專利名稱：一種RANKL-Fc融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種RANKL-Fc融合蛋白及其制備方法和用途。

背景技術：
骨形成和骨吸收是正常骨新陳代謝過程中密切相關的兩個過程。骨質疏松癥患者因破骨細胞活性增加，骨吸收率超過骨形成率，導致骨質疏松，其中并無骨礦物質缺陷。骨骼也是通常的腫瘤轉移侵襲部位，多發性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等都常轉移至骨骼。腫瘤細胞和成骨細胞相互作用，從而刺激骨髓內前體細胞分化成破骨細胞，因此，骨骼內腫瘤轉移部位常見破骨細胞數量增加，破骨細胞性的骨吸收也相應地增加。總體上，破骨細胞(Osteoclast)的過多形成是造成骨質疏松和腫瘤引起的骨吸收(Bone resorption)的主要原因。人體破骨細胞來自于分化的單核細胞(Monocyte)/巨噬細胞(Macrophage)。骨質疏松容易導致骨折，根據中國2000年第五次人口普查骨質疏松癥的結果及預測，中國60歲以上的老人在2050年將達到4.1億，占中國總人口的27.4％。隨著老年人口的迅速增加，骨質疏松易患人群也迅速增加。美國有2,800萬骨質疏松病人，其中150萬人因為骨質疏松而發生骨折(70萬人脊椎骨折，25萬人胯骨骨折)。世界衛生組織將2000年至2010年列為“骨與關節疾病十年”。根據世界衛生組織資料，近年來全世界因為骨質疏松而引起的骨折增加了4倍，腫瘤轉移致使破骨細胞活躍而引起的溶骨病變也不斷增加。美國有50萬病人因腫瘤轉移引起骨吸收而造成骨折，最常見的是多發性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等引起的骨破壞。不管是婦女停經后引起的絕經期骨質疏松，還是腫瘤轉移引起的骨吸收，原因都是人體內的破骨細胞過多而形成骨質疏松。為了解決骨質疏松的病理狀況，全世界生物醫學界都在尋找一種有效的方法抑制破骨細胞的形成和其活性。美國輝瑞(Pfizer Inc.)正在申請美國食品和藥品管理局批準其用以治療絕經后女性患者骨質疏松癥新藥Fablyn的上市，Fablyn工作機理與荷爾蒙雌性激素類似，這類藥物被稱作選擇性雌激素受體調節劑。2005和2006年，美國食品和藥品管理局兩次拒絕輝瑞的申請，其理由都是擔心該藥存在導致患者罹患子宮內膜癌的風險。輝瑞在2007年底再次遞交了Fablyn作為骨質疏松癥治療藥物的上市請求，并提交了全新的數據。美國Amgen生物醫藥公司正在開發骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)的蛋白藥物來抑制核因子κB受體配體活化劑(Receptor Activator for Nuclear FactorκBLigand)(RANKL)的活性，以期控制破骨細胞的過量形成。同時，美國洛杉磯的骨髓瘤/骨腫瘤研究所也正在研究發展一種減少破骨細胞形成的生物制劑-腫瘤壞死因子受體關聯因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，簡稱為TRAF6)抑制性多肽(TRAF6dn)。
RANKL屬于TNF家族，屬于II型跨膜蛋白，共由317個氨基酸構成，其中氨基端的1-47氨基酸殘基構成RANKL的胞內區域，48-67氨基酸殘基構成RANKL的跨膜區域，68～317氨基酸殘基構成RANKL的胞外區域。RANKL的141-317氨基酸殘基也可以從細胞膜上脫落，形成可溶的RANKL。RANKL是破骨細胞分化所必需的。RANKL的晶體結構顯示其胞外結構中含有一個獨特部分可激活破骨前體細胞表面的受體RANK，從而刺激破骨細胞的形成。RANK受體表達于單核巨噬細胞，軟骨細胞和破骨細胞前體，它是調節破骨細胞分化的主要受體。當腫瘤細胞轉移至骨骼部位后，RANKL是破骨細胞形成的主要生理調節子，可由腫瘤細胞直接分泌，無需基質細胞支持直接刺激破骨細胞形成。
自從發現RANKL/RANK信號通路，調節破骨細胞形成和激活的分子機理研究取得了快速進展。RANKL與RANK受體結合，激活了含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)接頭分子DAP12或FcRγ，接頭分子與破骨細胞前體細胞表面的對應得免疫球蛋白樣受體結合，介導胞內的鈣信號。鈣信號與RANKL/RANK信號通路的中間物質合作，激活了破骨細胞分化的關鍵信號分子NFATc1，導致破骨前體細胞分化成破骨細胞。
然而，ITAM的信息傳導系統受到了基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)的抑制。ITIM作為抑制性信息傳導系統通過含SH2域的肌醇多磷酸5’磷酸酶(SHIP)1(SH2domain-containing inositol polyphosphate 5’phosphatase)和含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1/2)(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase)的激活來平衡ITAM的信息傳導系統。然而，目前通過激活細胞內ITIM的信息傳導系統來抑制ITAM的信息傳導，達到減少破骨細胞形成的RANKL重組蛋白還未見報道。


