，而對(duì)照組的細(xì)胞卻呈現(xiàn)出中期和后期等正常的有絲分裂進(jìn)程。尺度為10"m。圖6顯示了細(xì)胞內(nèi)核酶介導(dǎo)的6Z況K/KZVmRNA切割效應(yīng)的以及其對(duì)肝癌細(xì)胞系，PLC(ATCCNo.CRL-8024)的生存和凋亡的作用。圖A顯示了核酶腺病毒，空載體腺病毒侵染的和未侵染的PLC細(xì)胞(它的值被認(rèn)為是1)MTT值。圖B顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時(shí)的細(xì)胞的凋亡標(biāo)記蛋白PARP(85kDa)的表達(dá)水平的Western分析結(jié)果。以PCNA蛋白的表達(dá)水平作為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖C顯示了WyVmRNA和核酶表達(dá)水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA做為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖D顯示了劑量為MOI25的腺病毒侵染72小時(shí)的細(xì)胞的SURVIVIN表達(dá)水平的Western分析結(jié)果。以PCNA蛋白的表達(dá)水平作為上載內(nèi)參。前者和后者的比值在圖下示出。圖7顯示了核酶對(duì)于S醒C-7721細(xì)胞對(duì)于Irinotecan(伊立替康)Hydrochloride的敏感性的增強(qiáng)的作用。圖A和B示出SMMC-7721細(xì)胞在遭受了24小時(shí)病毒感染的5,10和25和分別接受濃度為50，100和250g/ml的IH處理的MTT值。圖C禾BD顯示了以100和250g/ml的IH作為100%基準(zhǔn)所示出的相應(yīng)的GVaL，R3和R134病毒處理的MTT值的比率。圖E和F示出PARP(85kDa)和PCNA(內(nèi)參)的Western分析結(jié)果。前者和后者的比值在圖下示出。圖8顯示了核酶腺病毒對(duì)SMMC-7721腫瘤細(xì)胞的裸鼠內(nèi)成瘤能力的阻止效應(yīng)。圖A顯示了實(shí)驗(yàn)流程。圖B顯示了劑量為MOI:25的GVaL和R2感染的S醒C-7721細(xì)胞在裸鼠內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。圖C顯示了來(lái)自R2，GVaL，和無(wú)病毒感染的S醒C-7721細(xì)胞在裸鼠內(nèi)成瘤35天相對(duì)腫瘤大小。圖D顯示了GVaL/S腿C-7721;GVaL/Rl;GVaL/R2，GVaL/R3,GVaL/R4和GVaL/R134感染細(xì)胞在裸鼠內(nèi)成瘤35天的腫瘤。圖E顯示了劑量為MOI:10的GVaL和R4感染的SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。圖F顯示了在GVaL和R4感染SMMC-7721在裸鼠內(nèi)成瘤35天腫瘤的相對(duì)大小。圖G顯示了GVaL/R3，GVaL/R4，和GVaL/R134感染細(xì)胞在裸鼠內(nèi)成瘤35天的腫瘤。圖H顯示了GVaL感染的SMMC-7721細(xì)胞在R3和R134實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線。圖I示出GVaL感染的SMMC-7721細(xì)胞在R3和R134實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)腫瘤大小。圖J禾卩I分別顯示GvaL，R2(M0I:25)和R4(M0I:10)核酶病毒感染S醒C一7721細(xì)胞在裸鼠中成的瘤的5Z/vK/K/^和Ki67(反映細(xì)胞的DNA復(fù)制指數(shù))蛋白的表達(dá)水平。圖9顯示了5Z/yWyVmRNA的剪切變異體(全長(zhǎng)survivinvariantl;2B和deltaEx3)和及其能被核酶切割的潛力。具體實(shí)施例方式本發(fā)明第一方面提供了合成的或分離的核酶，該核酶能夠切割5Z/;K/W的mRNA(SEQIDNO:1)。所述核酶含一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和在該催化結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的兩個(gè)與底物RNA序列特異性配對(duì)結(jié)合的區(qū)域(在本發(fā)明中也稱為第一核酶結(jié)合臂和第二核酶結(jié)合臂)，所述第一核酶結(jié)合臂和第二結(jié)合臂分別包含選自下組的SEQIDNO:1的區(qū)域互補(bǔ)的序列(1)+53-60和+62_69;(2)+75-82和+84-91;(3)+224-231和+233-240;+350-357和+359-366。例如，當(dāng)?shù)谝缓嗣附Y(jié)合臂包含與SEQIDNO:1中+53-60位區(qū)域互補(bǔ)的序列時(shí)，第二核酶結(jié)合臂包含與SEQIDNO:1中+62-69區(qū)域互補(bǔ)的序列，而且兩者之間可以互換。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述核酶包含核酶R1、R2、R3或R4的序歹lj(見(jiàn)圖2)。此處使用的術(shù)語(yǔ)"核酶"不僅指?jìng)鹘y(tǒng)意義的能序列特異性地切割核糖核酸序列的核糖核酸分子，還包括DNA以及核酸類似物組成，或者其與RNA構(gòu)成組合分子，如DNA/RNA嵌合物。通過(guò)序列互補(bǔ)的方式，核酶以特異地切割RNA底物的磷酸二酯鍵的RNA分子。在切割后，水解了的底物寡核苷酸從核酶上脫落。此核酶又可以參加進(jìn)一步的反應(yīng)。原則上說(shuō)，所有能在分子內(nèi)切割磷酸二酯鍵的核酸對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)都是合適的。核酶的催化結(jié)構(gòu)域可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)知識(shí)來(lái)設(shè)計(jì)。此處所用的術(shù)語(yǔ)"包含"是指結(jié)合臂中除了與SEQIDNO:1的指定區(qū)域互補(bǔ)的序列外還可有其他序列，所述其它序列的長(zhǎng)度可以為1-30bp，更佳的為1-10bp。在另一較佳的實(shí)施方案中，所述核酶結(jié)合臂與SEQIDNO:1中的指定區(qū)域完全互補(bǔ)。如上所述，本發(fā)明提供了能夠在序列SEQIDNO:1處切割SURVIVINmRNA的錘頭狀核酶。本發(fā)明的技術(shù)方案也可用其它類型的核酶形式來(lái)實(shí)施，其包括但不限于錘頭狀核酶，發(fā)夾狀核酶，環(huán)形核酶，環(huán)形/發(fā)夾狀核酶，套索狀核酶，發(fā)夾/套索狀核酶，RNA酶P核酶，肝炎病毒核酶，I類內(nèi)含子核酶或者小型酶。對(duì)于熟練掌握這些現(xiàn)有技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，所有這些選擇均為顯而易見(jiàn)。