本發明涉及一種用于治療腺癌的試劑。

背景技術：

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康和生命，全球因癌癥每年死亡人數約600萬，我國因癌癥死亡數每年約130萬，按目前趨勢預測在2020年隨全球人口達80億，將有2000萬新發癌癥病人，每年死亡人數達1200萬，因此，腫瘤的早期發現和早期診斷對腫瘤的預防和治療至關重要。探索有價值的腫瘤分子標記物則有助于治療前對腫瘤進展的程度進行評估，從而為治療決策提供參考。在診治癌癥過程中引入腫瘤分子生物標記物，有以下三個好處：①預測癌癥患病風險，早期診斷，對患癌風險較高者采取預防措施，防止癌癥發生；在早期癌癥患者，體內癌細胞數較少時及時采取措施，徹底根治癌癥；②指導治療：對經過生物標記物檢查，估計預后不好的患者采取更為猛烈的治療方法，增加生存可能性；對于估計預后好的患者避免采用不必要的猛烈的治療方法，防止藥物本身給患者帶來的巨大打擊；③發現新藥適應人群，仔細觀察患者體內某個腫瘤相關分子，對治療的反應情況，據此對治療方案做出進一步調整，構成一整套癌癥病人的診療循環，在這個診療循環中，臨床醫生會收集很多病人對診療方案的具體反應，這些反應對于開發新藥有非常重要的作用。

21世紀腫瘤治療進入了分子靶向治療和個體化治療的時代。隨著腫瘤生物學與腫瘤基因組學的發展，涌現出一些新型的腫瘤分子標志物，這些分子標志物對于腫瘤的早期診斷、分子分型、預后估評和針對性治療起著非常重要的作用。理想的腫瘤標志物應該是特異性高、敏感性強、可信度高、穩定性強，能早期檢測出腫瘤患者；特異性好，能準確鑒別腫瘤/非腫瘤患者；有器官特異性，方便對腫瘤的定位；血清中水平與腫瘤體積大小、臨床分期相關，用以判斷預后；半衰期短，可反映腫瘤的動態變化，監測治療效果、復發和轉移；測定方法精密度、準確性高，操作方便。然而迄今為止尚沒有一種腫瘤標志物能同時滿足以上要求。目前，人類發現的腫瘤標志物已有百余種，但臨床常用的僅20多種，能用于大規模人群普查的腫瘤標志物更少，比如宮頸腺癌的臨床及分子生物學特性不同于宮頸鱗癌，患者5年生存率較宮頸鱗癌低，預后差，因此對其標志物的研究具有重要的意義；乳腺癌檢測c-erbb-2、cath-d(組織蛋白酶d)、p53、pcna表達陽性，er、pr表達陰性，表明存在播散高風險因素，對預后有不良影響。同時，正是由于分子標志物的發現，使肺癌的治療進入了個體化時代，而隨著研究的不斷深入，將有越來越多的患者享受到個體化治療的成果，肺癌轉變為慢性病的奇跡正在成為現實。因此如何發現新型腫瘤分子標志和如何應用新型腫瘤分子標志來指導腫瘤的靶向治療和個體化治療成為當今腫瘤診療領域的重要課題。

ppo基因(kiaa0090,genebank)是一個新的癌基因，ppo基因在基因庫的編碼為kiaa0090。申請人對該基因的研究已有近十年的歷史，從基因分離、克隆到功能鑒定；從分子、細胞、器官水平進行了系列研究。對該基因的結構及功能有了初步的了解。它位于1號染色體末端1p36.13區，dna長度約36000bp,cdna長度6022bp。共有25個外顯子,編碼993個氨基酸，蛋白質分子量為110kd。最保守的氨基酸恰恰位于磷酸化功能域內，功能域分析顯示該基因可能與磷酸化有關，包括依賴camp和cgmp蛋白激酶磷酸化點、蛋白激酶c磷酸化點、激酶ii磷酸化點、酪氨酸激酶磷酸化點。它屬于蛋白激酶類，主要激活途徑是基因擴增。在細胞學水平的研究表明，該基因有使mapk和erk2的磷酸化蛋白表達明顯增加的作用，同時還有促進細胞增殖的作用；與之相關的腫瘤有乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、結腸癌、肺腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、膽管癌、甲狀腺癌、惡性黑色素瘤等。如此在多種腺癌中都出現過表達的癌基因非常罕見，該基因能否成為腺癌的一個新的腫瘤分子標志物？有待于更加深入、細致的研究。