發明內容
為了解決上述的技術問題，本發明的一個目的在于提供一種RANKL-Fc融合蛋白。
本發明的第二個目的在于提供編碼上述RANKL-Fc融合蛋白的基因序列。
本發明的第三個目的在于提供上述RANKL-Fc融合蛋白的制備方法。
本發明的第四個目的在于提供上述RANKL-Fc融合蛋白在制備用于治療骨吸收疾病的藥物組合物中的應用。
本發明的第五個目的在于提供一種包含上述RANKL-Fc融合蛋白的藥物組合物。
本發明提供了一種RANKL-Fc融合蛋白，所述RANKL-Fc融合蛋白為P1-P2和P1-L-P2形式，其中P1為RANKL蛋白的胞外區域，P2為人IgG Fc蛋白，L為連接肽。
所述RANKL胞外區域片段選自 1)SEQ ID NO1所示的RANKL氨基酸序列； 2)從SEQ ID NO1中第68-188位之間任何一個氨基酸殘基，包含第68和188位氨基酸殘基，至SEQ ID NO1末端氨基酸殘基所組成的氨基酸序列； 3)在2)所述氨基酸序列前加Asp形成的氨基酸序列。
所述人Ig G的Fc蛋白如SEQ ID NO2所示的蛋白序列，或SEQ ID NO2中第16位氨基酸殘基Ala到最后一位氨基酸殘基Lys。
所述連接肽的序列為(Gly4Ser)3。
本發明還提供了編碼RANKL胞外區域與Fc融合蛋白的核酸序列。本發明分別提供一種編碼RANKL胞外區域的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和一種編碼人Ig G Fc蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
本發明還進一步提供了一種融合基因RANKL-Fc，所述融合基因RANKL-Fc為編碼RANKL胞外區域與Fc所組成的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
由于一種氨基酸可以有多種密碼子編碼。因此在某些實施方案中，可以根據實際需要對上述編碼RANKL胞外區域與Fc融合蛋白的核酸序列的核酸密碼子進行突變，特別是使用CHO細胞偏愛的密碼子，但編碼RANKL-Fc融合蛋白的氨基酸序列不變。
本發明還提供了上述RANKL-Fc融合蛋白的制備方法，具體包括如下步驟 a)將編碼RANKL胞外區域片段的核苷酸序列和編碼人Ig G的Fc的核苷酸序列連接于表達載體，得到RANKL-Fc融合蛋白的重組表達載體； b)將步驟a)中的重組表達載體轉入宿主細胞，篩選獲得表達RANKL-Fc融合蛋白的工程細胞株； c)培養步驟b)獲得的工程細胞株； d)從步驟c)中的培養產物中分離RANKL-Fc融合蛋白。
所述步驟a)中的表達載體可以選用各種已知的載體，優選為載體pCDNA3.1或載體pSecTag。
所述步驟b)中的宿主細胞優選為CHO細胞，更優選的，宿主細胞為CHO-K1或CHO-DG44細胞株。
在本發明的一個優選的實施例中，上述RANKL-Fc融合蛋白的制備方法為將經篩選得到的工程細胞株培養在含有10％胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件為溫度36℃～37.5℃，CO2濃度為5％。培養15天后，離心培養液得上清，Protein A親和層析分離RANKL-Fc融合蛋白。
本發明進一步提供了RANKL-Fc融合蛋白作為破骨細胞形成及其生物學活性抑制劑的用途。
本發明還進一步提供了RANKL-Fc融合蛋白在制備用于治療骨吸收疾病的藥物組合物中的應用。
本發明更進一步提供了一種用于治療骨吸收疾病的藥物組合物，僅含有治療有效量的RANKL-Fc融合蛋白的藥物制劑，或者是治療有效量的RANKL-Fc融合蛋白與藥學上可接受的載體一起組成的藥物制劑。
所述骨吸收類疾病選自骨質疏松癥、佩吉特病、骨髓炎、血鈣過多、與手術或服用類固醇相關的骨質減少、骨壞死、由類風濕關節炎引起的骨吸收、牙周骨吸收、溶骨性轉移或與癌癥相關的骨吸收類疾病。
本發明所提供的藥物組合物可以多種劑型存在，如用于靜脈注射等的注射劑，用于皮下注射、表皮外敷等的經皮吸收劑，用于噴鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的噴霧劑，用于滴鼻、眼、耳等的滴劑，用于肛腸等的栓劑、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式，及肺部給藥制劑及其他非腸道給藥的組合物。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。該藥用組合物還可以加入香味劑、甜味劑等。
如上所述的RANKL-Fc融合蛋白的藥物制劑可對哺乳動物臨床使用，包括人和動物，可以經靜脈注射或者口、鼻、皮膚、肺吸入等途徑給藥。上述藥物的優選周劑量為0.1-5mg/kg體重，優選的療程為10至30天。一次性給藥，或分次給藥。無論采用何種給藥方法，個體人的最佳劑量應根據具體的治療而定。