錘頭狀核酶的切割位點(diǎn)的序列要求是任何由NUH(N可以是任意的核苷酸，H可以是除了G以外的任意核苷酸)組成的RNA序列。在SURVIVINmRNA序列(醒一OOl168;SEQIDNO:1)中有449個(gè)NUH序列可作為錘頭狀核酶切割的靶序列。本發(fā)明對(duì)SURVIVINmRNA的+61，+83，+232和+358的核苷酸作為錘頭狀核酶靶切點(diǎn)的價(jià)值作了系統(tǒng)的分析。核酶分別含有SURVIVINmRNA(歷—001168,A作為翻譯的起始密碼，ATG被定義為+1)的+53-60和+62-69，+75-82和+84-91，+224-231和+233-240，和+350-357和+359-366特異性配對(duì)的臂區(qū)(核酶Rl到R4,圖2B)。本發(fā)明中的核酶，以及編碼這些核酶的DNA以及其他適合的核酸分子，可通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得。核酶亦可通過(guò)傳統(tǒng)的基因表達(dá)的方式從其編碼DNA序列在真核細(xì)胞啟動(dòng)子(在靶細(xì)胞中表達(dá))或原核細(xì)胞啟動(dòng)子(在試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄)的控制下完成。前者為CMV等和其它在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。后者由T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子和SP6RNA聚合酶的啟動(dòng)子。本發(fā)明中的核酶可以是單體或是多聚體。術(shù)語(yǔ)"多聚體核酶"和"聚核酶"在本發(fā)明的陳述中意思相同，都是意為一個(gè)通過(guò)一系列的核酶首尾相連形成的RNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了頭尾連接的3個(gè)錘頭狀核酶基因，其中每個(gè)核酶的兩個(gè)結(jié)合臂分別由與SEQIDN0:1的以下區(qū)域互補(bǔ)的序列組成(1)+53-60和+62-69;(2)+224-231和+233-240;(3)+350-357和+359-366。例如，第一個(gè)錘頭核酶的兩個(gè)結(jié)合臂分別與SEQIDNO:1的+53-60和+62-69區(qū)域互補(bǔ)，第二個(gè)錘頭核酶的兩個(gè)結(jié)合臂分別與SEQIDNO:1的+224-231和+233-240區(qū)域互補(bǔ)，第三個(gè)錘頭核酶的兩個(gè)結(jié)合臂分別與SEQIDNO:1的+350-357和+359-366區(qū)域互補(bǔ)。所述三個(gè)核酶的位置也可以前后互換。用核酶來(lái)治療疾病還涉及向受靶細(xì)胞引進(jìn)化學(xué)合成的核酶或可以表達(dá)核酶分子的基因。這涉及到將能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生核酶的核酶基因及其調(diào)控區(qū)的復(fù)合體的轉(zhuǎn)道。為此，本發(fā)明提供了一種包含編碼此核酶RNA的序列的載體。在此，"載體"指一種能夠表達(dá)核酶的序列裝配體。在此核酶基因由適于將其導(dǎo)入并在宿主細(xì)胞高效表達(dá)的載體所攜帶。其中編碼核酶基因的序列受到聚合酶III(例如來(lái)自腺病毒的tRNA或VA-1)，CMV，SV40等真核細(xì)胞類型特異性的啟動(dòng)子，亦可由組織或腫瘤細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子控制。除了本發(fā)明中所使用的非增殖性腺病毒載體以外，其他載體也可能同樣有效或更好。病毒類載體還有腺病毒相關(guān)病毒，慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體。本發(fā)明所使用的腺病毒載體攜帶受著腺病毒VA-1基因的polIII啟動(dòng)子控制的編碼針對(duì)SURVIVINmRNA的核酶的DNA序列。核酶的編碼序列處于A.Lieber'spGVaL載體的腺病毒VRLRNA基因中，在保留必要序列的前提下，大部分VA1基因區(qū)已被去除后轉(zhuǎn)移到腺病毒載體中。鑒于核酶序列插入腺病毒ValIRNA基因中，在該基因強(qiáng)有力的polIII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生高水平的RNA，并有較高的穩(wěn)定性，即，核酶脂A半衰期長(zhǎng)。核酶序列置于一個(gè)人工引入ValI基因由倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列組成的環(huán)形區(qū)中(圖3A)——核酶RNA可望充分暴露于VA1RNA部分之外，預(yù)期可增加核酶與其靶分子RNA的接觸，而達(dá)到對(duì)其有效地切割。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種載體(如腺病毒表達(dá)載體)，它包含編碼本發(fā)明所述的核酶的RNA的序列，以及與該序列操作性相連的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。在更佳的技術(shù)方案中，所述核酶RNA序列位于腺病毒VALRNA基因中。在更優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述核酶RNA序列位于人工引入ValI基因的由倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列組成的環(huán)形區(qū)中。在另一技術(shù)方案中，該載體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)核酶基因在一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的控制之下。本發(fā)明還提供了攜帶上述載體的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于如大鼠、小鼠以及人細(xì)胞等。本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)的分析涉及到生物信息方法設(shè)計(jì)，對(duì)在試管、細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中錘頭狀核酶對(duì)底物RNA切割的特異性和有效性的系統(tǒng)分析(a)通過(guò)mfold軟件預(yù)測(cè)的SURVIVINmRNA的開(kāi)放區(qū)域，對(duì)其中4個(gè)符合錘頭狀核酶切點(diǎn)序列的順序進(jìn)行了相對(duì)應(yīng)的核酶的設(shè)計(jì)和表達(dá)載體的構(gòu)建。(b),用RT-PCR法在mRNA水平以及免疫檢測(cè)方法(Western和免疫細(xì)胞化學(xué))在腫瘤組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平上測(cè)度SURVIVIN表達(dá)。(c),通過(guò)用T7噬菌體RNA的轉(zhuǎn)錄酶在試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄，制作核酶和底物RNA。