專利名稱：一種前列腺癌相關的基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及前列腺癌相關的N-myc 下游調節3型基因(NDRG3)及其應用；針對NDRG3基因或蛋白的拮抗劑及其 應用。
背景技術：
前列腺癌是歐美國家男性常見病，在過去20年中，中國前列腺癌發病率 的增加也居各種腫瘤之首。前列腺癌患者被確診時， 一半左右的病例都屬晚期， 大部分病例有癌細胞轉移，不僅失去了早期根治的機會，而且處于該階段的治 療預后效果很不理想。因此，前列腺癌已成為危害老年男性人群健康的重大疾 病。前列腺癌的分子病理學機制是錯綜復雜的，不但多基因參與其發病，而且 外部的環境因素如飲食、炎癥、生活方式、病毒、化學物質、射線等也參與其 進程。
迄今為止，多方面的研究已經論證了多基因和環境因素間的復雜關系在前 列腺癌的發生、發展中起著重要作用。
在癌組織中通常表達上調的基因產物可作為研發新的抗癌藥物的潛在靶 點，事實上，針對某些類型癌癥中異常表達的、導致癌癥生長和發展的分子， 已經開發出了有效的新藥，這類藥物包括治療治療慢性粒細胞白血病的Glivec (STI-571)、乳腺癌的Herceptin等。
已知有多種分子在前列腺癌組織中過度表達，因而被鑒定為前列腺癌標記 物或者治療靶標，然而這些分子多數在其他主要器官中同樣過度表達，以這些 分子為耙的藥物可能對癌細胞是有毒的，但同樣對其他器官的正常細胞造成損 害。因此，在腫瘤組織中大量表達并且僅在腫瘤組織中表達的基因有希望成為 候選靶。
綜上，本領域迫切需要找到與前列腺癌的發生和發展相關的、且在前列腺 癌中特異表達的基因，作為前列腺癌的治療靶標。

發明內容
本發明的目的在于提供一種前列腺癌相關的N-myc下游調節3型基因 (NDRG3)及其應用。
本發明的另一目的在于提供所述NDRG3的拮抗劑及其在制備預防或治療 前列腺癌的藥物中的應用。
本發明的另一目的在于提供基于所述的NDRG3作為藥物篩選靶點，篩選 預防或治療前列腺癌的潛在物質的方法。
本發明的另一目的在于提供以所述的NDRG3作為標志物，檢測前列腺癌 的方法、試劑或試劑盒。
在本發明的第一方面，提供一種N-myc下游調節3型基因(NDRG3)或蛋 白的拮抗劑的用途，用于制備預防或治療前列腺癌的組合物。 在另一優選例中，所述的前列腺癌細胞表達NDRG3。 在另一優選例中，所述的組合物還用于抑制前列腺癌細胞的轉移。 在另一優選例中，所述的拮抗劑選自(但不限于)
特異性干擾N-myc下游調節3型基因表達的小干擾RNA分子或反義核苷 酸；或
特異性與N-myc下游調節3型基因編碼的蛋白結合的抗體或配體。
在另一優選例中，所述的小干擾RNA分子是
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；
SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；
SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或
SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小千擾RNA分子。
在本發明的第二方面，提供一種用于預防或治療前列腺癌的小干擾RNA 分子，所述的小干擾RNA分子選自
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。在本發明的第三方面，提供一種預防或治療前列腺癌的組合物，所述的組 合物含有
(1) 有效量的N-myc下游調節3型基因或蛋白的拮抗劑，以及
(2) 藥學上可接受的載體。
在另一優選例中，所述的組合物還含有有效量的以下抗腫瘤藥物溶瘤病毒。
在另一優選例中，所述的溶瘤病毒是ZD55-IL24。
在本發明的第四方面，提供一種篩選預防或治療前列腺癌的潛在物質的方
法，所述方法包括
(1) 用候選物質處理表達N-myc下游調節3型基因的體系；和
(2) 檢測所述體系中N-myc下游調節3型基因的表達或活性；
其中，若所述候選物質可降低N-myc下游調節3型基因的表達或活性，則 表明該候選物質是預防或治療前列腺癌的潛在物質。
在另一優選例中，步驟(l)包括在測試組中，將候選物質加入到表達N-myc 下游調節3型基因的體系中；和/或
步驟(2)包括檢測測試組的體系中N-myc下游調節3型基因的表達或活 性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達N-myc 下游調節3型基因的體系；
如果測試組中N-myc下游調節3型基因的表達或活性在統計學上低于(優 選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組， 就表明該候選物是預防或治療前列腺癌的潛在物質。
在另一優選例中，所述的體系是細胞。
在另一優選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細 胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于預防或治療前列 腺癌有用的物質。
在本發明的第五方面，提供一種特異性識別N-myc下游調節3型基因或其 編碼的蛋白的試劑的用途，用于制備檢測前列腺癌的試劑或試劑盒。
在另一優選例中，所述的特異性識別N-myc下游調節3型基因或其編碼的 蛋白的試劑選自特異性擴增N-myc下游調節3型基因的引物； 特異性識別N-myc下游調節3型基因的探針；或 特異性結合N-myc下游調節3型基因編碼的蛋白的抗體或配體。 在另一優選例中，所述的特異性擴增N-myc下游調節3型基因的引物具有 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
