專利名稱：一種堿性磷酸酶的制取方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別是涉及到一種堿性磷酸酶提取制備的方法。
背景技術：
堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,EC3. I. 3. IAP)是非特異性磷酸單酯酶,可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應，生成無機磷酸和相應的醇、酚、糖等，還可以催化磷酸基團的轉移反應，且大腸桿菌AP還是一種依賴亞磷酸鹽的氫化酶。AP存在于除高等植物外幾乎所有的生物體內，可直接參加磷代謝，在鈣、磷的消化、吸收、分泌及骨化過程中發揮了重要的作用。堿性磷酸酶臨床上主要用于骨骼、肝膽系統疾病的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸 的鑒別診斷。對于不明原因的高ALP血清水平，可測定同工酶以協助明確其器官來源。在動物飼養和疾病診斷方面，AP是反映成骨細胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的重要生化指標。在免疫學研究方面，已廣泛應用AP標記抗體進行酶聯免疫熒光反應(ELISA)和Western印跡分析，即將AP與顯色劑或去磷酸化后能發光的底物相互作用來揭示靶與檢測酶復合物的存在，與過氧化物酶相比，AP用作標記酶的優點是穩定性高、靈敏度高，缺點是成本高、標記困難。在生物化學和分子生物學方面，用AP催化除去DNA分子的5末端磷酸基團以防止載體自連是基因克隆中的常規手段之一。隨著科學的發展、科研手段的進步、對AP認識的不斷深人，將使AP在科研和臨床診斷中發揮更大的作用。在傳統工藝中，動物臟器內堿性磷酸酶的提取需加入大量的酸堿，對環境造成較大的污染，因此本發明按照循環經濟理念，推進工藝的廢物循環，從源頭減少廢物的產生，實現由末端治理向污染預防和生產全過程控制轉變，促進動物臟器等廢棄物制備堿性磷酸酶新型生化試劑研發技術開發，控制和減少污染物排放，提高資源利用效率，為動物廢棄臟器內堿性磷酸酶的產業化推廣提供一定的技術支持。

發明內容
本發明的目的是提出一種堿性磷酸酶的制取方法，依本工藝可以有效減少環境污染，提高產品的產量和純度，降低生產成本。I、發明技術方案—種堿性磷酸酶的制取方法，主要通過如下技術方案實現(I)粗酶液的制備動物屠宰廢棄臟器剪碎，加Tris-HCl緩沖液勻漿，4°C下攪拌后離心，上清液即為堿性磷酸酶粗酶液；⑵酸沉淀 所得粗酶液，用HAc調至pH，攪拌后離心，沉淀溶于TriS-HCl緩沖液中。加正丁醇攪拌后離心，吸取水層對Tris-HCl緩沖液透析并濃縮；(3) (NH4) 2S04 鹽析
用(NH4) 2S04進行分段鹽析，沉淀用TriS-HCl緩沖液，溶解并透析；(4) DEAE-Sephacel 柱層析透析液上樣于DEAE-S印haceI柱，上樣后用NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液透析濃縮備用；(5) ConA-Sepharose 柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱，甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液透析濃縮備用；(6) Sephadex G-200 柱柱層析濃縮液上樣于平衡后的S^hadex G-200柱，同一緩沖液洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮備用； (7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液透析后置_70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品。2、發明技術特點(I)采用現代生物技術以動物屠宰副產物肝臟為原料制備新型典型科研用生化試劑堿性磷酸酶，在增加國內市場新型生化試劑供應量的同時，可提高國內動物屠宰副產物資源的綜合利用價值。(2)采用先進的提取技術，堿性磷酸酶的回收率高于10%，產品比酶活達到402U/mg以上，純化倍數達到1297倍以上。(3)所采用的制備工藝具有周期短、生產設備典型、操作工藝簡單、成本低、效率聞、廣品純度聞等優點，適合廣業化生廣。
四

圖I :動物臟器內堿性磷酸酶制備工藝流程圖
五具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明進一步說明。實施例一(I)粗酶液的制備新鮮豬腎皮質25kg剪碎，加Tris-HCl緩沖液75L (50mmol/L, ρΗ7· 8)，勻漿3min(30sX6)，4°C下攪拌30min,3000Xg離心30min,上清液即為堿性磷酸酶粗酶液。⑵酸沉淀所得粗酶液，用HAc調至ρΗ5· O,攪拌4h, 8000Xg離心30min,沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl緩沖液中。加等體積正丁醇75L，攪拌lh，IOOOXg離心30min,吸取水層對Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并濃縮至1L。(3) (NH4) 2S04 鹽析用飽和度30%的(NH4)2SO4沉淀，攪拌30min，6000Xg離心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,攪拌 30min,6000Xg 離心 30min,沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。
(4) DEAE-Sephacel 柱層析透析液上樣于Tris-HCl 緩沖液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和O. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上樣后用 O O. 2mol/L的NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(lOOmmol/L，pH7. 8，含O. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析濃縮備用。(5) ConA-Sepharose 柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 O. lmol/L甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7. 8，含O. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析濃縮備用。