(d)，通過(guò)引物延伸，報(bào)告基因活性測(cè)定和蛋白水平檢測(cè)來(lái)判定錘頭狀核酶切割SURVIVINmRNA的特異性和有效性。(f)，通過(guò)攜帶非增殖性腺病毒載體感染腫瘤細(xì)胞并高效表達(dá)核酶。通過(guò)RT-PCR方法對(duì)核酶的表達(dá)進(jìn)行定量。(g)，SURVIVIN表達(dá)受抑所致的細(xì)胞水平上生物學(xué)效應(yīng)通過(guò)MTT方法對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡狀態(tài)進(jìn)行度量，通過(guò)Western分析對(duì)PARP(85KD)水平的度量來(lái)判斷細(xì)胞的調(diào)往狀態(tài)，和通過(guò)RT—PCR在RNA水平上，Western在蛋白質(zhì)水平上評(píng)估核酶對(duì)SURVIVIN表達(dá)的影響。(f)，SURVIVIN表達(dá)受抑所致的活體動(dòng)物水平上生物學(xué)效應(yīng)通過(guò)對(duì)裸鼠體內(nèi)荷瘤的生長(zhǎng)的度量，和以免疫組化手段對(duì)腫瘤組織中的SURVIVIN蛋白和K67蛋白(反映細(xì)胞增殖的速率)在的水平的度量。上述核酶及其載體可用于治療所有與SURVIVIN表達(dá)過(guò)高相關(guān)聯(lián)疾病狀態(tài)。在本發(fā)明中需要這種治療的試驗(yàn)對(duì)象包括動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，比如人類，家畜，非人類的靈長(zhǎng)類，寵物，動(dòng)物園動(dòng)物等等，雖然在本發(fā)明中的試驗(yàn)對(duì)象為人類。以用本發(fā)明來(lái)治療的病情為所有與SURVIVIN相關(guān)或與其表達(dá)過(guò)高(過(guò)表達(dá))相關(guān)聯(lián)的疾病狀態(tài)，其可包括，但不局限于腫瘤(所有組織來(lái)源，如心血管疾病和自身免疫性疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)等。本發(fā)明也提供了在表達(dá)SURVIVIN的組織和細(xì)胞里促進(jìn)凋亡的方法和一種增加癌細(xì)胞對(duì)化療和放射療法敏感性的方法。在簡(jiǎn)要的介紹這項(xiàng)發(fā)明后，通過(guò)下面的這個(gè)實(shí)施例可以使這項(xiàng)發(fā)明更容易理解。這個(gè)例子只是為了說(shuō)明，并不是為了將本發(fā)明的范圍僅局限在這個(gè)實(shí)施例。實(shí)施例材料與方法1、構(gòu)建質(zhì)粒和腺病毒1)抗-^7AF/r/iV核酶表達(dá)質(zhì)粒載體通過(guò)MFOLD軟"f牛(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/forml.cgi)對(duì)人^7if7^77VmRNA(GenBankNo.BC008718;SEQIDNO:l)進(jìn)行分析，獲得編碼區(qū)(從ATG的A:1至TGA中的A:426，環(huán)狀)中的暴露區(qū)。繼而根據(jù)NUH核酶切割準(zhǔn)則設(shè)計(jì)4個(gè)核酶分別在+61,+83,+232和+358處切害U(R1—4)(圖2A)。合成的寡聚核酸對(duì)(表1)5'端磷酸化后退火成雙鏈，然后克隆到pGVaL質(zhì)粒載體的Sail和PstI酶切位點(diǎn)[25](圖3A)。構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGVaL-Rl、-R2、-R3、-R4。表1核酶的寡聚核苷酸核酶Rl(+61)R2(+83)R3(+232)序列R1U5-TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGCGGACGAAAGAGATGCATGCA-3(SEQIDNO:2)RIB5-TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG-3(SEQIDNO:3)R2U5-TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA-3(SEQIDNO:4)R2B5-TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG-3(SEQIDNO:5)R3U5-TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA-3(SEQIDNO:6)R3B5-TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG-3(SEQIDNO:7)_R4U5-TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA-3(SEQIDNO:8)R4(+358)R4B5-TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAA__AG-3(SEQIDNO:9)_U:上鏈；B:下鏈；2)SL^WT77V質(zhì)粒表達(dá)載體F/raV的編碼區(qū)(從ATG的A:1至TGA中的A:426)用pfu-PCR從SMMC-7721肝癌細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增獲得，引物為SurL5-CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG-3(SEQIDNO:10);SurR5-GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT-3(SEQIDNO:1l)(帶下劃線部分分別是BglII和Xhol的識(shí)別位點(diǎn)。然后通過(guò)克隆到pcDNA-HA載體的三個(gè)HA標(biāo)記的下游區(qū)域，從而獲得HAS。pGL-3-basic中的HindIII(平端)和XbaI熒光酶素間的片斷克隆到HAS的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，從而獲得HASL(圖3C)。3)非復(fù)制型的腺病毒-核酶載體(AdMax系統(tǒng)構(gòu)建，http:〃www.microbix.com/)(圖3.B)pGVaL和pGVaL-Rl-4的BamHI/NheI(平端)片斷通過(guò)AdMax系統(tǒng)插入到載體pDC的BglII/HindIII(平端)位點(diǎn)，從而分別得到pDC-GVaL和pDC-Rl-4。pDC-Rl中的EcoRI/SacI(平端)的片斷插入到pDC-R3的EcoRI/SmaI位點(diǎn)(平端)中，獲得pDC-R13。pDC-R13的EcoRI/SacI(平端)片斷插入到pDC-R4的EcoRI/SmaI位點(diǎn)(平端)中從而獲得pDC-R134。上述質(zhì)粒分別與腺病毒骨架載體(pBHGE3AEl)共轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞，通過(guò)cre-loxp介導(dǎo)的腺病毒重組，而產(chǎn)生預(yù)期的腺病毒。