專利名稱：：修飾的磷酸酶的制作方法
技術領域：
：本發明涉及磷酸酶，且更具體地涉及(遺傳)修飾的磷酸酶、包含(遺傳)修飾的磷酸酶的藥物組合物、和(遺傳)修飾的磷酸酶在治療或治愈如敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、或腎衰竭中的用途。本發明還涉及制備;壽酸酶的方法。
背景技術：
：磷酸酶是對其底物進行去磷酸化的酶；即其將磷酸單酯水解為磷酸根離子和具有自由羥基基團的分子。此作用與通過使用能量分子如ATP將磷酸根基團連接到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用直接相反。磷酸酶可以-皮分為主要的兩類半胱氨酸依賴性磷酸酶(CDP)和金屬磷酸酶。后者的活性依賴于在其活性位點上一種或多種金屬離子的存在。CDP通過磷酸-半胱氨酸中間產物催化磷酸酯鍵的水解。游離的半胱氨酸親核試劑與磷酸根部分的磷原子成鍵，并通過合適位置的酸性氨基酸殘基或水分子將連接磷酸根基團和酪氨酸的P-O鍵質子化。磷酸-半胱氨酸中間產物隨后被另一水分子水解，由此產生用于另一去磷酸化反應的活性位點。金屬磷酸酶與其活性位點內的一個或多個催化必需的金屬離子配位。目前對這些金屬離子的鑒定存在一些混亂，原因是不斷嘗試去鑒定它們但得出了不同的答案。目前證據表明這些金屬可能是鎂、錳、鐵、鋅或其任意組合。認為橋接兩金屬離子的氫氧根離子參與了對磷酸根基團的親核攻擊。磷酸酶發揮與將磷酸根基團添加到蛋白質上的激酶/磷酸化酶相反的作用。磷酸根基團的添加可以活化或去活化酶(如激酶信號通路)，或使蛋白質-蛋白質相互作用發生(如SH3結構域)；因此磷酸酶是許多信號轉導通路所必需的。應該注意到磷酸根的添加和去除并非必需對應酶的活化或抑制，且一些酶具有用于活化或抑制功能性調節的單獨磷酸化位點。例如，CDK的活化或去活化依賴于被磷酸化的特定氨基酸殘基。磷酸根在信號轉導中很重要，因為它們調節與其相連的蛋白質。將磷酸根去除以逆轉該調節作用。這可以通過水解自行發生，或受蛋白質磷酸酶的調節。并非限制本發明，將堿性磷酸酶作為本文所述和要求保護的磷酸酶的實例進行詳細討論。堿性磷酸酶(ALP)(EC3.1.3.1)是負責從包括核苷酸、蛋白質和生物堿的多種分子中去除磷酸根基團的水解酶。去除磷酸根基團的過程被稱為去磷酸化。顧名思義，堿性磷酸酶在堿性環境下最有效。因為DNA通常在5'端具有磷酸根基團，所以堿性磷酸酶已成為分子生物學實驗室中一種十分有用的工具。去除這些磷酸根防止了DNA的連接(5'端連接相同或另一分子的3，端)；此外，磷酸根基團的去除使得可以進行放射標記(被放射活性磷酸根基團替代)，以通過方法或實驗中的其它步驟測定被標記DNA的存在。出于這些目的，來自蝦的堿性磷酸酶最有用，因為其一旦完成其使命則最易被去活化。堿性磷酸酶的另一重要用途是作為酶免疫分析的標記物。此外，堿性磷酸酶可以用在如敗血癥、炎性腸疾病或腎衰竭的治療中。雖然現有的(堿性)磷酸酶在診斷學和疾病治療中都十分有用，但是仍需具有如改變的(如改進的)比活性、穩定性(如體內T1/2、或儲存(貨架期)方面的穩定性)或底物特異性的備選磷酸酶。此外，也需要具有不同的pH或溫度或鹽依賴性分布，或不依賴pH或溫度或鹽的磷酸酶。
發明內容本發明提供了備選的(遺傳)修飾的磷酸酶。在第一實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶。這些突變體在本文中也稱為"結構域交換突變體"。堿性磷酸酶(AP)(根據IUBMB酶命名法為EC3.1.3.1,常用名為堿性磷酸酶)是催化磷酸單酉旨(phosphatasemonoester)和1120反應生成醇和磷酸根的酶。AP的其它名稱為堿性磷酸單酯酶、磷酸單酯酶、甘油磷酸酶、堿性磷酸水解酶、堿性苯基磷酸酶、正磷酸單酯磷酸水解酶(最適宜堿性)。AP的系統名稱為磷酸單酯磷酸水解酶(最適宜堿性)。AP是廣譜特異性酶，其也可以催化轉磷酸作用。已知在人類和其它哺乳動物中已知有至少四類不同但相關的堿性磷酸酶。在人類中，它們是腸、胎盤、胎盤樣和肝/骨/腎(或組織非特異性)堿性磷酸酶。前三類一起位于2號染色體上，而組織非特異性形式則位于1號染色體上。尚不知道AP的確切生理學功能，但AP似乎參與大量生理學過程。胎盤堿性磷酸酶在本文中簡稱為ALPP或PLAP。簡稱ALPI或IAP是指腸堿性磷酸酶。胎盤樣2堿性磷酸酶在本文中簡稱為ALPP2、ALPG或GCAP,且簡稱ALPL、TNSALP、TNAP或BLK在本文中用來指肝/組織非特異性堿性磷酸酶。用于一種和相同堿性磷酸酶的不同縮寫在本文中可以交換使用。從構象上看，堿性磷酸酶大致由兩個結構域構成花冠結構域和活性位點結構域。活性位點結構域可以分為單獨的部分，如催化殘基和三個金屬離子位點(Znl、Zn2和Mg3)。從一級結構看，很明顯花冠結構域側翼連接形成活性位點結構域的氨基酸。因此，在優選的實施方案中，催化結構域不由連續的氨基酸序列構成，而是側翼連接花冠結構域。堿性磷酸酶的氨基酸序列和催化和花冠結構域的相對位置是技術人員已知的。例如，參考圖1，其顯示出四條人堿性磷酸酶的氨基酸序列。這些序列中的花冠結構域用下劃線標出。本發明的結構域交換突變體優選通過用另一磷酸酶的花冠結構域(下劃線標出)替換其自身花冠結構域(下劃線標出)來制備。例如，ALPP花冠結構域位于氨基酸366至430位之間，因此在優選的實施方案中，參照對應于圖1中氨基酸366至430位的花冠結構域，即在優選的實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域是獲得自不同的堿性磷酸酶，且圖1的ALPP中的花冠結構域位于氨基酸366至430位之間。堿性磷酸酶存在于從細菌到人類的幾乎所有生物體中。在優選的實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶，且其中所述不同的磷酸酶中的至少一種是人磷酸酶。另一種磷酸酶是如ECAP(大腸桿菌(^c/zen'c/z/"co//)石成性磷酸酶)或七種已知BIAP(牛腸堿性磷酸酶)中的一種。在優選的實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶，且其中所述不同的堿性磷酸酶是人磷酸酶。如果修飾的磷酸酶隨后用在人類治療中，例如用在敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、或腎衰竭治療中，這一點將特別有用。預期此(遺傳)修飾的人源磷酸酶沒有免疫原性或免疫原性很低。然而，技術人員清楚如果將修飾的磷酸酶用在如"體外，，或"離體，，診斷中，修飾的磷酸酶可以由如人和大腸桿菌堿性磷酸酶構成，或可以由牛和大腸桿菌石威性磷酸酶構成。在另一個優選的實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶，且其中所述花冠結構域是ALPP花冠結構域，且其中所述催化結構域是ALPI催化結構域。優選地，所述不同的磷酸酶中的至少一個是人磷酸酶，且在更優選的實施方案中，兩個不同的磷酸酶都是人磷酸酶。在本發明之前，通常認為堿性磷酸酶的催化結構域是在比活性方面最重要的結構域。此外，過去認為花冠結構域與堿性磷酸酶的穩定性有關。因此，在檢測包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域(下文稱為催化ALPI/花冠ALPP)的重組堿性磷酸酶時，預期此重組石威性磷酸酶的活性能與ALPI的活性相當。然而，在不含或含有極少量Zn"的培養基中，如Freestyle293表達培養基(GIBCO),催化ALPI/花冠ALPP的產生導致約600U/mg的比活性，然而由相同細胞系且在相同培養基中產生的ALPI導致約30U/mg的比活性。更令人驚奇地是向產生細胞的生長培養基中加入Zn"的影響其對催化ALPI/花冠ALPP的比活性沒有影響，而ALPI的比活性增至約750U/mg。在產生后加入相似濃度的Zr^+僅誘導ALPI的比活性在16小時后增加2倍。這些結果的總結顯示在表1和2中。不受理論的束縛，認為ALPP花冠結構域在產生的重組催化ALPI/花冠ALPP中提供了構象變化，這導致有更高比活性和Zn"非依賴性的酶，即ALPP花冠結構域的存在導致相對高比活性，且被認為是Zn"非依賴的。此外，不但顯示出ALPI在產生期間需要高Zi^+濃度以增加酶的比活性，而且ALPI的比活性在Zi^+缺乏的培養基中在24小時內下降，然而催化ALPI/花冠ALPP在相同條件下保持其初始比活性。