專(zhuān)利名稱(chēng)：文昌魚(yú)雙甲基精氨酸水解酶AmphiDDAH基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文昌魚(yú)雙甲基精氨酸水解酶(AmphiDDAH)基因及其編碼的蛋白PDDAH，以及該蛋白在制備治療心血管疾病和關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，屬于脊索動(dòng)物門(mén)(Chordata)，頭索動(dòng)物亞門(mén)(cephalochordate)，是現(xiàn)存和脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系最近的無(wú)脊椎動(dòng)物，也是脊椎動(dòng)物祖先的模型，是海洋中較原始的動(dòng)物類(lèi)。在文昌魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中，為了提高自身的免疫力及其組織和器官的分化形成，文昌魚(yú)胚胎能夠產(chǎn)生DDAH，水解非對(duì)稱(chēng)性的雙甲基精氨酸(ADMA)，增強(qiáng)一氧化氮合成酶(NOS)的活性，從而調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)在體內(nèi)的含量。
1989年Ogawa首先用生化提取的方法在老鼠肝臟中分離得到DDAH，此酶為單條肽鏈，分子量約為33KDa，等電點(diǎn)為5.2，它能特異地水解其底物ADMA生成胍氨酸和甲胺，活性范圍在pH5.5-pH7.5之間，不需要輔因子。2001年Murray-Rust等人對(duì)細(xì)菌DDAH晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，DDAH通過(guò)Cys-His-Glu(C-249，His-162，Glu-114)三個(gè)活性位點(diǎn)與其底物NOS的抑制劑ADMA相結(jié)合，并水解其底物。在髓鞘堿性蛋白、熱激蛋白、細(xì)胞核分子蛋白的加工、修飾過(guò)程中釋放出自由的甲基化精氨酸(ADMA)，這些分子分布在細(xì)胞溶質(zhì)、血漿、組織中，在不同的組織和器官中有著不同的濃度分布。在病理?xiàng)l件下，如高血脂癥、高血壓、腎病變、動(dòng)脈粥樣化病人的血漿中，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎部位的組織液中，由于DDAH的活性下降，導(dǎo)致ADMA濃度上升，NO水平下降，引理病理的發(fā)生。炎癥細(xì)胞因子IL-1β能誘導(dǎo)DDAH的表達(dá)，減少ADMA含量，從而增加NOS的活性，增加NO水平，從而刺激血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。視黃酸也可通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞DDAH的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的成熟與發(fā)育。NO也可通過(guò)刺激血管平滑肌細(xì)胞中可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的活性，增加cGMP的含量，導(dǎo)致平滑肌松弛，是一種內(nèi)源性的血管舒張物。在關(guān)節(jié)炎中，軟骨細(xì)胞對(duì)胰島素相關(guān)的生長(zhǎng)因子I(IGF-I)不敏感，NO含量升高，當(dāng)軟骨細(xì)胞被暴露在NO中，IGF-I刺激的IGF-I受體的磷酸化減少，從而影響軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，研究開(kāi)發(fā)文昌魚(yú)DDAH用于治療心血管疾病和骨關(guān)節(jié)病，是一項(xiàng)很有意義的工作。
目前，國(guó)內(nèi)對(duì)DDAH的研究報(bào)道較少。對(duì)NO含量有重要調(diào)節(jié)作用的DDAH，進(jìn)行基因重組、表達(dá)，具有很重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的文昌魚(yú)AmphiDDAH基因及其編碼的蛋白。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因的PDDAH蛋白在制備治療心血管疾病和關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過(guò)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和大規(guī)模測(cè)序的方法，從文昌魚(yú)神經(jīng)胚中分離得到神經(jīng)胚AmphiDDAH基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本發(fā)明基因AmphiDDAH所編碼的蛋白(重組蛋白DDAH，命名為PDDAH)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；等電點(diǎn)為4.12，分子量為30,649道爾頓。
該蛋白通過(guò)表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)。
所述表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH是建立以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入His的親和標(biāo)記位點(diǎn)及蛋白酶3C識(shí)別位點(diǎn)的高效表達(dá)載體，該系統(tǒng)使PDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)。
本發(fā)明所選擇的青島文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山東省沙子口水域。