經(jīng)鑒定(測(cè)序)后，核酶腺病毒將大規(guī)模擴(kuò)增，純化，定效價(jià)后分裝并保存在-2(TC冰箱備用。2、試管內(nèi)核酶切割特異性和效價(jià)的度量1)利用T7RNA聚合酶(Takara)通過(guò)試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄2ug線性化了的pGVaL/pGVaL-R4(XbaI)和HASL(HindIII酶切)而分別獲得核酶和HA-SWF/P7A^熒光素酶RNAs，用DNaseI消化后通過(guò)半定量的RT-PCR對(duì)RNAs進(jìn)行定量。2)試管內(nèi)核酶對(duì)HA-SWr/r/A^-熒光素酶RNAs的剪切溶于10ul的50mMTris(pH7.5)/lmMEDTA的核酶和HA-SWWT77V-熒光素酶RNAs(各1nm)經(jīng)熱變性后迅速降溫到30°C。加入MgCl2至最終濃度為10mM，起始60分鐘的剪切反應(yīng)。RNAs經(jīng)用醋酸銨/乙醇沉淀后，進(jìn)行分析。A，2/3的對(duì)照和轉(zhuǎn)錄剪切樣品通過(guò)5-32P標(biāo)記利用T4多聚核苷酸激酶進(jìn)行引物延伸分析(SPE1用于Rl和R2,SPE2用于R3和SPE3用于R4,表2,圖2C)。利用同樣的引物以HASL模版通過(guò)T7DNA聚合酶驅(qū)動(dòng)的測(cè)序反應(yīng)(Amersham，UK)來(lái)作為切口定位的參照。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>寡核苷酸末端通過(guò)T4核苷酸激酶將h^P]ATP的32P標(biāo)記(5000Ci/mmo1)B，剩下的1/3產(chǎn)物在試管內(nèi)翻譯(RabbitReticulocyteLysateSystem,Promega)而產(chǎn)生蛋白，所得產(chǎn)物的1/5通過(guò)Lumat光度計(jì)(LB9506)檢測(cè)熒光酶素，并作圖。剩下的4/5的翻譯產(chǎn)物通過(guò)HA抗體的Western分析，并通過(guò)SuperSignalWestPico熒光底物進(jìn)行顯示，對(duì)其定量。3、腺病毒核酶抑制SURVIVIN表達(dá)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)SMMC-7721和PLC肝癌細(xì)胞分別在含10。/。胎兒牛血清(PAA,Austria)或10%新生小牛血清(Si-ji-Qing,中國(guó))的Dulbeccco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen)在37°C，5。/。C02條件下，培養(yǎng)。病毒感染后72小時(shí)后通過(guò)MTT方法測(cè)定細(xì)胞存活率。MTT相對(duì)值通過(guò)如下公式計(jì)算絕對(duì)值氣樣品OD值-空白組ODy(對(duì)照組OD-空白組OD)x100%。病毒感染后48小時(shí)后細(xì)胞被收集做RT-PCR和Western分析。在分析細(xì)胞對(duì)Irinotecanhydrochloride細(xì)胞毒素的敏感性時(shí)[26]，SMMC-7721細(xì)胞被病毒感染24h，繼而用最終濃度分別為50，100，250ug/ml的Irinotecanhydrochloride處理48h，然后進(jìn)行MTT測(cè)量。使用半定量的RT-PCR對(duì)SURVIVIN，J5—肌動(dòng)蛋白和核酶的表達(dá)水平進(jìn)行定量，(所用的引物見(jiàn)表3)。核酶病毒感染細(xì)胞和無(wú)核酶病毒感染的細(xì)胞的SURVIVINmRNA的表達(dá)程度通過(guò)SRVIVIN對(duì)P—肌動(dòng)蛋白的比值)來(lái)表示的。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>N.B.，Loop1和Loop2是用來(lái)對(duì)核酶表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析的。用15%SDS/PAGE凝膠上Western方法來(lái)分析St/iF/raV的表達(dá)OSWWraV抗體，F(xiàn)L-142,SantaCruz，USA)，以PCNA作為內(nèi)參。85KDa的PARP(pAB[27]，Promega,USA)/PCNA的Western分析是在7.5%SDS的PAGE凝膠上進(jìn)行的。SWWWiV或85Kd的PRAR對(duì)PCNA帶的相對(duì)強(qiáng)度的比值是判斷核酶病毒感染的細(xì)胞和對(duì)照的指標(biāo)。4、免疫熒光顯微觀察SMMC-7721細(xì)胞分別被SWF/F/iV核酶(;R3或R4)和GVaL(無(wú)核酶對(duì)照)病毒感染24h后，經(jīng)富爾馬林固定，2%TritonX-100處理，然后用含0.05%Tween-20和1。/oBSA(Sigma)的PBS封閉。分別用抗鼠微管蛋白抗體DM1A1:5，000;人著絲粒抗體ACA1:2，000對(duì)其作用1小時(shí)。用TPBS洗3次，以完全去除一抗。用TexasRed-偶聯(lián)的羊抗人IgG+IgM和FITC-偶聯(lián)的兔抗鼠IgG(JacksonImmunoResearch)作為二抗體進(jìn)行分別對(duì)微管蛋白或著絲粒熒光顯色。將DNA用TOTO-3(Invitrogen)染色。波片用LeicaSP5公焦顯微鏡觀察。5、核酶腺病毒對(duì)在裸鼠中腫瘤細(xì)胞能力的抑制SMMC-7721細(xì)胞分別被MOI:10或25的核酶病毒感染24h/37°C后皮下注入到裸鼠((Balb/c,nu/nu)的側(cè)部(3xl0V點(diǎn))。每組有三只老鼠，每只老鼠的左側(cè)注入了SMMC-7721細(xì)胞或Adeno/GVaL(不含核酶的病毒)感染的細(xì)胞(對(duì)照)，右側(cè)注入核酶腺病毒感染的細(xì)胞。監(jiān)視和測(cè)檢腫瘤的生長(zhǎng)直到4周后試驗(yàn)的結(jié)束。對(duì)腫瘤秤重。腫瘤經(jīng)甲醛固定，切片后用H&E染色或免疫熒光來(lái)檢測(cè)SWWW(抗體，F(xiàn)L-142,SantaCruz,USAl:10稀釋)和Ki67蛋白(1:10稀釋Ki67抗體，Novocastra，UK)的表達(dá)，顯色是通過(guò)EnVisionSystem(HRP，GK400315，DAKO，USA)獲得。每種蛋白的表達(dá)都通過(guò)程度(0-3)和陽(yáng)性細(xì)胞的比率(0=小于5%，1=5-25%,2=25-50%，3=50-75%，4=大于75%)打分。整體的免疫熒光分?jǐn)?shù)通過(guò)將程度與百分率相乘。l-4分記為+，6-8記為++，9-12記為+++。試驗(yàn)結(jié)果1、設(shè)計(jì)抗-^WF/F/7V錘頭狀核酶禾ij用MFOLD軟件(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/ma/forml.cgi)[28](圖.2A)來(lái)預(yù)測(cè)SURVIVINRNA編碼區(qū)的暴露區(qū)，繼而設(shè)計(jì)出來(lái)分別剪切SWWT77VmRNA的+61(R1),+83(R2),+232(R3)，禾tl+358(114)錘頭狀核酶(圖.2B-C)。