在活體動物的研究表明，用干擾rna(rnai)的方式,阻斷該基因的表達，可以減少磷酸化和核增殖抗原(pcna)的表達，并且能夠抑制卵巢癌的生長。我們把它命名為ppo(phosphorylationandproliferationoncogene)，并于2004申請了國家發明專利，2009年獲正式批復。在以上研究的基礎上，擬首先從乳腺癌開始，在分子、細胞、器官和整體等不同層面作深入細致的系列研究。研究pp0基因與乳腺癌的發生、發展和轉歸的關系以及探索分子靶向治療的可能性。如獲如期結果，以此類推，今后將逐一研究pp0基因與其它腺癌的關系(肺癌、胰腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌、膽管癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮癌等)。如獲預期結果，可將研究成果轉化為臨床診斷和生物制藥。這將是漫長而艱苦的過程，需要長期不懈的努力。

惡性腫瘤的發病率與日俱增，已成為人類健康的第一殺手。新癌基因的克隆是對腫瘤學的貢獻，闡明ppo基因在mapk通路中發揮作用的分子學機制，會對了解各種類型的腺癌發病機理提供幫助。目前，腫瘤的病因尚不清楚，預防還十分困難，治療還沒有特效藥。手術治療、放療、化療以及免疫治療作為傳統的治療方法，已經顯露出愈來愈多的缺點。分子靶向治療作為癌癥治療的第六種方法，在美國已經開始，使人們看到了癌癥治療的曙光。但尋找新的靶標是目前非常重要的工作。ppo基因與多種癌癥有關，利用rna干擾方法，抑制ppo基因可以抑制卵巢癌細胞的生長。ppo基因希望能成為新的靶標，對癌癥診斷和治療起到一定作用。

技術實現要素：

針對上述現有技術，本發明提供了一種用于治療腺癌的試劑。本發明的試劑，可以抑制腺癌生長，并殺死癌細胞。目前，人類癌癥中三分之二是腺癌，腺癌特異性治療試劑的應用，將為癌癥分子靶向性治療提供幫助。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種用于治療腺癌的試劑，為ppo基因的rna干擾劑，為腺病毒包裹的含有atcttcccgtcctccatca核苷酸片段的pgenesil質粒。

所述腺病毒包裹的含有atcttcccgtcctccatca核苷酸片段的pgenesil質粒，可通過以下方法制備得到：首先通過化學合成制備得到atcttcccgtcctccatca核苷酸片段；然后，利用基因重組的方法，將atcttcccgtcctccatca核苷酸片段重組進pgenesil質粒(該質粒是現有技術中已經有的常規質粒)，將重組質粒通過轉染大腸桿菌細胞擴增、提取、純化而得到大量的含有atcttcccgtcctccatca核苷酸片段的pgenesil質粒；利用常規技術手段，將實驗室常用的腺病毒與重組質粒混合，加入常用的蛋白酶，最后得到腺病毒包裹的含有atcttcccgtcctccatca核苷酸片段的pgenesil質粒。

ppo為申請人利用克隆篩選技術,在1p36區找到的一個新的癌基因。研究表明，ppo基因僅在腺癌中有過表達，可能是一種腺癌的特異性基因，將有助于提高人們對腺癌的發生、發展規律,細胞的增殖、分化的調控機制的認識，初步研究表明該基因只在腺癌中表達。因此，我們認為，ppo可能是腺癌相關的基因。在此基礎上，我們完成了從細胞學到動物實驗的相關研究，在ppo基因的整個rna序列中，發現了最有效的作為ppo基因的rna干擾的核苷酸序列(atcttcccgtcctccatca)，進而研發了一種試劑，發現該試劑可以抑制腺癌生長，并殺死癌細胞。本發明的用于治療腺癌的試劑，可以特異性地抑制ppo基因的蛋白表達，可以抑制癌細胞的生長，這將為癌癥治療提供新的靶標和治療方法：用腺病毒包裹的含有atcttcccgtcctccatca核苷酸片段的pgenesil質粒轉染腫瘤細胞，從而達到將atcttcccgtcctccatca核苷酸片段帶入細胞核，進而干擾ppo基因rna的合成，抑制ppo蛋白合成的目的，最終抑制腫瘤生長。