這些結果暗示體內活性是Zn"非依賴性的。這類活性不依賴于Zn"的酶在Zr^+缺失是病理學一部分的疾病(如營養缺乏、酒精成癮和腸道完整性損傷、包括敗血癥的慢性感染、或廣義的炎性疾病)，或可能禁忌添加Zi^+的的疾病(如敗血癥的急性期、自身免疫性疾病)中可能十分有用。除去產生和應用的優點，催化ALPI/花冠ALPP還具有與儲存期間穩定性相關的優點。西此，已顯示出天然AP如ALPI在低Zr^+濃度的環境中會喪失其酶活性。因此在Zr^+缺失是病理學一部分的疾病中，所述天然AP不能在被認為是最有利的位點如在炎性位點展現其酶活性。相反，重組AP對低Zr^+濃度不敏感，例如催化ALPI/花冠ALPP在低Zn"濃度的環境(如在炎性位點)中保持其活性。在健康個體中，Zi^+血清參考值在10和20pM之間。例如，在酒精成癮或營養不良時，這些水平可以降低至小于1OpM或甚至小于1。如果存在充足的Zn"水平，在人身體中其活性和如免疫原性反應依賴Zn2+的一些酶更為有效。已知免疫系統的先天以及特定部分受鋅影響，且已經確定包含鋅的蛋白質在炎性位點積累。此外，(亞)慢性炎癥如類風濕性關節炎、敗血癥和克羅恩氏病(Crohn，sdisease)表現出血清鋅缺乏。令人驚奇地，本發明還發現催化ALPI/花冠ALPP可比未修飾的(重組)堿性磷酸酶在更寬pH范圍內保持其活性。考慮到許多疾病如炎癥和/或缺血包括組織pH中的紊亂，因此催化ALPI/花冠ALPP在這類疾病的治療中特別有用。因此，在一個實施方案中，本發明提供了包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的磷酸酶作為藥物的用途，優選作為用于治療伴有組織pH紊亂的疾病中藥物的用途，優選地所述疾病包括炎性疾病和/或伴有缺血的疾病。本發明認為包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的重組磷酸酶在治療伴有局部或全身Zn"缺乏的疾病中特別有用。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的磷酸酶作為藥物的用途，優選作為用于治療伴有Zr^+缺乏疾病中藥物的用途，優選地所述疾病包括炎性疾病，更優選地選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表IO所列疾病組成的組中。在另一個實施方案中，本發明提供了包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的磷酸酶在制備用于治療伴有Zi^+缺乏疾病的藥物中的用途，優選地所述疾病包括炎性疾病，更優選地上述疾病選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表10所列疾病組成的組中。在又一個實施方案中，本發明提供了用于治療受試者(優選人)以治療伴有Zr^+缺乏疾病的方法，包括向有此需要的受試者給予有效量的包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的磷酸酶，其中所述疾病優選包括炎性疾病，更優選地選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣-更化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表10所列疾病組成的組中。在另一個優選的實施方案中，本發明提供了包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶，且其中所述花冠結構域是ALPI花冠結構域，且其中10所述催化結構域是ALPP催化結構域(下文稱為催化ALPP/花冠ALPI)。優選地，所述不同的磷酸酶中的至少一個是人磷酸酶，且在更優選的實施方案中，兩個不同的磷酸酶都是人磷酸酶。基于人堿性磷酸酶的其它優選結構域交換突變體是:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>為了筒明起見，ALPI是腸AP，ALPP是月臺盤AP，GCAP是胎盤樣AP,TNAP是組織非特異性AP。很顯然可以也可以制備ECAP或任何人形式(ALPI、ALPP、GCAP或TNAP)的催化結構域與BIAP花冠結構域的組合。此外，也可以制備BIAP花冠結構域與ECAP或任何人形式的催化結構域的組合。貫穿說明書、實施例和本領域文獻，其它命名用于指定堿性磷酸酶的各自同種型。為了簡明，下表中列出了常用的或本申請中所用的名稱和縮寫。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>另一類有用的修飾磷酸酶是指原來在自然條件下通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定物與細胞膜連接，但現在經修飾而不再與細胞膜連接的磷酸酶。GPI錨定的磷酸酶的實例是堿性磷酸酶和5，-核苷酸酶。全部同工酶均在細胞膜上有功能性活性，且缺乏GPI錨定物的形式不以可檢測的水平自然存在。雖然已經表明了血清堿性磷酸酶的活性，但是通常認為此酶仍存在于脫落的膜部分或膜嚢泡中。奶中AP活性也存在于包含膜嚢泡的部分中。GPI錨定物作為前體分子存儲在細胞中，在此處其通過轉酰胺酶與附著位點連接。GPI錨定物的骨架在哺乳類中是相同的，但是已知有依賴細胞類型的修飾。發現堿性磷酸酶主要通過其GPI錨定物與質膜結合。例如，嗜中性粒細胞在其帶負電荷的細胞膜背景下呈遞該酶，而非將其釋放進入炎性微環境中。出于此原因，通常認為為了獲得最佳的AP體內活性，應將該酶嵌入細胞膜或嚢膜中。此外，已經觀察到聚陰離子底物可以在體內進一步導致對于磷酸酶和其衍生物的磷酸酶活性有利的陰離子條件，這些磷酸酶是指通常在堿性pH下最適宜的磷酸酶和其衍生物，特別是對于堿性磷酸酶的磷酸酶活性有利的陰離子條件。對于人受試者中AP的藥學用途，大多數應用中需要^1尋人形式的該酶用于藥物和治療，這是因為獲得自其它物種的AP形式在人受試者中具有免疫原性，且治療會引起免疫反應和病理學上的副作用。在一些受試者中，甚至會發生致死的副作用，即過敏性休克(顯示在我們的動物研究中)，因此，應將免疫副作用的風險降至最低。從人中分離AP在實踐中并不可行，通常可以在不同的重組表達平臺上制備人重組形式的AP蛋白質。然而，包含GPI和膜錨定的蛋白質的表達和純化十分困難；GPI蛋白質很難從膜分離且很難分離和純化。然而，一直認為GPI錨定物和膜定位是AP生物學活性所必需的。本發明的此部分是基于驚人的發現，即在基于肝細胞的生物分析中，發現缺乏GPI錨定物的人AP酶(此酶因此是可溶的并易于被重組蛋白質表達系統分泌)在生理pH水平下對于生物學相關的磷酸化底物展現出顯著的磷酸酶活性。在一個實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶，即磷酸酶未附著到細胞膜上。在優選的實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致具有生物活性的分泌性磷酸酶，即其顯示出對生物學(相關)底物的活性。并沒有負責GPI錨定物連接的通用序列，但是可見明顯的共有序列1)C末端的氨基酸的疏水延伸(至少11個氨基酸，但是優選大于11個氨基酸)。2)疏水區上游，親水氨基酸間隔區(5-12個氨基酸)。3)GPI與小氨基酸(甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、絲氨酸或半胱氨酸)連接。4)GPI連接位點下游之后的2個后續氨基酸必然是小氨基酸，且在多數情況下其選自于甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、絲氨酸或半胱氨酸。基于此共有序列，技術人員能夠通過如插入一個或多個氨基酸和破壞部分共有序列來突變此共有序列。然而，在優選的實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶，且其中所述修飾包括對含共有GPI信號序列的氨基酸序列的突變或刪除。對于在人治療中的應用，希望所得修飾的磷酸酶沒有免疫原性或免疫原性很低，即此修飾的磷酸酶基本上是人源的。在優選的實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶(優選具有針對生物學相關底物的活性)，且其中所述磷酸酶是人磷酸酶。