專利名稱：一種新的肺炎球菌結(jié)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的肺炎球菌結(jié)合疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種肺炎球菌多
個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體結(jié)合的新的肺炎球菌結(jié)合疫苗，來(lái)源于不同血清型的莢膜糖通
過(guò)與蛋白載體的化學(xué)結(jié)合后，以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。本發(fā)明還涉及所述的新的肺炎球菌結(jié)合疫苗的制備方法，以及新的細(xì)菌莢膜糖蛋白結(jié)合疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)引發(fā)的疾病是全球兒童尤其是發(fā)展中國(guó)家兒童發(fā)病率和死亡率的最主要病因，肺炎球菌的疾病負(fù)擔(dān)主要來(lái)自于2歲以下兒童和老年人，肺炎球菌疾病已成為全球一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。全球每年約1，060萬(wàn)5歲以下兒童罹患肺炎球菌疾病，WH0估計(jì)每年有160萬(wàn)人死于肺炎球菌疾病，包括70 100萬(wàn)5歲以下的兒童，其中大多數(shù)是生活在發(fā)展中國(guó)家的兒童(http:〃www.who. int/biologicals/areas/vaccines/pneumo/en/)。 全球通過(guò)接禾中疫苗可予頁(yè)防的小于5歲兒童死亡疾病中，肺炎球菌疾病為第l位，占28% (楊永弘，中國(guó)疫苗和免疫，2008 ;14:4:376-377)。肺炎球菌疾病死亡人數(shù)已超過(guò)艾滋病、瘧疾和麻疹死亡人數(shù)的總和(Obaro，Expert Rev Vaccines. 2009 ;8 (8) :1051-1061)。季節(jié)性流感病毒、H1N1流感病毒、HIV病毒感染和其他與免疫缺陷相關(guān)的病癥使罹患肺炎球菌病的幾率大增。美國(guó)CDC公布上世紀(jì)每次流感大流行，繼發(fā)的肺炎球菌疾病是發(fā)病和死亡的最主要病因，在季節(jié)性流感流行期間也觀察至Ll同樣的情況(http://www. cdc. gov/hlnlflu/vaccination/provider/provider_pneumococcal, htm)。 肺炎球菌誘發(fā)的嚴(yán)重疾病包括肺炎、腦膜炎和敗血癥，中耳炎、鼻竇炎和氣管炎也為常見(jiàn)，但感染的臨床癥狀略輕。暴露于肺炎球菌后，常出現(xiàn)暫時(shí)性鼻咽部細(xì)菌定植但并不發(fā)病，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降，肺炎球菌可造成呼吸系統(tǒng)的局部感染，如急性中耳炎、鼻竇炎等；肺炎球菌進(jìn)入下呼吸道導(dǎo)致肺炎；進(jìn)一步，肺炎球菌侵入血液、腦脊液或其他原本無(wú)菌的部位時(shí)所形成的感染性疾病，稱為侵襲性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococcal Disease,IPD)，菌血癥性肺炎、菌血癥發(fā)熱、敗血癥和腦膜炎是IPD的主要臨床表現(xiàn)。
肺炎球菌感染的高發(fā)人群是< 5歲兒童和^ 65歲的老人，其中< 2歲兒童發(fā)病率最高。美國(guó)在大規(guī)模使用肺炎球菌結(jié)合疫苗前，IPD在《12月齡幼兒中的年發(fā)病率為167/10萬(wàn)，在6 11月齡幼兒中的發(fā)病率達(dá)到235/10萬(wàn)的高峰，在12 23月齡幼兒中的發(fā)病率為203/10萬(wàn)，而整體人群的發(fā)病率只有24/10萬(wàn)。在歐洲和美國(guó)，IPD的年發(fā)病率為10 100例/10萬(wàn)。發(fā)展中國(guó)家中5歲以下兒童中IPD的發(fā)病率要比工業(yè)化國(guó)家高好幾倍。我國(guó)1996 2000年< 5歲兒童死亡監(jiān)測(cè)結(jié)果分析中，肺炎是首位原因(773/10萬(wàn))，占全部死亡的19% (楊永弘，中國(guó)疫苗和免疫，2008 ;14 :4 :376-377)。
肺炎球菌是革蘭陽(yáng)性、具有莢膜的雙球菌。莢膜多糖(Polysaccharides, PS)為其主要致病毒力因子。根據(jù)莢膜多糖的成份差異，將肺炎球菌區(qū)分46個(gè)血清群91個(gè)血清型。不同年齡、時(shí)間和地理區(qū)域的優(yōu)勢(shì)流行血清型分布譜也有所不同，但常見(jiàn)的血清型在全球各地都有所發(fā)現(xiàn)，且全球常見(jiàn)的致病血清型是一致的。從全球范圍來(lái)看，約20余種血清型與超過(guò)80%發(fā)生在各年齡段的IPD有關(guān)。全球最常見(jiàn)的血清群是6、14、19，然而在發(fā)展中國(guó)家幼兒IPD中主要是1、5、8血清群。 肺炎球菌對(duì)抗生素(如青霉素、頭孢菌素、復(fù)方新諾明、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類)的耐藥性在全世界已經(jīng)成了一個(gè)相當(dāng)嚴(yán)峻的、急劇發(fā)展的現(xiàn)象。隨著肺炎鏈球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益增加，當(dāng)前亟需有效的疫苗來(lái)控制肺炎球菌疾病(WHO. WeeklyEpidemiological Record. No. 12， 2007 ;93-104)。目前，有2個(gè)預(yù)防肺炎球菌疾病疫苗已上市，分別是含有23個(gè)血清型莢膜多糖抗原的疫苗(Pneumococcal PolysaccharideVaccine, PPV23)和含有7個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體結(jié)合的結(jié)合疫苗(PneumococcalConjugate Vaccine, PCV7)。 莢膜糖(包括莢膜多糖和莢膜寡糖)抗原是非T細(xì)胞依賴型抗原，不能產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)，在2歲以下兒童中免疫原性弱。因此PPV23主要用于預(yù)防成人和^ 2歲兒童肺炎球菌性疾病。PPV23每劑0. 5毫升，含有23個(gè)血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)的純化莢膜多糖，每個(gè)血清型莢膜多糖為25 ii g。這23個(gè)血清型在美國(guó)和其他一些工業(yè)化國(guó)家覆蓋大多數(shù)的成人IPD約90%， PPV23也包括最常見(jiàn)的耐藥血清型。30多年來(lái)，盡管進(jìn)行了多個(gè)研究，PPV23在兒童和成人的效力和效果仍然難以定論，存在諸多爭(zhēng)議。對(duì)PPV23疫苗的效力和效果進(jìn)行綜合性的meta分析(包括2007年WHO委托開(kāi)展的meta分析和一個(gè)對(duì)RCTs的綜合分析)發(fā)現(xiàn)，在健康年輕人中PPV23對(duì)IPD和全因肺炎具有保護(hù)作用，在老年人中對(duì)IPD至少也有一定程度的保護(hù)。但這些試驗(yàn)并未證實(shí)PPV23在高風(fēng)險(xiǎn)人群(如患有可增加感染風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)疾病的成人和兒童、所有年齡段的嚴(yán)重免疫抑制者)對(duì)IPD和全因肺炎具有保護(hù)作用(Moberley S et al. Cochrane Database ofSystematic Reviews,2008 :1 ;CD000422，HussA et al. Canadian Medical Associationjournal, 2008.)。許多工業(yè)化國(guó)家推薦老人和其他高風(fēng)險(xiǎn)人群接種PPV23, WHO建議在資源有限的國(guó)家，現(xiàn)有證據(jù)不支持老人和高風(fēng)險(xiǎn)人群常規(guī)接種PPV23 (WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ;373-584)。
莢膜糖抗原和蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合后，轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)細(xì)胞依賴型抗原，可誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其特征是促進(jìn)保護(hù)性免疫力的形成，尤其是在嬰兒中產(chǎn)生保護(hù)，以及誘導(dǎo)免疫記憶。每0. 5ml劑量的PCV7含2 ii g血清型4、9V、 14、 19F和23F的莢膜多糖；2 y g血清型18C的寡糖；4 g血清型6B的多糖。每一血清型莢膜糖都與無(wú)毒性的白喉CRM. 197蛋白結(jié)合，并由磷酸鋁佐劑吸附。在美國(guó)，在引進(jìn)該疫苗開(kāi)展大規(guī)模免疫接種之前，該疫苗中包含的血清型約占兒童侵襲性肺炎鏈球菌株的86%。美國(guó)的大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)研究表明，由PCV7疫苗血清型誘導(dǎo)的針對(duì)IPD的保護(hù)性免疫力在接種了至少3針次的兒童中可達(dá)97. 4%，在至少接種1針次的兒童中可達(dá)93. 9%。在將PCV7引進(jìn)國(guó)家免疫接種規(guī)劃1年后，由該疫苗中含有的肺炎球菌血清型所致的IPD在所有1歲以下接種者中的發(fā)病率降低了 100%。在引進(jìn)該疫苗3年后，1歲以下兒童中所有IPD的發(fā)病率降低了 84. 1%;在20 39歲成人中降低了52%，在60歲以上個(gè)體中降低了27%。后續(xù)監(jiān)測(cè)表明，在引進(jìn)該疫苗2年后，IPD在5歲以下兒童中的發(fā)病率降低了 75% 。在5歲以上、未接種疫苗的人群中IPD發(fā)病率的下降可能是因?yàn)閬?lái)自5歲以下、已接種疫苗的嬰幼兒的細(xì)菌傳播減少了 ，即所謂"群體免疫"現(xiàn)象。在美國(guó)，在所有被防止的IPD中約有68X可歸功于這種間接效應(yīng)。PCV7已通過(guò)在全球 不同地區(qū)開(kāi)展的試驗(yàn)中接受了檢驗(yàn)，并已被證實(shí)是有效的、安全的、耐受性好，即便是在HIV 患兒中也是如此。WHO全球疫苗安全咨詢委員會(huì)在2006年11月對(duì)PCV7的安全性進(jìn)行了 評(píng)估，結(jié)論認(rèn)為，有關(guān)PCV7和其他肺炎球菌結(jié)合疫苗的安全性的證據(jù)是令人信服的(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 12，2007 ;93—104)。 然而，PCV7大規(guī)模接種后，肺炎球菌血清型流行病確出現(xiàn)了變化，PCV7于2000 年在美國(guó)大規(guī)模接種后，在小于1歲兒童中觀察到非疫苗血清型IPD成為最大增長(zhǎng)，達(dá)到 10. 8/10萬(wàn)。在小于5歲兒童中19A血清型引發(fā)的IPD發(fā)病率從1998 1999年的2. 6/10 萬(wàn)增長(zhǎng)至2005年的9. 3/10萬(wàn)。2005年，在小于5歲兒童中的IPD的40%是非疫苗血清型 19A引起的，19A成為發(fā)病率增長(zhǎng)最高的血清型。2005年在小于5歲兒童中盡管PCV7疫苗 血清型疾病繼續(xù)下降，但是2002 2005年IPD總體發(fā)病率卻呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)(Reingold et al.Morbidity & Mortality WeeklyR印ort. 2008 ;57 :6 :144-148.)。另一研究者也指出， 2002 2005年小于5歲兒童中每年IPD的72 91 %是非疫苗血清型菌株引發(fā)的(Pelton et al.Pediatr Infect DisJ. 2007 ;26 (6) :468-472.)。 有鑒于成功的疫苗對(duì)肺炎球菌疾病所帶來(lái)的巨大的公共衛(wèi)生影B向，WHO認(rèn)為應(yīng)優(yōu) 先開(kāi)發(fā)安全、有效、價(jià)格適中，并能為肺炎球菌疾病提供更廣譜保護(hù)的肺炎球菌疫苗。需要 有更有效的結(jié)合疫苗或其他類型的疫苗，這些疫苗可涵蓋導(dǎo)致全球大齡兒童和成人嚴(yán)重疾 病的大多數(shù)肺炎球菌血清型(往往也是對(duì)常用抗菌藥物耐藥的血清型)。WH0支持當(dāng)前正 在開(kāi)展的這類疫苗產(chǎn)品的研發(fā)工作(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ; 373-584)。因此，擴(kuò)大PCV7疫苗血清型就凸顯為急迫的任務(wù)。 近年來(lái)，鑒于1 、3、5、6A、7F和19A血清型侵入性肺炎疾病的嚴(yán)重性和危害，在PCV7 疫苗基礎(chǔ)上增加血清型1和5的PCV9、繼續(xù)增加血清型7F的PCV10、再增加血清型3的 PCV11、進(jìn)一步增加血清型6A和19A的PCV13相繼在開(kāi)發(fā)中。PCV7在美國(guó)、歐洲、亞洲和拉 丁美洲的覆蓋率分別為80 90%、 60 80%、 40 80%。在PCV7中增加6個(gè)型別莢膜糖 蛋白結(jié)合物，成為13價(jià)結(jié)合疫苗。13價(jià)結(jié)合疫苗對(duì)美國(guó)和歐洲的覆蓋率均提升至90%以 上，對(duì)亞洲和拉丁美洲的覆蓋率也提升至70 80%。然而，相比較PPV23疫苗在全球的覆 蓋率和考慮到大規(guī)模接種疫苗后將出現(xiàn)非疫苗血清型流行增加的趨勢(shì)，PCV13覆蓋率仍需 要繼續(xù)擴(kuò)大。 現(xiàn)有肺炎球菌結(jié)合疫苗在技術(shù)上均是將每一個(gè)血清型的莢膜糖獨(dú)立與蛋白載體 經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合后，形成單價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，再將各個(gè)單價(jià)血清型莢膜糖_蛋白 結(jié)合體合并，進(jìn)而配制成為含多個(gè)血清型莢膜糖的肺炎球菌結(jié)合疫苗。肺炎球菌結(jié)合疫苗 中各個(gè)莢膜糖抗原以單價(jià)莢膜糖-蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在，彼此并無(wú)結(jié)構(gòu)上的鏈接。例如， PCV7是將來(lái)源于7個(gè)血清型的不同莢膜糖分別與蛋白載體CRM197經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成7個(gè) 單價(jià)莢膜糖_蛋白結(jié)合體，即4PS-CRM197、9VPS-CRM197、14PS-CRM197、19F PS-CRM197、23F PS-CRM197、6B PS-CRM197禾P 18C 0S-CRM197，再將上述7個(gè)單價(jià)莢膜糖-蛋白結(jié)合體按比 例合并配制成多價(jià)成品疫苗。因此，利用現(xiàn)有技術(shù)將超過(guò)13個(gè)血清型的更多血清型莢膜糖 與蛋白載體分別結(jié)合，形成多個(gè)單價(jià)的血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體，再將多個(gè)單價(jià)血清型 莢膜糖-蛋白結(jié)合體合并，并制成單一疫苗制劑，在技術(shù)上仍存在困難(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200680053139. 6)。同時(shí)，現(xiàn)有的PCV7和即將上市的PCV13與Hib結(jié)合疫苗相比較，在生產(chǎn)
