專利名稱：：一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)筋草生物堿類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)筋草生物堿類化合物，屬于中藥有效成分研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù)顯示，2005年在全球5800萬例總死亡人數(shù)中，因各類腫瘤導(dǎo)致的死亡人數(shù)占13%，腫瘤已成為當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。隨著生命科學(xué)的進(jìn)步和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人類對腫瘤的認(rèn)識已經(jīng)深入到分子細(xì)胞層面，各種新的手術(shù)治療手段和化療藥物不斷問世。然而，據(jù)美國癌癥研究所統(tǒng)計(jì)，50余年來，癌癥治療并沒有得到根本改觀，癌癥死亡率仍然居高不下，主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移，沒有腫瘤轉(zhuǎn)移的有效治療手段和藥物。目前世界公認(rèn)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，大約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移?；瘜W(xué)藥物治療，是原發(fā)腫瘤治療及手術(shù)后預(yù)防轉(zhuǎn)移的重要治療手段。幾十年的臨床實(shí)踐表明，化療藥物多藥耐藥性的發(fā)生以及化療藥物非常嚴(yán)重的毒副作用，不僅嚴(yán)重削弱了化療效果，而且化療藥物嚴(yán)重?fù)p害患者的免疫系統(tǒng)，基本上破壞了抵抗腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的第一道屏障，半年內(nèi)的腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)69%，這是化學(xué)治療的兩難選擇。迄今為止，世界上尚沒有抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物問世。雖然在不同的腫瘤形成過程中，腫瘤細(xì)胞的基因會發(fā)生不同的變化，但是在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程大致相同。2001年，ZlotnikA小組研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的趨化運(yùn)動在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中起著關(guān)鍵的作用。趨化因子CXCL12可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動。如果使用抑制趨化因子CXCL12的受體CXCR4活性的抗體則可以減弱乳腺癌細(xì)胞的趨化能力，并抑制其擴(kuò)散，抑制腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動將能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。因此，在干擾或阻斷惡性腫瘤在宿主體內(nèi)播散的過程中，抑制腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動是抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研究中最重要的環(huán)節(jié)，是延長生存期、提高生存質(zhì)量和降低死亡率的最有效手段。另一方面，由于常規(guī)原發(fā)腫瘤切除后的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物治療是持續(xù)的、長期給藥過程，理想的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物不僅阻斷腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移，而且應(yīng)該是非細(xì)胞毒藥物或者毒副作用很低，不會對免疫系統(tǒng)造成損害。轉(zhuǎn)筋草(PachysandraterminalisSieb.Zucc)為黃楊科(Buxaceae)板凳果屬(Pachysandra)植物粉蕊黃楊的帶根全草，是湖北省土家族常用民間藥物，主治風(fēng)濕熱痹，小腿轉(zhuǎn)筋，月經(jīng)不調(diào)。在對轉(zhuǎn)筋草進(jìn)行生物活性化學(xué)成分研究中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)筋草提取物具有很強(qiáng)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，在1μg/ml和5μg/ml的濃度下，對乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231趨化抑制率分別為66%和95%(在同樣濃度下未顯示對乳腺癌細(xì)胞的毒性)。因此進(jìn)一步開展了抗腫瘤轉(zhuǎn)移化學(xué)成分研究，初步提取分離并鑒定了33個化學(xué)成分，其中12個新化合物，為酚酸類、木脂素類、紫羅蘭酮及其生物堿(其中紫羅蘭酮型生物堿為首次發(fā)現(xiàn)的新天然結(jié)構(gòu)類型，均為新化合物)和孕留烷型生物堿化合物。對各單體化合物進(jìn)行了抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性篩選試驗(yàn)表明只有生物堿類化合物顯示了很強(qiáng)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)筋草生物堿類化合物，該類生物堿具有紫羅蘭酮生物堿結(jié)構(gòu)和孕留烷生物堿結(jié)構(gòu)類型，可用于制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。