GPI錨定的磷酸酶的實例是堿性磷酸酶和5，-核香酸酶，因此，在優選的實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶，且其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶，例如人堿性磷酸酶，如人肝-腎-骨磷酸酶、人腸堿性磷酸酶或人胎盤樣堿性磷酸酶。很明顯任何所述可分泌的修飾磷酸酶均可通過如以下步驟來產生向宿主細胞內引入能夠編碼所述可分泌的磷酸酶且與調控序列有效連接的核酸，且允許所述宿主細胞表達所述可分泌的磷酸酶，并任選地從用于生長和/或維持宿主細胞的培養基中分離所產生的磷酸酶。然而，除了在上述GPI連接序列中進行突變之外，還存在制備無GPI錨定連接分泌蛋白的其它方法1)在作為膜錨定的蛋白質表達后，可以使用磷脂酶來切除GPI錨定物。因此，本發明還提供了用于制備可分泌的磷酸酶的方法，包括培養能夠表達膜錨定的磷酸酶的宿主(細胞)，使所述宿主細胞產生所述磷酸酶并用磷脂酶孵育所獲得的細胞，和任選地分離釋放的磷酸酶。膜錨定的磷酸酶例如是野生型(或天然或未修飾的)磷酸酶。然而，膜錨定的磷酸酶可以在其序列的其它部分(例如花冠結構域)中包含突變。2)可以通過干擾GPI錨定物的產生或使用在GPI錨定物產生中有缺陷的細胞(類型)來產生可分泌形式的GPI錨定蛋白。在GPI錨定生物化學中存在缺陷的細胞系的實例是，例如Jurkat、AM-B、C84、BW、S49、CHO和Raji。在另一個實施方案中，本發明因此提供了用于制備可分泌的磷酸酶的方法，包括培養能夠表達可分泌的(堿性)磷酸酶的宿主細胞(例如包含編碼任一上述修飾的可分泌的(堿性)磷酸酶的核酸序列的宿主細胞)，使所述宿主產生所述可分泌的磷酸酶，和任選地分離產生的磷酸酶，其中所述宿主細胞無法進行功能性GPI錨定的蛋白的生物合成。然而，宿主細胞也可以產生具有功能性GPI信號序列的磷酸酶。3)可以通過干擾轉酰胺酶或使用缺乏轉酰胺酶的細胞來抑制GPI錨定物與蛋白質的連接，以使蛋白質無錨定且可分泌。可以通過誘變CHO來獲得此類缺陷性細胞。技術人員清楚可以對包含花冠結構域和催化結構域的修飾的磷酸酶進行進一步修飾并使其可分泌，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶。因此，在優選的實施方案中，本發明提供了在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶，且其中所述重組的磷酸酶還包含獲得自不同磷酸酶的花冠結構域和催化結構域。圖l提供了此類(堿性)磷酸酶突變體的實例。此組合的或"雙，，突變體產生例如修飾的磷酸酶，其具有某種比活性、穩定性或底物特異性，且同時由于可以從生產細胞周圍的培養基中將其分離，此產物的產量得到極大的提高。堿性磷酸酶的催化結構域由在酶的一級序列中不相鄰的若干氨基酸序列組成。催化結構域包含對在去磷酸化反應中從底物中切除的磷酸根基團起受體作用的催化性絲氨酸殘基(ALPP中的Ser92)。酶的催化結構域還包含一種或多種金屬離子。包含在催化結構域中的特定氨基酸殘基負責參與去磷酸化反應中金屬離子的結合和配位。在ALPP中，與金屬配位的殘基是Asp42、Hisl53、Serl55、Glu311、Asp316、His320、Asp357、His358、His360和His432。在另一個實施方案中，本發明提供了在催化殘基附近和/或在金屬離子配位磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶。技術人員能夠很好地鑒定并突變在催化殘基周圍(即，在催化殘基附近，優選構象上在催化殘基附近)和/或在金屬離子配位的磷酸根穴中的氨基酸。如上所述，磷酸酶的序列是已知的。作為示例，圖1列出了其中四條人堿性磷酸酶的氨基酸序列。在優選的實施方案中，本發明提供了在催化殘基附近和/或在金屬離子配位磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。如果+務飾的磷酸酶隨后用在人類治療中，例如用在敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、或腎衰竭治療中，這一點將特別有用。預期此(遺傳)修飾的人源磷酸酶沒有免疫原性或免疫原性很低。然而，技術人員清楚如果將修飾的磷酸酶用在如"體外，，或"離體，，診斷中，修飾的磷酸酶可以由如人和大腸桿菌堿性磷酸酶構成，或可以由牛和大腸桿菌石威性磷酸酶構成。在另一個優選的實施方案中，所述磷酸酶是堿性磷酸酶。至少對于人堿性磷酸酶的同種型而言，金屬離子配位磷酸根結合的穴是保守的。其由兩個Zn結合的延伸和一個Mg結合的延伸組成，所述延伸分別包含如下氨基酸對于Znl為氨基酸Asp316、His320和His432,對于Zn2為氨基酸Asp42、Asp357和Asp358，和對于Mg為氨基酸Serl55和Glu31(參考圖1的ALPP)。配位氨基酸殘基和/或位于配位殘基附近殘基的突變可能以正面或負面的方式影響所得突變體酶的催化性質。例如，在ALPP中，氨基酸殘基44、87、93、322、323和429位于配位殘基的附近。用ALPI的一個、二個、三個或四個相應氨基酸進行取代來誘變這些殘基可以影響該酶的催化性質。相反，用ALPP的相應氨基酸取代ALPI的氨基酸殘基44、87、93、322、323和429可以影響ALPI酶的催化性質。表4和5顯示了可以被取代的氨基酸(的組合)。16因此，在優選的實施方案中，本發明提供了在催化殘基附近和/或在金屬離子配位磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶，其中所述突變是表4、5或6中所示的突變。技術人員清楚在催化殘基附近和/或在包含金屬離子的磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶可以進一步被修飾，以例如包含在GPI信號序列中的修飾。此突變體甚至可以通過催化結構域和花冠結構域來進一步修飾，即修飾獲得自不同磷酸酶的所述花冠結構域和催化結構域。在另一個實施方案中，在催化殘基附近和/或在包含金屬離子配位的磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶也可以通過催化和花冠結構域的結構域交換來進一步修飾，即修飾獲得自不同磷酸酶的所述花冠結構域和催化結構域。此外，在又一個實施方案中，本發明提供了在催化殘基附近和/或在金屬離子配位磷酸根結合的穴中包含突變的分離或重組的磷酸酶。實現任一所述(遺傳)修飾的磷酸酶的分子生物學技術為技術人員所熟知，且包括如限制性酶孵育、連接、PCR、突變引入等技術。在另一個實施方案中，本發明提供了編碼如本文所述磷酸酶的核酸序列，例如，編碼結構域交換突變體的核酸序列、或編碼分泌性磷酸酶的核酸、或編碼分泌性結構域交換突變體的核酸序列等。本發明還提供了包含編碼如本文所述磷酸酶的核酸序列的載體。此載體優選地包含其它核酸序列，如對編碼磷酸酶的核酸序列轉錄/翻譯所必需的元件(如啟動子和/或終止子序列)。所述載體也可以包含編碼選擇標記(如抗生素)的核酸序列，以選擇或保持所述載體轉化的宿主細胞。適合的載體的實例是克隆或表達載體。根據本發明，可以使用適用于調節適合宿主細胞中表達的任何載體，該載體在宿主細胞中或整合或游離地復制。該載體可以為質粒、病毒(包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、桿狀病毒)、粘粒、噬菌體或噬菌粒、游離型載體或人工染色體。此外，本發明還提供了包含所述的核酸序列或載體的宿主細胞。細胞可以是適用于產生重組蛋白質的真核細胞，優選哺乳動物細胞、植物細胞或酵母細胞。適合的酵母宿主細月包包括釀酒酵母(Sacc/zwomyc^cwev^/ae)和巴斯德畢赤酵母(P/c/7/a/os/oz^)。優選的宿主細胞為源自哺乳動物(或更優選人)的細胞，如BHK、HEK293、CHO或PerC6。編碼如本文所述的磷酸酶的核酸序列，或包含所述核酸序列的載體，或包含所述核酸序列或包含含有所述核酸序列載體的宿主細胞在制備修飾的磷酸酶中非常有用。磷酸酶包含糖基化位點，因此該磷酸酶優選在提供所希望糖基化模式的細胞中制備。在優選的實施方案中，所用的制備體系為哺乳動物(例如人)體外制備平臺，且更優選地該制備包括大規模制備。在另一個優選的實施方案中，所用的制備體系為引入人工人樣糖基化模式的植物、或酵母或哺乳動物(優選非人類)平臺。通過測試不同制備方法，本發明的發明人意外地測得在制備野生型或突變(堿性)磷酸酶期間，Zn"離子的存在可以影響所制備磷酸酶的比活性。