7過(guò)程和生產(chǎn)成本方面分別相當(dāng)于7個(gè)和13個(gè)Hib結(jié)合疫苗。這些因素限制了肺炎球菌結(jié)合疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。 本發(fā)明提供的新型肺炎球菌結(jié)合疫苗，系將來(lái)源于2個(gè)不同血清型莢膜糖抗原或多個(gè)不同血清型莢膜糖抗原，與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，形成2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；再將一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上這樣的結(jié)合體配制成肺炎球菌結(jié)合疫苗。因此，本發(fā)明的肺炎球菌結(jié)合疫苗繼承了現(xiàn)有肺炎球菌結(jié)合疫苗的安全性、良好的免疫原性、誘導(dǎo)免疫記憶的優(yōu)勢(shì)；又成功地解決了將更多的血清型莢膜糖抗原納入其中的技術(shù)困難，使疫苗覆蓋范圍更廣；進(jìn)一步，顯著性地縮短了疫苗生產(chǎn)過(guò)程和降低了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合與其它型莢膜糖相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。換言之，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵相互間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。本發(fā)明提供的肺炎球菌結(jié)合疫苗用于嬰幼兒、兒童及成人預(yù)防肺炎球菌感染引發(fā)的疾病。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜多糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜多糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，莢膜多糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合與其它型莢膜多糖相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜多糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜多糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜多糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵相互間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜寡糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜寡糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，莢膜寡糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合與其它型莢膜寡糖相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜寡糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜寡糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜寡糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜寡糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵相互間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜多糖和寡糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜多糖和寡糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，莢膜多糖和寡糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合與其它型莢膜多糖和寡糖相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜多糖和寡糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜多糖和寡糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖和寡糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜多糖和寡糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵相互間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜多糖和寡糖，這些來(lái)源于一組不同血清型的莢膜多糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，這組莢膜多糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜多糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜多糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。這些來(lái)源于另外一組的不同血清型的莢膜寡糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，這組莢膜寡糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜寡糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜寡糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于一組不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖和來(lái)源于另外一組不同血清型的莢膜寡糖抗原分別與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述各型莢膜多糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述各型莢膜寡糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。2價(jià)或多價(jià)血清型莢膜多糖_蛋白結(jié)合體和2價(jià)或多價(jià)血清型莢膜寡糖_蛋白結(jié)合體分別獨(dú)立存在疫苗中，相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，此2 45個(gè)血清型莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來(lái)源于不同血清型的莢膜糖以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在疫苗中，換言之，本發(fā)明疫苗中包含的每個(gè)2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體與其他2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，此2 45個(gè)血清型莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體分別含有相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖，并且該價(jià)數(shù)均介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來(lái)源于不同血清型的莢膜糖以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在疫苗中，其中，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體以相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式獨(dú)立存在于疫苗中，并且該相等價(jià)數(shù)均介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中包含相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體的組合，例如，包含兩個(gè)以上2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含兩個(gè)或兩個(gè)以上3價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；或包含兩個(gè)或兩個(gè)以上4價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；或包含兩個(gè)或兩個(gè)以上5價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上6價(jià)血清型莢膜
9糖-蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上7價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上8價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上9價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上10價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上11價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上12價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上13價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上14價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上15價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上16價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上17價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上18價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上19價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上20價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上21價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上22價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上23價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；或包含一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上24價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；以此類推，直至包含一個(gè)或兩個(gè)45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；并且，每個(gè)2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體與其他2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，此2 45個(gè)血清型莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體以不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中，且該不相等價(jià)數(shù)介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來(lái)源于不同血清型的莢膜糖以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在疫苗中，其中，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體以不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式獨(dú)立存在于疫苗中，且該不相等價(jià)數(shù)介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中同時(shí)包含不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合，既可包含2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，也包含3價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體、4價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體、5價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體、直至45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的任選組合。并且，每個(gè)2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體與其他2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖，這些來(lái)源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，此2 45個(gè)血清型莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體以部分相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中，且該相等價(jià)數(shù)介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的肺炎球菌結(jié)合疫
10苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個(gè)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來(lái)源于不同血清型的莢膜糖以一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在疫苗中，其中，所述兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體以部分相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式獨(dú)立存在于疫苗中，且該相等價(jià)數(shù)介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中同時(shí)包含相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合，并且，每個(gè)2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體與其他2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來(lái)源于不同細(xì)菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，各型(群)莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的聯(lián)合疫苗，所述各型(群)莢膜糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌2群(A、 C)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來(lái)源于不同細(xì)菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，各型(群)莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型、腦膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的聯(lián)合疫苗，所述各型(群)莢膜糖以2價(jià)和/或多價(jià)被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來(lái)源于肺炎球菌不同血清型的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合形成彼此間結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。這些來(lái)源于腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合形成各群莢膜糖彼此間結(jié)構(gòu)上的鏈接，以4價(jià)血清群莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。來(lái)源于b型流感嗜血桿菌的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合，以單價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的聯(lián)合疫苗，所述肺炎球菌以每2價(jià)和/或多價(jià)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述腦膜炎球菌各群莢膜糖以被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖以被蛋白載體結(jié)合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌莢膜糖、腦膜炎球菌莢膜糖、b型流感嗜血桿菌莢膜糖相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌2群(A、 C)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來(lái)源于肺炎球菌不同血清型的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合形成彼此間結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。