專利名稱：抑制2型志賀毒素活性的多肽tf1及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制2型志賀毒素活性的多肽TFl及其編碼基因與應用。
背景技術：
志賀毒素(ShigaToxin，Stx)，又稱志賀樣毒素(Shiga-like Toxin, Slt)作為腸 道病原菌產生的一類具有腸毒性、細胞毒性和神經毒性的細菌外毒素，包括1型、2型志賀 毒素(Stxl，Mx2)，是急性細菌性痢疾、霍亂0139、0157:H7等新發腸道病原菌最為關鍵的 強致病毒力因子，可以引起出血性結腸炎(hemorrhagic colitis, HC)、血栓形成性血小板 減少性紫癜(TTP)以及高病死率的溶血性尿毒癥(hemolytic uremic syndrome,HUS)等嚴 重并發癥。而流行病學研究和臨床資料均表明，相比較乂^，與感染并發癥，特別是 HUS發生的相關性更高，被認為是重要的防治藥物設計靶標。目前針對志賀毒素相關病原菌的重癥感染尚無特異有效的預防產品和急救治療 藥物。臨床普遍采用的抗生素治療已經引起多重耐藥菌株的出現，造成抗生素治療的失效。 抗生素使用造成更加不利的后果是菌體崩解引發志賀毒素過量釋放，加大了由毒素引發各 種并發癥的風險。因此針對志賀毒素相關疾病的治療主張慎用抗生素，而應尋求特異性藥 物作為新的有效治療手段。Stx2(又稱Slt2)由1個志賀毒素A亞單位(Μχ2Α)和5個志賀毒素B亞單位 (Stx2B)組成，毒素通過Stx2B介導與真核細胞表面的(Λ3受體結合，進而Stx2A作用于 細胞^S rRNA引起細胞病變。Stx2B與細胞(Λ3受體的結合是毒素發揮作用的起始關鍵 環節，如能阻斷這種結合，將從根本上抑制分子毒性的發揮。國內外研究方向主要集 中在毒素受體類似物和抗體治療方面。Mshikawa報道了能與Mx結合的多糖化合物，具 ^ WI^ffli/Ml (Nishikawa K, Matsuoka K, Watanabe Μ, et al. Identification of the optimal structure required for a Shiga toxin neutralizer with oriented carbohydrates to function in the circulation. J Infect Dis 2005 ；191 2097-2105.) ；2002 年 Natori Y.報道了 Gb3 受體治療的實例(Natori Y. New drugs that prevent cytotoxicity of Shiga toxins. Nippon Rinsho. 2002. 60(6) :1131-1137.),包 括一種能在胃腸道途徑阻止毒素擴散的新制劑和另一種可在循環系統抑制志賀毒素毒性 的水溶性制劑。但是受體類多糖化合物的復雜制備工藝和副作用成為制約其發展的障礙。 最近，有學者報道可表達毒素模擬受體的益生菌具有顯著的毒素中和效果，可用于治療志 賀毒素相關疾病(Paton JC, Rogers TJ, Morona R，Paton AW. Oral administration of formaldehyde—killed recombinant bacteria expressing a mimic of the Shiga toxin receptor protects mice from fatal challenge with Shiga-toxigenic Escherichia coli. Infect Immun 2001 ;69 :1389-1393.)，但是這種活菌治療的安全性有待進一步考察 和驗證。在抗體治療方面，Sieorm等研究報道的單克隆抗體能夠阻斷與細胞受體的 結合，中禾口 Stx2 細胞毒t生(Sheoran AS, Chapman-Bonofiglio S，Harvey BR, et al. Human antibody against shiga toxin 2administered to piglets after the onset ofdiarrhea due to Escherichia coli 0157:H7prevents fatal systemic complications. Infect Immun 2005 ;73 :4607-4613.)