專利名稱：：花色苷及對chop基因的調控在防治動脈粥樣硬化中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，具體涉及一種花色苷單體，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷在制備預防或治療動脈粥樣硬化藥物和保健食品中的用途；同時涉及對CHOP(C/EBP同源蛋白)基因的調控在防治動脈粥樣硬化中的應用。
背景技術：
：100多年來動脈粥樣硬化的流行呈越演越烈之勢，在世界范圍內，動脈粥樣硬化血栓形成導致的死亡人數占全部死亡人數的52%，遠遠超過了第二位死因的腫瘤(24%),成為名副其實的死亡第一殺手。動脈粥樣硬化是一種全身性疾病，可導致全身主要器官，如心、腦、腎乃至肢體等功能障礙而嚴重影響患者生活質量，還給家庭和社會經濟帶來沉重負擔。因此，尋找高效、低毒藥物預防和治療動脈粥樣硬化顯得十分必要。動脈粥樣硬化的發病機制十分復雜，至今尚未完全明了。近年來越來越多的研究證實，內質網應激與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。已知的一些心血管疾病的獨立危險因子，如同型半胱氨酸、肥胖和細胞內游離膽固醇的積聚均能引發內質網應激，而內質網應激則可能通過增加細胞內脂質的積聚，激活炎癥反應通路和誘導細胞凋亡而促進動脈粥樣硬化的發生發展。內質網應激反應通路的激活可能是動脈粥樣硬化病理過程中的共同發病機制，而內質網應激反應通路中的關鍵因子也可能成為動脈粥樣硬化治療的新耙點。CHOP，即C/EBP同源蛋白，也稱為生長停滯和DNA損傷誘導蛋白153(GADD153)或DNA損傷誘導轉錄子3(DDIT3)，是聯系內質網應激與細胞凋亡的重要中間信號分子。內質網應激反應誘導CHOP基因的表達，可引發內皮細胞凋亡而致內皮功能損傷，引發巨噬細胞和血管平滑肌的凋亡致細胞殘骸沉積在血管，從而促進動脈粥樣硬化的發生發展。同時，實驗證實，CHOP一巨噬細胞對膽固醇誘導的凋亡不敏感。這些發現均強烈支持內質網應激導致的凋亡是動脈粥樣硬化的主要因素之一。目前，對動脈粥樣硬化尚無一種很有效的防治藥物和方法。抗動脈粥樣硬化研究的主要方向集中在通過調脂、抗氧化、抗血小板聚集、抑制平滑肌細胞增殖、保護內皮功能等方法抑制斑塊增長，通過抗炎、抑制細胞因子表達、阻止基質降解、抗細胞凋亡等穩定斑塊。有些藥物在降脂和預防斑塊破裂上顯示較好作用，但其副作用也不可小視。動脈粥樣硬化的主要預防措施是健康飲食，適當運動。因此找到一種既可以預防動脈粥樣硬化，又具有治療作用的物質呢？自1987年發現法國某些地區人民高脂肪膳食卻出現低冠心病死亡率的所謂"法蘭西悖論"后，法國葡萄酒的主要成分花青素引起了人們的極大的關注。花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，是黃酮類中的多酚化合物。自然條件下游離的花青素極少見，常與單糖形成糖苷，即花色苷。花色苷廣泛存在于植物的果實、種子、花和外皮中，也存在于某些飲料(茶葉、啤酒)、蔬菜、水果和糧食中。攝入的花色苷在胃和小腸吸收后，很快達到最高血液濃度。血漿半衰期約7小時，體內保留時間達達72小時，其生物可利用度高，基本無毒。近幾年的研究顯示，花色苷具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、防治心腦血管疾病、降血糖、抗炎、抗腫瘤、促進視力等多種藥理作用。特別是其在防治心血管疾病中的作用令人振奮。研究顯示花色苷能有效清除自由基，保護血管內皮抵抗過氧化亞硝基陰離子引起的內皮功能障礙；能改善彈性纖維抗降解能力，保護血管內皮細胞，維持血管壁的正常功能；可以刺激血管內皮細胞中一氧化氮合成酶的活性，提高一氧化氮水平，舒張血管；在體外實驗中，花色苷能明顯抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集；可以有效地降低膽固醇及低密度脂蛋白水平，預防心腦血管疾病的發生；用花色苷加膽固醇喂養的家兔，其血漿膽固醇水平、巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白以后轉變成泡沫細胞的數量以及主動脈粥樣硬化發生率均低于單純喂養膽固醇家兔。花色苷還能顯著改善載脂蛋白E基因4缺陷小鼠血脂代謝，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成并增加其穩定性。進一步的研究發現，花色苷可以通過調節轉錄調節蛋白核因子KB而影響多種炎癥反應和免疫反應調節因子的基因表達，包括血管細胞粘附分子-1、細胞間粘附分子-1。但是，也有研究發現，用黑醋栗汁來源的花色苷喂養遺傳性高脂血癥兔，發現花色苷對高脂血癥兔的血脂代謝無影響，并不能拮抗動脈粥樣硬化的形成。花色苷的這些不同結果是什么原因造成的呢？由于目前對于花色苷抗動脈粥樣硬化的研究，多選用不同植物來源的花色苷提取混合物，從單體成分獲得的數據甚少，從而決定了現今已有研究結果的不確定性。同時，大多數研究均局限在對調脂療效、主動脈粥樣斑塊厚度、面積及某些生化指標的觀察上，較少深入到對細胞及亞細胞活性物質表達及機制的水平。由于天然來源的花色苷的無毒或低度特性，運用現代的先進研究萬法和新技術手段對花色苷單體的抗動脈粥樣硬化作用及其機理加以闡述和證明，無疑將推動其在世界范圍內的推廣和應用。