這些來(lái)源于腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合形成各群莢膜糖彼此間結(jié)構(gòu)上的鏈接，以2價(jià)血清群莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。來(lái)源于b型流感嗜血桿菌的莢膜糖通過(guò)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合，以單價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型、腦膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結(jié)合所組成的聯(lián)合疫苗，所述肺炎球菌以每2價(jià)和/或多價(jià)血清型莢膜糖被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述腦膜炎球菌各群莢膜糖以被蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵彼此間在結(jié)構(gòu)上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖以被蛋白載體結(jié)合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌莢膜糖、腦膜炎球菌莢膜糖、b型流感嗜血桿菌莢膜糖相互間沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的多價(jià)細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟 (a)從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖； (b)將步驟(a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群)的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖； (c)將步驟(b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合并純化，制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原； (d)將步驟(c)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。 在本發(fā)明術(shù)語(yǔ)中，莢膜糖包括莢膜多糖和莢膜寡糖；所述莢膜寡糖是莢膜多糖經(jīng)水解法(包括酸、堿、酶水解)、氧化法和消除法(包括堿或裂解酶介導(dǎo)的P消除法)等化學(xué)方法降解后的莢膜寡糖；進(jìn)一步，所述莢膜寡糖還包括莢膜多糖經(jīng)超聲波降解法和機(jī)械剪切等物理方法降解后的莢膜寡糖。 在本發(fā)明術(shù)語(yǔ)中，單價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體是指一個(gè)單一血清型
(群)莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成的結(jié)合物，該莢膜糖與其它型(群)莢膜糖沒(méi)有結(jié)構(gòu)上的鏈接。2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體是指2個(gè)不同血清型(群)莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成結(jié)合物，此2個(gè)型(群)莢膜糖經(jīng)與蛋白載體生成化學(xué)鍵彼此間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接。換言之，蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵將2個(gè)不同型(群)莢膜糖鏈接在一起。多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體是指3個(gè)或3個(gè)以上的不同血清型(群)莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成結(jié)合物，此3個(gè)或3個(gè)以上的型(群)莢膜糖經(jīng)與蛋白載體生成化學(xué)鍵相互間建立結(jié)構(gòu)上的鏈接。換言之，蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵將3個(gè)或3個(gè)以上的不同型(群)莢膜糖鏈接在一起。 本發(fā)明提供來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結(jié)合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備莢膜糖的肺炎球菌血清型選自于 肺炎球菌全部血清型菌株，優(yōu)選45個(gè)型菌株，更優(yōu)選1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株，最優(yōu)選1、2、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F型菌株。進(jìn)一步，制備莢膜糖的肺炎球菌血清型菌株是依據(jù)流 行病學(xué)流行優(yōu)勢(shì)血清型菌株而確定的。 本發(fā)明提供來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結(jié)合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)源于多個(gè)血清型菌株的莢膜糖抗原 任選地以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在 于疫苗中。優(yōu)選45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；更優(yōu)選24價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合 體；最優(yōu)選14價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；進(jìn)一步，優(yōu)選12價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合 體；優(yōu)選11價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選10價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選9 價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；優(yōu)選8價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體；優(yōu)選7價(jià)血清型莢膜 糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選6價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選5價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié) 合體；優(yōu)選4價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選3價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體；優(yōu)選2 價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體。換言之，例如，來(lái)源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的莢膜糖優(yōu)選地以24價(jià)血清 型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在；更優(yōu)選以12價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在；最 優(yōu)選以8價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在；進(jìn)一步，優(yōu)選以6價(jià)血清型莢膜糖_蛋 白結(jié)合體形式存在；優(yōu)選以4價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在；優(yōu)選以3價(jià)血清型 莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在；優(yōu)選以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在。所述來(lái) 源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、 33F型菌株的莢膜糖是以任選方式劃分為24價(jià)(l組)；12價(jià)(2組)；8價(jià)(3組)；6價(jià)(4 組)；4價(jià)(6組)；3價(jià)(8組)；2價(jià)(12組)。每組莢膜糖與蛋白載體結(jié)合后再混合組成本 發(fā)明疫苗。因此，24價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由1個(gè)24價(jià)血清型莢膜糖_蛋 白結(jié)合體所組成；12價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體疫苗是由2個(gè)不同的12價(jià)血清型莢膜 糖_蛋白結(jié)合體所組成；8價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由3個(gè)不同的8價(jià)血清型莢 膜糖_蛋白結(jié)合體所組成；6價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由4個(gè)不同的6價(jià)血清 型莢膜糖_蛋白結(jié)合體所組成；4價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由6個(gè)不同的4價(jià) 血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體所組成；3價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由8個(gè)不同的3 價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體所組成；2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體疫苗是由12個(gè)不同 的2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體所組成。 本發(fā)明提供來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結(jié)合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)源于多個(gè)血清型菌株的莢膜糖抗原 任選地以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式并以 組合方式存在于疫苗中。在本發(fā)明疫苗中，抗原優(yōu)選2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體 進(jìn)行組合；更優(yōu)選2 24價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；最優(yōu)選2 14價(jià)血清型 莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；進(jìn)一步，優(yōu)選2 12價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 11價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 10價(jià)血清型莢膜糖_蛋 白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 9價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 8價(jià)血清 型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 7價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu) 選2 6價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 5價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合 體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 4價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合；優(yōu)選2 3價(jià)血清型莢膜 糖-蛋白結(jié)合體進(jìn)行組合。換言之，例如，來(lái)源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的莢膜糖優(yōu)選地以2 24價(jià)血清 型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；更優(yōu)選以2 14價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的 組合形式存在；最優(yōu)選以2 12價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；進(jìn)一步， 優(yōu)選以2 11價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 10價(jià)血清型莢 膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 9價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形 式存在；優(yōu)選以2 8價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 7價(jià)血 清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 6價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的 組合形式存在；優(yōu)選以2 5價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 4 價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 3價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合 體的組合形式存在。2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體混 合后組成本發(fā)明疫苗。因此，本發(fā)明疫苗可同時(shí)包含2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和多 價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體。 本發(fā)明提供由2價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型肺炎球 菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體的組成的肺炎球菌結(jié)合疫苗，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先將 肺炎球菌莢膜糖劃分為2個(gè)和/或多個(gè)組，每個(gè)組包含2個(gè)血清型莢膜糖或多個(gè)血清型莢 膜糖。每個(gè)組所含的血清型莢膜糖經(jīng)合并后再與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，形成2價(jià)血清 型莢膜糖_蛋白結(jié)合體或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，進(jìn)而配制成疫苗成品。因此，將 血清型莢膜糖劃分成組的數(shù)量并且確定每組包含2個(gè)血清型莢膜糖或多個(gè)血清型莢膜糖 是依據(jù)莢膜糖分子量大小、總氮、磷、糖醛酸、己糖胺、甲基戊糖、0-乙酰基含量劃分。進(jìn)一 步，隨機(jī)地任選血清型莢膜糖進(jìn)行組合。 本發(fā)明提供來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結(jié)合疫苗，莢膜糖抗原任選地以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血 清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。其中，所述的2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合 體的制備是預(yù)先將2個(gè)來(lái)源于不同血清型莢膜糖合并，然后再與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)結(jié)合， 形成2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體。2個(gè)血清型莢膜糖均與載體蛋白產(chǎn)生化學(xué)鍵鏈接， 載體蛋白又依據(jù)化學(xué)鍵將2個(gè)莢膜糖在結(jié)構(gòu)上形成鏈接。所述的多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白 結(jié)合體的制備是預(yù)先將多個(gè)來(lái)源于不同血清型莢膜糖合并，然后再與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)結(jié) 合，形成多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體。多個(gè)血清型莢膜糖均與載體蛋白產(chǎn)生化學(xué)鍵鏈 接，載體蛋白又依據(jù)化學(xué)鍵將多個(gè)莢膜糖在結(jié)構(gòu)上形成鏈接。因此，來(lái)源于不同血清型莢膜 糖預(yù)先合并的相互間比例是確定本發(fā)明結(jié)合疫苗成品中各型抗原含量的主要條件之一，莢 膜糖合并比例根據(jù)莢膜糖種類(多糖或寡糖)、莢膜糖結(jié)構(gòu)特征、莢膜糖_蛋白結(jié)合體價(jià)數(shù)、 結(jié)合方法及工藝條件等因素而變化。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，莢膜糖相互間合并重量 比優(yōu)選為l : 0.05 20(w/w)(本發(fā)明所述w/w系指重量比，例如iig/iig)的比例合并，更