附圖說明

圖1：fig.1篩選ppo基因對癌癥治療試劑的實驗，其中，1：未轉染；2～8：轉然后；2～7：ppo基因被knockdown；8、ppo基因被knockout。

圖2：ppo基因對癌癥治療試劑的轉染實驗。

圖3：轉染后第一天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖4：轉染后第二天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖5：轉染后第三天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖6：轉染后第四天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖7：轉染后第五天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖8：轉染后第六天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖9：轉染后第7天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖10：轉染后第8天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖11：轉染后第9天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖12：轉染后第10天照片，其中，a圖為普通顯微鏡照片，表示細胞數量和形態；b圖為熒光顯微鏡照片，表示轉染成功的細胞。

圖13：利用rna干擾所完成的動物實驗(第一次：利用rna干擾抑制卵巢癌細胞在裸鼠皮下生長的試驗)，其中，a是相同大小的腫瘤，左側注射lamin控制基因的rnai試劑，右側注射ppo的rnai試劑；b是切取的標本；c為生長曲線示意圖。

圖14：利用rna干擾所完成的動物實驗(第二次：利用rna干擾抑制卵巢癌細胞在裸鼠皮下生長的試驗)，其中，a是相同大小的腫瘤，左側注射vetcor，右側注射ppo的rnai試劑；b是切取的標本；c為生長曲線示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。

實驗用于治療腺癌的試劑的篩選、制備、研究

ppo基因是我們克隆的基因，通過大量的實驗證明，和癌癥的發病有關，如果破壞該基因，可以抑制腫瘤的生長。我們從ppo基因的rna序列中，篩選了13個小的片段，對這13個片段做了進一步實驗，尋找到了最佳的片段，如圖1所示，圖1中的第八個片段可以將ppo蛋白完全敲出，是最佳序列，即：atcttcccgtcctccatca(如seqidno.1所示)。

本實驗設計的13個核苷酸序列如下(如seqidno.2～13所示)(序列前面的數字表示該核苷酸片段在整個基因序列中的起始核苷酸的位置，序列后面的百分數表示該段核苷酸片段對整個基因的抑制率。這些結果是由計算機程序自動設計完成的，再由人工合成后，進行下一步的驗證。其中圖1就是這個實驗的結果，其中第一個是陽性對照，自2～7可見ppo蛋白逐漸減少，第8完全消失，證明第8個核苷酸序列能夠完全抑制ppo蛋白的表達，是最好的選擇)：

atcttcccgtcctccatca核苷酸片段，利用基因重組的方法，獲得了穩定的表達。將腺病毒包被的試劑轉染肺腺癌細胞株a549，獲得穩定的轉染表達，如圖2～12所示。如圖3～12所示，經過十天的觀察，絕大部分腫瘤細胞被殺死。正是通過這些實驗，我們發現本試劑可以在細胞水平殺死腫瘤細胞。

建立小鼠卵巢癌動物模型，皮下注射本發明的用于治療腺癌的試劑，同時，以注射等量的lamin控制基因的rnai試劑為對照。觀察腫瘤大小。結果如圖13所示。

建立小鼠卵巢癌動物模型，皮下注射本發明的用于治療腺癌的試劑，同時，以注射等量的vector為對照。觀察腫瘤大小。結果如圖14所示。

由圖13、14可知，經過兩次動物實驗，均顯示在活體水平，該試劑也可以達到抑制卵巢癌細胞生長的目的。

通過對腫瘤細胞在離體和活體實驗表明，該試劑可以抑制腫瘤的生長。這將為癌癥的分子靶向治療開辟一個新的天地。

注：本實驗所用試劑及動物儀器均從商業公司購買，試驗流程均按照學術期刊刊登標準方法完成。

sequencelisting

<110>申請人名稱或姓名

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