在本發明的第六方面，提供一種檢測前列腺癌的試劑盒，所述的試劑盒中 含有特異性識別N-myc下游調節3型基因或其編碼的蛋白的試劑。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖h NDRG3在人的組織和前列腺癌細胞株的表達情況。
A:利用大規模平行測序技術檢測NDRG3在33種人正常組織中的表達模式。
B:前列腺癌細胞株LNCaP、 CL-l、 PC-3、 DU145和前列腺永生化間質細 胞株WPMY-l中NDRG3的表達情況，左圖為RT-PCR檢測mRNA，右圖為 Western blot檢測NDRG3蛋白，以P -actin作為上樣量對照。
C: LNCaP細胞中NDRG3受雄激素調節，左圖為RT-PCR檢測mRNA右 圖為Western blot檢測NDRG3蛋白(泳道1與4:未受雄激素處理；泳道2與5: 受雄激素(lOnM)處理24小時；泳道3與6:受雄激素(10nM)處理48小時。以 P-actin作為上樣量對照。
圖2: NDRG3在人前列腺癌組織中的表達情況。
在組織芯片上用免疫組化方法檢測NDRG3的表達情況，圖A， B， E， F 為前列腺癌樣品和圖C， D為BPH樣品。其中圖F中的樣品未受一抗處理， 作為陰性對照。
圖3: NDRG3的過度表達促進前列腺癌細胞PC-3的致癌潛能。
A: Western blot分析穩定轉染NDRG3的細胞株PN3， PN5和PN10的表達水平。其中，Parental表示未轉染的親本PC-3細胞；PNK表示陰性對照。 B: PN3， PN5和PN10細胞的生長速率，NDRG3穩定表達的細胞克隆生
長率明顯快于對照PNK。
C:創傷修復試驗的照片。
D: NDRG3過表達的細胞株(PN3， PN10),禾[I PNK，親本PC-3細胞在裸 鼠上腫瘤形成試驗。
圖4:在CL1細胞中降低NDRG3表達降低了細胞的生長速度和克隆形成 能力。
A: Western blot結果顯示NDRG3-siRNA組(泳道l)的蛋白表達量明顯低 于GFP-siRNA組(泳道2)。
B:轉染NDRG3-siRNA和GFP-siRNA后72小時、120小時細胞生長的比較。
C: CL-1細胞轉染NDRG3-siRNA后的克隆形成試驗。
圖5:過量表達NDRG3的細胞株PN3， PN10在ZD55-IL24作用下的存活率。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次揭示N-myc下游調節3型基因 (NDRG3)在前列腺癌中高表達，并且NDRG3的異常表達或活化與前列腺癌的 發生和發展密切相關。NDRG3的過表達可促進腫瘤細胞的生長，而抑制NDRG3 的表達可抑制腫瘤細胞的生長。并且，NDRG3的過表達可增強腫瘤細胞對于 抗腫瘤藥物的抵抗能力。因此，NDRG3是一種在腫瘤細胞中發揮重要功能的 基因，不僅可作為前列腺癌的診斷標志，還可作為靶點開發預防或治療前列腺 癌的藥物。
NDRG3
N-myc下游調節基因(N-myc downstream regulated gene， NDRG)是最近 發現的一個新的基因家族，它至少包括NDRG1、 NDRG2、 NDRG3和NDRG4 四個成員。其中已經發現NDRG1、 NDRG2作為腫瘤生長的負調節因子參與細胞的增殖與分化，因此具有腫瘤生長抑制的功能。然而，在現有技術中NDRG3 的功能還沒有得到深入研究，尤其是NDRG3的功能以及是否與癌癥之間存在 關系并不清楚。
NDRG3基因(參見NP—114402.1)編碼374個氨基酸的蛋白質。為揭示前 列腺癌的發生機理，鑒定新的癌癥診斷標記物和/或者藥物耙點以治療癌癥，本 發明人聯合大規模并行測序(MPSS)和組織芯片等技術分析了NDRG3在前列 腺和前列腺癌中的基因表達情況。利用MPSS技術對人類多種組織進行了 NDRG3表達分析，研究顯示NDRG3表達具有高度組織特異性，其中在睪丸和 前列腺中具有高表達。前列腺中每百萬有30個轉錄產物，睪丸每百萬有92個 轉錄產物，其表達明顯高于其他組織，這說明NDRG3在前列腺中是一個特異 表達基因。
本發明人用RT-PCR和Western印跡分析顯示，NDRG3在五種前列腺細胞 (包括PC3， DU145， CL-1， LNCaP和WPMY-1)中都有不同水平的表達，并 且在LNCaP細胞中NDRG3的表達可以被雄激素類似物R1881顯著上調。本發 明人還在組織芯片上檢測到NDRG3在前列腺癌樣本中的表達率為58.6%，而 在良性前列腺增生(BPH)樣本中僅為13.2%，兩者差異顯著。上述結果說明 NDRG3可以作為前列腺癌診斷的標志物。
為了研究NDRG3是否能夠影響前列腺癌細胞的致癌潛能，本發明人制備 了穩定轉染并高表達NDRG3的腫瘤細胞株，從而研究過表達NDRG3對腫瘤 細胞的影響。結果顯示NDRG3能夠顯著促進前列腺癌細胞的增長，在克隆形 成試驗和創傷修復實驗中也表明它能夠增強前列腺癌細胞的惡性度和遷移性。 NDRG3過表達可在裸鼠模型上促進腫瘤形成。證明NDRG3具有腫瘤促進功能 并在前列腺癌的發生、發展中起相當重要的作用。上述研究結果不僅肯定了 NDRG3具有促進腫瘤生長的功能，而且提示它對于治療或預防前列腺癌有重 要意義。