14優(yōu)選的合并重量比為i : o. i 10(w/V)，最優(yōu)選的合并重量比為i : o. 2 5(w/w)。莢 膜糖合并有多種其它的重量比，在此所述重量比僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明。所以，可以采用各
種等同的莢膜糖合并重量比實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的2價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體或多價(jià)血清
型莢膜糖-蛋白結(jié)合體。 本發(fā)明提供來(lái)源于肺炎球菌多個(gè)血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結(jié)合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白載體選自破傷風(fēng)類毒素(TT)、 白喉類毒素(DT)、白喉毒素?zé)o毒變異體(CRM197) 、 B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球 菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血桿菌 D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)、銅綠假單胞菌 外毒素A(PEA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。更優(yōu)選TT、DT、CRM197和0MP。最優(yōu)選DT和CRM197。 總之，選用上述蛋白作為最常見(jiàn)的載體和細(xì)菌類莢膜糖結(jié)合制備結(jié)合疫苗是本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的方案，例如選用這些蛋白載體制備b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、制備肺炎球菌結(jié) 合疫苗、制備腦膜炎球菌結(jié)合疫苗(Lee， Chi-Jen等人Infect Medl9(3) : 127-133， 2002)。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合肺炎球菌多糖的蛋白載體最優(yōu)選為DT。如果滿足需要，也 可采用其它蛋白載體，此處給出的蛋白載體僅僅是為了例示性說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明的肺炎球菌結(jié)合疫苗的又一方案，將來(lái)源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、
Ply等合并成為肺炎球菌蛋白復(fù)合物，再將此蛋白復(fù)合物作為蛋白載體與莢膜糖進(jìn)行結(jié)合。
一方面，肺炎球菌蛋白復(fù)合物發(fā)揮蛋白載體的功效，將莢膜糖由T細(xì)胞非依賴型抗原轉(zhuǎn)變 成T細(xì)胞依賴型抗原，產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)。另一方面，肺炎球菌蛋白復(fù)合物又作為蛋白抗原 參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且擴(kuò)大了結(jié)合疫苗交叉免疫保護(hù)范圍，增強(qiáng)疫苗的免疫效力。
在本發(fā)明中，肺炎球菌莢膜糖的制備和質(zhì)量控制的方法及標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，技術(shù)人員可依據(jù)世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球 菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和中華人民共 和國(guó)藥典三部(2005年版)等技術(shù)文件制備莢膜糖并進(jìn)行質(zhì)量檢定。 在本發(fā)明中，單價(jià)莢膜糖和蛋白載體結(jié)合的方法以及對(duì)單價(jià)莢膜糖-蛋白結(jié)合 體進(jìn)行質(zhì)量控制的方法及標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(Pawlowski et al. Vaccine 2000 ;18 :1873-1885 ;Wessels et al. J. Clin. Invest. 1990 ;86 :1428-1433 ;WHOTechnical Report Series.No. 897. 2000 ;WHO Technical Report Series. No. 924. 2004 ;WHO Technical R印ort Series. No. 927. 2005 ;羅賓遜等，疫苗關(guān)鍵技術(shù)詳解。化學(xué)工業(yè)出版社， 2006年，165-178頁(yè)；張延齡等，疫苗學(xué)。科學(xué)出版社，2004年，506_517、652-653、679_681、 699-700、896-902、918-925、943-945、961-964、968-978頁(yè)；)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案 中，2價(jià)或多價(jià)莢膜糖和蛋白載體結(jié)合方法可選用任何已知的單價(jià)莢膜糖和蛋白載體結(jié)合 的方法進(jìn)行制備，優(yōu)選自還原胺法、酰胺縮合法、硫醚縮合法、二硫化反應(yīng)法、硫代氨甲酰反 應(yīng)法、0-烷基異脲化反應(yīng)法、重氮結(jié)合反應(yīng)法，更優(yōu)選還原胺法和酰胺縮合法，最優(yōu)選2種 法或多種方法的聯(lián)合應(yīng)用。技術(shù)人員可參照世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制 造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)制備2價(jià)或多價(jià)莢膜糖-蛋 白結(jié)合體并進(jìn)行質(zhì)量檢定。在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，先用溴化氰(CNBr)或氰化劑 (1-氰基_4- 二甲基氨基-吡啶四氟硼酸，CDAP)對(duì)2價(jià)莢膜糖或多價(jià)莢膜糖進(jìn)行活化處 理，再以己二酰肼(ADH)為雙功能親核間隔基加入已活化的莢膜糖中，形成莢膜糖-ADH衍生物，再經(jīng)過(guò)碳二亞胺(EDAC)介導(dǎo)的縮合作用與蛋白載體共價(jià)結(jié)合，形成2價(jià)莢膜糖-蛋 白結(jié)合體或多價(jià)莢膜糖_蛋白結(jié)合體，再經(jīng)純化獲得用于配制肺炎球菌結(jié)合疫苗的抗原組 分。莢膜糖與蛋白的結(jié)合有多種已知的方法，在此所述的結(jié)合方法僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明。 所以，可以采用各種等同的方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的結(jié)合，因此任何用于莢膜糖與蛋白載體 結(jié)合的方法和工藝或者過(guò)程都有可能用于實(shí)施本發(fā)明。 本發(fā)明提供制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法。其中，所述細(xì)菌包括但不限于肺 炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜 糖的細(xì)菌。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌優(yōu)選肺炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿 菌。在本發(fā)明中，制備莢膜糖的細(xì)菌菌種購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理 中心(CMCC)或美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物收藏中心(ATCC)。 本發(fā)明提供制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案 中，兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群)莢膜糖依據(jù)重量比合并后，對(duì)其進(jìn)行勻化處理，益于不同 血清型(群)莢膜糖與蛋白載體的結(jié)合較為均衡。優(yōu)選的勻化處理方法是超聲處理；優(yōu)選 的參數(shù)是25 75Hz 2 10分鐘。 本發(fā)明提供制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案 中，對(duì)2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合 體抗原進(jìn)行脫毒處理，益于降低多價(jià)細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗在大量增加莢膜糖抗原價(jià)數(shù)后的 副反應(yīng)。脫毒劑優(yōu)選自甲醛、戊二醛、過(guò)氧化氫，更優(yōu)選戊二醛。 因此，本發(fā)明提供制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血 清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法。所述方法進(jìn)一步包括以下 步驟 (a)從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖。其中，所述細(xì)菌包括但不限于肺炎球菌、腦膜炎 球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜糖的細(xì)菌；
(b)將步驟(a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群) 的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖。其中，所述莢膜糖合并后進(jìn) 一步經(jīng)勻化處理； (c)將步驟(b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，制 成2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗 原； (d)將步驟(c)的產(chǎn)物脫毒處理并純化制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合 體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原； (e)將步驟(d)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。 在本發(fā)明提供的肺炎球菌結(jié)合疫苗和細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗中，疫苗劑量按照藥學(xué) 領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。例如，在確定劑量時(shí)應(yīng)考慮到抗原特性、佐劑
16性質(zhì)、接種者的年齡、疫苗接種途徑等諸因素。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，成品疫苗優(yōu)選 的每一血清型(群)莢膜糖劑量為0. 1 50 g，更優(yōu)選的每一血清型(群)莢膜糖劑量為 1 25 i！ g，最優(yōu)選的每一血清型(群)莢膜糖劑量為2 10 i！ g。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，肺炎球菌結(jié)合疫苗和細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗還可包含 本領(lǐng)域常用的佐劑。優(yōu)選的佐劑有鋁佐劑、磷酸鈣佐劑、霍亂毒素B亞單位(CTB)、皁角素 Q21、類脂體、單磷酸類脂A(MPL)、 MF59、大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，更優(yōu)選的佐劑是鋁佐 劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。 在本發(fā)明提供的肺炎球菌結(jié)合疫苗和細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗中，疫苗的劑型和配伍 按照藥學(xué)領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗 劑型優(yōu)選是液體劑型、凍干劑型、丸劑、片劑、膠囊劑型，更優(yōu)選是液體劑型或凍干劑型，最 優(yōu)選是液體劑型。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，肺炎球菌結(jié)合疫苗和細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗可以是無(wú) 防腐劑疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的另一實(shí)施方案中，聯(lián)合疫苗包含防腐劑，優(yōu)選的防腐劑是硫柳 汞、2_苯氧乙醇、苯甲醇。 本發(fā)明提供的肺炎球菌結(jié)合疫苗和細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗，接種途徑包括皮內(nèi)注 射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，還包括經(jīng)鼻腔、口腔、肛門(mén)、陰道、黏膜途徑給藥。