青島文昌魚(yú)神經(jīng)胚cDNA文庫(kù)的構(gòu)建提取神經(jīng)胚總RNA，通過(guò)反向PCR合成一鏈DNA，然后通過(guò)LD-PCR合成雙鏈DNA，經(jīng)Sfi I酶切后，與pcDNA3.0連接轉(zhuǎn)化E.coli，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)文庫(kù)重組克隆大規(guī)模序列測(cè)定，從中得到了1個(gè)新的編碼文昌魚(yú)DDAH的克隆，命名為AmphiDDAH(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因編碼274個(gè)氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等電點(diǎn)為4.12，分子量為30,649道爾頓，具有保守的DDAH酶活性位點(diǎn)。
本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，將編碼新基因AmphiDDAH克隆到原核融合表達(dá)載體pETTRX上(本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。此表達(dá)載體(pETTRX-AmphiDDAH)以T7為啟動(dòng)子，TRX為分子融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達(dá)，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6×His結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。所設(shè)計(jì)的上游引物含有蛋白酶3C位點(diǎn)，利于外源蛋白單體的獲得。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，PDDAH融合蛋白的表達(dá)量較高，大部分處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組PDDAH蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到融合蛋白，融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶切割和Q陰離子交換柱層析，可得到純度在90％以上的PDDAH蛋白。
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et a1.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株，堿法提取質(zhì)粒。


圖1為本發(fā)明的文昌魚(yú)PDDAH蛋白和其它物種DDAH蛋白的比較結(jié)果，其中“*”表示相同；“:”表示差異較小；“.”表示差異明顯；空格表示完全不同。
圖2為文昌魚(yú)神經(jīng)胚總RNA。
圖3雙鏈cDNA電泳結(jié)果。
圖4為基因AmphiDDAH的重組表達(dá)質(zhì)粒pETTRX-AmphiDDAH構(gòu)建圖。
圖5為重組PDDAH蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析電泳圖。1低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker；2未經(jīng)誘導(dǎo)的pETTRX-AmphiDDAH菌體總蛋白；3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pETTRX-AmphiDDAH菌體總蛋白；4誘導(dǎo)菌超聲上清總蛋白；5，6，7，8，9分別為50mM，100mM，200mM，300mM，400mM咪唑洗脫峰蛋白；圖6為重組PDDAH的G25分子篩和Q柱親和層析的SDS-PAGE分析。1低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker；2經(jīng)過(guò)親和層析得到的TRX-PDDAH融合蛋白；3TRX-PDDAH融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶(Prescission protease)切割；4Q柱純化的重組PDDAH蛋白。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1文昌魚(yú)神經(jīng)胚總RNA的提取和cDNA的合成總RNA的提取和cDNA合成收集文昌魚(yú)神經(jīng)胚，采用Trizol試劑法提取神經(jīng)胚總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，獲得文昌魚(yú)神經(jīng)胚總RNA，其A260/A280＝1.828，經(jīng)1％甲醛變性膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)清晰的18s和28s兩條帶，比值＞1(見(jiàn)圖2)，表明總RNA完整性較好、純度也較高。取1ug總RNA，以SMART III olignuclotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)和CDSIII/3′PCR引物(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，得到10μl一鏈eDNA產(chǎn)物。
取2ulcDNA一鏈產(chǎn)物，以5’PCR Primer(5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)和3’PCR Primer(5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)為引物進(jìn)行LD-PCR合成二鏈cDNA。
實(shí)施例2文昌魚(yú)神經(jīng)胚AmphiDDAH基因序列的測(cè)定和分析將二鏈cDNA連接至pcDNA3.0載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑選重組克隆測(cè)序。Blast同源分析表明，獲得了編碼全長(zhǎng)AmphiDDAH基因的EST序列，基因長(zhǎng)度都是822bp，編碼274個(gè)氨基酸的PDDAH蛋白，是1個(gè)新的DDAH蛋白。