本發(fā)明是通過以下提取分離、純化和篩選技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，其特征在于取自然干燥的轉(zhuǎn)筋草粉碎后用以6倍量95%的乙醇加熱回流提取3次，每次6h。提取液減壓濃縮，得浸膏700g，浸膏加水混懸后，分別用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取物101g，醋酸乙酯提取物88g，正丁醇提取物360g和轉(zhuǎn)筋草水層部分。石油醚提取物和轉(zhuǎn)筋草水層總生物堿經(jīng)硅膠柱色譜初步分離，進(jìn)一步經(jīng)制備HPLC色譜純化得化合物1(18.5mg),2(16.Omg),3(9.5mg),4(16.Omg),5(9.5mg),6(16.Omg)和7(25.Omg)。其中化合物1為新發(fā)現(xiàn)的天然紫羅蘭酮生物堿結(jié)構(gòu)類型，化合物7為新化合物，文獻(xiàn)未見報(bào)道。結(jié)構(gòu)式如下1234567抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性評價(jià)Transwellchemotaxis方法原理在Transwell小室上腔直接將8μm孔徑濾膜安放在侵襲腔室的上下腔室之間，腫瘤細(xì)胞通過變形運(yùn)動穿過濾膜，用這種模型能夠分析細(xì)胞運(yùn)動能力的大小。在藥物篩選時加入趨化誘導(dǎo)劑(趨化因子EGF)，通過衡量與測試藥物共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和空白組腫瘤細(xì)胞趨化穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量變化，來表達(dá)測試藥物抑制腫瘤細(xì)胞的趨化遷移能力的大小，進(jìn)而評價(jià)測試藥物抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品低細(xì)胞毒劑量的篩選利用MTT法篩選出低細(xì)胞毒作用的樣品濃度。2.樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)將細(xì)胞鋪于6孔板，置于37°C，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時使其貼壁，24小時后以確定的濃度將樣品加于6孔板內(nèi)，37°C5%CO2孵箱內(nèi)共孵育24小時。3.趨化實(shí)驗(yàn)將用樣品處理過的細(xì)胞分別用0.25%的胰酶消化后，用含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，該細(xì)胞懸液1300rpm離心5分鐘。將上清倒出，加0.1%的BM將細(xì)胞混勻后再次離心5分鐘后，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)成5X105，放置在孵箱內(nèi)備用。于冰上配置趨化因子EGF，加于趨化小室的下室，每孔30ul，將包被好的膜鋪于下室上，放好膠墊，固定上室，將之前準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液加到上室，每孔50ul，每個樣品濃度3個復(fù)孔，加好后置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3.5h后取出，取出下室，刮去沒有趨化過來的細(xì)胞，然后用三步染色試劑進(jìn)行固定和染色，染色后將膜用石蠟油固定，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。4.統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法計(jì)數(shù)時，每個孔選取5個視野分別計(jì)數(shù)，取平均值，三個復(fù)孔再取平均即為該樣品濃度下的趨化細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)用SPSS11.5進(jìn)行處理。計(jì)算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>各化合物對腫瘤細(xì)胞的毒性作用MTT比色測定法的原理此分析方法以還原3-(4，5_二甲基噻唑-2-基)-2，5_二苯基四唑溴化物(MTT)為基礎(chǔ)，是一種檢測細(xì)胞存活和生長狀況的常用方法。MTT為一種通用的細(xì)胞染色劑，活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的琥珀酸脫氫酶，可將外源性黃色MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜(Formazane)，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。用DMSO溶解Formazane后用酶標(biāo)儀在550nm波長處檢測光密度的變化大小，來衡量測試藥物對細(xì)胞的生長抑制作用，進(jìn)而評價(jià)細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)步驟將培養(yǎng)好的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，吸出胰酶后，用含10%FBS的培養(yǎng)液終止消化，混勻細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)密度為ιχIO4,將調(diào)好的細(xì)胞懸液加于96孔板，每孔180ul，置于37°C，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，24小時后加藥，每個濃度5個復(fù)孔，加好藥后繼續(xù)置于37°C，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)48小時，之后每孔加5mg/ml的MTT20ul，繼續(xù)置于37°C，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)4小時，4小時后取出96板，將上清吸出，每孔加IOOul的DMS0，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測量吸光度。