，但臨床應用有待于抗體制備工藝的改進完善。近年來日益引起人們研究關注的肽類小分子物質，作為藥物具有很鮮明的技術優 勢，包括分子量小，結構相對簡單，可通過化學合成或基因工程方法進行大量低成本制備； 功能明確，免疫原性低，副作用小，安全性高；易于從多途徑吸收，給藥途徑可多樣化。小分 子肽成為新藥篩選的重要來源之一(李越希，黃培堂。多肽在生物醫藥和診斷試劑中的應 用。中國生化藥物雜志2001. 22(4) :208-210.)。其中利用噬菌體肽庫具有高容量的特點， 篩選具有毒素抑制作用的多肽分子就是可行的技術手段。目前針對志賀毒素的肽類抑制 劑鮮見報道。可參考的科學文獻主要為2006公開的Nishikawa K的研究報道(Nishikawa K, Watanabe M, Kita E, et al. A multivalent peptide library approach identifies a novel Shiga toxin inhibitor that induces aberrant cellular transport of the toxin. Faseb J 2006 ;20 :2597-2599.)，以及 Miura Y 的研究報道(Miura Y, Sakaki A, Kamihira Μ, Iijima S, Kobayashi K. A globotriaosylceramide(Gb3Cer)mimic peptide isolated from phage display library expressed strong neutralization to Shiga toxins. Biochem Biophys Acta 2006 ；1760 :883-889.)。

發明內容
本發明的目的在于提供一種抑制2型志賀毒素活性的多肽。本發明提供的多肽，命名為TFl (又名Pl)，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。本發明的另一目的在于提供上述的多肽的修飾體。本發明提供的多肽的修飾體是在上述多肽的N端和/或C端進行化學修飾或生物 修飾得到的。進一步，上述化學修飾可為乙酰化修飾或氨酰化修飾。上述修飾體可為單肽或分支肽。上述多肽的編碼基因也屬于本發明的保護范圍之內。含有上述基因的重組載體、重組菌或轉基因細胞系也屬于本發明的保護范圍之內。上述多肽或者上述的修飾體在制備預防和/或治療由2型志賀毒素或產2型志賀 毒素的病原菌所引起疾病的藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍之內。上述病原菌為產2型志賀毒素的大腸桿菌、志賀氏痢疾菌或霍亂弧菌。具體地講，上述產2型志賀毒素大腸桿菌為腸出血性大腸桿菌0157。實驗證明本發明提供的多肽Pl的濃度越大，其與Mx2B結合量越大。多肽Pl與 結合的親和力常數KD :1. 25X10—1。細胞毒性中和實驗發現P1的濃度為300 μ M時，對乂義2細胞毒作用的抑制率達82%。多肽TFl (又名PI) (300ymol/L)對FITC_Stx2B與 HeLa細胞結合的阻斷率為45. 7%。動物實驗發現安慰劑組動物在4_5天時全部死亡，不 同劑量多肽Pl給藥組表現為不同程度的保護效應，當多肽的劑量達到llmg/kg，Pl可以對 小鼠提供完全保護(見圖6A)，多肽Pl對小鼠的保護效力具有劑量依賴性。


