專利名稱：雙層膠原－殼聚糖海綿支架及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種組織工程支架，尤其是涉及一種用于皮膚組織工程支架材料的雙層膠原-殼聚糖海綿支架及其制備方法。
背景技術：
組織工程支架用來模擬細胞外基質的多孔結構，以賦予支架某些細胞外基質的基本功能， 同時支架材料被逐漸降解吸收，從而誘導種子細胞、受損組織或器官部位細胞定向遷移，達 到修復組織或器官的目的。組織工程支架是形成組織工程化組織和器官的關鍵因素。理想的 組織工程支架應具備(1)良好的生物相容性和生物降解性，無明顯的炎癥反應、免疫反應 和細胞毒性，在體外以及植入體內后的降解和吸收速度應該與細胞和(或)組織生長的速度相 匹配；(2)具有足夠的力學強度，材料不會在患者活動中塌陷、撕裂、破潰；(3)高孔隙率、 高表面積，便于細胞的粘附和導入及營養和代謝產物的交換；(4)表面(包括內表面)親和性 良好，材料表面的化學結構、親/疏水性、拓撲結構(粗糙度、孔洞的大小及其分布、溝槽的深 度寬度、纖維的粗細)、電荷狀況(電荷的性質、密度)、表面負載的活性因子等有利于細胞 的粘附、鋪展、繁殖等；(5)可塑性強，易于加工成各種形狀和結構；(6)易于消毒。
從材料的選取方面來講，當前認為天然高分子物質是一種優良的組織工程生物材料，這 一類物質包括有膠原、殼聚糖、海藻酸(鹽)、海底珊瑚和多種高分子的粘多糖。但每種材料 的性能都存在不足之處。其中，膠原是細胞外基質的主要成分，有利于細胞的粘附、增殖和 分化。殼聚糖的結構與人體內的糖胺聚糖極其相似，能促進生長因子及膠原的合成還能減緩 膠原的降解速度([l] Ma Lie ,Gao Changyou ，Mao Zhengwei ,et al . Collagen/ chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering [ J ] . Biomaterials， 2003 ， 24 : 4833 -4841)。雖然各國在皮膚組織工程支架方面已有深入探索，但是由于存在生物相容性、細胞 親和性、免疫原性及力學性能等問題，還沒有一種令人十分滿意的皮膚支架材料在臨床上廣 泛推廣。目前，組織工程皮膚所使用的支架已報道有不同的制備方法，但大多都是結構均一 的表皮或真皮單層支架。研究表明，模擬皮膚的真、表皮結構制備成的雙層皮膚支架比單層 的皮膚支架有更優越的性能致密的表層可以防治細菌的入侵及體液的快速蒸發，多孔的內 層有利于組織的長入([2] Hinrichs WL, Lommen EJ， Wildevuur CR, et al. Fabrication andcharacterization of an asymmetric polyurethane membrane for use as a wound dressing[J]. J Appl Biomater. 1992 ,3(4):287-303)。而已報道的雙層皮膚支架大多以聚氨酯或殼聚糖為原料制備， 尚未見有膠原-殼聚糖雙層海綿支架的報道([3] Matsuda K, Suzuki S， Isshiki N, et al. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials[J]. 1993， 14:1030-1035; [4] Fwu-Long Mi, Yu-Bey Wu, Shin-Shing Shyu, et al. Asymmetric chitosan membranes prepared by dry/ wet phase separation : a new type of wound dressing for controlled antibacterial release [J]. Journal of Membrane Science ，2003 ，212 : 237 — 254; [5] Jianbiao Ma, Hongjun Wang, Binglin He, et al. A preliminary in vitro study on the fabrication and tissue engineering applications of a novel chitosan bilayer material as a scaffold of human neofetal dermal fibroblasts [J]. 5z'owafen'a&， 22, 337-336入