例如，通過向所用宿主細胞的生長培養基中添加Zn2+,ALPI的比活性可以從30U/mg增至750U/mg。常用于培養宿主細胞的培養基包含0.5-3nMZn2+。通過添加上至lmM的Zn2+,其比活性顯著地改進。因此推斷出ALPI是Zn^依賴性磷酸酶。這與已描述的催化ALPI/花冠ALPP突變體相反，該催化ALPI/花冠ALPP突變體似乎為Zn"不依賴性的，即在宿主細胞培養期間缺少Zi^+不會顯著地影響所制備磷酸酶的比活性，且在存儲和反應期間缺少Zn"也不會降低比活性。在另一個實施方案中，本發明提供了制備磷酸酶的方法，包括在包含Zr^+的培養基中培養能夠表達所述磷酸酶的宿主細胞，并使該細胞產生所述磷酸酶。在優選的實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，且在另一個優選的實施方案中，所述磷酸酶是人磷酸酶。在另一個優選的實施方案中，所述磷酸酶是堿性磷酸酶。本發明的方法可以用于制備野生型(或天然或非遺傳修飾的)磷酸酶，且也同樣可以很好地用于制備遺傳修飾的磷酸酶，例如任一本文所述的磷酸酶。在其它優選的實施方案中，本發明提供了制備磷酸酶的方法，包括在包含Zl^+的培養基中培養能夠表達所述磷酸酶的宿主細胞，并使該細胞產生所述磷酸酶，所述方法還包括分離所述磷酸酶。本發明還提供了可通過制備磷酸酶的方法獲得的磷酸酶，所述方法包括在包含Zr^+的培養基中培養能夠表達所述磷酸酶的宿主細胞，且使該細胞產生所述磷酸酶。無論是否本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶具有某種比活性，通過使用可商購的底物并在堿性磷酸酶孵育后用可商購的試劑盒測定無機磷酸根釋放，技術人員可以很容易地測試某種底物特異性或某種穩定性(如pH、溫度、體內半衰期)。此外，也可以使用本文實驗部分所述的測試來測定是否修飾的磷酸酶具有其它生物學相關活性。如上所述，本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶在診斷和治療中很有用。在一個實施方案中，本發明提供了包含修飾的磷酸酶的藥物組合物，例如-包含花冠結構域和催化結構域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶，或.-在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶，或-在催化殘基附近包含突變的分離或重組的磷酸酶，或-其任意的組合。所述藥物組合物任選地包含可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可以以任何形式存在，例如片劑、可注射的流體或輸液流體等。此外，上述(遺傳)修飾的磷酸酶可以通過不同途徑如經靜脈、經直腸、經支氣管或經口服來給藥。另一個適合的給藥途徑是使用十二指腸滴劑。在優選的實施方案中，所用的給藥途徑是經靜脈給藥。技術人員清楚優選地遞送有效量的(遺傳)修飾的石粦酸酶。初始點時可以卩吏用l-5000U/kg/天。如果使用經靜脈給藥途徑，(遺傳)修飾的磷酸酶(至少在一段時間上)優選通過連續輸液來施用。組合物可以任選地包含可藥用的賦形劑、穩定劑、活化劑、載體、滲透劑、推進劑、消毒劑、稀釋劑和防腐劑。適合的賦形劑是藥物制劑領域所公知的，且技術人員4艮容易發現并使用，參見如Remmington'sPharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,PhiladelphiaPA，17thed.1985。對于口服給藥，可分泌的AP可以例如以固體劑型給藥，例如月交嚢、片劑(優選具有腸包衣)和散劑，或以液體劑型給藥，例如酏劑、糖漿和混懸劑。AP可以與非活性成分和粉末化載體(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等)一起被裝入明膠膠嚢中。可以加入以提供所需的顏色、味道、穩定性、緩沖能力、分散或其它已知所需特征的其它非活性成分的實例為鐵紅、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、食用白墨水等。可以使用類似的稀釋劑來制備壓縮的片劑。片劑和膠嚢均可被制成使藥物在數小時內連續釋放的緩釋產品。壓縮的片劑可以是糖包衣或膜包衣的，以掩蓋任何不希望的味道并保護片劑免受大氣影響，或可以是腸包衣的，以用于在胃腸道內選擇性崩解。口服給藥的液體劑型可以包含調色劑和調味劑以增加患者的接受度。在優選的實施方案中，包含(遺傳)修飾的磷酸酶來源的組合物適用于口服給藥，且包含為保護AP免受胃液和低pH不良影響的腸包衣。腸包衣和控釋制劑是本領域公知的。本領域的腸包衣組合物可以包含與活性成分如(遺傳)修飾的磷酸酶和其它賦形劑混合的水溶性腸包衣聚合物的溶液，其分散在水溶液中且可以隨后被干燥和/或制成小球。形成的腸包衣使(遺傳)修飾的磷酸酶在存儲時可以抵抗大氣濕度和氧氣的侵襲，且在攝入時可以抵抗胃液和低pH的侵襲，而在下腸道內的堿性條件下易于分解。上述藥物組合物在如敗血癥，炎性腸疾病或其它炎性疾病，和/或腎衰竭的治療中非常有用。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了如本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶，其用作藥物，優選用于治療敗血癥、炎性腸疾病、腎衰竭和炎癥，所述炎癥優選自由類風濕性關節炎、哞喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表10所列疾病組成的組中。在另一個實施方案中，本發明提供了如本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶在制備用于治療敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、和/或腎衰竭的藥物中的用途。如果高度懷疑或證實存在感染，且滿足以下全身炎癥反應綜合征(SIRS)的兩個或多個標準，則考慮為敗血癥心率大于卯次搏動/分鐘；體溫小于36。C(96.8°F)或大于38。C(100.4°F);換氣過度(高呼吸速率)，大于20次呼吸/分鐘，或血氣、PaC02小于32mmHg;白細胞計數小于4000細胞/mm3,或大于12000細胞/mm3(小于4x109或大于12x10"曰胞/L),或大于10%帶型(未成熟白細胞)。然而，公認的定義隨著敗血癥的征兆和癥狀最新列表的不斷擴展而發展，以反映臨床經驗。更危急的敗血癥亞類是嚴重敗血癥(具有急性器官障礙的敗血癥)和感染性休克(具有難治愈動脈低血壓的敗血癥)。或者，當滿足兩個或多個全身炎癥反應綜合征標準而沒有感染跡象時，患者可以簡單地被診斷為"SIRS"。可以將具有SIRS和急性器官障礙的患者稱為"嚴重SIRS"。如果患者具有敗血癥以及全身灌注不足的征兆(或末端器官障礙或血清乳酸大于4mmol/dL)，則將其定義為具有"嚴重敗血癥"。在適當的流體推注(通常20ml/kg的crystaloid)后，如果患者患有敗血癥以及低血壓，則將其定義為具有"感染性休克"。本發明提出根據本發明的(遺傳)修飾的磷酸酶特別適用于敗血癥的治療。在敗血癥的情況中，如本文所述的修飾的磷酸酶優選經由靜脈給藥。炎性腸疾病(IBD)是大腸和小腸(在某些情況下)的炎性病癥的集合。IBD的主要類型是克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎(UC)。占較少情況的是IBD的其它類型膠原性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、Behcet綜合癥、感染性結腸炎、未確定的結腸炎。克羅恩氏病和UC的主要區別在于炎性變化在腸中的位置和性質。盡管大多數情況是出現在末端21回腸，但克羅恩氏病可以影響從口到肛門的任何胃腸道部分。相反地，潰瘍性結腸炎局限于結腸和肛門。在顯微鏡下，潰瘍性結腸炎局限于粘膜(腸的上皮內壁)，而克羅恩氏病影響整個腸壁。最終，克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎表現為不同程度上的腸以外的癥狀(如肝問題、關節炎、皮膚癥狀和眼問題)。在很少的情況中，將患者診斷為同時患有克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎，盡管不確定是否為組合或簡單地無法確定為其中的一種或另一種。