圖1為TFl (又名Pl)合成肽的質量分析圖，A圖為質譜分析圖，B圖為高效液相色4譜分析圖。圖2為WA8(又名P8)合成肽的質量分析圖，A圖為質譜分析圖，B圖為高效液相色 譜分析圖。圖3為梯度濃度多肽(Pl、P8)與Stx2B結合活性，隨著濃度增大，多肽PI、P8與 Stx2B結合量逐漸增大。圖4為多肽與的結合動力學曲線圖，BIAcore系統動態分析TFl (又名Pl)、 WA8(又名P8)合成肽與乂口的梯度特異結合。其中曲線自下而上所示濃度由低到高倍增， A圖Pl濃度范圍為0. 96-15. 38umol/L, B圖P8的濃度范圍為2. 44-39. 125umol/L,結果顯 示多肽能與特異結合，具有量效關系。圖5為TFl (又名Pl)、WA8 (又名P8)合成肽的體外細胞毒抑制效應的光鏡觀察 (X200)，A為對照組(PBS)，B* Mx2，C* 與多肽(Plor P8)孵育后加入HeLa細胞。圖6為小鼠5LD50攻毒保護實驗結果，小鼠先腹腔給藥，20min后(5LD50)腹 腔攻毒記錄存活率，圖A為對Pl的藥效觀察，圖B為對P8的藥效觀察，給藥劑量范圍分別 為 0. 7mg/kg-llmg/kg0
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、短肽TFl (又名Pl)、WA8(又名P8)的修飾、化學合成與結合活性分析一、短肽TFl (又名Pl)、WA8 (又名P8)的修飾、合成UTFU WA8合成肽序列的篩選Stx2B蛋白的制備以EHEC 0157 :H7菌(購自ATCC)為模板，用引物 5' -catatggctaaaggtaaaattgag-3‘ 禾口 5，gcggccgcgcctcagtcatcagtcatt-3 ‘ JT" stx2B基因。利用pEASY-Tl克隆載體測序鑒定，測序結果表明，擴增產物的核苷酸序列 如GenbankNC_002655的第1；353327位至第1；35；3533位。將擴增產物插入pET2^+載 體(購自Novagen公司)的NdeI和Not I酶切位點構成重組質粒pET22b_stx2B，然后 將pET22b-stx2B導入E. coli. BL21 (DE3)菌株(購自Transgen公司)構建重組工程菌 pET22b-stx2B/BL21 (DE3)。重組菌克隆接入含100ug/mL氨芐青霉素的LB培養基，37°C水 浴過夜震蕩，次日按1 100比例轉接于三角燒瓶擴大培養。待茵體0D_至0.6,WAIPTG 至工作濃度為lmmol/L，繼續誘導表達證，可以實現Mx2B的高效表達。誘導菌體超聲破碎 處理后，10000r/min離心lOmin，收集包涵體蛋白，以含6mol/L鹽酸胍的PBS溶液變性溶 解，將變性蛋白裝入透析袋，以含遞減濃度尿素(6，4，2，1，Omol/L)的Tris緩沖液(lOmmol/ L Tris, lmmol/L EDTA，0. 3mol/L精氨酸，lmmol/L還原型谷胱甘肽，0. 25mmol/L氧化型谷胱 甘肽，10%甘油，50mmol/L NaCI, pH 8.0)逐步透析，最后透析至 10mmol/L Tris, pH 8.0。 復性蛋白最后經Q S印harose離子柱純化，洗脫液為lOmmol/L Tris-lmol/L NaCI，線性 洗脫。相關實驗研究細節已公開發表(Tu W，Cai K，Gao X，Xiao L，Chen RC, Shi J，Liu H, Hou XJ, Wang Q, Wang H, Improved production of holotoxin Stx2with biological activities by using a single-promoter vector and an auto-induction expression system. Protein Expr. Purif. 2009,67(2) :169-174)。
利用噬菌體展示技術，以重組Stx2B為靶標，通過親和淘選步驟，從隨機線性十二 肽庫中篩選獲得特異結合的短肽。根據篩選出的與2型志賀毒素特異結合的短肽序 列，搜索出現頻率最高2個序列，命名為TFl (又名PI)、WA8 (又名P8)。利用protparam tool 軟件(http //www. expasy. org/tools/protparam. html)對短肽 TFl、WA8 的理化性質進行 預測分析，結果顯示=TFl由12個氨基酸組成，分子式為C77H皿N17O18S1，分子量為1584. 8，理 論pi為5. 19 ；WA8由12個氨基酸組成，分子式為C79H96N16O18,分子量為1557. 7，理論pi為 6. 74。2、化學修飾及體外合成在不改變短肽一級結構的前提下，在短肽TF1、WA8的N端分別進行乙酰化修飾，以 增加短肽的水溶性和穩定性。