本發明通過基因克隆技術來合成一種RANKL-Fc融合蛋白，該融合蛋白中的RANKL部分是RANKL的胞外區域，通過激活細胞內ITIM的信息傳導系統來抑制ITAM的信息傳導，達到減少破骨細胞形成的目的。通過將RANKL-Fc融合蛋白的基因克隆到一個表達載體中，轉化CHO細胞，篩選得到高表達的工程細胞株，通過細胞培養制備RANKL-Fc融合蛋白。CHO細胞表達的蛋白更具有天然的修飾和結構，利用CHO細胞表達的RANKL-Fc融合蛋白具有更高的生物活性。



圖1RANKL-Fc與RANKL受體結合能力鑒定結果示意圖。
圖2RANKL-Fc與FcγRII受體結合能力鑒定結果示意圖。
圖3RANKL-Fc抑制破骨細胞形成實驗結果示意圖。
圖4RANKL-Fc抑制破骨細胞生物學活性實驗結果示意圖。

具體實施例方式 下面用實施例對本發明作進一步闡述。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書的范圍內。
實施例1融合蛋白RANKL-Fc的表達 RANKL-Fc融合蛋白的表達過程包括以下步驟合成基因；把基因插入表達載體，用表達載體轉染CHO細胞；利用Hygromycin篩選表達RANKL-Fc融合蛋白CHO工程細胞株，培養該細胞株，最后從細胞培養液中分離純化RANKL-Fc蛋白。具體包括 1)基因合成 委托基因合成的專業公司(上海生工生物工程技術服務有限公司)合成SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，其中5-10是Nhe I的酶切位點；11-73是編碼Igκ鏈分泌信號肽的核苷酸序列；74-823是編碼人RANKL胞外區域的核苷酸序列，其編碼的RANKL部分對應于SEQ ID NO1中的68-317；824-1522是編碼人Ig G Fc片段的核苷酸序列；編碼的蛋白對應于SEQ ID NO中的1-232。1523-1528是Xba I酶切位點。
2)表達載體的構建 從基因合成公司(上海生工生物工程技術服務有限公司)得到上述合成的基因后，用Nhe I和Xba I雙酶切基因和載體pCDNA3.1(美國Invitrogen公司)，分別回收基因和載體的酶切片段，用T4連接酶將基因插入到載體中，構建表達載體pCDNA/RANKL-Fc。
3)CHO工程細胞株的建立 利用大腸桿菌擴增上述表達載體。抽提質粒后，用電轉的方法把表達載體轉入CHO-K1細胞中。將細胞培養與含有500mg/L的hygromycin(潮霉素)的10％FBS-DMEM培養基中，14天后，得到抗性細胞庫。將細胞進行限定稀釋并按每孔1個細胞的接種到20個96孔板上，最后得到50～200個單克隆。按表達量排序，取前20個克隆反復傳代10代，比較10代培養中的蛋白表達量，其中有不少于5個克隆的蛋白表達量始終保持在5pg/cell/day以上。應用這些細胞株生產蛋白。
4)RANKL-Fc融合蛋白的生產 利用10％FBS-DMEM(INVITROGEN，CA)培養基，在37℃，5％CO2培養上述CHO工程細胞株15天，2000rpm離心后，收集上清，再用蛋白A親和層析柱(PHARMACIA)分離純化得到RANKL-Fc融合蛋白。
實施例2RANKL-Fc融合蛋白與RANK(RANKL受體)結合實驗 利用磁珠分離技術，從人外周血中分離出單核細胞。將1×106單核細胞分別培養于MCSF和RANKL培養基72小時后與5微克實施例1中純化的RAKL-Fc融合蛋白在4℃反應1小時，加入5微升FITC標記的抗人RANKL抗體(CALTAG，CA)，用流式細胞儀檢測熒光標記細胞。結果如圖1所示，表明實施例1中表達的融合蛋白RIG可與RANK結合，THP1細胞呈FITC陽性。圖1中，SSC-H為細胞內顆粒數，FSC-H為細胞大小，FL2-H為PE，FL1-H為FITC。
實施例3RANKL-Fc融合蛋白與FcγRII受體結合實驗 HMC-1是實施例1中傳代篩選出的一株高表達細胞株，在細胞的表面表達有FcγRII。HMC-1細胞培養在含有10％的胎牛血清的DMEM培養基中。將1×106HMC-1細胞與5微克實施例1中純化的RANKL-Fc融合蛋白在4℃反應1小時，加入5微升FITC標記的抗人IgG FITC標記抗體(CALTAG，CA)，用流式細胞儀檢測細胞。結果如圖2所示，表明實施例1中表達的融合蛋白RIG可與FcγRII受體結合，HMC-1細胞呈FITC陽性。圖2中，SSC-H為細胞內顆粒數，FSC-H為細胞大小，FL2-H為PE，FL1-H為FITC。
實施例4RANKL-Fc融合蛋白抑制破骨細胞形成實驗 利用抗CD14微球(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)從多發性骨髓瘤病人的骨髓或PBMC中分離出CD14+細胞。用含有50ng/ml RANKL和20ng/ml M-CSF的培養基培養細胞。三天后，將RAKL-Fc融合蛋白和對照試劑加入到培養基中，14天培養后，收獲細胞并固定，進行TRAP染色分析(TRAP-staining kit；Sigma，St Louis，MO，USA)鑒定多核破骨細胞的數量，根據融合指數評價破骨細胞的頻率。
如圖3所示，本實施例證明RANKL-Fc融合蛋白可阻斷RANKL介導破骨細胞形成，并存在劑量依賴性。