發明內容本發明的目的在于提供一種花色苷在制備治療或預防動脈粥樣硬化藥物中的用途；以及調控CHOP基因的表達在制備治療或預防動脈粥樣硬化藥物中的應用。具體涉及一種花色苷的單體，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷改善氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬細胞系損傷的作用，并探討其作用機制。因此，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷可在制備治療或預防動脈粥樣硬化發生發展的藥物中應用。本發明采用小鼠RAW264.7巨噬細胞(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，來源于上海中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號TCM13)進行實驗，通過噻唑藍(MTT)法測定矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(購于美國Sigma公司，目錄號74397)對ox-LDL處理的RAW264.7巨噬細胞活性的影響。并提取細胞總RNA，用AflfymetrixMouseU4302.0基因表達譜芯片(來源于美國Affymetrix公司)進行標記雜交實驗，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法對Affyemtrix基因芯片的掃描結果進行差異基因分析，篩選出差異基因，隨后采用實時定量PCR法對表達的差異基因進行進一步驗證，具體探討矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷的作用機制。具體
發明內容如下A.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷為花色苷單體(購買于美國Sigma公司，目錄號74397)，可人工合成，研究證實無任何毒副作用。B.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對小鼠RAW264.7巨噬細胞的作用將培養的小鼠RAW264.7巨噬細胞(來源于上海中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號TCM13)接種于96孔板，待細胞長成80~90%融合的單層后，隨機分為6組，即空白對照組、30、60、90、120、150pmol/L花色苷組，每組重復8孔，分別加以0、30、60、90、120、150pmol/L矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷處理，置于37°C、5%C02培養箱中培養24小時后，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍，MTT)法檢測細胞的存活率，倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態。-C.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬細胞系損傷的改善作用將培養的小鼠RAW264.7巨噬細胞接種于96孔板，待細胞長成80~90%融合的單層后，隨機分為6組，即空白對照組、0、30、60、90、120pmol/L花色苷組，每組重復8孔，實驗中先以0、30、60、90、120pmol/L濃度的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷預處理細胞1小時，然后加入ox-LDL(終濃度40mg/L)，空白對照組用無血清常規RPMI1640培養基代替ox-LDL和花色苷，置于37。C、5%(302培養箱中共同孵育24小時后，以倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態，MTT法檢測細胞的存活率。'D.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細胞系基因表達譜的作用將培養的小鼠RAW264.7巨噬細胞接種于60ml培養瓶中，待細胞長成80~90%融合的單層后，隨機分為3組，g卩①對照組RPMI1640培養基常規培養細胞；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L;③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的花色苷培養細胞1小時，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL。每組重復3次，各組細胞繼續培養24小時后收獲細胞，分別提取純化各組細胞總RNA，利用AffymetrixMouseU4302.0基因表達譜芯片(來源于美國Affymetrix公司)進行標記雜交實驗，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法對Affyemtrix基因芯片的掃描結果進行差異基因分析，篩選出差異基因。E.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細胞系CHOP(C/EBP同源蛋白)基因表達的作用將培養的小鼠RAW264.7巨噬細胞接種于60ml培養瓶中，待細胞長成80~卯％融合的單層后，隨機分為3組，即①對照組RPMI1640培養基常規培養細胞；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L;③花色苷+OX-LDL組先用60(amol/L的花色苷培養細胞1小時，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL。每組重復3次，各組細胞繼續培養24小時后收獲細胞，分別提取純化各組細胞總RNA，用實時定量PCFi法對基因芯片篩選出的差異基因CHOP的表達進行檢測。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果1、矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷為一種花色苷的單體，化學結構清楚，可人工合成，研究證實無任何毒副作用。2、本發明表明，當矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、卯、120pmol/L時，小鼠RAW264.7巨噬細胞呈橢圓形，細胞生長狀態良好，MTT結果顯示細胞活力與正常對照組沒有顯著差異。說明矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30120pmol/L范圍內為安全濃度。3、本發明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30~120pmol/L范圍內均可改善ox-LDL對RAW264.7細胞的損傷作用，且其改善作用沒有劑量依賴性。4、本發明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷主要保護了ox-LDL對脂質內膜的破壞，增強了細胞增殖能力和組織結構的再形成能力。5、本發明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷能降低ox-LDL導致的編碼內質網應激中關鍵CHOP蛋白基因的高表達，減輕動脈粥樣硬化發生發展過程中的內質網應激反應，從而發揮其抗動脈粥樣硬化作用。圖1.不同濃度花色苷作用于RAW264.7巨噬細胞24小時后細胞活力比較。*與對照組比較，P<0.05。圖2.不同濃度花色苷對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理的RAW264.7巨噬細胞活力的影響。*與對照組比較，P<0.05;#與ox-LDL組比較，P<0.05。圖3.顯微鏡下觀察120nmol/L花色苷對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理RAW264.7巨噬細胞的形態(x200)。圖4.定量PCR中Ct值(Cyclethreshold,循環閾值)設定示意圖。圖5.定量PCR法檢測各組細胞中CHOP基因的表達水平。具體實施方式下面用矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷進行關于對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理的小鼠RAW264.7巨噬細胞系保護作用的實驗研究及機制探討，說明其在制藥領域的新用途。實施例1:矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對小鼠RAW264.7巨噬細胞的作用1實驗材料1.1實驗藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷為花色苷的一種單體，購于美國Sigma公司，目錄號74397，英文名Cyaninchloride,也稱為Cyanidin-3，5-di-0-glucoside，分子式C27H31C1016,分子量646.98，化學結構如下所示。OH1.2實驗對象小鼠RAW264.7巨噬細胞即小鼠單核巨噬細胞白血病細胞，來源于上海中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號TCM13。1.3試劑3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍，MTT)購自美國Fluka公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國GibC0公司；胰蛋白酶購自武漢生命科學技術公司。