鑒于膠原-殼聚糖材料優越的生物學性能，利用其制備出類似于天然皮膚結構的組織工程支架 對于組織工程皮膚的發展和完善具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于組織工程皮膚的雙層膠原-殼聚糖海綿支架。 本發明的另一目的在于提供一種上述雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法。 本發明所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架為雙層網狀結構，下層為膠原與殼聚糖復合膜， 下層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑為80 12(^m，厚度為2 3mm，下層膠原與殼聚糖復合膜 的孔徑呈互相貫穿的層狀孔狀結構；上層為膠原與殼聚糖復合膜，上層膠原與殼聚糖復合膜 的孔徑為30 80pm,厚度為0.5 1.5mm，上層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑呈互相貫穿的層 狀孔狀結構。
所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架呈微黃色，柔軟有彈性，可隨意彎折不斷裂，與正常皮 膚的厚度相符，內層表面粗糙，可見大小均一的小孔，外層表面光滑，未見小空洞，支架大 小和形狀可根據需要制備。
本發明所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法包括以下步驟
1) 將膠原溶脹液溶解于乙酸中，溶解后，按質量百分比，分別配制濃度為0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的膠原分散液；
2) 將殼聚糖溶解于乙酸中，溶解后，按質量百分比，分別配制濃度為0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的殼聚糖分散液；
3) 按質量比，分別將相同濃度的膠原分散液和殼聚糖分散液以(1 :9) (9: 1)的比 例混合，得按質量百分比，濃度為0.2%~0.5%和0.5%~0.8%的兩種膠原-殼聚糖溶液；
4) 按質量百分比，稱取濃度為0.5%~0.8%的膠原-殼聚糖溶液置于一60 一80匸冷凍過夜后，冷凍干燥，得到海綿狀的白色支架；5) 將凍干的海綿支架用聚四氟乙烯板壓膜后，用戊二醛進行交聯，清洗后，冷凍過夜， 冷凍干燥，得到顏色接近正常皮膚顏色的單層支架；6) 再向單層支架上倒入按質量百分比濃度為0.2%~0.5%的膠原-殼聚糖溶液，冷凍過夜， 再冷凍干燥，得到含有兩層結構的雙層支架；7) 將凍干的雙層支架再次用戊二醛進行交聯，清洗后，冷凍過夜，冷凍干燥，即得所需 的雙層膠原-殼聚糖海綿支架。在步驟l)中，乙酸的濃度最好為0.05~1M。 在步驟2)中，乙酸的濃度最好為0.05~1M。 在步驟4)中，所述冷凍干燥的時間最好為24 48h。在步驟5)中，將凍干的海綿支架用聚四氟乙烯板壓膜的時間最好為12 24h，所述的清 洗最好依次用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及去離子水浸洗，冷凍過夜 的溫度最好為一2(TC，冷凍干燥的時間最好為12 24h。在步驟6)中，冷凍過液的溫度最好為一2(TC，冷凍干燥的時間最好為24 48h。在步驟7)中，所述清洗最好依次用蒸熘水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及 去離子水浸洗，冷凍過夜的溫度最好為一20°C，冷凍千燥的時間最好為12~24h。本發明采用的制備方法所涉及的技術原理是膠原、殼聚糖不僅各自有許多優良的生物 特性，而且在復合使用時功能上還顯示互補性。較高固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿孔 徑較小，可以減少細胞植入過程中的漏液，增加細胞在支架中的停駐數量。另外，較高固含 量的溶液制備的海綿孔徑較小，交聯處理的過程中較小的孔之間易發生融合，從而使材料收 縮。24h的壓膜則可以顯著降低較高固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿交聯后沿直徑方向 的收縮，以較高固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿經壓膜、交聯后作為表皮層，可以避免 內層海綿的巻曲變形并保證復合雙層支架有足夠的強度，而表層孔徑小于0.22nm，可有效防 止外界細菌的入侵。較低固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿孔徑較大，作為真皮層可在長 時間內提供細胞增殖的空間，促進細胞的增殖。