本發(fā)明的肺炎球菌結(jié)合疫苗及細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗制備方法與現(xiàn)有肺炎球菌結(jié) 合疫苗及其制備方法相比較，包括與當(dāng)前已上市的肺炎球菌結(jié)合疫苗例如PCV7和即將上 市的PCV13及其制備方法的比較，進(jìn)一步與已公開(kāi)的專利文本所述的肺炎球菌結(jié)合疫苗及 制備方法例如中國(guó)專利200680017776. 8、00807773. 8、92100700. 0、00807759. 2、02827993. X、01815748. 3、200680052954. 0、200680053139. 6、200610054832. 7的比較，更進(jìn)一步與中 國(guó)專利03141407. 9的比較，其區(qū)別及有益效果在于 (1)本發(fā)明疫苗所含抗原結(jié)構(gòu)不同。現(xiàn)有肺炎球菌結(jié)合疫苗在技術(shù)上均是將來(lái)源 于每一個(gè)血清型的莢膜糖獨(dú)立與蛋白載體經(jīng)化學(xué)結(jié)合后，形成單價(jià)的血清型莢膜糖-蛋白 結(jié)合體，再將各個(gè)單價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體混合，進(jìn)而配制成為含多血清型莢膜糖 的肺炎球菌結(jié)合疫苗。因此，現(xiàn)有肺炎球菌結(jié)合疫苗中所含各個(gè)血清型莢膜糖抗原以單價(jià) 莢膜糖-蛋白結(jié)合體獨(dú)立存在，各個(gè)血清型莢膜糖彼此并無(wú)結(jié)構(gòu)上的鏈接。本發(fā)明疫苗是 將不同血清型的莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上的血清型莢膜糖預(yù)先合并后再與蛋白載體經(jīng)化 學(xué)鍵結(jié)合后，形成2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，再將 各個(gè)2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體混合，進(jìn)而配 制成為含多血清型莢膜糖的肺炎球菌結(jié)合疫苗。因此，本發(fā)明疫苗中所含各個(gè)血清型莢膜 糖抗原以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體存在，并 且，2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體中各個(gè)血清型莢膜糖 彼此有結(jié)構(gòu)上的鏈接。 (2)本發(fā)明疫苗所含抗原分子量更大。本發(fā)明疫苗所含的2價(jià)血清型莢膜糖_蛋 白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，由于依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合2價(jià) 或多價(jià)莢膜糖在結(jié)構(gòu)上相互間形成鏈接，莢膜糖抗原分子量間接被增大。因此，本發(fā)明疫苗 較單價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體有更好的免疫原性。 (3)本發(fā)明疫苗減少蛋白載體免疫競(jìng)爭(zhēng)。本發(fā)明疫苗所含抗原是2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，不同血清型莢膜糖依據(jù)與蛋白載 體的化學(xué)鍵結(jié)合在結(jié)構(gòu)上相互間形成鏈接。因此，較單價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體而言， 本發(fā)明疫苗所含的2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體 抗原中的蛋白載體總量減少，導(dǎo)致與莢膜糖應(yīng)答的B細(xì)胞較與蛋白載體應(yīng)答的B細(xì)胞占優(yōu) 勢(shì)，并競(jìng)爭(zhēng)更多Th細(xì)胞參與到B細(xì)胞應(yīng)答莢膜糖的過(guò)程中，從而減少蛋白載體誘導(dǎo)的表位 抑制效應(yīng)。 (4)本發(fā)明疫苗所含抗原更穩(wěn)定。本發(fā)明疫苗所含的2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié) 合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體，由于依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合2價(jià)血清 型莢膜糖或多價(jià)血清型莢膜糖在結(jié)構(gòu)上相互間形成鏈接，因此，本發(fā)明疫苗所含莢膜糖抗 原較現(xiàn)有技術(shù)的單價(jià)莢膜糖更具穩(wěn)定性。 (5)本發(fā)明提供了一種制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多 價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法，所述方法包括以下步 驟 (a)從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖； (b)將步驟(a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群) 的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖； (c)將步驟(b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合并 純化，制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白 結(jié)合體抗原； (d)將步驟(c)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。 (6)本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/ 或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法，所述方法包括以 下步驟 (a)從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖。其中，所述細(xì)菌包括但不限于肺炎球菌、腦膜炎 球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜糖的細(xì)菌；
(b)將步驟(a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群) 的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖。其中，所述莢膜糖合并后進(jìn) 一步經(jīng)勻化處理； (c)將步驟(b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，制 成2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗 原； (d)將步驟(c)的產(chǎn)物脫毒處理并純化制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合 體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原； (e)將步驟(d)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型 (群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。 本發(fā)明通過(guò)如下實(shí)施例，但非限制，舉例進(jìn)一步描述本發(fā)明的核心內(nèi)容，所述實(shí)施例闡述本發(fā)明的概念和幾個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明的其它實(shí)施例在不背離本發(fā)明的核心 的前提下為本領(lǐng)域技術(shù)人員所預(yù)見(jiàn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明可通過(guò)如下實(shí)施例進(jìn)一步了解，所述實(shí)施例選擇了幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，僅 為了更好展示本發(fā)明，而非對(duì)發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行限制。
實(shí)施例 實(shí)施例1肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)及莢膜多糖的制備 將低溫保藏的肺炎球菌凍干菌種啟開(kāi)，用生理氯化鈉溶液復(fù)溶后，接種至5 10%羊血瓊脂斜面培養(yǎng)基，置5 8% C02環(huán)境中，于35 37t:培養(yǎng)16 24小時(shí)。轉(zhuǎn)種至 肺炎球菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于35 37t:培養(yǎng)10 18小時(shí)。繼續(xù)轉(zhuǎn)種至肺炎球菌液體基礎(chǔ) 培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，于35 37t:培養(yǎng)10 18小時(shí)。按5 10%接種量將增菌后的肺炎 球菌液體培養(yǎng)物接種至已加入液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，攪拌、通氣培養(yǎng)，于35 37°C 培養(yǎng)8 12小時(shí)，pH控制在6. 0 7. 4之間。發(fā)酵培養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)細(xì)菌濃度變化，鏡檢培養(yǎng) 物純度及菌體形態(tài)特征。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，按發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基的量加入終濃度為0.05 0. 20%去氧膽酸鈉裂解菌體細(xì)胞，攪拌20 60分鐘，終止發(fā)酵培養(yǎng)。 用連續(xù)流離心機(jī)離心去除菌體細(xì)胞碎片，收集上清液。對(duì)上清液進(jìn)行超濾濃縮，超 濾膜規(guī)格選用50 IOOKD，濃縮倍數(shù)至原體積的1/5 1/20。置超濾后的濃縮液于生理氯 化鈉溶液中進(jìn)行透析。向透析后的濃縮液加入乙酸鈉至終濃度3 10%，攪拌至充分溶解， pH調(diào)至4. 8 6. 4。繼續(xù)于2 8t:環(huán)境中緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇至終濃度15 60%， 攪拌15 45分鐘，經(jīng)12， 000 16， 000g、2 8"超速離心，收集上清液。于上清液中繼續(xù) 加入乙酸鈉至終濃度5 15X，攪拌至充分溶解，pH維持4. 8 6. 4。繼續(xù)于2 8"環(huán)境 中緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇至終濃度30 80%，攪拌15 45分鐘，經(jīng)2， 200 2， 800g、 2 『C離心，收集粗多糖沉淀物。抽真空，_201:儲(chǔ)存，待進(jìn)一步純化。
將粗多糖加入0. 3 0. 6M的乙酸鈉溶液中，pH調(diào)至6. 5 7. 2，于2 8T環(huán)境 中攪拌至完全溶解。再加入冷酚至終濃度65 75%進(jìn)行抽提，經(jīng)14， 000 18， 000超速離 心，收集上清液。重復(fù)冷酚抽提步驟2 4次。收集的上清液于2 『C經(jīng)透析，除去殘留 酚，透析液為注射用水。于2 『C環(huán)境中緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇至終濃度40 90%， 攪拌15 45分鐘，經(jīng)2， 200 2， 800g、2 8t:離心，收集多糖沉淀物。多糖沉淀物經(jīng)無(wú)水 乙醇和丙酮浸泡、洗滌各2 4次，干燥后用注射用水溶解，再經(jīng)0. 22 ii m除菌過(guò)濾得到純 化多糖，以液體或凍干形式儲(chǔ)存于-2(TC以下。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫 苗制造及檢定規(guī)程(WHO TechnicalR印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)純化 多糖進(jìn)行檢定。 按照上述方法分別制備肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖。
實(shí)施例2肺炎球菌莢膜寡糖的制備 將純化多糖溶解于0. 2 1. 0M乙酸溶液中至終濃度1 4mg/ml，浸入70 IO(TC 油浴或水浴中水解6 40小時(shí)。水解后將pH調(diào)至7. 0，于2 8"透析。再經(jīng)S印harose 4FF層析柱純化，用15mM NaCl液洗脫，收集寡糖。通過(guò)0. 22 y m除菌過(guò)濾得到純化寡糖，以液體或凍干形式儲(chǔ)存于-20°C以下。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及 檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)純化寡糖進(jìn)行 檢定。 按照上述方法分別制備肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、
12F、 14、 15B、 17F、 18C、 19A、 19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖。 實(shí)施例3腦膜炎球菌莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖的制備 按照中國(guó)專利200710007045. 1方法制備A群、C群、W135群、Y群腦膜炎球菌莢膜
多糖和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖。 再按照本發(fā)明實(shí)施例2方法制備A群、C群、W135群、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖和 b型流感嗜血桿菌莢膜寡糖。 按世界衛(wèi)生組織正式頒布的腦膜炎球菌多糖疫苗制造及檢定規(guī)程(WHOTechnical R印ort Series, No. 658， 1980)和b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 897， 2000)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)純化多糖和寡糖進(jìn)行檢定。
實(shí)施例4蛋白載體_白喉類毒素(DT)的制備 將低溫保存的白喉?xiàng)U菌凍干菌種啟開(kāi)，用生理氯化鈉溶液復(fù)蘇，接種至血瓊脂斜 面培養(yǎng)基，于33 36t:培養(yǎng)16 20小時(shí)。轉(zhuǎn)種至改良林氏肉湯培養(yǎng)基，于33 36。C培 養(yǎng)16 20小時(shí)。再轉(zhuǎn)種至改良林氏肉湯培養(yǎng)基，于33 36t:培養(yǎng)16 20小時(shí)。繼續(xù)轉(zhuǎn) 種至含改良林氏肉湯培養(yǎng)基的菌種瓶?jī)?nèi)進(jìn)行增菌培養(yǎng)，于33 36t:培養(yǎng)36 72小時(shí)。將 菌種瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至含改良林氏肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)，在通氣、攪拌、PH7. 0 8. 5條 件下，于33 36t:培養(yǎng)40 56小時(shí)。發(fā)酵完畢，加入終濃度O. 1 0. 5%的甲醛滅菌處 理，經(jīng)離心收集上清液。上清液經(jīng)0. 22 ii m濾器除菌過(guò)濾，再經(jīng)30 50KD膜超濾濃縮。分 別加入NaHC03至終濃度0. 45 0. 55%、活性碳至終濃度0. 72 0. 78 % 、 (NH4) 2S04至終濃 度28.0 30.0%，攪拌30分鐘，置室溫靜置12 18小時(shí)。離心收集上清液。于收集的上 清液中加入(NH4)2S04至終濃度42. 0 45. 0%，攪拌30分鐘，置室溫靜置4 8小時(shí)。離 心收集沉淀并溶于0. 1 % NaHC03溶液中。于2 8°C 、透析60 72小時(shí)后，再經(jīng)0. 22 y m 濾器除菌過(guò)濾。除菌過(guò)濾后的液體加入賴氨酸至終濃度1. 0 2. 0%，再加入甲醛至終濃度 0. 4 0. 6%， pH調(diào)至6. 8 7. 0，置37 40。C脫毒42 48天。脫毒后的DT原液按《中 華人民共和國(guó)藥典》(2005年版)規(guī)定項(xiàng)目和方法檢定，檢定合格后原液置2 8t:保存?zhèn)?用。 實(shí)施例5莢膜糖-蛋白結(jié)合疫苗的制備 (1)肺炎球菌24價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(24價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體)
將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖用注射用水稀釋并按各型多糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的多糖濃度為2.0 10. Omg/型多糖/ml。超聲勻化處理25 75Hz 2 10分鐘。加入溴化氰活化多糖至終濃度1. 0 4. Omg/mg總多糖，用NaOH調(diào)節(jié)pH并維持 pH9. 5 11. 5，于20 26。C攪拌30 60分鐘。再加入己二酰肼至終濃度12. 0 18. Omg/ ml，調(diào)節(jié)并維持pH8. 0 10. O，保持15 30分鐘。于20 26。C攪拌30 60分鐘，再置 在2 『C攪拌18 24小時(shí)，形成多糖_己二酰肼衍生物。將多糖_己二酰肼衍生物于 2 8。C透析72 96小時(shí)，再經(jīng)0. 45 ii m濾器除菌過(guò)濾。將DT稀釋至1. 0 4. Omg/ml，按