1.4儀器.二氧化碳培養箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(YJ-1450型)購自蘇州凈化設備公司；倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司；熒光酶標儀購自瑞士TECAN公司。2實驗方法2.1RAW264.7細胞的培養正常生長的RAW264.7細胞培養于含10%胎牛血清、20%mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及125mg/L谷氨酸鹽的RPMI-1640培養基中，培養條件為37"、5%C02，接種密度為1xl07個/L，倍增時間為4872h。21分組及給藥方法采用不含血清的RPMI-1640培養基依次稀釋矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。常規培養RAW264.7細胞，調整細胞密度為1xl07個/L，然后均勻接種于無菌96孔培養板中，37°C、5%(302培養24小時，使細胞生長成良好單層。實驗開始前用等體積無血清培養基靜止培養24小時使細胞同步化，隨后隨機分為①空白對照組無血清培養基培養；②花色苷組矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷終濃度分別為30、60、90、120、150pmol/L。每組重復8孔，置于37。C、5%0)2培養箱中培養24小時后進行檢測。2.3MTT法培養于96孔板中的細胞處理結束后，吸出細胞孔中的殘余液體，用預熱至37'C的PBS溶液漂洗2次；然后每孔加20pi的MTT(5mg/ml溶于磷酸鹽緩沖液)溶液及180^的不含血清的RPM-I1640培養基，于37。C繼續培養4小時；隨后每孔加入100^DMSO，在水平搖床上緩慢振蕩10分鐘，以溶解細胞中的紫色結晶物；最后在酶標儀上570nm處測定其光吸收值。細胞對照空OD值-實驗孔OD值細胞增殖抑制率(％)=-——""^-X100%細胞對照空OD值2.4觀測的指標(1)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態改變(2)MTT法檢測細胞活力2.5數據處理數據以^±5表示，多組均數進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。3實驗結果倒置相差顯微鏡觀察顯示，正常的RAW264.7細胞呈橢圓形或多邊形，貼壁生長。當矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、90、120pmol/L時，細胞仍呈橢圓形，細胞生長狀態良好。當矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度達150pmol/L時，出現部分細胞脫落、漂浮。.MTT實驗結果(圖l)顯示，當矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、90、120pmol/L時，細胞活力與正常對照組無明顯差異。當矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度達150pmol/L時，細胞活力與正常對照組相比明顯下降。以上實驗結果表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30120^mol/L范圍內為安全濃度。實施例2:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對ox-LDL致小鼠RAW264.7巨噬細胞系損傷的改善作用1實驗材料1.1實驗藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實施例l。1.2.實驗對象小鼠RAW264.7巨噬細胞同具體實施例1。1.3試劑ox-LDL購自北京協和生化室；MTT購自美國Fluka公司；DMSO購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自武漢生命科學技術公司。1.4儀器同具體實施例l。2實驗方法2.1RAW264.7細胞的培養同具體實施例l。2.2分組及給藥方法采用不含血清的RPMI-1640培養基依次稀釋矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。常規培養RAW264.7細胞，調整細胞密度為1x107個/L，然后均勻接種于無菌96孔培養板中，37°C、5%0)2培養24小時，使細胞生長成良好單層。實驗開始前用等體積無血清培養基靜止培養24小時使之同步化，隨后隨機分為①空白對照組無血清培養基常規培養；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組分別用安全濃度為30、60、90、120pmol/L的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷培養細胞1小時，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續培養。