雖然是完全不同的疾病，二者均可以表現出任何以下的癥狀腹痛、嘔吐、腹瀉、便血、失重和各種相關的病癥或疾病(關節炎、壞疽性膿皮病、原發硬化性膽管炎)。診斷通常通過結腸鏡檢查以及病理損傷的活組織;險查進行。在IBD的情況中，如本文所迷的(遺傳)修飾的磷酸酶優選經由腸包衣片或經由十二指腸滴劑給藥。除了這些炎性腸疾病，本發明提出根據本發明的磷酸酶適用于治療其它炎性疾病。炎性疾病可以影響不同器官，如肺、關節、肝、胰腺、皮膚，或甚至是神經組織。表10給出了可能受炎性影響器官的非限定性列表。多種致病因子顯示出引起或維持此炎性疾病。所述致病因子的非限定性實例為微生物(細菌、真菌、病毒)、過敏原、自免疫、外傷和缺血/再灌注。雖然致病因子和病因可以是多種多樣，但是(亞)慢性炎癥由紊亂的免疫反應所引起。通常認為此紊亂的免疫反應通過惡性循環而持續，其包括可進而活化免疫系統的炎癥誘導的組織損傷。其中，ATP顯示出在上述惡性循環中起作用。本發明提出如本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶能夠使ATP去磷酸化，并因此打斷所述的惡性循環，這有利于患有所述炎性疾病的個體。當治療此炎性疾病時，根據本發明的(遺傳)修飾的磷酸酶優選經由靜脈給藥，或如果可行經由局部給藥，例如在類風濕性關節炎的情況中經由關節內給藥、在(中樞)神經系統發炎的情況中經由鞘內給藥、在(變應性)哮喘的情況中經由支氣管內給藥或在如神經性皮炎的情況中經由局部給藥。此外，已描述(亞)慢性炎性反應如敗血癥、克羅恩氏病、類風濕性關節炎等可伴隨有(血清)鋅缺乏。根據本發明的磷酸酶特別適用于治療所述炎性疾病，其中所述磷酸酶處在鋅缺乏的環境中時未喪失其酶活性。本發明提出根據本發明的磷酸酶可在低至0.01|iM的亞生理Zr^+濃度下保持其活性，其中所述磷酸酶包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域。因此，在一個實施方案中，本發明提供了包含ALPI催化結構域和ALPP花冠結構域的磷酸酶在包含Zr^+濃度小于lO)iM(優選Zn"濃度小于lpM、更優選Zn"濃度小于O.lpM)的環境中在底物(優選腺苷磷酸)去磷酸化中的用途。急性腎衰竭(ARF)是指導致血清肌酸酐水平升高的急性腎功能損失。在急性腎衰竭中，腎小球濾過率在數天至數周內下降。因此，造成含氮廢物的排泄降低，且不能維持體液和電解質平衡。患有急性腎衰竭的患者通常沒有癥狀，而所述病癥是通過所觀察到的血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平的上升來診斷的。當血清肌酸酐水平每天增加至少0.5mg/dL,且每天的尿排出小于400mL(少尿癥)時，則出現完全的腎機能停止。本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶不但可以用于治療腎衰竭，而且可以改進腎功能，特別是在腎功能是至少部分損害/降低的情況下。在優選的實施方案中，所用的給藥途徑是經靜脈。技術人員清楚優選地遞送有效量的(遺傳)修飾的磷酸酶。初始時可以使用l-5000U/kg/天。如果使用經靜脈給藥途徑，(遺傳)修飾的磷酸酶(至少在一段時間上)優選通過連續輸液來施用。在另一個實施方案中，本發明提供了用于治療患有敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、和/或腎衰竭患者的方法，包括向所述受試者給予有效量的任一本文所述的修飾的磷酸酶。除了可以將如本文所述的(遺傳)修飾的磷酸酶并入藥物組合物，此磷酸酶也可以是營養組合物的一部分。在本發明優選的實施方案中，(遺傳)修飾的磷酸酶的來源是優選從奶(優選牛奶)中制備或分離的(遺傳)修飾的磷酸酶。奶可以獲得自經飼養或經遺傳修飾的動物，以在其奶中制備相比于野生型動物奶中更高水平的(遺傳)修飾的磷酸酶。從奶中制備富含(遺傳)修飾的磷酸酶的部分是本領域已知的。例如，富含于或源自于乳脂球膜的部分是優選的富含(遺傳)修飾的磷酸酶的奶部分，且通常可以通過原奶的常規脫脂獲得。可以將從奶中分離的(遺傳)修飾的磷酸酶配制在藥物組合物和食品組合物或營養食品中。在優選的實施方案中，根據本發明的用于(遺傳)修飾的磷酸酶經口服給藥至胃腸道粘膜的包含(遺傳)修飾的磷酸酶組合物是富含(遺傳)修飾的磷酸酶的食品或營養食品。在一個實施方案中，食品可以是植物、水果或蔬菜，其任選地經過遺傳修飾以包含更高水平的(遺傳)修飾的磷酸酶。在另一個實施方案中，包含(遺傳)修飾的磷酸酶的食品或營養食品是乳制品。在包含未經巴斯德滅菌的奶或其部分(優選牛奶)的特定制劑和組合物中，包含高水平的(遺傳)修飾的磷酸酶，且特別適于作為根據本發明的(遺傳)修飾的磷酸酶的來源用于口服給藥。本發明還涉及富含(遺傳)修飾的磷酸酶的乳制品的制備方法，優選奶、奶部分或奶產品的制備方法。該方法包括分餾原奶(優選牛奶)、巴斯德滅菌不包含或不富含(遺傳)修飾的磷酸酶的部分，和將該巴斯德滅菌后的部分與包含富含未經巴斯德滅菌的(遺傳)修飾的磷酸酶部分的所述部分再配制，以獲得不易腐敗且富含(遺傳)修飾的磷酸酶的乳制品。富含未經巴斯德滅菌的(遺傳)修飾的磷酸酶部分可以通過其它方法滅菌，例如《旦不限于UV射線、X射線或y射線輻射、過濾、壓力、滲透壓、化學品或抗生素，確保(遺傳)修飾的磷酸酶保持充分的活性，且奶部分變得基本上無菌。此奶制品可以用在組合物中，或直接給藥至患有或有發展為敗血癥、IBD或腎衰竭風險的受試者中。然而，也可以將富含(遺傳)修飾的磷酸酶的乳制品作為用于保持腸結構整體性的藥品或營養食品提供給健康受試者。此外，本發明的修飾的磷酸酶也可以被添加到營養品(例如奶)中以代替在所述營養品中進行制備。此外，可以制備隨后加入到營養品中或直接被人類應用的片劑和/或膠嚢。24本發明將在以下非限定性實施例中做更詳盡解釋。具體實施例方式實驗部分才才沖+和方法實施例1不同磷酸酶對生物學活性底物ATP的去磷酸化獲得自PerkinElmer的ATPliteTM試劑盒，其包含以下試劑哺乳動物裂解溶液、底物緩沖液、凍干的底物溶液和凍干的ATP標準品。凍干ATP標準品的制備用MiliQ配制一'J、瓶凍干的ATP標準品溶液，以獲得10mM儲備液。在加入MiliQ之后，渦旋1分鐘以使ATP完全溶解。ATP去磷酸化活性的測定-制備ATP起始濃度為20pM的6條標準曲線，并進行一系列的稀釋。每孔的終體積應為100(^1。-制備酶活性為1U/ml的磷酸酶。制備起始濃度為1U/ml的3條標準曲線，并進行一系列的稀釋。終體積應為50|il。-制備40^1^1ATP溶液。-在96孔黑色OptiplateTM(PerkinElmer)中一起加入50(il的1U/ml磷酸酶溶液標準曲線和50jil的40|iMATP溶液。每孔的終體積為lOO(il。-振蕩平板并37。C下孵育90分鐘。-使試劑在室溫下平衡。-根據制造商的建議，通過加入適量的底物溶液緩沖劑配制一小瓶凍干的底物溶液。輕輕搖晃至溶液均勻。-加入50|_il的哺乳動物細胞裂解溶液，并在700rpm下將平板4展搖5分鐘。-向孔中加入50^1的底物溶液，并在700rpm下將平才反振搖5分鐘。-向平板噴灑70%的乙醇以去除氣泡。-將平板置于黑暗處10分鐘，并在Viktor3TMMultiLabelReader(PerkinElmer)上測定發光。實施例2使用不同同種型的堿性磷酸酶進行的肝切片檢測用02/>^20/異氟烷麻醉后將大鼠處死，將肝取出并儲存在威斯康星大學器官保藏溶液(UW)中直至進行切片。取肝組織片的核心部分(直徑5mm),并儲存在冰冷卻的UW溶液中直至進行切片。用Kmmdieck切片機進行切片。使用添加有終濃度為25mM葡萄糖的冰冷卻的KHB作為切片緩沖劑。使用標準的設置(循環速度30;中斷模式)制備大鼠肝切片(厚度200-250|im;濕重士3mg)。在切片后，將大鼠肝切片儲存在UW溶液中直至實驗開始。在37。C下，用添加有GlutamaxI(GibcoBRL，Paisly，蘇格蘭)、50mg/ml慶大霉素(GibcoBRL)的1.3mlWilliams培養基E對12孔板(Greiner,Alphena/dRijn,荷蘭)中的切片單獨孵育，并用95%02/5%(302飽和。將切片用或不用10嗎/mlLPS和用或不用不同濃度的不同AP同種型孵育24小時。將切片的培養基儲存在-80。C直至NOx測定。通過向110(!l上清液中加入5(al的0.275^1100mMNADPH、2.2(al10U/ml硝酸鹽還原酶和0.055(il10mMFAD的混合物(該混合物用水稀釋2倍)來測定NOx(NO、N02和N03的總和)。