進一步的，本發明人利用干擾NDRG3表達的siRNA轉染前列腺癌細胞， 研究所述siRNA對細胞產生的影響和作用。結果顯示RNAi后的前列腺癌細胞 中大部分內源性的NDRG3蛋白表達降低，細胞的生長速度顯著降低，細胞形 成的克隆數明顯減少，即生長率和克隆形成能力顯著降低。這說明降低NDRG3 的表達可以抑制前列腺癌細胞的生長。因此NDRG3可以作為前列腺癌的藥物 設計的靶標。目前生物治療已成為腫瘤治療的發展方向，其中以溶瘤病毒為載體的病毒 -基因治療技術已顯示較好的療效。本發明人使用了 ZD55-IL24溶瘤病毒株。該 病毒株主要通過兩個基本點途徑殺死腫瘤細胞1，通過溶瘤病毒ZD55選擇性 在腫瘤細胞內繁雜，最后直接殺死宿主腫瘤細胞；2，通過溶瘤病毒ZD55選擇 性在腫瘤細胞內繁雜時，合成IL24。 IL-24分泌后，能選擇性殺死腫瘤細胞。 結果，本發明人首次發現，ZD55-IL24溶瘤病毒能有效殺死前列腺癌細胞，但 在同樣的ZD55-IL24用量的條件下，過量表達NDRG3的前列腺癌細胞的存活 率顯著增高。這充分說明過量表達NDRG3的前列腺癌細胞能明顯的抵抗溶瘤 病毒的作用。N-myc下游調節3型基因的拮抗劑基于本發明人的上述新發現，本發明提供了一種NDRG3基因或蛋白的拮 抗劑的用途，用于制備預防或治療前列腺癌的組合物。如本文所用，所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑包括了抑制劑、下調劑、 阻滯劑、阻斷劑等。所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑是指任何可降低NDRG3蛋白的活性、 降低NDRG3基因或蛋白的穩定性、下調NDRG3蛋白的表達、減少NDRG3 蛋白有效作用時間、或抑制NDRG3基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可 用于本發明，作為對于下調NDRG3有用的物質，從而可用于預防或治療前列 腺癌。例如，所述的拮抗劑是特異性干擾N-myc下游調節3型基因表達的小 干擾RNA分子或反義核苷酸；或是特異性與N-myc下游調節3型基因編碼的 蛋白結合的抗體或配體。作為本發明的一種優選方式，所述的拮抗劑是一種NDRG3特異性的小干 擾RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的"小干擾RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA 為耙目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA千擾(RNA interference)過 程。作為本發明的特別優選的方式，提供了一種效果良好的小干擾RNA分子， 所述的小干擾RNA分子可特異性的干擾NDRG3基因的表達，與其它的人類核 酸序列沒有顯著的同源性；并且經驗證，其具有良好的干擾NDRG3表達的效 果。所述的小干擾RNA分子是選自SEQIDNO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO:9或SEQIDNO: IO所示小干擾RNA分子的一種或多種。更優選的，所述的小 干擾RNA分子是SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10所示小干擾RNA分子的組合分子；該組合分子中各小干擾RNA分子的比例 是(1-10): (1-10): (1-10): (1-10);較佳的是(l-5): (1-5): (1-5): (1-5);更佳的是(1國2): (1-2): (1-2): (1-2)。本發明對小干擾RNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學 合成法，體外轉錄法等。應理解，本領域技術人員在得知了本發明所提供的 siRNA的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達所述的小干擾RNA。例 如，在本發明的一種優選例中，所述的小干擾RNA是化學合成的。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義 鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。 一個雙鏈RNA復合物可以由相互 分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化 學合成的，其后可通過退火雜交，產生合成的雙鏈RNA復合物。所述的小干擾RNA可通過采用適當的轉染試劑被輸送到細胞內，或還可 采用本領域已知的多種技術被輸送到細胞內。此外，小干擾RNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個或多個編碼正義鏈 和反義鏈的表達盒來制備。當正義鏈和反義鏈由一個單獨的表達盒編碼時，它 們可以從生成的轉錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈 小干擾RNA。檢測前列腺癌的試劑或試劑盒基于本發明人的上述新發現，可以將NDRG3作為診斷前列腺癌的標志物 (i)進行前列腺癌的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)評估相關人群的 前列腺癌治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評 估相關人群前列腺癌患病風險，早期監測早期防治。比如，可分離出由NDRG3 基因表達異常而導致前列腺癌的人群，從而可進行更有針對性地治療。因此，本發明提供了NDRG3基因或蛋白的用途，用于制備診斷(或檢測)前 列腺癌的試劑或試劑盒。可釆用各種本領域已知的技術來檢測NDRG3基因的存在與否以及表達情 況，這些技術均包含在本發明中。例如可用已有的技術如Southern印跡法、序列分析、PCR等，這些方法可結合使用。本發明還提供了用于在分析物中檢測NDRG3基因的存在與否以及表達情況 的試劑。優選的，當進行基因水平的檢測時，可以采用特異性擴增NDRG3的引 物；或特異性識另IJNDRG3的探針來確定NDRG3基因的存在與否；當進行蛋白水 平的檢測時，可以采用特異性結合NDRG3編碼的蛋白的抗體或配體來確定 NDRG3蛋白的表達情況。作為本發明的優選方式，所述的試劑是引物，其可特異性擴增出NDRG3 基因或基因片段。更優選的，所述的引物具有SEQIDNO: l和SEQIDNO:2所示 的序列。該引物擴增獲得的擴增產物具有合適的長度，且特異性高，對于復雜體系 的擴增也具有良好的特異性。