每組重復8孔，置于37'C、5%<:02培養箱中培養24小時后進行檢測。2.3MTT法同具體實施例1。2.4觀測的指標(1)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態改變。(2)MTT法檢測細胞活力2.5數據處理數據以；±5表示，多組均數進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。3實驗結果MTT實驗結果(圖2)顯示，40mg/L的ox-LDL能明顯降低細胞活力，而不同安全濃度的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(30、60、90、120pmol/L)均能明顯改善ox-LDL對細胞的損傷，提高細胞活力。圖3顯示的是倒置相差顯微鏡下觀察的正常對照、40mg/L的ox-LDL及矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為120pmol/L是細胞的生長狀況圖。以上實驗結果表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷可改善ox-LDL對RAW264.7細胞的損傷，且濃度沒有劑量依賴性。實施例3:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細胞系基因表達譜的作用1實驗材料1.1實驗藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實施例l。1.2實驗對象小鼠RAW264.7巨噬細胞同具體實施例1。L3.試劑ox-LDL購自北京協和生化室；MTT購自美國Fluka公司；DMSO購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自武漢生命科學技術公司；TRIZOL試劑購自上海生物工程公司產品；RNA純化試劑盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)來源于美國QIAGEN公司；AffymetrixMouseU4302.0基因表達譜芯片來源于美國Affymetrix公司；逆轉錄試劑盒購自美國Pmmega公司；乙醇、異丙醇、正庚烷、正己垸、乙腈均為色譜級，購自上海國藥集團；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯仿均為化學純，購自上海國藥集團。1.4'儀器二氧化碳培養箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(YJ-1450型)購自蘇州凈化設備公司；倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司。2實驗方法2.1RAW264.7細胞的培養同具體實施例1。2.2分組及給藥方法.常規培養RAW264.7細胞，調整細胞密度為1xi(^個/L，然后均勻接種于無菌60ml培養瓶中，37°C、5%<:02培養24小時，使細胞生長成良好單層。實驗開始前用等體積無血清培養基靜止培養24小時使之同步化，隨后隨機分為①空白對照組無血清培養基常規培養；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷培養細胞1小時，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續培養。每組重復3次，置于37°C、5%C02培養箱中繼續培養24小時后收獲細胞供檢測。2.3RNA的提取及檢測2.3.1總RNA的提取(TRIZOL法)131)均質化取2xl0細胞加入lmlTRIZOL，用lml移液器反復吹打。2)均質化的樣品在153(TC放置5分鐘，然后加入0.2倍體積的氯仿，蓋子蓋緊后劇烈振搖15秒使混勻，在1530'C放置23分鐘，4'C，7000rpm離心15分鐘，離心后形成下層紅色的酚氯仿相，中間相和上層無色水相。3)將上層水相轉移至一個新的離心管(水相的體積大約為均質化時所用TRIZOLl體積的60。/。)，加入0.8倍體積的異丙醇，劇烈振搖使混勻，4'C，7000rpm離心15分鐘，棄上清。4)加入70%(ml/ml)酒精，顛倒離心管數次以洗去沉淀所含鹽分。如沉淀較大可用移液器頭先將沉淀打散。然后4。C，7000rpm離心10分鐘，棄上清。5)重復以上步驟l次。6)153(TC晾干，然后加入適量的無RNA酶的水溶解。.7)用分光光度計分析RNA濃度，在260nm波長，10D約等于40嗎/ml的RNA。8)1%(mg/ml)瓊脂糖電泳。2.3.2脂A的純化(QIAGENRNeasyTotal脂AIsolationkit)具體方法按QIAGEN公司隨試劑盒提供的操作手冊進行。2.4基因芯片和分析方法基因芯片制作由上海生物芯片有限公司完成。