多肽的化學修飾合成由上海波泰生物科技公司完成。固相合 成法進行化學合成，并進行質譜和HPLC質量分析，如圖1、2所示，圖I-A顯示質譜分析合成 肽TFl的分子量為1584. 9與理論值相符，圖I-B顯示HPLC質量分析合成肽TFl的純度為 95. 1 % ；圖2-A顯示質譜分析合成肽WA8的分子量為1557. 7與理論值基本相符，圖2-B顯 示HPLC質量分析合成肽WA8的純度為95. 3%。短肽TFl (又名Pl)的氨基酸序列如序列表中序列1所示；WA8 (又名P8)的氨基 酸序列如序列表中序列2所示。二、短肽TFl (又名Pl)、WA8 (又名P8)的結合活性分析BIAcore 3000生物傳感器系統、CM5芯片及配套試劑為GE公司產品，抗組氨酸HRP 標記抗體購自Pierce公司(ELISA效價為1 2000)。大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS感受態細 胞，大腸桿菌DH5 α和pEASY-Tl克隆載體購自北京"TransGen生物技術公司。Taq DNA聚合 酶，T4DNA連接酶和限制性內切酶購自NEB公司，PCR引物由Sunbio北京生物科技有限公司 合成，質粒提取和純化試劑盒購自Biomed北京有限公司，5毫升HisTrap純化柱購自GE公 司，S-IOkDa的透析膜購自北京科海軍舟生物技術公司，表達載體pET3h購自Novagen公 司。1、ELISA分析多肽與Stx2B相互作用濃度梯度多肽4°C過夜包被(設置陰性對照BSA)，PBST洗滌，3% BSA封閉lh， PBST洗滌，加入步驟一制備得到蛋白，置37°C孵育1小時。然后洗滌，與多肽結合 的Stx2B采用抗組氨酸標簽抗體檢測，顯色，OD490讀數。如圖3所示，隨著多肽(Pl，P8)濃 度增大，與Mx2B結合量逐漸增大，相同的多肽濃度下Pl結合Stx2B量大于P8。2、TFUWA8合成肽與特異結合的SI3R動態分析Stx2 的制備以 EHEC 0157:H7 菌為模板，用引物 1 5，-GGGGGGAATTCATGAAGTGTAT ATTATTTAAATGGG-3 '和 2 5 ‘ -TTTTTTGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTCATTATTAAACTGCACTT CAG-3’擴增全志賀毒素基因stx2。利用pEASY-Tl克隆載體測序鑒定，測序結果表明，擴增 產物的核苷酸序列如Genbank NC_002655的第1352290位至第1353527位。采用單啟動子 雙讀碼框的策略構建工程菌pET3h-StX2/plySS，具體是將擴增產物插入pET3h的EcoRI 和Mil酶切位點構成重組質粒pET3h-stx2，然后將pET3h-stx2導入E. coli. BL21 (DE3) plysS菌株(購自Transgen公司)構建重組工程菌pET3^i-stx2/plysS。其中，重組質粒pET3h-stX2含有一個T7啟動子，全志賀毒素基因stx2克隆含 有兩個開放閱讀框(Stxh和Stx2b)。添加IPTG至終濃度為lmmol/L進行誘導，30°C水浴振蕩培養證，可以實現的高效可溶表達，Stx2經鎳柱HisTrap純化后純度達90%以 上，具有生物學功能活性，相關實驗研究細節已公開發表(Tu W, Cai K, Gao X, XiaoL, Chen RC,Shi J,Liu H,Hou XJ, Wang Q,Wang H,Improved production of holotoxin Stx2with biological activities by using a single-promoter vector and an auto-induction expression system. Protein Expr.Purif. 2009,67(2) :169-174)。借助BIAcore生物傳感器系統，測定短肽與制備的特異結合活性。將 偶聯到芯片CM5的Fc4上，偶聯量為2235. 9RU，以EDC/NHS活化和乙醇胺封閉。測定不同 濃度的短肽0倍比稀釋)與乂口結合的動力學曲線。