圖1為雙層膠原-殼聚糖海綿支架真皮層橫截面的SEM照片。圖2為雙層膠原-殼聚糖海綿支架表皮層橫截面的SEM照片。圖3為雙層膠原-殼聚糖海綿支架表皮層經壓膜后表層的SEM照片。圖4為0.2%膠原-殼聚糖溶液制備的海綿支架及0.8%膠原-殼聚糖溶液制備的海綿支架SEM照片比較圖。圖5為雙層膠原-殼聚糖海綿支架內層細胞生長情況的SEM照片。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。 實施例1分別將膠原溶脹液及殼聚糖溶于0.05M乙酸水溶液中，得到0.2。/。(wt)的膠原分散液與 殼聚糖分散液及0.8% (wt)的膠原分散液與殼聚糖分散液。將相同濃度的膠原分散液與殼聚 糖分散液按9 : 1的質量比混合得固含量為0.8%及0.2%的膠原-殼聚糖溶液。將15g固含量為 0.8M的膠原-殼聚糖溶液液倒入直徑9cm的玻璃培養皿中，保持液面水平置于一6(rC冰箱冷凍 過夜后，迅速將其移入冷凍干燥機冷凍干燥40h。將凍干的海綿置于兩塊光滑的聚四氟乙烯 板之間，以15kg重物壓膜24h。將壓膜后的海綿浸入0.2%戊二醛交聯液中，4'C反應24h后， 分別用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及去離子水浸洗，一2(TC冷凍過夜 后再進行15h冷凍干燥。在凍干的海綿上倒入60g固含量為0.2%膠原-殼聚糖溶液，保持液 面水平置于一2(TC冷凍過夜。再將其移入冷凍干燥機冷凍干燥4011.凍干的雙層海綿支架再次 按上述步驟進行交聯、清洗、凍干，即得到厚度為3.8mm的海綿支架。掃描電鏡顯示真皮層 呈網狀結構，平均孔徑為80 10(Him (如圖l);表皮層呈互相貫穿的層狀孔狀結構，平均孔 徑為30 50prn，(如圖2)表層孔直徑小于0.22pm (如圖3)。實施例2分別將膠原溶脹液及殼聚糖溶于0.5M乙酸水溶液中，得到0.2% (wt)的膠原分散液與 殼聚糖分散液及0.8% (wt)的膠原分散液與殼聚糖分散液。將相同濃度的膠原分散液與殼聚 糖分散液按8 : 2的質量比混合。將10g固含量為0.8%的膠原-殼聚糖溶液倒入直徑6cm的玻 璃培養皿中，保持液面水平置于一6(TC冰箱冷凍過夜后，迅速將其移入冷凍干燥機冷凍干燥 24h。將凍干的海綿置于兩塊光滑的聚四氟乙烯板之間，以15kg重物壓膜24h。將壓膜后的 海綿浸入0.25%戊二醛交聯液中，4t:反應12h,再分別用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽 和NaCI溶液及去離子水浸洗浸洗，一20'C冷凍過夜后再進行24h冷凍干燥。在凍干的海綿 上倒入40g固含量為0.2。/。膠原-殼聚糖溶液，保持液面水平置于一20'C冷凍，再凍干24h。凍 干的雙層海綿支架按上述步驟進行交聯、清洗、凍干，即得到厚度為3mm的海綿支架。掃描 電鏡顯示真皮層呈網狀結構，平均孔徑為80 100pm;表皮層呈互相貫穿的層狀孔狀結構，平 均孔徑為30 50nm，表層孔直徑小于0.22pm。實施例3分別將膠原溶脹液及殼聚糖溶于1M乙酸水溶液中，得到0.3% (wt)的膠原分散液與殼 聚糖分散液及0.7% (wt)的膠原分散液與殼聚糖分散液。將相同濃度的膠原分散液與殼聚糖 分散液按7 : 3的質量比混合得固含量為0.7%及0.3%的膠原-殼聚糖復合液。將100g固含量 為0.7%的膠原-殼聚糖復合液倒入大小為28cmX18cm陶瓷托盤中，保持液面水平置于一6(TC 冰箱冷凍過夜后，迅速將其移入冷凍干燥機冷凍干燥42h。將凍干的海綿置于兩塊光滑的聚 四氟乙烯板之間，以15kg重物壓膜24h。將壓膜后的海綿浸入0.5%戊二醛交聯液中，4。C反 應12h后，分別用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及去離子水浸洗，一20 'C冷凍過夜后再進行24h冷凍干燥。在凍干的海綿上倒入400g固含量為0.3%膠原-殼聚糖復 合液，保持液面水平置于一2(TC冷凍過夜。再將其移入冷凍干燥機冷凍干燥42h。凍干的雙 層海綿支架再次按上述步驟進行交聯、清洗、凍干，即得到厚度為4mm的海綿支架。掃描電 鏡顯示真皮層呈網狀結構，平均孔徑為100 120pm;表皮層呈互相貫穿的層狀孔狀結構，平 均孔徑為50 80pm，表層孔直徑小于0.22pm。以下給出實驗結果。所得的膠原-殼聚糖雙層海綿支架呈微黃色，柔軟有彈性，可隨意彎折不斷裂，厚度在正 常人體皮膚的厚度范圍(0.5 4mrn)。傅立葉紅外光譜表明膠原、殼聚糖分子之間存在化學作 用；將所得的膠原-殼聚糖雙層海綿支架在萬能材料試驗機上監測其抗拉強度平均為58.7± 1.3KPa表明，改支架具有一定的力學強度，可以用于手術操作和移植需要。將所得的膠原-殼聚糖雙層海綿支架進行細胞種植實驗及動物移植實驗，監測其生物相容 性及皮膚修復活性。細胞實驗表明該材料無細胞毒性(如圖5)，其中成纖維細胞在材料中的生 長規律表明較高固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿可以減少細胞植入過程中的漏夜，增加 細胞在支架中的停駐數量；較低固含量的膠原-殼聚糖溶液制備的海綿可在長時間內提供細胞 增殖的空間，促進細胞的增殖；用該膠原-殼聚糖雙層海綿支架構建完整的人工皮膚，通過建 立SD大鼠皮膚缺損模型進行人工皮膚替代物移植實驗表明該人工皮膚替代物組織附著性、 吸濕性好，能促進傷口愈合，并具有引導組織形成，促進組織細胞生長的效果。這些實驗結 果均表明該膠原-殼聚糖雙層海綿支架不僅具有良好的結構穩定性，而且具有良好的生物相容 性和皮膚修復活性，具有較大的實際應用價值。