(6) Sephadex G-200 柱柱層析濃縮液上樣于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一緩沖液洗脫,收集 堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮備用。 (7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱(IOcmX IOOcm)，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品，經檢測產品比酶活為412U/mg，堿性磷酸酶的回收率為12%，純化倍數為1302倍。實施例二(I)粗酶液的制備新鮮豬肝臟25kg剪碎，加Tris-HCl緩沖液75L(50mmol/L, ρΗ7· 8)，勻漿3min (30sX6)，4°C下攪拌30min,3000Xg離心30min,上清液即為堿性磷酸酶粗酶液。(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc調至pH5. 5，攪拌3. 5h，8000 X g離心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl緩沖液中。加等體積正丁醇75L，攪拌lh，IOOOXg離心30min,吸取水層對Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并濃縮至1L。(3) (NH4) 2S04 鹽析用飽和度30%的(NH4)2SO4沉淀，攪拌30min，6000Xg離心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,攪拌 30min,6000Xg 離心 30min,沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱層析透析液上樣于Tris-HCl 緩沖液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和0. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上樣后用 O 0. 2mol/L的NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(lOOmmol/L，pH7. 8，含0. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析濃縮備用。(5) ConA-Sepharose 柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 O. lmol/L甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7. 8，含O. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析濃縮備用。(6) Sephadex G-200 柱柱層析
濃縮液上樣于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一緩沖液洗脫,收集堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮備用。(7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品，經檢測產品比酶活為405U/mg，堿性磷酸酶的回收率為11%，純化倍數為1305倍。實施例三(I)粗酶液的制備豬小腸洗凈，取其25kg粘膜剪碎，加Tris-HCl緩沖液75L (50mmol/L，pH7. 8)，勻衆3min(30sX6)，4°C下攪拌30min,3000Xg離心30min,上清液即為堿性磷酸酶粗酶液。 (2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc調至pH5. 0，攪拌3. 5h，8000 X g離心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl緩沖液中。加等體積正丁醇75L，攪拌lh，IOOOXg離心30min,吸取水層對Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并濃縮至1L。(3) (NH4) 2S04 鹽析用飽和度30%的(NH4)2SO4沉淀，攪拌30min，6000Xg離心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,攪拌 30min,6000Xg 離心 30min,沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱層析透析液上樣于Tris-HCl 緩沖液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和0. 02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上樣后用 O 0. 2mol/L的NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(lOOmmol/L，pH7. 8，含0. lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析濃縮備用。(5) ConA-Sepharose 柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 0. lmol/L甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7. 8，含0. ImmoI/L的MgCl2和0. 02mmol/L的ZnCl2)透析濃縮備用。(6) Sephadex G-200 柱柱層析濃縮液上樣于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一緩沖液洗脫,收集堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮備用。 (7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品，經檢測產品比酶活為415U/mg，堿性磷酸酶的回收率為11. 5%，純化倍數為1301倍。實施例四(I)粗酶液的制備新鮮豬腎皮質25kg剪碎，加Tris-HCl緩沖液75L (50mmol/L, ρΗ7· 8)，勻漿3min(30sX6)，4°C下攪拌30min,3000Xg離心30min,上清液即為堿性磷酸酶粗酶液。