在37。C孵育30分鐘后，加入5^1第二混合物(2.2)il0.5M丙酮酸鈉和0.55^15mg/mlLDH,在水中以1:0.82稀釋)。在37。C孵育5分鐘后，加入5|il30%ZnS04，并將樣品在2000rpm下離心。隨后將100pl上清液轉移至新平板，并與包含0.1%磺胺、0.01%正萘基乙二胺和2.5%磷酸的lOO(ilGriess試劑混合。最終，在微板讀數器上在550nm處測定吸光度。將該吸光度與硝酸鈉標準曲線的吸光度相關聯。實施例3細胞外ATP去磷酸化的生物學作用鼠巨噬細胞系RAW264.7和人上皮細胞系T84(結腸直腸癌)獲得自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Rockville,MD,USA),并分別保存在DMEM/F12(l:l)和包含4.5g/1葡萄糖的DMEM培養基中。兩種培養基獲得自InvitrogenCorp.(Breda,荷蘭)，包含GlutamaxI,并添加有10%熱滅活的FBS(WisentInc.,Quebec,加拿大)、100U/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素(均來自InvitrogenCorp.)。在長至匯合時使用胰蛋白酶-EDTA傳代培養T84細胞系，并使用橡膠棒刮下RAW264.7細胞。將4xio5T84細胞鋪在含有2ml培養基的12孔板(Nunc,Roskilde，丹麥)中。在達到匯合時，更換培養基，且如圖(柱狀分布圖)所示，將細胞在存在或不存在不同濃度ATP和/或AP下用l嗎/mlLPS(圖3)或不用lpg/mlLPS(圖2)孵育2小時。在2小時后，收集上清液，并轉移至包含RAW264.7細胞的24孔板中。在之前一天將這些RAW264.7細胞以每毫升培養基2x105的密度鋪在24孔板(Nunc,Roskilde,丹麥)中。在轉移lml的T84細胞上清液之前，將RAW的上清液吸出并棄掉。在收集上清液并用商購的ELISA(BiosourceEuropeSE,Nivelles，比利時)^r測細胞因子(IL-6、TNFa)含量前，在37。C和5。/oC02下將RAW細胞與T84上清液孵育24小時。實施例4突變體的制備使用標準的分子生物學技術制備如本文所述的突變體和，更具體地，如表4、5和6所述的突變體。表4-6中所述的氨基酸位置與圖l所示的序列相對應。僅說明了突變的位置，即僅給出了與野生型序列的差異。例如，表4的突變體1，如果與給出的野生型序列相比，在位置87、93和429上未改變，即位置87為K,位置93為G,且位置429為E。使用標準的分子生物學技術，如PCR定點誘變、限制性酶分析和序列分析制備和檢驗突變體。實施例5在t=0時，用含有不同濃度Zn"的稀釋緩沖劑(0.025M甘氨酸/NaOHpH9.6/lmMMgCl2/l。/o甘露醇/0.050/()BSA)將包含450士50單位的不同重組堿性磷酸酶稀釋4000倍。在第二實施例中，在緩沖劑中省略作為可能Zr^+來源的BSA。在稀釋后l分鐘內(T=0),取樣，并使用下述pNPP檢測測定堿性磷酸酶活性。卯分鐘(丁=172小時)、180分鐘(T=3小時)和22小時(T=22小時)后，在各個時間點取樣，并使用下述pNPP檢測直接測定石成性磷酸酶活性。通過由之前使用商購BCA試劑盒(Pierce)獲得的蛋白質含量除所得結果(U/ml)而產生的比活性(U/mg)來反向計算出活性(U/ml)。;A^P磷酸酶活性測定工作底物將試劑、底物、樣品和孵育室的溫度設為25。C。將分光光度計設為405nm波長和lcm光程。將50|il測試物和1450^1工作底物移入一次性比色皿中，混合并立即將試管置于分光光度計中，在3分鐘內記錄405nm吸光度的增加。每體積的活性使用以下公式計算活性(U/ml)^AE405/分鐘x1.6x稀釋因子注意測量范圍應在0.04和0.4U/ml之間。實施例6pH對不同磷酸酶穩定性的影響研究了HEK293細胞中瞬時表達的堿性磷酸酶的pH穩定性。在25。C下，使用已調節其特定pH的5種不同的O.IM緩沖劑(乙酸鈉、MES(2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)、Tris(2-氨基-2-羥曱基-丙烷-l,3-二醇)和甘氨酸)，測試4.0-9.0的pH范圍。將1%甘露醇穩定的BiAP用作參照。將堿性磷酸酶溶液在各個緩沖劑中稀釋至約100U/ml,在室溫下儲存24小時，并使用上述/7V/lP磷酸酶活性檢測測定酶活性。實施例7鋅對不同磷酸酶表達的影響在添加有lmMMgCl2+0.1mM鋅鹽(ZnCl2、或ZnS04、或ZnAc2)的培養基中使用小規模轉染研究不同鋅鹽對HEK293細胞中瞬時表達的堿性磷酸酶的活性的影響。使用shIAP、shPLAP、Xinplap(催化ALPI/花冠ALPP)和sALPP-ALPI-CD(催化ALPP/花冠ALPI)轉染HEK293細胞，且在t=144小時，取樣，并使用上述pA/P尸磷酸酶活性;險測分析酶活性。實施例8鋅對不同磷酸酶穩定性的影響在存在或不存在100|iMZnCl2下，制備包含約20U/ml不同(重組)的堿性磷酸酶同種型的溶液以用于溫度穩定性測試。將樣品在室溫、37。C和56。C下儲存，并使用上述piV尸尸磷酸酶活性檢測分析在t=0、2小時和24小時測定酶活性(pA^RP)。實施例9堿性磷酸酶融合蛋白和突變體的生成為了選擇適合的表達系統，將編碼成熟蛋白，具有或不具有GPI錨定物序列的人腸(hIAP)和人胎盤(hPLAP)cDNA克隆到一些載體中。在小頭見模感染后，所用的表達載體是由CMV驅動的，包含半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)信號序列，且具有便于純化的N-末端HIS標記。在成功表達可分泌的hIAP和hPLAP后，在silico中構建兩種融合的人可分泌的堿性磷酸酶，一種基于包含胎盤花冠結構域(成熟序列的氨基酸360-430)的腸AP29的骨架，第二種基于包含腸AP花冠結構域的胎盤AP的骨架(第一種稱為RecAP或催化ALPI/花冠ALPP,第二種稱為shPLAP-shIAP-CD或催化ALPP/花冠ALPI)。合成包含人半胱氨酸蛋白酶抑制劑信號序列的兩個基因，并將其克隆到包含CMV啟動子的表達載體中。實施例10GPI錨定物對磷酸酶比活性的影響制備一些AP的重組形式，將它們純化，并使用上述；A^P磷酸酶活性牙全測評價酶活性。此外，使用SDS-PAGE和GelEval軟件測定樣品中蛋白質含量。用活性(U/ml)除以蛋白質濃度(mg/ml)來計算比活性，并用U/mg表示。實驗部分結果實施例1通過不同磷酸酶對生物學活性底物ATP的去磷酸化用不同濃度的BIAP、sALPP、sALPI或嵌合催化ALPI/花冠ALPP孵育終濃度為20pM的ATP。從表9可明顯看出，pNPP化學活性與其針對生物學底物如ATP的活性并非1:1的關系。然而，在37。C下在90分鐘后，濃度分別為0.031和0.004pNPP單位的BIAP和sALPI顯示出大于50%的ATP去磷酸化，而ALPP和催化ALPI/花冠ALPP則分別在0.125和0.0625pNPP單位的濃度下才能完成此量的去磷酸。實施例2使用堿性磷酸酶不同同種型的肝切片檢測通過LPS(10pg/ml)刺激使肝切片產生NOx。圖6顯示了在存在不同濃度的不同重組人堿性磷酸酶(sALPI、sALPP、GPI錨定的ALPI、催化ALPI/花冠ALPP)時，NOx的產生被顯著地抑制。在此實驗中，將牛源的ALPI用作陽性對照，并將溶劑作為陰性對照。未添加LPS,肝切片產生的NOx小于10jiM，且在孵育期間不因為存在不同磷酸酶而顯著改變(數據未顯示)。由此可以得出，全部測試的重組的人堿性磷酸酶同種型，無論GPI錨定物是否存在，具有針對涉及LPS誘導的NOx產生的生物學底物的活性。實施例3細胞外ATP去磷酸化的生物學作用與T84上清液一起孵育時RAW264.7細胞的IL-6生產依賴于LPS。沒有LPS(圖2)，產生低水平的IL-6。ATP以及AP不能改變RAW264.7細胞產生的IL-6水平。相反，當LPS存在時，與T84上清液一起孵育的RAW264.7產生的IL-6隨著ATP濃度的增加而增加。這種通過ATP來增加細胞因子的產生可以完全被0.1U/ml或更高的AP濃度所降低(圖3)。4吏用相同的方法對于TNFa,以及使用HT29替代T84作為上皮細胞來源對于TNFa和IL-6,可以獲得類似的結果(未顯示)。