權利要求
1.雙層膠原-殼聚糖海綿支架，其特征在于為雙層網狀結構，下層為膠原與殼聚糖復合膜，下層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑為80～120μm，厚度為2～3mm，下層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑呈互相貫穿的層狀孔狀結構；上層為膠原與殼聚糖復合膜，上層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑為30～80μm，厚度為0.5～1.5mm，上層膠原與殼聚糖復合膜的孔徑呈互相貫穿的層狀孔狀結構。
2. 如權利要求1所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟1) 將膠原溶脹液溶解于乙酸中，溶解后，按質量百分比，分別配制濃度為0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的膠原分散液；2) 將殼聚糖溶解于乙酸中，溶解后，按質量百分比，分別配制濃度為0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的殼聚糖分散液；3) 按質量比，分別將相同濃度的膠原分散液和殼聚糖分散液以(1 :9) (9: 1)的比 例混合，得按質量百分比，濃度為0.2%~0.5%和0.5%~0.8%的兩種膠原-殼聚糖溶液；4) 按質量百分比，稱取濃度為0.5%~0.8%的膠原-殼聚糖溶液置于一60 _80'C冷凍過 夜后，冷凍干燥，得到海綿狀的白色支架；5) 將凍干的海綿支架用聚四氟乙烯板壓膜后，用戊二醛進行交聯，清洗后，冷凍過夜， 冷凍干燥，得到顏色接近正常皮膚顏色的單層支架；6) 再向單層支架上倒入按質量百分比濃度為0.2%~0.5%的膠原-殼聚糖溶液，冷凍過夜， 再冷凍干燥，得到含有兩層結構的雙層支架；7) 將凍干的雙層支架再次用戊二醛進行交聯，清洗后，冷凍過夜，冷凍干燥，即得所需 的雙層膠原-殼聚糖海綿支架。
3. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟1 )中， 乙酸的濃度為0.05~1M。
4. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟2)中， 乙酸的濃度為0.05~1M。
5. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟4)中， 所述冷凍干燥的時間為24 48h。
6. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟5)中，將凍干的海綿支架用聚四氟乙烯板壓膜的時間為12 24h。
7. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟5)中， 所述的清洗依次用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及去離子水浸洗；冷凍 過夜的溫度為一20'C，冷凍干燥的時間為12 24h。
8. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟6)中， 冷凍過液的溫度為一2(TC，冷凍干燥的時間為24 48h。
9. 如權利要求2所述的雙層膠原-殼聚糖海綿支架的制備方法，其特征在于在步驟7)中， 所述清洗依次用蒸餾水、NaBH4的磷酸鹽緩沖液、飽和NaCI溶液及去離子水浸洗，冷凍過 夜的溫度為一20'C，冷凍干燥的時間為12~24h。
全文摘要
雙層膠原-殼聚糖海綿支架及其制備方法，涉及一種組織工程支架。提供一種用于組織工程皮膚的雙層膠原-殼聚糖海綿支架及其制備方法。為雙層網狀結構，上、下層為膠原與殼聚糖復合膜，孔徑呈互相貫穿的層狀孔狀結構。膠原溶脹液溶于乙酸，配濃度為0.2％～0.5％和0.5％～0.8％的膠原分散液；殼聚糖溶于乙酸，配濃度為0.2％～0.5％和0.5％～0.8％的殼聚糖分散液；兩種分散液混合，得兩種膠原-殼聚糖溶液；濃度為0.5％～0.8％的膠原-殼聚糖溶液冷凍過夜，干燥得海綿狀的白色支架，壓膜后交聯，清洗，冷凍過夜，干燥得單層支架；倒入膠原-殼聚糖溶液，冷凍過夜，干燥得雙層支架，交聯，清洗，冷凍過夜，冷凍干燥。
文檔編號A61L27/40GK101254313SQ20081007086
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月3日 優先權日2008年4月3日
發明者孫莉萍, 張其清, 靜 李, 王秀燕 申請人:廈門大學