檢測在20yL/min流速下進行， 由knsorgram記錄曲線分別觀察短肽TF1、WA8的動態結合過程。通過BIAevaluation 3. O軟件包分析，由knsorgram記錄曲線中的結合(association)部分獲得Ka，解離 (dissociation)部分獲得Kd。對應梯度濃度多肽有不同的反應量。從分析結果報告中可 以讀取Ka、Kb、ΚΑ、KD數值。公式為R為某一時刻的SPR信號(RU，Req為多肽(analyte) 穩定結合水平(RU)，Rmax為多肽的最大結合能力(RU)，t為時間，dR/dt為SI3R信號變換 率，C 為多肽濃度。Rnax= (MWanalyte/MWligand)RligandXSvalence, Ka = (dR/dt)/t， Kd = (dt/dR)/R, KD = Kd/Ka = CX (Rmax-Req)/Req。結果如圖4所示，Pl和P8的濃度范圍分別為0. 96-15. 38uM、2. 44-39. 125uM，測 算結果表明，Pl與結合的親和力常數KD 1. 25 X IO-6M ；P8與結合的親和力常數 KD 2. 48X101。實施例2、TFU WA8合成肽的體外細胞毒抑制活性及對毒素的靶細胞結合阻斷作 用HeLa細胞株、胰酶消化液和雙抗購自Hyclone公司，DMEM培養基購自GIBCO公司， 胎牛血清購自Biochorm公司，MTT為sigma公司產品，FITC購自萊寶公司。細胞培養瓶、培 養板購自CORNING公司，(X)2培養箱為日本SANYO公司產品，倒置光學顯微鏡為日本Olympus 產品，流式細胞儀為Coulter公司產品。一、細胞毒性中和實驗收集培養的對數期細胞(HeLa細胞)，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μ 1，鋪 板使待測細胞調密度至IO4/孔(邊緣孔用無菌？83填充)，5%0)2，371孵育過夜。終濃 度150uM的多肽(IOOul)與5CD50的(2. 5ng)混合，同時設置一個正常對照組PBS， 設置一個只加的對照組，4°C過夜孵育。再加入96孔細胞培養板培養的細胞中，5% C02，37°C孵育72小時，倒置顯微鏡下觀察。棄去培養液，小心用PBS沖2_3遍后，每孔加入 50 μ 1 MTT溶液(5mg/ml)繼續培養4h，終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150ul 二 甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD57tl處測量各 孔的吸光值，按以下公式計算抑制率抑制率％=[(多肽+StX2)0D57(l-StX20D57(l]/[正常 0D570-Stx20D570]。如圖5所示，相同濃度下，Pl比P8對的細胞毒作用的抑制率高，針 對大于細胞致死毒量的(5 X CD50)，Pl的IC50 (半數抑制濃度)為180 μ Μ, Ρ8的IC50 為193 μ Μ，其中Pl的濃度為300 μ M時，對細胞毒作用的抑制率達82% ；Ρ8的濃度為 300 μ M時，對細胞毒作用的抑制率可以達到。二、流式細胞分析多肽對Mx2B與細胞結合作用的影響HeLa細胞為(Λ3+細胞，Stx2B為毒素的受體結合區，Stx2B可通過(Λ3受體與HeLa7細胞特異結合，利用此細胞模型可檢測多肽對Stx2B與HeLa細胞結合是否具有阻斷作用。 應用熒光素FITC標記毒素亞單位Stx2B制備FITC-Stx2B 將上述純化的蛋白樣品Stx2B 透析至碳酸鹽緩沖液(PH9. 2)，按0. 05mg FITC/mg蛋白的劑量加入DMSO溶解的FITC，室 溫避光攪拌池，以磷酸鹽緩沖液(PH7. 2)透析，換液數次至不再有FITC析出，即制備的 FITC-Stx2B。將標記蛋白 FITC-Stx2B(5ug)和多肽(終濃度 300 μ M) (IOOul)孵育 4°C過 夜(注意避光)，然后加入細胞(細胞數量大約106)37°C孵育ai，1000r/min離心5min，PBS 洗滌和懸浮細胞，重復2次。細胞用40%多聚甲醛固定G°C，10min)，離心，取細胞以PBS 懸浮，進行流式細胞檢測。