針對NDRG3基因的特異性探針的設計是本領域人員熟知的技術，例如，制備 一種探針，其可與NDRG3基因上特定位點發生特異性結合，而不與NDRG3基因以 外的其它基因特異性結合，且所述探針帶有可檢測信號。利用特異性結合NDRG3蛋白的抗體來檢測分析物中NDRG3蛋白表達情況的方法也是本領域人員熟知的技術。本發明還提供了用于在分析物中檢測NDRG3基因的存在與否以及表達情 況的試劑盒，該試劑盒包括特異性擴增N-myc下游調節3型基因的引物；特 異性識別N-myc下游調節3型基因的探針；或特異性結合N-myc下游調節3型 基因編碼的蛋白的抗體或配體。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、 PCR、雜交、顯色等所需 的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、 洗液等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等。 藥物篩選在得知了NDRG3的過表達可促進腫瘤細胞的生長，而抑制NDRG3的表達 可抑制腫瘤細胞的生長這一特征后，可以基于該特征來篩選抑制NDRG3的表達 或活性的物質。可從所述的物質中找到對于預防或治療前列腺癌真正有用的藥物。因此，本發明提供一種篩選抑制淀粉樣蛋白產生的潛在物質的方法，所述 的方法包括用候選物質處理表達NDRG3的體系；和檢測所述體系中NDRG3 的表達或活性；若所述候選物質可抑制NDRG3的表達或活性，則表明該候選 物質是預防或治療前列腺癌的潛在物質。所述的表達NDRG3的體系較佳的是 細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達NDRG3的細胞； 或可以是重組表達NDRG3的細胞。例如所述的細胞選自前列腺癌細胞PC-3， DU145， CL-1或LNCaP。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到NDRG3的表 達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質 的表達NDRG3的體系。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一 步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于預防或治療前列腺癌真 正有用的物質。另一方面，本發明還提供了釆用所述篩選方法獲得的預防或治療前列腺癌 的潛在物質。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以 從中篩選出能夠對于抑制NDRG3的表達和活性，進而預防或治療前列腺癌有 用的物質。組合物本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt。/。；較佳的 0.0000l-20wt%;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗 劑，以及藥學上可接受的載體。任何前述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑均可用 于組合物的制備。作為本發明的一種優選方式，提供了一種用于預防或治療前列腺癌的組合 物，所述的組合物含有有效量的本發明所述的小干擾RNA分子，以及藥學上可 接受的載體。作為本發明的一種優選方式，提供了一種用于預防或治療前列腺癌的組合 物，所述的組合物含有有效量的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑，以及有效量的 抗腫瘤藥物溶瘤病毒(優選ZD55-IL24)。由于高表達NDRG3的腫瘤細胞比普 通腫瘤細胞具有更強的生命力，其抵抗腫瘤細胞的能力更強，因此在使用所述抗腫瘤藥物的同時或之前使用所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑來下調 NDRG3的表達或活性，可使得所述腫瘤細胞對抗腫瘤藥物更敏感，從而達到 更理想的治療效果。如本文所用，所述"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且 可被人和/或動物所接受的量。所述"藥學上可接受的載體"指用于治療劑給 藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身 并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通 技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、 緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助 流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試 劑。在得知了所述NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的用途后，可以釆用本領域熟知 的多種方法來將所述的拮抗劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動 物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋 給予等；優選的，所述給藥方式是非腸道給予的。優選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將NDRG3的拮抗劑通 過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶NDRG3的拮 抗劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或siRNA)遞送到靶點上，并使之表達 活性的NDRG3拮抗劑，具體情況需視所述的拮抗劑的類型而定，這些均是本領 域技術人員所熟知的。