使用AffymetrixMouseU4302.0基因表達譜芯片，該芯片含45000個探針集，34000個已知功能基因2.4.1樣本類型與基因芯片編號表l:樣本分組及意義<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4.2基因芯片數據預處理應用RMA(Robustmultiarrayanalysis)對Affyemtrix基因芯片的eel格式文件進行數據預處理，該文件中包含了每個探針集的原始強度。RMA完全基于基因的PM探針信號值，在計算信號值的過程中，進行五個步驟①通過探針鄰近區域背景的加權平均對每個探針背景校正；②去除信號響應值為P的基因占基因總數比例低于50%的樣本；③對校正后的PM對數轉換；估計PM對數轉換后的均值，而后對均值進行指數化；⑤對指數化后的均值去除極大極小值后，進行標準化。2.4.3差異基因顯著性分析經過數據預處理后，分析花色苷+ox-LDL組、正常對照、ox-LDL組三組間的差異表達基因。尋找組間差異基因的方法是基于隨機方差模型的方差分析方法。由于每組中的樣本數量較少，無法判斷樣本分布是否符合正態分布，因此，不能簡單地使用基于正態分布進行分組樣本的方差分析。在此，使用貝葉斯統計理論的共軛先驗分布推斷基因標化后信號值(之后簡稱信號值)在樣本中的均值和方差中的分布。若要保證兩者符合正態分布，則這兩者的聯合共軛先驗分布則應該為反伽馬分布。因此，問題將溯源至確定先驗分布是否為反伽馬分布，而后在確定其超參數。在此，發明人使用極大似然法確定先驗分布。由于隨機方差模型分析根據實際數據推斷先驗分布，從而推斷出理論分布，因此，在應用貝葉斯方法處理統計問題時，不但完全利用有限的樣本信息K還利用了先驗分布，從而推導出實際的后驗分布狀況。因此，大大增加了對有限信息的利用效率，從而更為有效地提高差異表達基因鑒別的準確性。2.4:4分析對象花色苷+ox-LDL組、正常對照、ox-LDL組三組的所有基因檢測值。2.4.5統計學方法在此，以任何兩個分組間之間都不存在差異作為零假設，而后檢驗零假設是否成立，從而發現分組間的顯著性差異基因。在此，t值為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>3實驗結果基因芯片結果顯示在34000個已知功能基因中，有差異基因309條。其中，ox-LDL組和對照組比較上調基因24條，下調基因87條；花色苷+ox-LDL組和ox-LDL組比較上調基因16條，下調基因22條。經共表達基因的顯著性分析后，篩選出兩個基因群構建基因功能相似性網絡，計算網絡中心點，得出在花色苷+ox-LDL組禾nox-LDL組比較中，CHOP(C/EBP同源蛋白)基因是矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷下調的主要調控基因。矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷主要保護了ox-LDL對脂質內膜的破壞，增強了細胞增殖能力和組織結構的再形成能力。實施例4:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細胞系CHOP(C/EBP同源蛋白)基因表達的作用1實驗材料1.1實驗藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實施例l。1.2實驗對象小鼠RAW264.7巨噬細胞同具體實施例1。1.3試劑ox-LDL購自北京協和生化室；MTT購自美國Fluka公司；DMSO購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自武漢生命科學技術公司；TRIZOL試劑購自上海生物工程公司產品；RNA純化試劑盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)來源于美國QIAGEN公司；反轉錄試劑購于美國Invitrogen公司；定量PCR試劑(PowerSYBRGreenPCRMasterMix)購于美國ABI公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；乙醇、異丙醇、正庚烷、正己垸、乙腈均為色譜級，購自上海國藥集團；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯仿均為化學純，購自上海國藥集團。1.4儀器二氧化碳培養箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(YJ-1450型)購自蘇州凈化設備公司；倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司；定量PCR儀(7300SequenceDetectionSystem)購于美國ABI公司。2實驗方法2.1RAW264.7細胞的培養同具體實施例1。2.2分組及給藥方法'常規培養RAW264.7細胞，調整細胞密度為1xl07個/L，然后均勻接種于無菌60ml培養瓶中，37°C、5%(302培養24小時，使細胞生長成良好單層。