可以推斷AP使ATP去磷酸化，并因此降低其LPS增強作用。不可能的是AP使LPS去磷酸化，因為未觀察到AP對LPS的作用。ATP和LPS的組合僅能被AP減少至與僅有LPS相同的水平。實施例5不同磷酸酶的Zn"依賴性的測定如圖4和表7中所示，Zn"顯著地穩定sALPI的比活性，然而sALPP和嵌合體催化ALPI/花冠ALPP保持其初始比活性，該活性不依賴培養基中Zn"的存在。在此實驗中，通常用在pNPP磷酸酶活性檢測中的BSA可以作為微量Zn"的來源。因此，進行第二實驗。表8和圖5顯示在沒有BSA和存在消耗Zn"的螯合劑EDTA下，在22小時后全部同種型喪失其比活性。然而，在儲存和反應期間加入生理濃度(0.5-10nM)的Zn2+使sALPP和催化ALPI/花冠ALPP保持大于60%(個別75%)的初始比活性，然而sALPI的大于95%的初始比活性喪失。非生理學的高濃度Zn"是保持sALPI比活性所必須的。因此可以推斷嵌合體催化ALPI/花冠ALPP顯示與sALPI相當的高比活性，以及與sALPP相當的Zn"不依賴的比活性。可以推斷Zn"依賴性位于sALPI花冠結構域中，然而高比活性位于sALPI催化結構域中。實施例6pH對不同磷酸酶穩定性的影響將BiAP、shIAP、shPLAP、RecAP稀釋，并在室溫下在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的0.1M緩沖劑(乙酸鈉、MES(2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)、Tris(2_氨基-2-羥曱基-丙烷-l,3-二醇)和甘氨酸)中存儲24小時。對于每個pH值，根據標準的pNPP檢測測定初始酶活性和儲存后的酶活性。正如其名稱所預期和表明的一樣，堿性磷酸酶活性在高pH范圍內(堿性環境)為最佳。然而，如圖7所示，胎盤型比腸同種型更穩定。此外，這些結果表明，此穩定性，特別是在高pH范圍中，由花冠結構域而非由催化結構域所決定，因為催化ALPI/花冠ALPP(recAP)符合shPLAP的穩定性分布，在pH5-9之間穩定，然而BIAP和shIAP的穩定性局限于pH7-8。相反，在pH9時，催化ALPP/花冠ALPI(shPLAP-hIAP-CD)不如胎盤類型的AP和催化ALPI/花冠ALPP穩定。這表明催化ALPI/花冠ALPP比天然AP或測試的反向嵌合體(催化ALPP/花冠ALPI)在更寬的pH值范圍內保持其活性。實施例7鋅對不同磷酸酶表達的影響在HEK293細胞中使用小規模轉染，研究不同鋅鹽對瞬時表達的堿性磷酸酶的活性的影響。為此，將shIAP、shPLAP、Xinplap(催化ALPI/花冠ALPP)和sALPP-ALPI-CD(催化ALPP/花冠ALPI)轉染，且在t=144小時取樣并分析酶活性。所獲得的結果顯示對于酶活性存在對Zr^+離子的濃度依賴性，但是所觀察到的活性增加不依賴于所用鋅鹽的類型。從圖8所示的結果可以推斷出所獲得的酶活性依賴于鋅，但是其不依賴于所用鋅鹽的種類。此外，加入鋅對具有大于30的酶活性誘導因子的shIAP的產生最有利。對于sALPP和Xinplap，活性增加分別小于2和大于4。在缺乏鋅時反向嵌合體(sALPP-ALPI-CD，也稱作催化ALPP/花冠ALPI)顯示出可忽略的(如果有)活性，而在存在鋅時其所荻得的活性與sALPP相當。此外，在未添加Zn/Mg時，Xinplap顯示出比任何其它測試的AP更高的酶活性(因子5),且與shIAP或反向嵌合體催化ALPP/花冠ALPI相比對Zn/Mg的依賴性更j氐。實施例8鋅對不同磷酸酶穩定性的影響圖9顯示了在不同溫度的時間下且存在或不存在100jiMZnCl2時，不同AP的穩定性分布。從這些結果可以推斷，在缺少鋅時，堿性磷酸酶的腸同種型(sALPI和BIAP)在酶活性方面是高度溫度敏感的。在37°C,BIAP在2小時內喪失了其20%的活性，且在24小時后僅保留有20%的酶活性。shIAP顯示在37。C儲存24小時后活性降低30%。圖9C顯示在37。C穩定性測試期間鋅的存在保護酶免受降解。然而，在56。C,鋅不再保護腸同種型，且二者在最初2小時內幾乎完全喪失其酶活性。相反，在存在或不存在lOO)iMZnCl2時，RecAP(催化ALPI/花冠ALPP)和shPLAP(sALPP)在甚至56。C直至22小時顯示出優秀的穩定性。實施例9堿性磷酸酶融合蛋白和突變體的生成可分泌的hIAP和可分泌的hPLAP通過使用CMV啟動子驅動的，包含半胱氨酸蛋白酶抑制劑信號序列的載體在HEK293中表達，且其在蛋白質的N-末端部分包含HIS標記。表達的蛋白通過HIS標記純化并通過SDS-PAGE分析(參見圖10)。用于可分泌的hIAP和hPLAP的1升懸浮培養物產生的蛋白質分別為38mg和16mg,且顯示出大于95%的純度。hIAP和hPLAP的比活性分別為21U/mg和1OOU/mg。基于這兩種可分泌的重組磷酸酶，在silico中設計兩種結構域交換突變體，并在HEK293細胞中表達。對于RecAP獲得了值得注意的結果，所述RecAP由腸堿性磷酸酶骨架以及胎盤堿性磷酸酶的花冠結構域組成。在常規培養條件下，RecAP顯示出比可分泌的hIAP高5倍的酶活性(14U/ml對2.7U/ml)。然而，在細胞培養和磷酸酶表達期間加入上至lOO(aM的鋅鹽對RecAP的酶活性僅有很小的作用(18.8U/ml對未添加鋅時的14細ml)，然而其顯著地改進了可分泌的MAP的活性(37.9U/ml對未添加鋅時的2.7U/ml)。另一方面，基于胎盤AP骨架以及腸AP花冠結構域的結構域交換突變體(催化ALPP/花冠ALPI)顯示出與腸形式相當的鋅依賴性，和與可分泌的PLAP相當的最大活性。如果在表達和純化后向酶中加入鋅，則觀察到的shIAP和催化ALPP/花冠ALPI的活性的增加無法實現。因此可以推斷在堿性磷酸酶(優選包含腸形式的花冠結構域的那些石威性磷酸酶)表達期間加入100|iM鋅導致產生更高的堿性磷酸酶活性。實施例10GPI錨定物對磷酸酶比活性的影響制備一些AP的重組形式并評價酶活性。圖11中所示的結果表明牛腸堿性磷酸酶(BIAP)和recAP(催化ALPI/花冠ALPP)顯示出類似的比活性，該比活性優于可分泌的hIAP、可分泌的hPLAP和GPI錨定的hIAP的比活性。酶的純度對特定酶活性很重要。應該注意在實驗室條件下純化四種人酶，而BIAP作為超純GMP批次獲得。還應注意到可分泌的MAP具有比GPI錨定的hIAP約高2倍的比活性。不受理論束縛，更高的比活性可以或與結構相關或與純度相關，因為可分泌的AP比GPI錨定的(膜結合的)AP更易于純化。表格表l:t=144小時后堿性磷酸酶在HEK293中的表達水平，和用O.lmMZnCl2過夜孵育后對活性的影響構建體單位/ml用O.lmMZnCl2過夜孵育后，單位/mlsALPPN-his標記3.343.55sALPPC-his標記3.753.97sALPIN-his標記1.551.92sALPIC-his標記7.528.07天然sALPI2.844.94表2:t=144小時后堿性磷酸酶在HEK293中的表達水平，和培養基中不同ZnCl2和/或MgCl2濃度對活性的影響單位/ml的酶活性構建體未添力口0.05mMZn2+O.lmMZn2+lmMZn2+5mMZn2+O.lmMZn2+/lmMMg2+sALPI2.255.856.66.45.961.3sALPP6.88.78.96.15.47.7表3:t=96小時后嵌合堿性磷酸酶在HEK293中的表達水平，和培養基中ZnCb對活性的影響單位/ml的酶活性構建體未添力口O.lmMZn2+/lmMMg2+催化ALPI/花冠ALPP3.722.43表4:具有所述氨基酸變化的ALPP中的突變位點<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表5:具有所述氨基酸變化的ALPI中的突變位點<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表6:在活性位點附近內ALPP和ALPI中的所述雙突變其它突變體突變體31ALPPS322G,R323V突變體32ALPIG322S，V323R表7:sALPI,而非sALPP和嵌合體催化ALPI/花冠ALPP，對于保持其體外比活性是Zn"依賴的。37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>未加入鋅鹽，然而檢測在存在可能是鋅天然來源的白蛋白(0.05%)下進行；參見結果部分。