抑制率=(1_加藥組OD值/空白組OD值)X100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果各化合物對MB-MDA-231(乳腺癌細(xì)胞)趨化抑制率(Cl(趨化指數(shù))=6.67)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>各化合物對MB-MDA-231(乳腺癌細(xì)胞)生長抑制率(細(xì)胞毒性)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性評價(jià)和細(xì)胞毒性評價(jià)表明，化合物1-7在0.2μg/ml的濃度下即呈現(xiàn)很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞遷移活性，最高抑制率為89.5%。而在0.2μg/ml和0.8μg/ml濃度下沒有顯示細(xì)胞毒性，表明化合物1-7具有很強(qiáng)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，而且毒性低。具體實(shí)施例方式轉(zhuǎn)筋草生物堿化合物1-7的提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定1.轉(zhuǎn)筋草生物堿化合物1-7的提取分離取自然干燥的轉(zhuǎn)筋草IOkg粉碎后用以6倍量95%的乙醇加熱回流提取3次，每次6h。提取液減壓濃縮，得浸膏700g，浸膏加水混懸后，分別用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取物101g，醋酸乙酯提取物88g，正丁醇提取物360g和轉(zhuǎn)筋草水層部分。石油醚提取物經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚_醋酸乙酯_甲醇梯度洗脫，得到22個組分(Fre.122)，根據(jù)碘化鉍鉀顯色TLC，將含有生物堿的組分Fre.815合并，以硅膠柱層析分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，TLC合并相似組分得到Fre.8.18.14，F(xiàn)re.8.7經(jīng)制備HPLC分離(ODS-A，甲醇-水，8515)得到化合物6(16.Omg)和7(25.Omg)。轉(zhuǎn)筋草水層部分以氨水調(diào)PH至10，再以醋酸乙酯萃取得到生物堿組分14g，經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇-氨水(9811-731)梯度洗脫，得到組分Fra.3.13.16，其中Fra.3.10經(jīng)制備HPLC分離(0DS-A，甲醇-水，982)得到化合物1(18.5mg)、4(16.Omg),5(9.5mg)；Fra.3.12經(jīng)制備HPLC分離(0DS-A，甲醇-水，955)得到化合物2(16.Omg)>3(9.Omg)。2.化合物1-7的波譜數(shù)據(jù)化合物1黃色油狀物，HRESI-MSm/z236.2004[M+H]+，calcd.236.2014，分子式C15H25Onzh-Wr(Cdcl3JOOMhz)δ:0.96(3Η,S,Η-12),1.00(3Η,S,Η-11),1.19(3Η,d,J=4.OHz,H-10)，1.91(3Η,s,H-13)，2.05(1Η,d,J=16.8Ηζ,Η_2)，2.35(1Η,d,J=16.8Ηζ，Η-2)，2·25(6Η，s，H-N(CH3)2)，2·54(1Η，d，Η_6)，2·93(lH，m，Η_9)，5·44(lH，m，H_7)，5.59(1Η,m,Η_8)，5·90(1Η，s,Η_4)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:199.1(C-3)，161.9(C-5)，136.6(C-8)，128.4(C-7)，125.7(C-4),55.9(C-6),47.5(C-2),42.0(C-N(CH3)2)，36.1(C-1)，27.9(C-11)，27.1(C—12)，23.4(C—13)，18.1(C-IO)化合物2淡黃色油狀物，F(xiàn)AB-MSm/z344[M+1]+，分子式C23H370N。1H-匪R(CDCL3,400MHz)δ:0.99(3Η,s,H-18)，0.88(3Η,s,H-19)，1.81(3H,d,J=7.5Hz,H_21)，6.46(1H,q,J=7.5Hz,H-20),2.31(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:206.0(C-16)，148.2(C-17)，128.0(C-20)，64.2(C-14)，54.2(C_9)，50.0(C-3)，46.6(C-5)，43.4(C-13)，41.4(C-N(CH3)2),37.9(C-15),37.3(C-12),36.4(C-I),35.9(C-IO),34.2(C-8)，32.6(C-2)，32.0(C-4)，28.7(C-7),24.3(C-6),20.9(C-Il)，17.4(C_21)，13.1(C-18)，12.3(C-19)?；衔?淡黃色油狀物，F(xiàn)AB-MSm/z344[M+1]+，分子式C23H370N。1H-匪R(CDCL3,400MHz)δ:0.78(3H,s,H-18)，0.86(3H,s,H-19)，2.04(3H,d,J=7.OHz,Η-21)，5.66(1Η,q,J=7.OHz,H-20),2.30(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:208·4(C-16)，148.5(C-17)，129.9(C-20)，65.4(C-14)，54.2(C_9)，50.4(C-3)，45.7(C-5)，44.6(C-13)，41.6(C-N(CH3)2)，35.8(C-15)，38.3(C-12)，37.7(C-I)，36.1(C-10)，34.6(C-8)，30.7(C-2),32.3(C-4),28.9(C-7),24.3(C-6),20.7(C-Il)，19.4(C_21)，13.5(C-18)，12.4(C-19)。化合物4白色針晶，F(xiàn)AB-MSm/z414[M+1]+，分子式C27H43O2N。