本發明所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的有效量可隨給藥的模式和待 治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術 人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所 述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半 衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給 藥的途徑等。通常，當本發明的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑每天以約 0.00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0,0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予， 能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分 開的劑量，或將劑量按比例地減少。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。實施例1.細胞培養前列腺癌細胞株LNCaP細胞，PC-3， DU145, CL-1和前列腺永生化間質 細胞WPMY-1皆購自ATCC。LNCaP細胞培養在含5% FBS和100U/ml青鏈霉 素的DMEM培養基中。其他細胞株培養在含10% FBS和100U/ml青鏈霉素的 RPMI 1640培養基中。所有細胞均在37'C含5% (302培養箱中培養。實施例2. MPSS檢測NDRG3在人體組織的表達提取各種人組織(見圖1)總RNA，用生物素標記的寡核苷酸引物 (oligo-dT)將mRNA合成為cDNA雙鏈；限制性內切酶Mbol (酶切位點為 GATC)消化cDNA片段，利用標記的生物素純化消化的cDNA片段；合成包 含1.67 ><107個長為32 bp的寡核苷酸片段的標簽載體；將純化的cDNA片段克 隆入標簽載體中，并通過標簽載體上的PCR引物擴增插入片段。酶切消化PCR 產物，生成含cDNA片段與32 bp標簽相連接的產物；通過tag和anti-tag雜 交連接將cDNA片斷與微球體連接起來，每一個微球體上也可承載104-105個 相同的cDNA拷貝。進一步消化結合在微球體上cDNA模板，用不同寡核苷酸接頭與連接在微 球體上的cDNA模板相連接，另外每一種接頭的3'端還帶有一個熒光標記，可 與熒光探針雜交，分別加入能產生紅黃藍綠雜交信號的四套熒光探針，進行雜 交用顯微拍照的方法記錄熒光信號，并將四種信號的圖像輸入計算機儲存。MPSS檢測結果NDRG3在前列腺和睪丸組織中分別有30 tpm(每百萬個 轉錄本具有的轉錄本數)和92 tpm(圖1A),其表達明顯高于其他組織，這說明 NDRG3在前列腺中是一個特異表達基因。實施例3.半定量RT-PCR檢測NDRG3在前列腺癌細胞中的表達 用Trizol試劑(Invitrogen)從各培養細胞(PC-3， DU145, CL-l， WPMY-1 和LNCaP)中提取總RNA，用Oligo-dT做引物和逆轉錄酶轉錄成cDNA，適當的稀釋每個單鏈cDNA以進行隨后的PCR擴增，用P -actin作為定量對照， 引物序列分別如下-NDRG3:正向(SEQIDNO: 1):5，- CtgCCtCCtgttC加CCC3CCt3 -3，,反向(SEQ ID NO: 2):5 '-ggcga3ttgtcccctaccacc3gt-3' <=P -actin:正向(SEQ ID NO: 3):5 ，-agaaaatctggcaccacacc-3'，反向(SEQ ID NO: 4):5 '-ctccttaatgtcacgcacga-3'。NDRG3的PCR條件是首先94t:變性10分鐘；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分鐘共26個循環；最后72'C延伸5分鐘。e -actin的PCR條件是首先94"C變性10分鐘；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分鐘共25個循環；最后72t:延伸5分鐘。結果如圖1B， NDRG3 mRNA在5種細胞中都有表達，在CL-1細胞中表 達量多，而在WPMY-1細胞中表達量少。實施例4. Western blot檢測NDRG3蛋白在前列腺癌細胞的表達提取前列腺癌細胞的蛋白質，分別取等質量的五種細胞的總蛋白加1/4體 積的4X樣品緩沖液于100'C煮5分鐘，使其變性。12%的SDS-PAGE分離樣 品；電轉移至硝酸纖維素膜；用0.05%的PBS-T[137mmol/LNaCl， 2.7 mmol/L KC1， 10mmol/LNa2HPO4， 2mmol/L KH2P04， 0.05% Tween20 (pH 7.4)]配置 的5。/J兌脂奶粉37t:封閉1小時；0.05%的PBS-T洗膜5分鐘X3次。 一抗山 羊抗NDRG3多克隆抗體(l: 200)37'C孵育2小時；洗膜15分鐘X3次；二抗 兔抗山羊IgG-HRP(l: 2000)37。C孵育1小時；0.05%的PBS-T洗膜15分鐘x3 次；加入ECL顯影液室溫放置3分鐘，壓片于暗盒中曝光。顯影、定影、讀片。結果如圖1B， NDRG3蛋白在LNCaP、 CL-1、 DU145和PC3有較高水平 的表達，而在WPMY-1中表達量低。將LNCaP細胞培養在含10。/。