人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明基于基因工程領域，公開了人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。本發明的技術方案為人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。本發明的研究結果表明在人脂肪細胞中過表達miR-1908可以明顯促進脂肪細胞的增殖速度和細胞個數，可用于制備促進脂肪細胞增殖的藥物。
【專利說明】AmiR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域，涉及人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]肥胖已成為危害全球人類健康的重要問題之一，受到社會的廣泛關注。隨著經濟發展和生活方式改變，中國的肥胖人口也急劇增長，且低齡化趨勢十分突出。肥胖相關的各種并發癥，如高血壓、糖尿病和心腦血管疾病等，嚴重威脅著人類健康?！缎掠⒏裉m醫學雜志》一項調查顯示中國糖尿病發病率已高達10%，且很大程度與肥胖有關。肥胖的科學治療及其并發癥的防治已成為臨床醫生面臨的挑戰。目前已知肥胖是機體在遺傳、環境、行為因素或三者相互作用下能量代謝失衡的結果，并且隨著遺傳學和生物學的發展，遺傳因素在肥胖發生中的重要性已倍受重視。已有研究結果指出，肥胖發生的病因中遺傳因素占40-70%,開展肥胖病因的遺傳學研究十分重要。
[0003]在前期研究工作中，發明人采用采用miRNA芯片(miRNA Array)技術篩選人脂肪
細胞分化前后的差異表達miRNA，獲得一條特異高表達于成熟脂肪細胞的miRNA-------人
miR-1908，提示其可能與肥胖的發生發展相關。該miRNA位于人的第11號染色體上FADSl基因的第一個內含子內，屬于基因內(Introgenic)miRNA。但目前沒有關于人miR-1908在脂肪細胞中的功能報道。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是 提供人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用。
[0005]發明人在研究中發現人miR-1908過表達組的細胞增殖速度明顯快于空載對照組細胞，細胞個數明顯增加，人miR-1908過表達組的脂肪細胞中S期細胞比例顯著高于空載對照組，表明染色質合成期細胞較多，細胞增殖速度加快，可見人miR-1908能夠顯著促進脂肪細胞增殖，因此，本發明提出了人miR-1908在制備促進脂肪細胞增殖藥物中的應用的技術方案。
[0006]本發明的有益效果:
[0007]本發明檢測了人miR-1908過表達對脂肪細胞增殖功能的影響，顯示過表達miR-1908能促進脂肪細胞增殖(細胞個數增多且增殖速度加快)，可用于制備促進脂肪細胞增殖的藥物，為研究肥胖的發生發展提供了新的研究手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1:pGLV-Hl-GFP/Puro載體圖譜、插入位點及人miR-1908過表達慢病毒載體酶切及測序鑒定結果。
[0009]圖2:人miR-1908過表達慢病毒感染人脂肪前體細胞株的鑒定。
[0010]圖3:人miR-1908過表達的脂肪細胞和對照細胞生長曲線圖。[0011]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 過表達的前體脂肪細胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空載轉染對照細胞。
[0012]圖4:人miR-1908的脂肪細胞和對照細胞0、24、48小時細胞各周期分布圖。
[0013]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 過表達的前體脂肪細胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空載轉染對照細胞，Gl:染色質合成前期，S:染色質合成期，G2/M:染色質合成后期及分裂期。
【具體實施方式】
[0014]以下通過實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。
[0015]實施例1
[0016]1.材料和方法
[0017]1.1 試驗材料:人前體脂肪細胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)購自美國Sciencell公司。本實驗所需的pGLV-Hl-GFP/Puro質粒購自上海吉瑪公司，包裝質粒 Pcgvp> Rev、Vsvg 購自美國 Allele Biotech&Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro慢病毒載體有本實驗小組自行構建；RNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司，miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA檢測試劑盒、TanMan基因表達mix II購自美國 ABI 公司，TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 試劑盒購自日本Takara公司，脂肪細胞專有培養基7211購自美國Sciencell公司，限制性內切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，引物有美國Invitrogen公司合成。
[0018]1.2實驗方法:
[0019](一)人miR-1908minigene的擴增及人miR-1908慢病毒過表達載體(pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro)的構建
[0020](I).DNA提取:按照以下步驟提取基因組DNA(德國Qiagen公司QIAamp DNAMiniKit)
[0021 ] I)取4ml離心管一只，加入600 μ I核裂解液，冰上冷卻。
[0022]2)加入10_20mg解凍的人脂肪組織，勻漿機勻漿10秒。將裂解物移至1.5ml離心
管中。65°C孵育30分鐘。
[0023]3)待樣品達到室溫后，加入200 μ I蛋白沉淀液，潤旋震湯20秒，直于冰上冷卻5分鐘。
[0024]4) 13，OOOXg離心4分鐘，可見白色沉淀。將上清移至一新離心管中。
[0025]5)加入600ul異丙醇，輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成。13，OOOXg離心I分鐘,棄去上清。
[0026]6)加入600ul室溫70%乙醇,輕輕顛倒離心管數次,13，OOOXg離心I分鐘，小心棄去上清。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10-15分鐘。
[0027]7)向離心管中加入50 μ I雙蒸水，65°C孵育I小時，以充分溶解DNA，4°C保存。
[0028](2)人 miR_1908minigene 的擴增
[0029](2.1)通過miRBase數據庫獲得人miR-1908的前體pre-miRNA_1908的序列；在NCBIblast中比對查找其所在的基因組序列，根據引物設計規則，采用Primerf軟件設計擴增包括pre-miR-1908在內的序列，并在其上游和下游分別引入BamHI和EcoRI酶切位點，上游引物(含BamHI位點，下劃線區域)5’ -GCCGGATCCCCACTGTCCCTATCCA-3 ’ ；下游引物(含EcoRI 位點，下劃線區域)5’ -ACCGAATTCGGCACTTCTGCGTTT-3?,目的基因長度為 537bp。(PCR試劑盒:TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
【權利要求】
1.人miR-1908在制備促進脂 肪細胞增殖藥物中的應用。
【文檔編號】A61P3/00GK103446592SQ201310361927
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2013年8月19日
【發明者】沈嶸, 倪毓輝, 郭錫熔, 季晨博, 楊蕾, 史春梅, 崔縣偉, 付子毅, 苗苗 申請人:南京市婦幼保健院