1H-WR(CDCL3,400MHz)δ:0.65(3Η,s,Η-18)，0·74(3H,s,H-19)，0·95(3H,d,J=6.8Hz,H-C4,-(CH3)2)，1.05(3H,d,J=6.4Hz,H-C4^-(CH3)2)；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ207.5(C-4),170.8(C-l，)，58.1(C-5)，58.0(C-3)，56.2(C_2，)，56.2(C-14)，54.6(C-17)，54.2(C-9)，42.5(C-13)，41.9(C_3，),41.8(C-10)，39.6(C-12)，36.4(C-I)，34.9(C-8)，30.2(C-7)，28.0(C-4，),27.5(C-16)，27.3(C-2)，27.3(C-20),24.0(C-15),21.6(C-6),20.3(C-Il)，19.9(C-C4,-(CH3)2)，13.8(C-19)，12.3(C-18)，10.2(C-21)。化合物5白色針晶，F(xiàn)AB-MSm/z457[M+1]+，分子式C29H48O2N2。1H-WR(O)CL3,400MHz)δ:0.65(3H,s,Η-18),0.75(3H,s,H-19),0.87(3H,d,J=6.4Hz,H-21)，0.95(3H,d,J=6.8Hz,H-C4,-(CH3)2)，1.05(3H,d,J=6.4Hz,H_C4’-(CH3)2)，2.18(6H,s,H-N(CH3)2)；13C-WR(CDCL3,100MHz)δ:207·4(C_4)，170.7(C_l，)，58.1(C_5)，58.0(C_3)，56.2(C-2，),56.2(C—14)，54.6(C—17)，54.2(C_9)，42.5(C—13)，41.9(C_3，),41.8(C-IO)，39.8(C-N(CH3)2),39.6(C-12),36.4(C-I),34.9(C-8),30.2(C-7),28.0(C_4，)，27.5(C-16),27.3(C-2),24.0(C-15),21.6(C-6),20.3(C_11)，19.9(C-C4,-(CH3)2)，13.8(C-19)，12.3(C—18)，9.3(C—21)?；衔?淡黃色油狀物，F(xiàn)AB-MSm/z434[M+l]+，分子式C29H3902N。1H-NMR(CDCL3,400MHz)δ:0.65(3H,s,H-18),1.01(3H,s,H-19)，2.13(3H,s,H-COCH3)，3.38(3H,s,H-N(CH3))；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ209.7(C-20),170.O(C-CONCH3),152.5(C-2'),131.6(C-6，)，130.8(C-T)，127.7(C_3，)，123.3(C_4，)，120.9(C_5，),64.O(C-3)，63.7(C-17)，54.4(C_9)，44.2(C-13)，42.3(C_5)，39.6(C_4)，38.9(C-12)，35.5(C-I)，35.5(C-8)，35.O(C-IO)，32.1(C-2),31.7(C-7),31.5(C-COCH3)，29.5(C-CONCH3)，28.5(C-6),24.3(C-16),22.8(C-15),21.O(C-Il)，13.8(C-18)，11.5(C-19)?；衔?淡黃色油狀物，F(xiàn)AB-MSm/z468[M+l]+，分子式C27H43O2N151H-NMR(O)CL3,400MHz)δ:0.61(3Η,s,Η-18),0.80(3Η,s,Η-19)，1.86/1.80(3Η,s,H-C3--(CH3)2)，2.13(3Η,s,H-C0CH3),3.04(3Η,s,H-N(CH3))；13C-NMR(CDCL3,100MHz)δ:209·7(C-20)，170.O(C-CONCH3)，144.4(C_3，)，120.2(C~2'),64.O(C-3),63.7(C-17),54.4(C-9)，44.2(C-13),41.5(C_5)，39.O(C-12)，35.6(C-I)，35.5(C-8)，35.2(C-IO),31.7(C_4)，31.7(C-7),31.5(C-COCH3),31.5(C-CONCH3),29.3(C-6),29.O(C-2),28.7(C-Il)，26.O(C-C3^-(CH3)2)，24.3(C-16)，22.7(C-15)，20.7(C_C3，-(CH3)2)，13.4(C-19)，12.5(C-18)。權(quán)利要求轉(zhuǎn)筋草生物堿化合物用于制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的用途，其中所述轉(zhuǎn)筋草生物堿化合物結(jié)構(gòu)為如下所示之一re-FSB00000165896200011.tif2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物用于制備抗乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物。3.轉(zhuǎn)筋草類生物堿化合物，其結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明涉及一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)筋草生物堿化合物，包括9-dimethylamino-4，7-megastigmadien-3-one(1)，E-salignone(2)，Z-salignone(3)，3β-(3′α-isopropyl)-lactam-5α-pregn-4-one(4)，pachystermineA(5)，3-spiro-(3′-oxo-isoindole)-5α-pregn-20-one(6)，3β-(methylsenecioylamino)-5α-pregn-20-one(7)，具有很強(qiáng)的抗乳腺癌細(xì)胞趨化遷移的作用，可用于制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。文檔編號A61P35/04GK101822657SQ201010114809公開日2010年9月8日申請日期2010年2月26日優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日發(fā)明者唐生安,李晨陽,段宏泉,翟慧媛,靳美娜申請人:天津醫(yī)科大學(xué)