石碳粉過濾得FBS的培養液中。48小時后， 加入10nMR1881。分別在此24和48小時后收集細胞，并按前述的方法制備 樣品，通過半定量RT-PCR與Western blot技術檢測NDRG3的表達。結果如圖 1C,表明NDRG3的表達可以被雄激素類似物R1881顯著上調。實施例5.免疫組化檢測前列腺癌組織芯片中NDRG3的表達帶有前列腺癌組織和BPH樣本的芯片購自陜西超英生物技術有限公司。 3% 11202室溫處理IO分鐘。蒸餾水洗滌2分鐘x3次，以消除內源性過氧化物 酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS(PH7.4)浸泡5分鐘；抗原修復，將切片放入一定 量的10mM檸檬酸鹽緩沖液中(PH6.0)，于微波修復加熱至沸騰18分鐘后離開 熱源，室溫放置20分鐘自然冷卻，PBS(PH7.4)洗3次，每次5分鐘；(5)滴加 正常的兔血清封閉液，室溫20分鐘甩掉封閉液，勿洗；滴加山羊抗NDRG3多 克隆抗體(l: 50)， 4。C孵育過夜。PBS沖洗，15分鐘x3次；滴加生物素化兔抗 山羊IgG， 37'C孵育15分鐘，PBS洗2分鐘x3次；滴加生物素親和素過氧化 物酶復合物，37。C孵育15分鐘，PBS沖洗5分鐘x4次；DAB顯色室溫顯 色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片； 顯微鏡觀察，顯示棕黃色顆粒者為陽性。根據對組織芯片結果的最后統計發現，NDRG3在前列腺癌樣本中的表達 率為58.6% (41/70)，而BPH樣本只有13.2%，兩者差異明顯。部分表達NDRG3 的前列腺癌樣本或BPH樣本的染色結果如圖2所示。實施例6.表達載體的構建 用下述引物擴增NDRG3全長編碼序列， 正向(SEQ ID NO: 5):GATCGGATCCGCCACCATGGATGAACTTCAGG; 反向(SEQ ID NO: 6):TAGAAAGCTTGGGCAGGACACCTCCATG;產物經處理后插入到pcDNA3.1/myc-His(-)B (Invitrogen)的BamH I和 Hind m位點，通過測序確定構建體，稱為pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3。實施例7.穩定轉染細胞株的建立和對細胞的影響1. 對腫瘤細胞生長的影響按照 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 的說明書操作，將 pcDN A3.1 /my c-His(-)B/NDRG3重組表達質粒轉染PC-3細胞，4小時后換含10。/。 FBS無抗生素的RPMI1640新鮮培養液繼續培養；24小時后換含10% FBS和 100U/ml青鏈霉素的RPMI1640新鮮培養液；再過24小時換含0.4mg/ml G418、 10% FBS和100U/ml青鏈霉素的RPMI1640新鮮培養液篩選培養；挑選單克隆 (PN3， PN5和PN10)擴大培養，Western blot鑒定。此外，本發明人還通過轉 染空載體建立了這些克隆的陰性對照住克隆PNK。Western blot分析結果顯示，穩定轉染NDRG3的細胞株PN3， PN5和PN10 比普通的PC-3細胞NDRG3蛋白的表達水平顯著提高(圖3A)。轉染后培養l-5天，觀察細胞的生長情況，結果顯示，NDRG3能夠顯著促 進腫瘤細胞的增長率(圖3B)。2. 對腫瘤細胞遷移的影響轉移性強是腫瘤惡性程度的一個重要標記。本發明人通過創傷修復實驗研 究了NDRG3的表達對腫瘤細胞遷移的影響。當PN3、 PNIO， PC-3和陰性對照 PNK在培養碟中的生長達到完全飽和時，用一個微量移液器用的槍頭在培養孔 中劃出一條"道"，并完全清除其中所有的細胞。此外，更換培養液以除去懸 浮細胞。IO小時后，本發明人發現，和PC-3和PNK等陰性對照相比，遷移進 入"道"中的PN3、 PN10細胞明顯增加，說明NDRG3能夠增強腫瘤細胞的遷 移性(圖3C)。實施例8.裸鼠腫瘤生成試驗NDRG3過表達的細胞株PN3、 PN10和陰性對照PNK和PC-3細胞在指數 生長期收獲，重懸于無血清的RPMI 1640中，接種于5周齡雄性BALB/C裸鼠 的背側部，lOOial每只，裸鼠兩側分別接種NDRG3過表達的PN3或PN10細胞 和陰性對照細胞，每6天用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，腫瘤體積V二(長X寬,/2 。
注射后18-48天的腫瘤體積如圖3D所示，表明NDRG3過表達在裸鼠模型 上促進腫瘤形成。
實施例9. NDRG3-siRNA對CL-1細胞生長和克隆形成的影響 CL-1細胞用4種NDRG3-siRNA寡核苷酸(Dharmacon， Lafayette， CO)混 合物(以按照摩爾比1:1:1:1混合)轉染，它們的序列為 GAUCAAACCACUUCUAAAU (SEQ ID NO: 7); AAACAGACCAGUUAUACUA (SEQ ID NO: 8); GCUAAAGGCUGGAUUGACU (SEQ ID NO: 9);禾口 CGCCUGAACCCUAUAAAUA (SEQ ID NO: 10)。
陰性對照為綠色熒光蛋白siRNA(GFP-siRNA)，它們的序列為 CGCUGACCCUGAAGUUCAUUU (SEQ ID NO: 11);或 GAGACCUGCUGAACACAAUU (SEQ ID NO: 12)。
按照TransMessenger Transfection Reagent (Qiagen， Hilden， Germany)說 明書操作。CL-1細胞轉染NDRG3-siRNA和陰性對照后48小時，鋪到24孔 板，每孔300個細胞，繼續培養14天，形成的克隆用4%甲醛固定，0.2%的 結晶紫染色。
結果顯示，NDRG3-siRNA組的NDRG3蛋白表達量明顯低于GFP-siRNA 組(圖4A)。