表8:在缺少白蛋白時，sALPI的比活性在生理學(O.OlpM)Zn"濃度下在22小時后降低大于95%,然而在相同條件下，sALPP和嵌合體催化ALPI/花冠ALPP保持大于60%(個別75%)的其初始比活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表9:不同堿性磷酸酶對生物學底物ATP的去磷酸化性質。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表10:炎性疾病和受影響器官的非限定性列表<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>信號序列)，而且除嵌合AP外，這些序列為在添加GPI錨定物和C末端氨基酸的加工之前的序列。圖2:在與T84上清液一起孵育的RAW細胞中，單獨的ATP未充分刺激IL-6的生產。未觀察到添加AP對IL-6產生的影響。圖3:在與T84上清液一起孵育的RAW細胞中，增加ATP濃度增大了LPS誘導的IL-6的產生。堿性磷酸酶抑制ATP的增大作用，而非LPS誘導的IL-6產生本身。圖4:催化ALPI/花冠ALPP的比活性是Zn不依賴的。圖5:ALPI而非催化ALPI/花冠ALPP的比活性隨時間降低。圖6:肝切片產生的LPS誘導的NOx受人堿性磷酸酶的不同可分泌的同種型的抑制。圖7:在不同pH值的0.1M緩沖劑中儲存24小時后，不同可分泌的人重組4^性磷酸酶和牛腸磷酸酶(BIAP)的相對酶活性。圖8:在不同重組堿性磷酸酶產生期間向培養基中加入的不同鋅鹽對酶活性的影響。圖9:存在鋅時，在A:室溫、C:37。C和E:56。C儲存后，或不含鋅時，在B:室溫、D:37。C和F:56。C儲存后，所測定的不同堿性磷酸酶的酶活性的穩定性。圖10:SDS-PAGE:純化的可分泌的hIAP和可分泌的hPLAP的蛋白質圖。泳道1)MW標記，4+5)10和25倍稀釋的可分泌的MAP,12+13)10和25倍稀釋的可分泌的hPLAP。圖11:四種人AP和一種牛AP針對磷酸對硝基苯酯(pNPP)(用于AP活性測定的標準化學底物)的酶比活性。權利要求1、一種分離或重組的堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶包含花冠結構域和催化結構域，其中所述花冠結構域和所述催化結構域獲得自不同的堿性磷酸酶。2、如權利要求1所述的磷酸酶，其中至少一種所述的不同磷酸酶是人磷酸酶。3、如權利要求l或2所述的磷酸酶，其中所述花冠結構域是ALPP花冠結構域，且其中所述催化結構域是ALPI催化結構域。4、如權利要求1或2所述的磷酸酶，其中所述花冠結構域是ALPI花冠結構域，且其中所述催化結構域是ALPP催化結構域。5、一種分離或重組的磷酸酶，所述磷酸酶在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾，其中所述修飾導致分泌性磷酸酶。6、如權利要求5所述的磷酸酶，其中所述修飾包括含有共有GPI信號序列的氨基酸序列的突變或刪除。7、如權利要求5或6所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。8、如權利要求5至7中任一項所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶。9、如權利要求5至8中任一項所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶選自人肝-腎-骨磷酸酶、人腸堿性磷酸酶或人胎盤樣堿性磷酸酶。10、如權利要求5至9中任一項所述的磷酸酶，還包含獲得自不同磷酸酶的花冠結構域和催化結構域。11、一種分離或重組的磷酸酶，所述磷酸酶在催化殘基附近和/或在金屬離子配位磷酸根結合的穴中包含突變。12、如權利要求11所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。13、如權利要求11或12所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶。14、如權利要求11至13中任一項所述的磷酸酶，其中所述突變是如表4、5或6中所示的突變。15、如權利要求11至14中任一項所述的磷酸酶，還包含在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中的修飾，其中所述修飾導致非GPI錨定的磷酸酶。16、如權利要求11至14中任一項所述的磷酸酶，還包含獲得自不同磷酸酶的花冠結構域和催化結構域。17、如權利要求15所述的磷酸酶，還包含獲得自不同磷酸酶的花冠結構域和催化結構域。18、一種編碼如權利要求1至17中任一項所述的磷酸酶的核酸序列。19、一種包含如權利要求18所述的核酸的載體。20、一種包含如權利要求18所述的核酸或如權利要求19所述的載體的宿主細胞。21、一種用于制備磷酸酶的方法，包括在包含Zn"的培養基中培養能夠表達所述磷酸酶的宿主細胞，和使所述細胞產生所述磷酸酶。22、如權利要求21所述的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。23、如權利要求21或22所述的方法，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。24、如權利要求21至23中任一項所述的方法，其中所述磷酸酶是^4性磷酸酶。25、如權利要求21至24中任一項所述的方法，其中所述磷酸酶是權利要求1至17中任一項所述的磷酸酶。26、如權利要求21至25中任一項所述的方法，還包括分離所述磷酸酶。27、一種通過權利要求21至26中任一項所述的方法獲得的磷酸酶。28、一種包含如權利要求1至17或27中任一項所述的磷酸酶的藥物組合物。29、如權利要求1至17或27中任一項所述的磷酸酶在制備用于治療敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、和/或腎衰竭的藥物中的用途。30、一種用于治療患有敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、和/或腎衰竭的受試者(優選人)的方法，包括向所述受試者給予有效量的如權利要求1至17或27中任一項所述的磷酸酶。31、如權利要求3所述的磷酸酶在包含Zn"濃度小于IO^iM,優選Zn"濃度小于l(iM、更優選Zn"濃度小于O.lpM的環境中在底物(優選腺苷磷酸)去磷酸化中的用途。32、一種如權利要求1至17或27中任一項所述的磷酸酶，所述磷酸酶用作藥物，優選用于治療敗血癥、炎性腸疾病和/或其它炎性疾病、和/或腎衰竭的藥物。33、一種如權利要求3所述的磷酸酶，所述磷酸酶用于治療伴有Zr^+缺乏的疾病，優選所述疾病包括炎性疾病，更優選選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣^哽化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表IO所列疾病組成的組中。34、如權利要求3所述的磷酸酶在制備用于治療伴有Zr^+缺乏的疾病的藥物中的用途，所述疾病優選地包括炎性疾病，更優選地選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表10所列疾病組成的組中。35、一種用于治療患有伴有Zi^+缺乏的疾病的受試者(優選人)的方法，包括向有需要的受試者給予有效量的如權利要求3所述的磷酸酶，所述疾病優選包括炎性疾病，更優選地選自由自身免疫性疾病、類風濕性關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病、敗血癥、神經性皮炎和表10所列疾病組成的組中。全文摘要本發明涉及磷酸酶，且更具體地涉及(遺傳)修飾的磷酸酶、包含(遺傳)修飾的磷酸酶的藥物組合物、和(遺傳)修飾的磷酸酶在治療或治愈如敗血癥、炎性腸疾病或其它炎性疾病、或腎衰竭中的用途。本發明還涉及制備磷酸酶的方法。文檔編號A61K38/00GK101688193SQ200880017810公開日2010年3月31日申請日期2008年4月25日優先權日2007年4月27日發明者威蘭姆·拉本,路易吉·約翰內森·科尼利厄斯·瓊克,馬克溫·保羅·韋爾德斯,馬提·貝爾納杜斯·弗朗西斯庫斯·武爾費林克申請人:安-法瑪公司