核酶基因繼而被插入到Lieber構(gòu)建的pGVaL載體中[25](圖.3A)。該載體較好地解決了高效地完成錘頭狀核酶介導(dǎo)的mRNA剪切三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)表達(dá)程度，穩(wěn)定性和接近靶點(diǎn)的可能性[25，29]。核酶基因被插入到受控于一強(qiáng)啟動(dòng)子polIII腺病毒ValIRNA基因內(nèi)部，不僅使其能夠高效轉(zhuǎn)錄，并有效地延長(zhǎng)了其穩(wěn)定性。核酶基因插入到Vall基因一個(gè)人為構(gòu)建的環(huán)中部[25](pGVaL-Rxin圖.3A)，預(yù)期核酶將會(huì)有效地暴露在此融合RNA的外部。為了方便試管內(nèi)合成，在ValI基因的上游引入了一個(gè)額外的T7噬菌體的啟動(dòng)子(圖.3A)。為了方便在細(xì)胞和動(dòng)物中分析，以便最終能應(yīng)用到臨床癌癥治療，我們將pGVaL-Rx中的含核酶的BamHI和NheI片段被引入到腺病毒載體中(圖.38)。HA標(biāo)記的SWWWiV-熒光蟲(chóng)熒光素酶融合基因被加入到以pcDNA3.1構(gòu)建的載體中，獲得HASL(圖.3C)。所以試管內(nèi)評(píng)估SWP7W7VRNA剪切特異性和效率可以通過(guò)以下方法方便的進(jìn)行1、引物延伸(同時(shí)檢測(cè)剪切特異性和效率)；2、western分析熒光素酶活性和蛋白含量(剪切特異性)。2、試管內(nèi)檢測(cè)核酶對(duì)SURVIVINmBNA的剪切特異性和有效性等量(lnM)的核酶和試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄的底物mRNA在Mg^起始下進(jìn)行剪切。剪切位點(diǎn)通過(guò)32P末端標(biāo)記(SPE1到SPE3，圖4A)的反義寡核苷酸引物延伸被精確定位到核苷酸序列水平，同時(shí)以人工合成的序列梯度作對(duì)照。所有的四種核酶都可以進(jìn)行對(duì)mRNA進(jìn)行精確的剪切(如圖.48所示)。若以相關(guān)的條帶密度是各自核酶的剪切能力的反應(yīng)，R2的效應(yīng)較低。對(duì)經(jīng)剪切的SURVIVIN—LUCRNA在試管內(nèi)被翻譯成的蛋白檢驗(yàn)熒光素酶的活性(圖.4C)或用Western分析的方法分析相應(yīng)的蛋白量(圖.4D)。核酶的剪切導(dǎo)致熒光素酶的活性從對(duì)照組(無(wú)核酶)(100%)分別減少到62.65%(R1),70%(R2),40.35%(R3),57%(R4)和28.7%(所有四個(gè))(圖.4C)。蛋白的密度從對(duì)照組(100%)分別減少到48.8%(R1),124.39%(R2),28.7%(R3),61。/。(R4)和16.5%(所有四個(gè))(圖.4D)。所有符合MFOLD預(yù)期的核酶都有特異的剪切SWWr/7VmRNA的不同強(qiáng)弱的能力。R3能力最強(qiáng)，然后能力強(qiáng)弱如下R1"R4〉R2。當(dāng)所有核酶都加入時(shí)剪切更為充分(圖.4C和D)。3、用核酶腺病毒感染和對(duì)內(nèi)源性SURVIVINmRNA的剪切及其生物學(xué)影響用不同劑量的攜帶核酶基因(R1到R4)或R134三聯(lián)體或無(wú)核酶的載體(GVaL)的非復(fù)制性的腺病毒感染SMMC-7721肝癌細(xì)胞72小時(shí)后，用MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞損失的生存能力(圖.5A)，用Western分析測(cè)量PARP85kDa蛋白的水平來(lái)反映細(xì)胞凋亡指數(shù)(圖.5B)，用Western分析和半定量PCR分析檢驗(yàn)SWF/F/iV表達(dá)的抑制(圖.5C)。和試管內(nèi)的觀察結(jié)果一致(圖.3和4)，R2是功效最低的核酶，甚至在MOI值在50的時(shí)候，MMT減少不多于20c/。。R3仍然是活性最強(qiáng)的。以R3做對(duì)照，R134有更強(qiáng)的效應(yīng)MOI12.5:23.2%(R3:38.6%),和MOI25:15.2%(R3:27.77%)(圖.5A)。PARP85kDa是PARP-1的特異性剪切產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)PARP，85kDa(—個(gè)檢驗(yàn)活化的細(xì)胞凋零過(guò)程的傳統(tǒng)蛋白標(biāo)記物)量的度量，在SMMC-7721對(duì)照為100%失，R2的相關(guān)值為164%,Rl:480%，R3:768%,R4:460%禾卩R134:1340%(圖.5B)。因此，由MTT試驗(yàn)檢測(cè)到的細(xì)胞活性的下降的確是由于核酶抑制SWr/F/W的表達(dá)以引起細(xì)胞凋零(圖.5C和D)。半定量RT-PCR分析證明了和被核酶腺病毒感染的細(xì)胞P—肌動(dòng)蛋白和核酶表達(dá)水平均無(wú)明顯差別。但SMMC-7721細(xì)胞中SWK/F/iVRNA則隨核酶不同而異91.4%,Rl:36.14%;R2:108.3%;R3:33.82%;R4:60.45%;R134:22%(圖.5C)。對(duì)^7if7P7iV蛋白的Western分析將得出同樣的結(jié)論。R134為最為有效(圖.5D)。免疫熒光研究表明SMMC-7721細(xì)胞通過(guò)R3和R134核酶病毒感染會(huì)發(fā)生的染色體分離的混亂(圖.5E:d'和d")。83±7%的被感染細(xì)胞的染色體在有絲分裂后期不能排在赤道板上，出現(xiàn)多極的紡錘絲(c'和c")，而GVaL感染的對(duì)照組此值為5土3。/0的(11=4)，但是由ACA標(biāo)記的微管完整性和著絲粒是不改變的，暗示著核酶處理的特異性(a，禾卩a")。對(duì)PLC肝細(xì)胞瘤系(ATCCNo.CRL-8024)上做了同樣的分析，得到了同樣的結(jié)論(圖.6)。SURVIVIN的過(guò)度表達(dá)是臨床所見(jiàn)的腫瘤放射性和化學(xué)抗性的重要機(jī)制31,32]。用反義寡核苷酸和siRNA抑制SURVIVIN的表達(dá)使本來(lái)對(duì)化療有抗性的細(xì)胞變得敏感[33,34]。分別被MOI為5，10和25的病毒感染24小時(shí)后，繼而被IH(—個(gè)化學(xué)療法藥物的異構(gòu)酶抑制劑)在3個(gè)sub-ID50劑量(50，100和250)ig/ml)中作用48小時(shí)后，進(jìn)行在MTT分析和PARP85kDa的定量(圖.7)。R3只在IH為50和100嗎/ml可促進(jìn)細(xì)胞死亡，但R134病毒甚至在250嗎/ml時(shí)仍然有效果(圖.7A和B)。R134較R3更為有效可更明確地在將R3病毒感染/100和250pg/mlIH處理細(xì)胞的MTT值分別為100%，輔以R134病毒感染的細(xì)胞的MTT與前者的比例來(lái)作圖的圖7C和D中示出。