并且，轉染NDRG3-siRNA后，CL-1細胞生長速度下降(圖4B和圖4D); 并且，CL-1細胞轉染NDRG3-siRNA后形成的克隆數明顯少于對照組 GFP-siRNA (圖4C);
因此，降低NDRG3的表達可以抑制腫瘤的生長和克隆形成。
實施例10. ZD55-IL24對PC3細胞的殺傷性及其受NDRG3影響的研究 在96孔板每個孔中分別加入2萬個普通PC細胞，PNK克隆，PN3和PN5 克隆。24小后再分別加入不同量(MIO1-MIO100)的溶瘤病毒ZD55-IL24(獲自 中國科學院上海生命科學研究院，可殺死腫瘤細胞)。在本研究中，病毒加入后72小時，對存活細胞進行計數。坐標縱軸代表存活細胞數；坐標橫軸代表溶瘤 病毒用量。將最初加入的細胞量設置為100%。
結果如圖5所示，可見溶瘤病毒ZD55-IL24能有效殺死PC-3前列腺癌細 胞。在同樣的ZD55-IL24用量(MIO100)的條件下，過量表達NDRG3的PC-3 細胞(PN3和PN10)的存活率比對照組(PNK)高出3-4倍。這充分說明過量表達 NDRG3的PC-3前列腺癌細胞能明顯的抵抗ZD55-IL24的作用。
實施例11.藥物篩選
細胞模型穩定轉染了 pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3的PC3細胞(制備方 法見實施例6和7)，其中表達NDRG3蛋白。
測試組用候選物質處理的上述細胞的培養物； 對照組不用候選物質處理的上述細胞的培養物。
如果與對照組相比，測試組中的NDRG3蛋白的表達顯著下降50%以上， 則說明該候選物質是潛在的預防前列腺癌的物質。
釆用上述方法，將由SEQ ID NO: 7-10(等量混合)的siRNA(候選物質1)， 以及SEQ ID NO: 11-12(等量混合)的siRNA(候選物質2)作為候選物質，轉染所 述細胞模型。結果發現，候選物質1是預防前列腺癌的物質；而候選物質2沒 有作用。
實施例12.組合物
將各5 nmol的SEQ ID NO: 7-10的siRNA加入到500 u 1純水中，或也可 加入到500" 1常規溶解緩沖液中，配制成含siRNA的組合物。
實施例13.檢測試劑盒
一種檢測前列腺癌的試劑盒，該試劑盒中含有 容器1，以及裝于該容器中的SEQ ID NO: 1所述序列的引物1; 容器2，以及裝于該容器中的SEQIDNO:2所述序列的引物2; 以及，其它一些容器，其中分別裝有dNTP; DNA聚合酶；MgCl: 以及，說明檢測方法的適用說明書。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。序列表
<110>上海市計劃生育科學研究所；
中國科學院上海生命科學研究院； 浙江大學
<120> —種前列腺癌相關的基因及其用途 <130> 084386 <160> 12
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 24
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature <223〉 引物
<400〉 1
ctgcctcctg ttcttaccca ccta 24
<210〉 2
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<212> DNA
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ggcgaattgt cccctaccac cagt 24
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agaaaatctg gcBccacscc 20
<210〉 4
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<221〉 misc一feature
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ctccttaatg tcacgcacga 20
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gatcggatcc gccaccatgg atgaacttca gg
32
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<212> DNA <213>人工序列
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tagaaagctt gggcetggaca cctccatg 28
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<212〉 腿 <213〉人工序列<220〉
<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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ganca33cc3 cuucu3aau 19
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<212〉 RNA <213〉人工序列
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<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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aaacagacca guuauacua 19
<210〉 9
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<212〉 腿 <213>人工序列