實施例5RANKL-Fc融合蛋白抑制破骨細胞的生物學活性 通過破骨細胞的骨吸收分析，進一步考察RANKL-Fc融合蛋白對破骨細胞的生物學活性的抑制作用。簡要地，用無菌水和超聲波清洗直徑為6mm，厚度為150um的猛犸象長牙牙質薄片，然后，在70％的乙醇中消毒，紫外照射過夜。從正常人的PBMC或骨髓分離得到CD14+細胞，分別培養于MCSF和RANKL培養基的CD14+單核細胞(5×104)在上述牙質薄片上利用RIG融合蛋白刺激21天。為了考察骨吸收面積，首先使用蒸餾水洗去薄片上的分化細胞，然后對薄片脫水和風干。用Toluidine藍染色，利用光學顯微鏡鑒別吸收坑和圖象分析測量每個薄片上的腔隙性吸收面積。如圖4所示，本實施例證明RANKL-Fc融合蛋白可抑制破骨細胞生物學活性。
實施例6RANKL140-317-Fc融合蛋白的制備及功能評價 利用實施例1的方法，制備融合蛋白RANKL140-317-L-Fc。該融合蛋白的RANKL的氨基酸序列對應于SEQ ID NO1中的140-317氨基酸殘基，其編碼核苷酸序列對應于SEQ ID NO3中的217-750。在RANKL140-317和Fc之間為連接肽，氨基酸序列為GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer，對應的編碼核苷酸序列為GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGCGGT GGC GGA TCG。Fc的氨基酸序列對應于SEQ ID NO2中的16-232，其編碼的核苷酸序列對應于SEQ ID NO4中的46-699。按實施例1的方法制備該融合蛋白RANKL140-317-L-Fc，并利用實施例2的方法評價該融合蛋白與RANK和FcγRII的結合(表1)，以及實施例3的方法評價該融合蛋白對破骨細胞分化的抑制作用(表2)，和實施例4的方法評價該融合蛋白對骨吸收的抑制作用(表3)。結果表明，融合蛋白RANKL140-317-L-Fc具有明顯的抑制破骨頭細胞分化和骨吸收的作用。
表1表達RANK的單核細胞和表達FcγRII的HMC-1細胞 對融合蛋白RANKL140-317-Fc的結合率(％)
實驗結果為3次獨立實驗的平均值。
表2融合蛋白RANKL140-317-Fc對破骨細胞生成的抑制作用
*20個顯微鏡觀察視野中的破骨細胞數量之和。
表3融合蛋白RANKL140-317-Fc對骨吸收的抑制作用
*20個顯微鏡觀察視野中骨吸收點數量之和。
本實施例中的融合蛋白RANKL-Fc融合蛋白組成成份全部來源于人源(human)性免疫球蛋白和RANKL，因此，該蛋白作為一種藥物進入人體，沒有任何異體蛋白的免疫源性。RANKL-Fc融合蛋白可將RANKL和Fcγ交聯在一起，從而誘發細胞內的抑制信號，抑制RANK-ITAM反應的發生。本發明的RANKL-Fc融合蛋白通過啟動細胞內抑制信號傳導系統ITIM，從而強有力地抑制了破骨細胞形成，將在骨質疏松和腫瘤引起的骨吸收的治療中發揮重要作用。
序列表
<110>上海富莼科芯生物技術股份有限公司
<120>RANKL-Fc融合蛋白及其制備方法和用途
<130>090184
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>317
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
1 5 10 15
Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
35 40 45
Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50 55 60
Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
100 105 110
Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
115 120 125
Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
165 170 175
Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
180 185 190
Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
195 200 205
Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210 215 220
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
225 230 235 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
260 265 270
Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
275 280 285
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290 295 300
Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp
305 310 315
<210>2
<211>232