病毒劑量為10MOI(10個(gè)病毒對(duì)1個(gè)細(xì)胞)/100嗎/mlIH的R134和R3病毒感染細(xì)胞的MTT的比值分別為88%和100%;而病毒劑量為10/250pg/ml時(shí),該值為77%和91.5%,而病毒劑量為25/100|ig/mlIH時(shí),該值為78%和94%以及而病毒劑量為25/250pg/ml時(shí)72%和83%。對(duì)相關(guān)蛋白的Western分析支持這一結(jié)果。在病毒劑量為25的條件下，PARP8SkDa蛋白的相對(duì)量增加到125%(Rl)，140%(R3)和135%(R4)(圖.7E),在病毒劑量為10的條件下，該值為147。/。(R134)(圖.7E)。更為明顯的是，當(dāng)細(xì)胞受到100iag/mlIH處理時(shí)。病毒劑量為5的R134(267。/。)導(dǎo)致比病毒劑量為25R3(226。/。)更多的的PARP85kDa蛋白(圖.7F)。4、腺病毒核酶阻止SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)劑量為25的病毒感染24小時(shí)后，注入裸鼠背部皮下。為了避免個(gè)體差異的影響，每個(gè)鼠的右背注入未感染的或無(wú)核每空載體腺病毒感染的SMMC-7721細(xì)胞，而鼠的左背注入核酶腺病毒(圖.8A)。除了R2核酶病毒感染細(xì)胞以較對(duì)照為緩的速率成瘤，形成較小的瘤(與GVaL腺病毒的瘤重比為0.64:1)，其它核酶病毒感染的細(xì)胞不能成瘤(圖.8B-D)。在病毒劑量為10的情況下，R4核酶病毒感染的細(xì)胞以較對(duì)照為緩的速率成瘤，形成較小的瘤(與GVaL腺病毒的瘤重比為0.45:1)，R3和R134核酶病毒未能成瘤(圖.8E-H)。與腫瘤成瘤行為相符，R2和R4感染所成的腫瘤細(xì)胞中，SW^7F/W(圖.8J)和ki67(圖.8K)的表達(dá)遠(yuǎn)低于GVaL腺病毒對(duì)照的水平。GVaL腺病毒感染SMMC-7721細(xì)胞的成瘤潛力可能較準(zhǔn)確地反應(yīng)了實(shí)驗(yàn)鼠個(gè)體間的成瘤能力的個(gè)體差異。從而，GVaL腺病毒腫瘤生長(zhǎng)在R134(100。/。)中比R3實(shí)驗(yàn)鼠(31%)中快2倍，盡管無(wú)腫瘤生長(zhǎng)背觀察到，仍提示R134確較R3核酶腺病毒更為有效地在裸鼠中抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖.8H)。討論SWK/W7V是治療癌癥的常用的耙基因[3，4]。已進(jìn)入臨床一或二期實(shí)驗(yàn)的小分子對(duì)抗劑包括4-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸作為抑制依賴于SWWF/iV基因表達(dá)的Spl[35]和干擾SWP7^7iWHsp90的相互作用的17-烯丙胺-格爾德霉素[36]或Shepherdin[37，38]。通過(guò)反義寡核苷酸，干擾RNA和核酶在mRNA水平抑制表達(dá)是在嘗試中的另一手段。錘頭核酶有著比反義寡核苷酸更為有效和可通過(guò)載體形式導(dǎo)入的優(yōu)點(diǎn)，又有較干擾RNA底物特異性高的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明中，我們針對(duì)SURVIVINmRNA的四個(gè)暴露區(qū)域設(shè)計(jì)了四種錘頭核酶R1:61,R2:83,R3:232，和R4:358(圖2)。試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所有四種核酶均能不同程度地特異地切割SURVIVINmRNA(圖.4A和B)，提示用MFOLD軟件預(yù)測(cè)的底物RNA暴露區(qū)域在核酶設(shè)計(jì)過(guò)程中的價(jià)值。其它試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均提示R3是最為有效的，其次為R1，R4,和效率最低的R2(圖4C和D)。慮及RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的高度可塑性和動(dòng)態(tài)性，可供各個(gè)核酶切割的針對(duì)區(qū)處于暴露狀態(tài)是有限的。與此理念相苻，四個(gè)核酶同時(shí)使用可產(chǎn)生較任一單核酶為強(qiáng)的效果(圖.4)。從而，在細(xì)胞內(nèi)和活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，攜帶核酶R1，R3和R4核酶基因的腺病毒(R134)較任一單個(gè)核酶為有效(圖5—8)。這還有細(xì)胞內(nèi)SURVIVIN的RNA存有的多種剪切形式，繼而產(chǎn)生多種蛋白的根源。如圖9所示，常見(jiàn)的剪切形式有SURVIVIN(全長(zhǎng))，SURVIVIN-AEx3(缺少外顯子3),以及SURVIVIN-2B(保留作為隱藏外顯子的內(nèi)含子2)。核酶R3是不能剪切與白血病預(yù)后兇險(xiǎn)相關(guān)的SURVIVIN-AEx3的RNA。從而，本發(fā)明中R134腺病毒有著更好的臨床應(yīng)用的前景。這個(gè)發(fā)現(xiàn)結(jié)合所選擇的相關(guān)實(shí)例已經(jīng)清楚的展示和說(shuō)明，這些內(nèi)容會(huì)被在這個(gè)領(lǐng)域精通的人所理解。在不改變本發(fā)明的精神和所要求范圍的情況下，在形式或細(xì)節(jié)上可能會(huì)出現(xiàn)不同。那些在這個(gè)領(lǐng)域精通的人會(huì)認(rèn)識(shí)到或有能力確信只用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段就可以找到和這里發(fā)現(xiàn)的具體實(shí)例描述的一樣的許多類似物。這些類似物都包括在所附權(quán)利要求的范圍中。參考文獻(xiàn)1.Hanahan,D.和R.A.Weinberg,thehallmarksofcancer,cell,2000.100(1):p.57-70.2.Salvesen,GS.，Duckett,C.S.，lapproteins:blockingtheroadtodeath'sdoor.NatureRev.Mol,CellBoil.,2002.3:p.401-410.3.Altieri,D,C.，Molecularcircuitsofapoptosisregualtionandcelldivisioncontrol:theSURVIVINparadigm.JCellBiochem,2004.92(4):p,656-63,4.Altieri,D.C.,Targetedtherapybydisablingcrossroadsignalingnetworks:theSURVIVINparadigm.MolCancerTher,2006,5(3):p.478-82.5.Dohi,T.，等，MitochondrialSURVIVINinhibitsapoptosisandpromotestumorigennesis.JClinInvest,2004.114(8):p.1117-27,6.Song，Z.