用ClustalW分析軟件，對(duì)已報(bào)導(dǎo)的不同物種的DDAH蛋白序列比較，結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出，DDAH的三個(gè)活性位點(diǎn)在不同的物種中是較為保守的。
實(shí)施例3重組PDDAH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)AmphiDDAH基因的兩端序列合成一對(duì)引物，上游引物含Kpn I和PrescissionProtease切割位點(diǎn)，下游引物含Not I切割位點(diǎn)。
上游引物(P1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCATG GCGKpnI Precision Protease siteGAT TTC TGT TGG AAT TT3’；下游引物(P2)5’ATAAGAATGCGGCCGCTTA CTA GAA CAG CAG AGA TTG GCA CGT C 3’；Not I以含AmphiDDAH基因的pcDNA3.0質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)為模板，P1、P2為引物PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小在800bp左右。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pETTRX上，得到重組表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH(其構(gòu)建過(guò)程如圖4所示)。表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH中的外源基因經(jīng)測(cè)序鑒定正確。所設(shè)計(jì)的上游引物中含Prescission蛋白酶切割位點(diǎn)，以便切除融合伴侶TRX。
實(shí)施例4文昌魚(yú)PDDAH融合蛋白的表達(dá)將pETTRX-AmphiDDAH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。基因工程菌超聲裂解上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件DNATOOLS6.0預(yù)測(cè)的理論值44kD相符(圖5)。
對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索得出?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取過(guò)夜培養(yǎng)物10ml接種于1L的氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴(kuò)大培養(yǎng)約4h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為0.1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)14h后離心收集菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在此條件下PDDAH融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的40％以上，處于可溶狀態(tài)(圖5)。
實(shí)施例五重組文昌魚(yú)PDDAH融合蛋白的純化將總菌體用50mM PB(pH6.5)洗滌，再用適量的50mM PB(pH6.5)懸浮，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析純化，SDS-PAGE分析融合蛋白的表達(dá)和層析的結(jié)果(圖5)。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出TRX-PDDAH能被Ni2+柱所吸附，用50mM、100mM的咪唑洗Ni2+柱時(shí)，能把大部分吸附在柱上的雜蛋白洗下，而用200mM、300mM、400mM濃度的咪唑能把目的蛋白TRX-PDDAH洗下。為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短對(duì)重組蛋白的處理時(shí)間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時(shí)，我們采用一步法進(jìn)行純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pETTRX所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，我們選用了較簡(jiǎn)化的洗脫條件先用100mM的咪唑洗Ni2+柱，棄洗脫峰，然后直接用400mM的咪唑洗Ni2+柱，收集重組蛋白的洗脫峰。
洗脫液過(guò)G25凝膠柱換3C酶切緩沖液，然后，在4℃冰箱進(jìn)行TRX-PDDAH的3C酶(1∶1000)切過(guò)夜，酶切后的蛋白溶液經(jīng)G25換成Q柱的平衡緩沖液，進(jìn)行Q柱的上柱純化。酶切后的樣品在上柱時(shí)，3C、TRX大部分沒(méi)有吸附在Q柱，基本上穿流掉了，用0.2M的NaCl洗脫時(shí)，洗脫下雜蛋白，而在0.3M時(shí)，能洗下我們的目的蛋白PDDAH(圖6)。
實(shí)施例6PDDAH重組蛋白活性分析加入DDAH酶催化的底物ADMA 40ul，上述純化的PDDAH蛋白360ul，37℃水解1hr之后，按照Knipp等人的方法進(jìn)行L-胍氨酸顯色，測(cè)OD530值，此水解反應(yīng)重復(fù)3次，以PBS為空白，測(cè)出Vm＝0.015±0.002mmol·L-1·mg-1·min-1。所以，在文昌魚(yú)中所得到的cDNA是DDAH基因的同源物，具有水解底物ADMA的活性，能調(diào)節(jié)NOS的活性，從而影響NO的生成。
序列表<110>中山大學(xué)<120>文昌魚(yú)雙甲基精氨酸水解酶(AmphiDDAH)基因及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>822<212>DNA<213>文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>peptide<222>(1)…(822)<400>1