實驗開始前用等體積無血清培養基靜止培養24小時使之同步化，隨后隨機分為①空白對照組無血清培養基常規培養；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷培養細胞1小時，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續培養。每組重復3次，置于37°C、5%C02培養箱中繼續培養24小時后收獲細胞供檢測。2.3RNA的提取及檢測2.3，1總RNA的提取(TRIZOL法)—同具體實施例3。2.3.2RNA的純化(QIAGEN脂easyTotalRNAIsolationkit)同具體實施例3。2.4RT-PCR反應2.4.1cDNA第一鏈合成(1)從-80'C冰箱中取出RNA，在2025'C下解凍，然后在0.2mlPCR管17中配制反應溶液。總RNA3|ig01igo-dT(15)(l嗎/pl)0，dNTPmix(10mM)l^ilddH20(DEPC)_Xpi總體積12^1(2)將反應管置于PCR儀中，65'C預變性5分鐘。'(3)變性反應結束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應體系5Xfirst-strandbuffer4.0|al0.1MDTT2.0|ilRNAinhibitor1.0SuperscriptII(200U/pi)1.0piddH20(DEPC)_Xpi總體積20pi(4)將PCR管子置于PCR儀中進行反應，42。C保溫50分鐘后，70'C變性15分鐘，4'C保存。2.4:2SYBRGreenRT-PCR反應體系2xSYBRGreenPCRbuffer12.5ulprimer(5pmo1)1(illTemplate(10ng)+ddH2011，50。C孵育2分鐘，然后95。C，IO分鐘；接著進行40個循環95°C，15秒；60°C，l分鐘。儀器使用ABI公司的Prism7300系統。2.4.3CHOP基因引物設計.引物設計如下ForwardPrimer:CTGAGGAGAGGACTGAGGGTAGACReversePrimer:CTGGACATGGACAGTAATAAACAATGT2.5統計、作圖方法(1)通過一系列的參數設定分析，得到不同樣本相對于不同基因的Ct值。.Ct值，C代表Cycle(循環)，t代表threshold(閾值)，Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數(如圖4所示)。(2)研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。因為比較的是轉錄水平的差異，所以通過檢測每個樣品的管家基因，將目的基因歸一化。PCR產物的增長形式為211，如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N就是循環數。所以先得到ACt=Ct待測基因一Ct管家基因，再轉換為原始模板濃度=2-ACt2.6重復性檢驗每個樣品3個平行樣，計算同一樣品的3個平行樣Ct值的變異系數，分析樣品目標基因定量結果的批內變異系數。3實驗結果實時定量RT-PCR結果如圖5所示，其進一步驗證了基因芯片結果，證實矢車菊素—3，5-二葡萄糖苷能降低ox-LDL導致的小鼠RAW264.7巨噬細胞中CHOP基因的高表達。權利要求1、花色苷在制備治療或預防動脈粥樣硬化的藥物中的應用。2、調控CHOP基因的表達在制備治療或預防動脈粥樣硬化藥物中的應用。3、根據權利要求r所述的應用，其特征是所述花色苷為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。全文摘要本發明公開了一種花色苷在治療動脈粥樣硬化藥物中的用途，以及對CHOP基因的調控在防治動脈粥樣硬化中的應用。涉及花色苷單體矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對氧化低密度脂蛋白致巨噬細胞損傷的改善作用，并探討其作用機制。本發明采用小鼠RAW264.7巨噬細胞系進行實驗，通過MTT法測定矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對氧化低密度脂蛋白處理的RAW264.7巨噬細胞活性的影響。并提取細胞總RNA，用AffymetrixMouseU4302.0基因表達譜芯片進行標記雜交實驗，RMA法對Affyemtrix基因芯片的掃描結果進行差異基因分析，篩選出差異基因，隨后采用實時定量PCR法對表達的差異基因進行進一步驗證。結果證實，矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷能下調CHOP基因表達，對氧化低密度脂蛋白損傷的巨噬細胞具有明顯的保護作用。文檔編號A61P9/00GK101322716SQ20081004863公開日2008年12月17日申請日期2008年7月30日優先權日2008年7月30日發明者張葉敏,陽李,歐陽靜萍,畢勇毅,同沈,王保華申請人:武漢大學