，X.Yao，和M.Wu，DirectinteractionbetweenSURVIVINandSmac/DIABLOisessentialfortheanti-apoptoticactivityofSURVIVINduringtaxol-inducedapoptosis.JBiolChem，2003.278(25):p.23130-40,7.Schultz,I.J.,等,Bladdercancerdiagnosisandrecurrenceprognosis:comparisonofmmarkerswithemphasisonSURVIVIN.ClinChimActa,2006.368(1-2):p.20-32.8.Parker,A.S.，等HighcancerexpressionlevelsofSURVIVINproteinindependentlypredictapooroutcomeforpatientswhoundergosurgeryforclearcellrenalcellcarcinoma.Cancer，2006.107(1):p.37-45.9.Karczmarek-Borowska,B,,等,SURVIVINantiapoptoticgeneexpressionasaprognositicfactorinnon-smallcelllungcancer:insituhybridizationsyudy.FoliaHistochemCytobiol,2005.43(4):p,237-42,10.Zhang，Y.,D.Huang，和G.Yu，SURVIVIVNexprssionanditsrelationshipwithapoptosisandprognosisinnasalandparanasalsinuscarcinomas.ActaOtolaryngol,2005.125(12):p.1345-50.11.LoMuzio，L.，等，SURVVINasprognsticfactorinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity.cancerLett,2005.225(1):p.27-33.12.Zaffaroni，N.，M.Pennati，和M,G.Daidone,SURVIVNasatargetfornewanticancerinterventions.JCellMolMed,2005.9(2):p.360-72.13.Mesri，M,，等，CancergenetherapyusingaSURVIVNmutaneadenovirus.JClinInvest,2001.108(7):p,981-90.14.Tu，S.R，等Genetherapyforcoloncancerbyadeno-associatedviralvector-mediatedtransferofSURVIVINCys84Alamulant.Gastroenterology,2005.128(2):p.361-75.15,Li,F.,等,Pleiotropiccell-divisiondefectsandapoptosisinducedbyinterferencewithSURVIVINfunction.NatCellBiol,1999.1(8):p.461-6.16.Zangemeister-Wittke，U.,Antisensetoapoptosisinhibitorsfacilitateschemotherapyandr緒Z-/油ce"^牟a""g.AnnNYAcadSci，2003.1002:p.90-4.17.Uchida,H.,等,^dewov/nw-zwec/zfl/ec/^a"s^ro/w7A^ag"/wWS[/iK/K/iV/"c/wcedap07^a/s加ewwa^//wwoa*ce〃growAv//rav/vaMolTher，2004.10(1):p.162-71.18.Caldas，H.，等,iWWK/KU/廠ectoi/她/^mcecoctez//&"/她wfswp/m^o/"o//w膨wrg腳A/wv/vaJMedGenet,2006.43(2):p.119-28.19.Pennati，M.，等，i/Zoz>7we-wed//a&(i/w/zz力"/o"o/iSf/iK/F/iVexpre^/ow/"creoyes5po/^a"eowsapopfos/sa"(itfecreaywAe/w附on^w/cpo/^w//"/0//z歸aw/ro加^ca"cerOncogene,2004.23(2):p.386-94.20.Choi,K.S.,T.H.Lee，禾口M.H.Jung，礎(chǔ)oz戸e匿膨cfetoic/eav，o///e/w腿wSt/7K/KWw/W」awdzw/nM/owa/7to/o/7/o"'co/5"t/WF7K/7VAfCF-7ce/fe.CancerGeneTher，2003.10(2):p.87-95,21.Pennati,M.,等,W/Zjozy/we-wed/a&t/doww-regw/a"owo/5"L^/F/K/^exprew/owsew5/"ze5/zw附aw附e/"wo附"to鄉(xiāng)o/ec(3T7W/ra/"v/vaCarcinogenesis,2004.25(7):p.1129-36.22.Pennati,M.,等，iad/aye/is7/z'za"owo//w附awwe/awowace〃sZ)ynAozy/we-zwed/a/^i0/SWK/K/A^xpm^o".JInvestDermatol,2003,120(4):p.648-54.23.Sullivan,S.M.，Z)eve/o，ewfo/》/"gewe/fera^y.JInvestDermatol,1994.103(5Suppl):p.85S-89S.24.Haseloff,J.和W丄.Gerlach，S/mpfew///"ewawd/2/g/2(ys;e"ycew^on力owwc/eoseac"v/to.Nature,1988,334(6183):p.585-91.25.Lieber，a.禾口M.Strauss,Se/ec"'o"q/"^7c/eWc/eavagej//^/arge/^/a^san力02yme邵固/ow版哼M(jìn)olCellBiol，1995.15(1):p.540-51.26.Furue,H.，/7b;o&o膨rase/"http:///Mo^ydeve/op/"gJ"/a"7.GanToKagakuRyoho，1993.20(1》p.42-9.27.Promega,力""-/^尸/S5Fmgwewf2000，Promga.p.http:〃www.promega.com/tbs/tb273/tb273.pdf.28.Zuker,M.禾卩A,B.Jacobson，t/s//7g/"ybr附a".owa""o^r/eiA^4化co"(ia^Wrwc,wrey.Rna,1998.4(6):p.669-79.29.Tanner,N.K.,i/Z)o^yme&,f/2ec/zarac/en^/os/npe""eyo/i^A^s.FEMSMicrobiolRev,1999,23(3):p,257-75.30.Ame,J,C.,C.Spenlehauer，andG.deMurcia，iM/PBioessays,2004.26(8):p,882-93.31.Che,X.F.,等，Overacpms^/ow0/iSt/7F/K/7///pr/zwa/^爿7Xce〃sawdso力腦ar5e/2"ecfeww-^wto/"gSL^F7「/7V邵r^/o"/"7Xce〃Blood，2006.107(12):p.4880-7.32.McLaughlin,N,，等,7feiSt/iF/K/jV-附^a^rai/omy,-加W//e"o妙eg7/oWa加way^wtoed7/7o4/"/歸ed/Z/zegrm7Zea;o一/^"o/(^匿￡7加//0^"^/《"〃她.BrainRes，2006.1071(1):p.1-9.33.Chawla-Sarkar,M，等，Z)owwgw/a//owo/5c/-2，F(xiàn)丄/尸orZ4ftcmc/SWK/K/A9"7^M^化mteesmy/加W/y/e/awo/Tiace〃sto々a2Zy77^/丄-,Wwcet/a/o//cw、.CellDeathDiffer,2004.11(8》p.915-23.34.Sah，N.K.