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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145 150 155 160
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<213>人工合成
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caaaaggaat tacaacatat cgttggatca cagcacatca gagcagagaa agcgatggtg240
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taccatgatc ggggttgggc caagatctcc aacatgactt ttagcaatgg aaaactaata420
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ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg1320
ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga1380
cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa1440
cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct1500
ctccctgtct ccgggtaaat gatctagagc tg 153權利要求
1.一種RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的結構形式為P1-P2或P1-L-P2，其中，P1是RANKL蛋白的胞外區域片段，P2為人Ig G的Fc蛋白，L為連接肽。
2.如權利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述RANKL胞外區域片段選自如下序列
1)如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；
2)從SEQ ID NO1中第68-188位之間任何一個氨基酸殘基，包含第68和188位氨基酸殘基，至SEQ ID NO1末端氨基酸殘基所組成的氨基酸序列；
3)在2)所述氨基酸序列前加Asp形成的氨基酸序列。
3.如權利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述連接肽的序列為(Gly4Ser)3。
4.如權利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白，其特征在于，所述人Ig G的Fc蛋白如SEQ ID NO2所示的蛋白序列，或SEQ ID NO2中第16位氨基酸殘基Ala到最后一位氨基酸殘基Lys。
5.一種融合基因RANCL-Fc，其特征在于，所述融合基因RANCL-Fc的序列如SEQ ID NO5所示。
6.權利要求1-4所述的RANKL-Fc融合蛋白的制備方法，包括如下步驟
a)將編碼RANKL胞外區域片段的核苷酸序列和編碼人Ig G的Fc的核苷酸序列連接于表達載體，得到RANKL-Fc融合蛋白的重組表達載體；
b)將步驟a)中的RANKL-Fc融合蛋白的重組表達載體轉入宿主細胞，篩選獲得表達RANKL-Fc融合蛋白的工程細胞株；
c)培養步驟b)獲得的工程細胞株；
d)從步驟c)中的培養產物中分離RANKL-Fc融合蛋白。
7.如權利要求6所述的RANKL-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟a)中的表達載體為載體pCDNA3.1或載體pSecTag。
8.如權利要求6所述的RANKL-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中的宿主細胞為CHO細胞。
9.權利要求1所述的RANKL-Fc融合蛋白作為破骨細胞形成及其生物學活性抑制劑的應用。
10.權利要求1所述RANKL-Fc融合蛋白在制備治療骨吸收疾病藥物上的應用。
11.如權利要求10所述的RANKL-Fc融合蛋白在制備治療骨吸收疾病藥物方面的應用，其特征在于，所述骨吸收類疾病選自骨質疏松癥、佩吉特病、骨髓炎、血鈣過多、與手術或服用類固醇相關的骨質減少、骨壞死、由類風濕關節炎引起的骨吸收、牙周骨吸收、溶骨性轉移或與癌癥相關的骨吸收類疾病。
全文摘要
本發明涉及一種RANKL-Fc融合蛋白及其制備方法和用途。RANKL-Fc融合蛋白具有P1-P2或P1-L-P2的結構形式，其中P1為RANKL蛋白的胞外區域片斷；P2為人Ig G的Fc部分，L為連接肽。本發明提供的融合蛋白可用于制備治療用于骨吸收疾病的藥物。
文檔編號A61K47/48GK101514232SQ20091004820
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者駿 包, 陳海明, 祝道成 申請人:上海富莼科芯生物技術股份有限公司