剩余細胞以PBS懸浮，采用流式細胞術分析FITC-Stx2B與Hela 細胞的結合情況。實驗分為三組陰性對照細胞組(PBS) ；FITC-Stx2B組；FITC_Stx2B和 多肽組。細胞檢測結果顯示(圖略)FITC-Stx2B處理的HeLa細胞有97. 22%熒光結合， FITC-Stx2B與多肽TFl (又名Pl)孵育后處理的HeLa細胞有52. 77%熒光結合，可以計算 出多肽TFl (又名Pl) (300 μ mol/L)對FITC-Stx2B與HeLa細胞結合的阻斷率為45.7%,相 似的計算出多肽WA8(又名P8) (300 μ mol/L)對FITC_Stx2B與HeLa細胞結合的阻斷率為 24. 8%。實施例3、TF1、WA8合成肽對2型志賀毒素攻毒小鼠的保護效果雄性Balb/C(17-19g)小鼠，由軍事醫學科學院動物中心提供。試驗用多肽TFl (又 名Pl)和WA8 (又名P8)純度> 95% (g級)一、TF1、WA8合成肽在毒素攻擊小鼠致死模型上的保護作用1、2型志賀毒素粗制品的制備接種產2型志賀毒素0157大腸桿菌(購自ATCC)于LB培養基過夜培養，次日按 1 100比例接種至IL培養基，震蕩培養72h，5000rpm離心lOmin。菌體沉淀懸于PBS緩 沖液，超聲波破碎細胞，IOOOOrpm離心lOmin，上清滴加飽和硫酸銨溶液至50%濃度，收集 鹽析沉淀，以PBS溶解并透析完全，得到志賀毒素2型志賀毒素粗制產物。2、TF1、WA8合成肽的體內志賀毒素毒性抑制效應雄性17_19g Balb/C小鼠隨機分六組，每組20只。多肽TFl (又名Pl)或WA8 (又 名P8)腹腔給藥，20min后用劑量為5LD50的2型志賀毒素粗制品(50ng)腹腔攻毒，同時設 置安慰劑對照組(生理鹽水)，攻毒組(StU)。連續觀察10天，每天兩次記錄各組動物的 存活情況。結果如附圖6顯示，Stx2(5LD50)腹腔攻毒，安慰劑組動物在4_5天時全部死亡， 不同劑量多肽(Pl或P8)給藥組表現為不同程度的保護效應，當多肽的劑量達到llmg/kg， Pl可以對小鼠提供完全保護(見圖6A)，P8有80%保護率(圖6B)；多肽Pl或P8對小鼠 的保護效力具有劑量依賴性。Pl在小鼠大于致死劑量攻毒保護實驗中表現出具有優于P8 的體內抗毒活性。
權利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.權利要求1所述的多肽的修飾體，其特征在于所述修飾體是在權利要求1所述多 肽的N端和/或C端進行化學修飾或生物修飾得到的。
3.如權利要求2所述的修飾體，其特征在于所述化學修飾為乙酰化修飾或氨酰化修飾。
4.如權利要求2所述的修飾體，其特征在于所述修飾體為單肽或分支肽。
5.權利要求1所述多肽的編碼基因。
6.含有權利要求5所述基因的重組載體、重組菌或轉基因細胞系。
7.權利要求1所述多肽或者權利要求2-4中任一所述的修飾體在制備預防和/或治療 由2型志賀毒素或產2型志賀毒素的病原菌所引起疾病的藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述病原菌為產2型志賀毒素的大腸桿菌、 志賀氏痢疾菌或霍亂弧菌。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述產2型志賀毒素大腸桿菌為腸出血性 大腸桿菌0157。
全文摘要
本發明公開了一種抑制2型志賀毒素活性的多肽TF1及其編碼基因與應用。本發明提供的多肽，命名為TF1(又名P1)，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。該多肽P1可以做成藥物以預防和/或治療由2型志賀毒素或產2型志賀毒素的病原菌所引起疾病。
文檔編號C12N5/10GK102040654SQ20101029046
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月25日 優先權日2010年9月25日
發明者侯曉軍, 劉越男, 史晶, 屠偉, 李濤, 王慧, 王琴, 蔡昆 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所