，等，o/fifowwegw/a"owo/iSL^K/KZ/Vex/ms"owoaracZ/ose^"."http://)^/2w即"rfmno/c/c"/r/"om"ce〃s.IntJRadiatOncolBiolPhys，2006.66(3):p.852-9.35.Chang，C.C,，等，7^"-0膨~/woraWz>vircgw"/'are"cac/dgraw/7i"at^s/ce〃w/arapopto^/"礎(chǔ)/""ga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包含選自下組的SEQIDNO:1的區(qū)域互補(bǔ)的序列(1)+53-60和+62-69;(2)+224-231禾卩+233-240;(3)+350-357和+359-366。5.如權(quán)利要求1所述的合成的或分離的核酶，其中所述核酶包含核酶R1、R2、R3或R4的序列。6.—種載體，它包含編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的核酶的RNA的序列。7.如權(quán)利要求6所述的載體，其中所述序列受控于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。8.如權(quán)利要求6所述的載體，其中所述載體是腺病毒表達(dá)載體。9.如權(quán)利要求6所述的載體，其中所述序列在腺病毒VALRNA基因中。10.如權(quán)利要求9所述的載體，其中所述載體是經(jīng)過(guò)修飾的以避免同源重組。11.一種用于治療存活素相關(guān)疾病的藥物組合物，它包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的合成的或分離的核酶或權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的載體。12.—種治療與存活素相關(guān)的疾病或與存活素表達(dá)升高相關(guān)的病情的方法，該方法包括給有需要的對(duì)象有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的合成的或分離的核酶、或權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的載體、或權(quán)利要求11所述的藥物組合物。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述與存活素相關(guān)的疾病選自高增殖細(xì)胞疾病或癌癥。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述對(duì)象是人或動(dòng)物。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述合成的或分離的核酶、所述載體或所述藥物組合物可通過(guò)選自腹膜內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、腸胃外、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)注射的途徑給予所述對(duì)象。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述癌癥選自肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、軟組織肉瘤、血液的惡性病變、兒童癌癥或橫紋肌肉瘤。17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述病情是自身免疫疾病或心血管疾病。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述自身免疫疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述心血管疾病是肺動(dòng)脈高血壓或動(dòng)脈硬化癥。20.—種能夠引起SURVIVIN基因高表達(dá)的組織或細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括給予所述組織或細(xì)胞有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的合成的或分離的核酶，權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求11所述的藥物組合物。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、軟組織肉瘤細(xì)胞、血液的惡性病變細(xì)胞、兒童癌癥細(xì)胞、或橫紋肌肉瘤細(xì)胞。22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、或子宮內(nèi)膜細(xì)胞。24.—種提高癌細(xì)胞對(duì)化療或放療的敏感性的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的合成的或分離的核酶、權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求11所述的藥物組合物接觸。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、軟組織肉瘤細(xì)胞、血液的惡性病變細(xì)胞、兒童癌癥細(xì)胞、或橫紋肌肉瘤細(xì)胞。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或子宮內(nèi)膜細(xì)胞。28.權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述的合成的或分離的核酶或權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的載體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療與存活素相關(guān)的疾病或與存活素基因表達(dá)升高相關(guān)的病情。全文摘要本發(fā)明涉及用來(lái)抑制SURVIVIN在細(xì)胞中表達(dá)的錘頭狀核酶為基礎(chǔ)的材料和方法，來(lái)治療包括癌癥在內(nèi)的細(xì)胞增殖亢進(jìn)性疾病。文檔編號(hào)A61P9/10GK101338306SQ20081003736公開(kāi)日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年5月14日優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日發(fā)明者朱景德申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所