20多糖_己二酰肼衍生物DT為1 : 0. 5 2比例(v/v)將DT加入多糖-己二酰肼衍生物 中，調(diào)節(jié)并維持pH5. 0 6. 0。加入碳二亞胺至終濃度20 30mg/ml，調(diào)節(jié)并維持pH5. 0 6. O，維持60 90分鐘后，調(diào)節(jié)并維持p朋.5 7. 5。加入戊二醛至終濃度0. 05 0. 15% 脫毒處理，維持4 6小時(shí)。置2 8"透析72 120小時(shí)，經(jīng)100 300KD超濾膜超濾濃 縮。用S印harose 4FF層析柱純化多糖_DT結(jié)合物，收集多糖_DT結(jié)合物，再經(jīng)0. 22 y m濾 器除菌過(guò)濾，獲得24價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液。用注射用水稀釋24價(jià)肺炎球菌多 糖-DT結(jié)合體原液、磷酸鋁、氯化鈉、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分別為結(jié)合DT 的各血清型多糖2 lOii g/ml、磷酸鋁1. 0 1. 5mg/ml、氯化鈉7. 5 9. 5mg/ml、2_苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH調(diào)至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分裝西林瓶并封口 。按世界 衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定，檢定合格后為肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗。
(2)肺炎球菌24價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(24價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體)
將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖用注射用水稀釋并按各型寡糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的寡糖濃度為2. 0 10. Omg/型寡糖/ml。加入溴化氰活化寡糖至 終濃度1. 0 4. Omg/mg總寡糖，用NaOH調(diào)節(jié)pH并維持pH9. 5 11. 5，于20 26。C攪拌 30 60分鐘。再加入己二酰肼至終濃度12. 0 18. Omg/ml，調(diào)節(jié)并維持pH8. 0 10. 0， 保持15 30分鐘。于20 26。C攪拌30 60分鐘，再置在2 8。C攪拌18 24小時(shí)， 形成寡糖_己二酰肼衍生物。將寡糖_己二酰肼衍生物于2 『C透析72 96小時(shí)，再 經(jīng)0. 45 ii m濾器除菌過(guò)濾。將DT稀釋至1. 0 4. Omg/ml，按寡糖-己二酰肼衍生物DT 為1 : 0. 5 2比例(v/v)將DT加入寡糖-己二酰肼衍生物中，調(diào)節(jié)并維持pH5. 0 6. 0。 加入碳二亞胺至終濃度20 30mg/ml，調(diào)節(jié)并維持pH5. 0 6. 0，維持60 90分鐘后，調(diào) 節(jié)并維持P朋.5 7. 5。置2 8t:透析72 120小時(shí)，經(jīng)100 300KD超濾膜超濾濃 縮。用S印harose 4FF層析柱純化寡糖-DT結(jié)合物，收集多糖-DT結(jié)合物，再經(jīng)0. 22 y m濾 器除菌過(guò)濾，獲得24價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液。用注射用水稀釋24價(jià)肺炎球菌寡 糖-DT結(jié)合體原液、磷酸鋁、氯化鈉、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分別為結(jié)合DT 的各血清型寡糖2 10ii g/ml、磷酸鋁1. 0 1. 5mg/ml、氯化鈉7. 5 9. 5mg/ml、2-苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH調(diào)至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分裝西林瓶并封口 。按世界 衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定，檢定合格后為肺炎球菌寡糖結(jié)合疫苗。
本實(shí)施例(1)方法與本實(shí)施例(2)方法不同之處在于，后者沒(méi)有超聲勻化處理和 戊二醛脫毒處理兩個(gè)步驟。 (3)肺炎球菌24價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(12價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+12價(jià)多糖-蛋 白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、6B、7F、9V、 14、 18C、 19F、23F，第2組包括6A、8、9N、IOA、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、20、22F、33F。分別用注 射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不同血清型多糖的12價(jià)肺炎球菌 多糖-DT結(jié)合體原液，再將此2組不同血清型多糖的12價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (4)肺炎球菌24價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(12價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+12價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2組包括5、8、9N、9V、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、 19F、22F、33F。分別用 注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的12價(jià)肺炎球 菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此2組不同血清型寡糖的12價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液 按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (5)肺炎球菌24價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(12價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+12價(jià)寡 糖-蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、7F、IOA、IIA、 14、15B、20、23F多糖，第2組包括6A、6B、8、9N、9V、12F、17F、18C、19A、19F、22F、33F寡糖。分
別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備一組不同血清型多糖的 12價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和另一組不同血清型寡糖的12價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié) 合體原液，再將此2組不同血清型多糖和寡糖的12價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和12 價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。
(6)肺炎球菌24價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(8價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+8價(jià)多糖-蛋白 結(jié)合體+8價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、9V、 14、 18C、 19F，第2組包括6A、8、9N、12F、15B、17F、19A、22F，第3組包括2、5、6B、IOA、 11A、20、23F、
33F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備3組不同血清型多糖的 8價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此3組不同血清型多糖的8價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié) 合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (7)肺炎球菌24價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(8價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+8價(jià)寡糖-蛋白 結(jié)合體+8價(jià)寡糖_蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、9N、9V、 18C、 20，第2組包括2、6A、6B、12F、14、15B、17F、22F，第3組包括5、8、IOA、IIA、 19A、 19F、23F、
33F。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備3組不同血清型寡糖的 8價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此3組不同血清型寡糖的8價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié) 合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (8)肺炎球菌24價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(8價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+8價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+8價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、IOA、IIA、 14、20 多糖，第2組包括6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、23F寡糖，第3組包括2、5、8、 12F、 15B、 17F、
2222F、33F多糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不 同血清型多糖的8價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和另一組不同血清型寡糖的8價(jià)肺炎球 菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此3組不同血清型多糖和寡糖的8價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合 體原液和8價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢 定。 (9)肺炎球菌24價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(6價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+6價(jià)多糖-蛋白 結(jié)合體+6價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體+6價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為4組；第1組包括1、3、4、7F、 18C、 19F，第 2組包括6A、8、9N、 12F、 17F、 19A，第3組包括2、9V、 IIA、 14、23F、33F，第4組包括5、6B、 IOA、 15B、20、22F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備4組不同血清 型多糖的6價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型多糖的6價(jià)肺炎球菌 多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。
(10)肺炎球菌24價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(6價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+6價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+6價(jià)寡糖_蛋白結(jié)合體+6價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為4組；第1組包括3、4、7F、9N、 12F、 18C，第 2組包括5、6A、8、17F、19A、19F，第3組包括2、9V、 IOA、 11A、22F、23F，第4組包括1、6B、14、 15B、20、33F。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備4組不同血清 型多糖的6價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型寡糖的6價(jià)肺炎球菌 寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。
(11)肺炎球菌24價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(6價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+6價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+6價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體+6價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為4組；第1組包括1、3、4、 11A、20、33F多糖， 第2組包括6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖，第3組包括2、5、8、 15B、 17F、22F多糖，第4組包 括7F、9N、9V、10A、12F、14寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例(1) 方法制備2組不同血清型多糖的6價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和另2組不同血清型寡 糖的6價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型多糖和寡糖的6價(jià)肺炎球 菌多糖-DT結(jié)合體原液和6價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫 苗成品并進(jìn)行檢定。 (12)肺炎球菌24價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(12價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+6價(jià)多糖-蛋 白結(jié)合體+4價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為4組；第1組包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2組包括IIA、 12F、 15B、 17F、22F、33F，第3組包括5、8、9N、9V，第4 組包括19A、19F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備4組不同血 清型多糖的12價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、6價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、4價(jià)肺 炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型
23多糖的12價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、6價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、4價(jià)肺炎球 菌多糖-DT結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫 苗成品并進(jìn)行檢定。 (13)肺炎球菌14價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(14價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖
用注射用水稀釋合并，按本實(shí)施例(1)方法制備14價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將
此14價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 本實(shí)施例(1)方法與本實(shí)施例(12)方法不同之處在于，后者成品疫苗配制時(shí)不添