<210>2<211>274<212>PRT<213>文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtauense)<220>
<221>peptide<222>(1)…(274)<400>21 MADFCWNFPE FKHAVVREVS DDVNNAVRDS TSTETVDLEK CRAEWELYVQ 5051 ALRDLGLDVT VIPQDPKLPD CQFVEDPCIV IGDTALITRP ACGPRQGETT 100101 VLEETMRNLG LKVRVVESDT ATLEGGDVIF TGKEIFCGDS VLSNEEGFKI 150151 LEETFGDDYP CHSIFVEYPE FHLKGYAALA APGIMAICDN EWGHPAWKDI 200201 CDTSNYPYKV MWIPDDFGNN CLYINGTIMH APESQKPDTF AVFQKDMADY 250251 NLIPMSSEEV SKVDAALTCQ SLLF* 27權(quán)利要求
1.從文昌魚(yú)神經(jīng)胚中分離得到神經(jīng)胚基因AmphiDDAH，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白PDDAH，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.權(quán)利要求2所述的蛋白PDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)重組表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH的構(gòu)建；(2)將pETTRX-AmphiDDAH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)；(3)對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行培養(yǎng)；(4)重組文昌魚(yú)PDDAH融合蛋白的純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白PDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的方法，其特征在于所述的重組表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH的構(gòu)建包括以下步驟(a)依據(jù)權(quán)利要求1所述的AmphiDDAH基因的兩端序列合成一對(duì)引物，上游引物含KpnI和Prescission Protease切割位點(diǎn)，下游引物含Not I切割位點(diǎn)，上游引物(P1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCATG GCG GAT TTCTGT TGG AAT TT3’；下游引物(P2)5’ATAAGAATGCGGCCGCTTA CTA GAA CAG CAG AGA TTG GCA CGT C 3’；(b)以含AmphiDDAH基因的pcDNA3.0質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物PCR擴(kuò)增；(c)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pETTRX上，得到重組表達(dá)載體pETTRX-AmphiDDAH.。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白PDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的方法，其特征在于步驟(3)的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取過(guò)夜培養(yǎng)物10ml接種于1L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴(kuò)大培養(yǎng)約4h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為0.1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)14h后離心收集菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白PDDAH在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)的方法，其特征在于步驟(4)重組文昌魚(yú)PDDAH融合蛋白的純化方法為將總菌體用50mMPB(pH6.5)洗滌，再用適量的50mMPB(pH6.5)懸浮，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析純化，收集重組蛋白的洗脫峰；重組蛋白的洗脫峰液過(guò)G25凝膠柱換3C酶切緩沖液，然后，在4℃進(jìn)行TRX-PDDAH的3C酶(1∶1000)酶切過(guò)夜，酶切后的蛋白溶液經(jīng)G25換成Q柱的平衡緩沖液，進(jìn)行Q柱的上柱純化。
7.權(quán)利要求2所述的蛋白在制備治療心血管疾病和關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及文昌魚(yú)AmphiDDAH基因及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備治療心血管和關(guān)節(jié)炎疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)cDNA文庫(kù)構(gòu)建和大規(guī)模測(cè)序的方法，從文昌魚(yú)神經(jīng)胚中分離得到文昌魚(yú)AmphiDDAH基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的蛋白(P
文檔編號(hào)A61K38/17GK1654652SQ20041007762
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者徐安龍, 徐斌, 曹寶華, 崔彩媚, 謝珍慧, 張文獻(xiàn), 董美玲 申請(qǐng)人:中山大學(xué)