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<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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gcuaaaggcu ggaxiugacu 19
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<212〉 脆 <213〉人工序列
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<221〉 misc一feature <223〉寡核苷酸
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cgccugaacc cuaimaaus 19<210〉 11
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<212〉 艦
<213〉 人工序列
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<221> misc—feature <223〉寡核苷酸
<400〉 11
cgcugacccu g犯guucauu u
<210〉 12
<211> 20
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
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<221〉 misc—feature <223〉 人工序列
<400> 12
gagaccugcu gaacacaauu
權利要求
1.一種N-myc下游調節3型基因或蛋白的拮抗劑的用途，用于制備預防或治療前列腺癌的組合物。
2. 如權利要求l所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑選自特異性干擾N-myc下游調節3型基因表達的小干擾RNA分子或反義核苷 酸；或特異性與N-myc下游調節3型基因編碼的蛋白結合的抗體或配體。
3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的小干擾RNA分子是 SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。
4. 一種用于預防或治療前列腺癌的小干擾RNA分子，其特征在于，所述 的小干擾RNA分子選自SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。
5. —種預防或治療前列腺癌的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(1) 有效量的N-myc下游調節3型基因或蛋白的拮抗劑，以及(2) 藥學上可接受的載體。
6. 如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述的組合物還含有有效量 的以下抗腫瘤藥物溶瘤病毒。
7. —種篩選預防或治療前列腺癌的潛在物質的方法，所述方法包括(1) 用候選物質處理表達N-myc下游調節3型基因的體系；和(2) 檢測所述體系中N-myc下游調節3型基因的表達或活性；其中，若所述候選物質可降低N-myc下游調節3型基因的表達或活性，則 表明該候選物質是預防或治療前列腺癌的潛在物質。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測試組中， 將候選物質加入到表達N-myc下游調節3型基因的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中N-myc下游調節3型基因的表達或活 性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達N-myc 下游調節3型基因的體系；如果測試組中N-myc下游調節3型基因的表達或活性在統計學上低于對照 組，就表明該候選物是預防或治療前列腺癌的潛在物質。較佳的，所述的體系是細胞體系。
9. 一種特異性識別N-myc下游調節3型基因或其編碼的蛋白的試劑的用 途，用于制備檢測前列腺癌的試劑或試劑盒。較佳的，所述的特異性識別N-myc下游調節3型基因或其編碼的蛋白的試劑選自特異性擴增N-myc下游調節3型基因的引物； 特異性識別N-myc下游調節3型基因的探針；或 特異性結合N-myc下游調節3型基因編碼的蛋白的抗體或配體。 較佳的，所述的特異性擴增N-myc下游調節3型基因的引物具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
10. —種檢測前列腺癌的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有特 異性識別N-myc下游調節3型基因或其編碼的蛋白的試劑。
全文摘要
本發明公開了一種前列腺癌相關的基因及其用途，所述的基因是N-myc下游調節3型基因(NDRG3)。NDRG3在前列腺腺癌組織中高表達，其過量表達可促進前列腺癌細胞增殖，并降低前列腺癌細胞的生物治療的效果。降低NDRG3蛋白的表達可明顯抑制前列腺癌細胞的生長。因而，NDRG3可作為新的前列腺癌診斷或治療的靶分子。
文檔編號A61K39/395GK101632833SQ200810040989
公開日2010年1月27日 申請日期2008年7月25日 優先權日2008年7月25日
發明者劉新垣, 揚 李, 李潤生, 李玉華, 林標揚, 王偉群, 范鈞鍇, 顧錦法 申請人:上海市計劃生育科學研究所;中國科學院上海生命科學研究院;浙江大學