加2-苯氧乙醇。因此本實(shí)施例(12)成品疫苗中不含任何防腐劑。 (14)肺炎球菌14價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(14價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖
用注射用水稀釋合并，按本實(shí)施例(1)方法制備14價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將
此14價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 本實(shí)施例(1)方法與本實(shí)施例(13)方法不同之處在于，后者成品疫苗配制時(shí)不添
加2-苯氧乙醇。因此本實(shí)施例(13)成品疫苗中不含任何防腐劑。 (15)肺炎球菌14價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(7價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+7價(jià)多糖-蛋 白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、9V、23F多糖，第2組包括6A、6B、7F、 14、 18C、 19A、 19F多
糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不同血清型多糖的7 價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此2組不同血清型多糖的7價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié) 合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (16)肺炎球菌14價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(7價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+7價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖 分為2組；第1組包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2組包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡 糖。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的7 價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此2組不同血清型寡糖的7價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié) 合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (17)肺炎球菌14價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(7價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+7價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為2組；第1組包括1、2、3、4、7F、9V、14多糖，第2組包括5、6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖。 分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備一組不同血清型多糖 的7價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和另一組不同血清型寡糖的7價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié) 合體原液，再將此2組不同血清型多糖和寡糖的7價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和7價(jià) 肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。
(18)肺炎球菌14價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(4價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+4價(jià)多糖-蛋 白結(jié)合體+4價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體)
將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為4組；第1組包括1、7F、9V、18C多糖，第2組包括14、 19A、 19F、23F多糖，第3組包括2、 3、4、5多糖，第4組包括6A、6B多糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1) 方法制備3組不同血清型多糖的4價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和1組不同血清型多糖 的2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型多糖的4價(jià)肺炎球菌多糖-DT 結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn) 行檢定。 (19)肺炎球菌14價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(4價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+4價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+4價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖 分為4組；第1組包括1、3、5、9V寡糖，第2組包括2、7F、18C、23F寡糖，第3組包括4、6A、 6B、 14寡糖，第4組包括19A、 19F寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1) 方法制備3組不同血清型寡糖的4價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液和1組不同血清型寡糖 的2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此4組不同血清型寡糖的4價(jià)肺炎球菌寡糖-DT 結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn) 行檢定。 (20)肺炎球菌14價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(4價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+4價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+4價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為4組；第1組包括2、5、7F、23F多糖，第2組包括4、6A、6B、18C寡糖，第3組包括1、3、9V、 14多糖，第4組包括19A、19F寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例 (1)方法制備2組不同血清型多糖的4價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、1組不同血清型寡 糖的4價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液和1組不同血清型寡糖的2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié) 合體原液，再將此4組不同血清型多糖的4價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液、4價(jià)肺炎球菌 寡糖-DT結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗 成品并進(jìn)行檢定。 (21)肺炎球菌14價(jià)多糖結(jié)合疫苗的制備(2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋 白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)多 糖_蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為7組；第1組包括1、9V多糖，第2組包括7F、 18C多糖，第3組包括14、23F多糖，第4 組包括19A、19F多糖，第5組包括2、3多糖，第6組包括4、5多糖，第7組包括6A、6B多糖。 分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實(shí)施例(1)方法制備7組不同血清型多糖的2價(jià) 肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液，再將此7組不同血清型多糖的2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合 體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (22)肺炎球菌14價(jià)寡糖結(jié)合疫苗的制備(2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡 糖_蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖_蛋白結(jié)合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖分為7組；第1組包括1、3寡糖，第2組包括5、9V寡糖，第3組包括2、23F寡糖，第4組包 括7F、 18C寡糖，第5組包括6A、6B寡糖，第6組包括4、 14寡糖，第7組包括19A、 19F寡糖。 分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備7組不同血清型寡糖的2價(jià) 肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此7組不同血清型寡糖的2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合 體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。 (23)肺炎球菌14價(jià)莢膜糖結(jié)合疫苗的制備(2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋 白結(jié)合體+2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體2價(jià)多糖-蛋白結(jié)合體+2價(jià)寡 糖_蛋白結(jié)合體+2價(jià)多糖_蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為7組；第1組包括2、23F多糖，第2組包括6A、6B寡糖，第3組包括5、7F多糖，第4組包 括4、 18C寡糖，第5組包括9V、 14多糖，第6組包括19A、 19F寡糖，第7組包括1、3多糖。分 別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備4組不同血清型多糖的 2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和3組不同血清型寡糖的2價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體 原液，再將此7組不同血清型多糖的2價(jià)肺炎球菌多糖-DT結(jié)合體原液和2價(jià)肺炎球菌寡 糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品并進(jìn)行檢定。
(24)肺炎腦膜炎聯(lián)合疫苗的制備(15價(jià)多糖蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、4、5、6A、6B、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F純化莢膜多糖和腦膜 炎球菌A群、C群、W135群、Y群純化莢膜多糖用注射用水稀釋合并，按本實(shí)施例(1)方法制 備15價(jià)多糖-DT結(jié)合體原液，再將此15價(jià)多糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成 疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)和腦膜炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO BS 06.2041， 2006 ;WH0 TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定。
(25)肺炎腦膜炎Hib聯(lián)合疫苗的制備(17價(jià)寡糖蛋白結(jié)合體)
將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡 糖、腦膜炎球菌A群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌C群純化莢膜寡糖、b型流感嗜血桿菌純化 莢膜寡糖用注射用水稀釋合并，按本實(shí)施例(1)方法制備17價(jià)寡糖-DT結(jié)合體原液，再將 此17價(jià)寡糖-DT結(jié)合體原液按本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式 頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005) 和腦膜炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO BS 06. 2041,2006 ;WHO Technical R印ort Series, No. 924,2004)及b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 897,2000)規(guī)定方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定。 (26)肺炎腦膜炎Hib聯(lián)合疫苗的制備(7價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體+7價(jià)寡糖-蛋白結(jié) 合體+5價(jià)寡糖-蛋白結(jié)合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡 糖、腦膜炎球菌A群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌C群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌W135群純化 莢膜寡糖、腦膜炎球菌Y群純化莢膜寡糖、b型流感嗜血桿菌純化莢膜寡糖分為3組；第1 組包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2組包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡糖，第3組包括 腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群寡糖和b型流感嗜血桿菌寡糖。分別用注射用水稀釋 合并各組寡糖，按本實(shí)施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的7價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)
26合體原液和1組不同血型(群)的5價(jià)腦膜炎Hib寡糖-DT結(jié)合體原液，再將此3組不同 血清型寡糖的7價(jià)肺炎球菌寡糖-DT結(jié)合體原液和5價(jià)腦膜炎Hib寡糖-DT結(jié)合體原液按 本實(shí)施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結(jié)合疫苗制造及 檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和腦膜炎球菌結(jié)合疫苗制造及檢 定規(guī)程(WHO BS 06.2041,2006 ;WHO TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)及b型流感 嗜血桿菌結(jié)合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHOTechnical R印ort Series, No. 897,2000)規(guī)定方 法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定。 實(shí)施例6結(jié)合疫苗特異性毒性檢查 對(duì)實(shí)施例5所制備的26種疫苗取樣分別等量合并成26份樣品，每份樣品選用體 重250 350g豚鼠4只，每只腹側(cè)皮下注射樣品2. 5ml，觀察30天，記錄體重變化。結(jié)果顯 示所有樣品注射局部無(wú)壞死、無(wú)脫皮、無(wú)脫毛，無(wú)晚期麻痹癥狀，每只豚鼠體重比注射前均 有增加。說(shuō)明本發(fā)明制備的26種結(jié)合疫苗所使用的白喉類毒素載體經(jīng)過(guò)結(jié)合工藝處理后 沒(méi)有發(fā)生白喉毒素特異性毒性反應(yīng)，也沒(méi)有出現(xiàn)毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。