(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc調至pH4. 8，攪拌3. 5h，8000 X g離心30min，沉淀溶于75L(50mmol/L, pH7. O)Tris-HCl緩沖液中。加等體積正丁醇75L，攪拌lh，IOOOXg離心30min,吸取水層對Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, pH7. 8)透析,并濃縮至1L。(3) (NH4) 2S04 鹽析用飽和度30%的(NH4)2SO4沉淀，攪拌30min，6000Xg離心30min，去沉淀。上清用80% 的(NH4)2SO4 沉淀,攪拌 30min,6000Xg 離心 30min,沉淀用 Tris-HCl 緩沖液(IOmmol/L, ρΗ7· 8，含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和 O. 02mmol/LZnCl2)溶解并透析。(4) DEAE-Sephacel 柱層析透析液上樣于Tris-HCl 緩沖液(1 Ommol /T,, pH7. 8,含 O. lmmol/L 的 MgCl2 和
O.02mmol/L 的 ZnCl2)平衡的 DEAE-Sephacel 柱(16cmX 70cm)，上樣后用 O O. 2mol/L的NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(lOOmmol/L，pH7. 8，含
0.lmol/L 的 NaCl、0· lmmol/L MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析濃縮備用。(5) ConA-Sepharose 柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱(16cmX30cm) ,0 0. lmol/L甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH7. 8，含0. ImmoI/L的MgCl2和O. 02mmol/L的ZnCl2)透析濃縮備用。(6) Sephadex G-200 柱柱層析濃縮液上樣于平衡后的Sephadex G-200柱(20cmX97cm),同一緩沖液洗脫,收集堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮備用。(7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱(IOcmX 100cm)，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ7· 8，含 0. lmmol/L 的 MgCl2 和 0. 02mmol/L 的 ZnCl2)透析后置 _70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品，經檢測產品比酶活為408U/mg，堿性磷酸酶的回收率為13%，純化倍數為1298倍。
權利要求
1.一種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為(1)粗酶液的制備動物屠宰廢棄臟器剪碎，加TriS-HCl緩沖液勻漿，4°C下攪拌后離心，上清液即為堿性磷酸酶粗酶液；(2)酸沉淀所得粗酶液，用HAc調至pH，攪拌后離心，沉淀溶于Tris-HCl緩沖液中。加正丁醇攪拌后離心，吸取水層對Tris-HCl緩沖液透析并濃縮；⑶(MM)2SO4鹽析用(MM)2SO4進行分段鹽析，沉淀用Tris-HCl緩沖液,溶解并透析；(4) DEAE-Sephacel柱層析透析液上樣于DEAE-Sephacel柱，上樣后用NaCl梯度洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HCl緩沖液透析濃縮備用；(5) ConA-Sepharose柱層析濃縮液上樣于平衡的ConA-Sepharose柱，甲基甘露糖苷洗脫。收集堿性磷酸酶活性部分，用Tris-HC I緩沖液透析濃縮備用；(6) SephadexG-200柱層析濃縮液上樣于平衡后的Sephadex G-200柱，同一緩沖液洗脫，收集堿性磷酸酶活性部分，透析濃縮后備用；(7) GGT免疫親和層析柱濃縮液過抗GGT免疫親和層析柱，收集流出液，用Tris-HCl緩沖液透析后置_70°C凍干獲得堿性磷酸酶產品。
2.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為步驟(I)動物屠宰廢棄臟器可以為肝臟、腎臟、小腸等。
3.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為步驟(2)酸沉淀中HAc調至粗酶液pH至4. 5-6. 0，攪拌3 4h，正丁醇的加入量為等體積。
4.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為步驟(3)(NH4) #04鹽析中鹽析梯度為30%-80%,溶解沉淀用緩沖液為含O. lmmol/L的MgCl2和O. 02mmol/L ZnCl2的 10mmol/L，pH7. 8 的 Tris-HCl 緩沖液。
5.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為步驟(4)DEAE-Sephacel柱層析中NaCl梯度洗脫濃度為O O. 2mol/L，所用Tris-HCl緩沖液中含O.lmol/L 的 NaCl、0. lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl20
6.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為步驟(5)、(7)所用Tris-HCl 緩沖液中含 O. lmmol/L MgCl2 和 O. 02mmol/L 的 ZnCl20
7.如權利要求I所述的ー種堿性磷酸酶的制取方法，其特征為堿性磷酸酶的回收率高于10%，產品比酶活達到402U/mg以上，純化倍數達到1297倍以上。
全文摘要
本發明涉及一種堿性磷酸酶的制取方法，關鍵步驟為將動物屠宰后的廢棄臟器經絞碎離心后獲得堿性磷酸酶粗酶液，再采用酸沉、鹽析、柱層析、透析、真空冷凍干燥等一系列工藝，最后得到堿性磷酸酶，其比酶活達到402U/mg以上。本發明制取的堿性磷酸酶的回收率高于10％，純化倍數達到1297倍以上，整個工藝具有周期短、生產設備典型、操作工藝簡單、成本低、效率高、產品純度高等優點，適合產業化推廣。
文檔編號C12N9/16GK102839162SQ20121036149
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者王福華 申請人:西藏儷陽科技有限公司