實(shí)施例7結(jié)合疫苗安全性檢查 對(duì)實(shí)施例5所制備的26種疫苗取樣，每份樣品分別選用體重18 22g小鼠5只 和體重250 350g豚鼠2只，每只小鼠腹腔注射樣品0. 5ml，每只豚鼠腹腔注射5. 0ml，觀 察7天，記錄體重變化。結(jié)果顯示觀察期內(nèi)所有小鼠、豚鼠均鍵存，且無(wú)異常反應(yīng)，到期時(shí)每 只小鼠、豚鼠體重比注射前均有增加。說(shuō)明本發(fā)明制備的26種疫苗中沒(méi)有污染外源性毒性 物質(zhì)，也沒(méi)有存在意外的不安全因子。
實(shí)施例8結(jié)合疫苗免疫原性測(cè)定 取實(shí)施例5制備的26種疫苗、肺炎球菌24個(gè)血清型多糖、腦膜炎球菌各血清群多 糖、Hib多糖和生理氯化鈉溶液腹腔免疫體重12 14g的NIH小鼠，每一樣品按照0、14、 28天程序免疫10只小鼠3針。結(jié)合疫苗組免疫劑量為所含各血清型(群)莢膜糖2 10 ii g/0. 5ml/次，多糖組免疫劑量與疫苗組所含各血清型(群)莢膜糖等量。初免后第35 天采血，分離血清。用ELISA方法測(cè)定抗體GMT值。將各血清型(群)多糖包被于96孔酶 標(biāo)板，置2 『C過(guò)夜。封閉后，加入系列稀釋的待測(cè)血清樣品，37t:反應(yīng)45分鐘。再加入 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG于37t:反應(yīng)45分鐘，最后加入底物四甲基聯(lián)苯胺，于暗 處顯色15分鐘，用終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定，計(jì)算血清抗體GMT。結(jié)果顯示疫苗 所含各血清型(群)莢膜糖較單獨(dú)多糖GMT有顯著性增長(zhǎng)。其中，肺炎球菌各血清型多糖 GMT為23 75，肺炎球菌結(jié)合疫苗中所含各血清型莢膜糖GMT為1864 8053。表1、表2 列舉了其中幾個(gè)疫苗免疫原性GMT測(cè)定數(shù)據(jù)。 綜上所述，說(shuō)明本發(fā)明制備的由2價(jià)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)莢膜糖_蛋
白結(jié)合體組成的肺炎球菌莢膜糖結(jié)合疫苗及其與腦膜炎球菌、Hib組成的細(xì)菌聯(lián)合結(jié)合疫
苗具有良好的安全性和免疫原性。
表l.肺炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性測(cè)定結(jié)果
疫苗 代碼
小鼠血清抗肺炎球菌各型莢膜糖抗體滴度(lgG GM'1')
4
6A 6B 7F
8
9N 9V 1 OA11A 12F 14 15B 17F 18C 19A 19F 20 22F 23F 3 3 F
(3) 3446 3046 5246 2735 4843 2054 2213 6845 2532 3786 4218 7263 3944 5446 5760 2256 5064 2484 4432 3049 6325 3354 2413 3286 (11) 2324 2430 6672 2014 5772 2588 簡(jiǎn) 5327 3249 4012 3506 6337 4387 5962 7081 3562 3855 2916 3687 351S 5623 2996 2016 2424 (18) 4076 2683 4322 3247 4262 2857 2443 5126 3264 5735 2785 3775 3258 2576
(22) 3182 3514 5074 2695 4608 2283 2739 5724
肺炎 多糖
35
314533 57
27 72
44
郁
52 48
65
6057 2017 4273 3942 2947
5462552446263859663429 32
表2.細(xì)菌莢膜糖蛋白結(jié)合疫苗免疫原性測(cè)定結(jié)果
疫苗 代碼
小鼠血淸抗細(xì)菌莢膜糖抗體滴度(lgGGMT)
6A
6B
7F
9V
14
18C
19A
19F
23F
A
C
Hib
(25)
細(xì)菌 多糖
2071 1946 3854 3538 3157 2173 2086 2642 2904 4536 3187 3521 4017 2653 1742 2037 1264
35 31 45 33 57 36 27 -72 48 55 26 38 59 29 25 21 1權(quán)利要求
一種肺炎球菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括2價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體，所述2價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體是指兩個(gè)不同的血清型莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成的結(jié)合物，蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵將此兩個(gè)不同血清型莢膜糖鏈接在一起，兩個(gè)不同的血清型莢膜糖依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合在結(jié)構(gòu)上形成鏈接；所述多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體是指多個(gè)不同的血清型莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成的結(jié)合物，蛋白載體通過(guò)化學(xué)鍵將此多個(gè)不同的血清型莢膜糖鏈接在一起，多個(gè)不同血清型莢膜糖依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合在結(jié)構(gòu)上形成鏈接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎球菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括一個(gè)或兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎球菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的莢膜糖_蛋白結(jié)合體分別含有相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖，并且其價(jià)數(shù)均介于2 45之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎球菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述兩個(gè)或兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的莢膜糖_蛋白結(jié)合體分別含有不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖，并且其價(jià)數(shù)均介于2 45之間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎球菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述兩個(gè)以上2 45價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體是指兩個(gè)以上的莢膜糖_蛋白結(jié)合體分別含有相等和不相等價(jià)數(shù)的血清型莢膜糖，并且其價(jià)數(shù)均介于2 45之間。
6. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些不同細(xì)菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，以2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。
7. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些不同細(xì)菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，以2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。
8. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些肺炎球菌不同血清型的莢膜糖以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中；這些腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖以4價(jià)血清群莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血桿菌的莢膜糖以單價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。
9. 一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個(gè)血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖；這些肺炎球菌不同血清型的莢膜糖以2價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中；這些腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖以2價(jià)血清群莢膜糖-蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血桿菌的莢膜糖以單價(jià)血清型莢膜糖_蛋白結(jié)合體形式存在于疫苗中。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌全部血清型菌株制備的莢膜糖。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株制備的莢膜糖。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型菌株制備的莢膜糖。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自流行病學(xué)流行優(yōu)勢(shì)血清型菌株制備的莢膜糖。
14. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述蛋白載體選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、白喉毒素?zé)o毒變異體、B群腦膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面粘附素A、肺炎球菌溶血素、流感嗜血桿菌D蛋白、百日咳毒素、霍亂毒素、結(jié)核菌素純蛋白衍生物、銅綠假單胞菌外毒素A、匙孔血藍(lán)蛋白。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述蛋白載體為來(lái)源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、 Ply合并而成的肺炎球菌蛋白復(fù)合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，成品疫苗每一血清型(群)莢膜糖劑量為0.1 50iig。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含佐劑。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述佐劑選自鋁佐劑、磷酸鈣佐劑、霍亂毒素B亞單位、皁角素Q21、類脂體、單磷酸類脂A、MF59、大腸桿菌不耐熱毒素。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。
20. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，成品疫苗不含任何防腐劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含選自硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇的防腐劑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖；所述的多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖。
23. —種制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟a) 從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖；b) 將步驟a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群)的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖；c) 將步驟b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合并純化，制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體抗原；d)將步驟c)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。
24. —種制備含有2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體的細(xì)菌莢膜糖結(jié)合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟a) 從不同血清型(群)細(xì)菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價(jià)血清型(群)莢膜糖；b) 將步驟a)所得的單價(jià)血清型(群)莢膜糖按兩個(gè)或兩個(gè)以上血清型(群)的莢膜糖依據(jù)比例合并，成為2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖，其中，所述莢膜糖合并后進(jìn)一步經(jīng)勻化處理；c) 將步驟b)的2價(jià)或多價(jià)血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原；d) 將步驟c)的產(chǎn)物脫毒處理并純化制成2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原；e) 將步驟d)的2價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原和/或多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體抗原配制成疫苗。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中，所述細(xì)菌選自肺炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述方法，不同血清型(群)莢膜糖相互間合并重量比為1 : 0. 05 20 (w/w)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述的2價(jià)血清型(群)莢膜糖-蛋白結(jié)合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖；所述的多價(jià)血清型(群)莢膜糖_蛋白結(jié)合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有2價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體和/或多價(jià)血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結(jié)合體的新型肺炎球菌結(jié)合疫苗及其制備方法。所述2價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體是指兩個(gè)不同血清型莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成的結(jié)合物，這兩個(gè)不同血清型莢膜糖依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合在結(jié)構(gòu)上形成鏈接。所述多價(jià)血清型莢膜糖-蛋白結(jié)合體是指多個(gè)不同血清型莢膜糖與蛋白載體經(jīng)化學(xué)鍵結(jié)合形成的結(jié)合物，這些多個(gè)不同血清型莢膜糖依據(jù)與蛋白載體的化學(xué)鍵結(jié)合在結(jié)構(gòu)上形成鏈接。另外，本發(fā)明還提供了制備細(xì)菌莢膜糖-蛋白結(jié)合疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61K39/112GK101785857SQ20101012940
公開(kāi)日2010年7月28日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者鄭玉清 申請(qǐng)人:鄭玉清