專利名稱：用于治療糖尿病的組合物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預防和治療糖尿病的組合物及其應用方法，更詳細地講是關(guān)于化合物伽馬一氨基丁酸，伽馬一氨基丁酸能分子(GABAergiC)的單獨使用或者是與胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)腸泌素(incretin)及其類似物(如exendin-4)的聯(lián)合使用，以促進胰島細胞的增殖，抑制胰島炎癥反應，降低胰島細胞的自身免疫并且增強調(diào)節(jié) T-細胞的功能，并能對糖尿病患者進行預防和治療的用于治療糖尿病的組合物及其應用。
背景技術(shù)：
糖尿病是引起人類死亡的主要病因之一。I型糖尿病是糖尿病的一種主要類型，特點是發(fā)病年齡早和胰島β -細胞的自身免疫性破壞，導致胰島素分泌不足和必需依賴外源性胰島素治療。凋亡是I型糖尿病患者胰島β-細胞死亡的主要形式。在正常情況下，胰島 β-細胞質(zhì)量的維持是一個動態(tài)過程，其增加和減少依賴于β-細胞存活(如β-細胞增殖和再生)和β-細胞死亡(如β-細胞凋亡和壞死)的比率，可以控制機體血糖水平在一個很窄的生理范圍內(nèi)。I型糖尿病病人的胰島β-細胞持續(xù)受到自身免疫的破壞。β-細胞凋亡是由于自身免疫破壞造成的，涉及朗格漢斯胰島中T-細胞的浸潤。胰島β-細胞的漸進性破壞主要是由于胰島中淋巴細胞的浸潤，細胞壞死導致胰島素分泌的缺乏。在這個自身免疫過程中由巨噬細胞釋放的炎癥因子，包括IL-I β，TNF-α和IFN-γ，是引起β -細胞破壞的主要分子。在疾病早期，胰島細胞依靠代償作用克服由自身免疫引起的破壞作用，這種代償機制在維持機體血糖方面起重要作用。然而當細胞死亡的速度遠遠大于細胞生長的速度時，細胞質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降，胰島素分泌不足導致糖尿病性高血糖發(fā)生。通常胰島素療法是治療I型糖尿病的的主要手段，但是外源胰島素并不能根治I 型糖尿病，因為很難實現(xiàn)一種血糖敏感性的胰島素給予方式來調(diào)整胰島素的用量使血糖控制在一個狹窄的生理范圍內(nèi)，外源胰島素不能阻止疾病的進展并最終引起糖尿病性并發(fā)癥的發(fā)生。對于人類I型糖尿病患者的治療，目前除了胰島素注射和胰島移植外尚無其它有效治療方法。胰島素注射治療不能終止I型糖尿病病情的發(fā)展也不能阻滯其并發(fā)癥的最終出現(xiàn)；胰腺胰島移植雖是一種有效的治療方法，但是該方法由于人類胰島來源較少，使胰島移植的供體來源有限，對于胰島移植的個體還需要給予免疫抑制劑，受試者需要終身使用免疫抑制劑并且通常在胰島移植后1-2年要再次做移植手術(shù)。目前的治療方法均無有效手段可以逆轉(zhuǎn)I型糖尿病。II型糖尿病的發(fā)病主要是由于患者自身產(chǎn)生的胰島素不足以維持體內(nèi)的糖代謝平衡。通常是由于胰島素抵抗和β -細胞代償缺陷造成。在正常的生理條件下，腸泌素激素在維持機體血糖中起重要作用。重要的腸泌素激素包括GLP-I和腸抑胃肽(血糖依賴性促胰島素分泌激素或者GIP)。GLP-I由小腸L-細胞在營養(yǎng)物攝取時分泌。GLP-I以一種血糖依賴性的方式促進胰腺胰島β-細胞再生/增殖和抑制β-細胞凋亡。GLP-I也可以增加罹患I型和II型糖尿病個體的胰島素分泌及降低血糖。GLP-I的長效類似物exendin-4 (Εχ4) 是一種長效高效的GLP-I的受體競爭物。對II型糖尿病十分有效，但對于I型糖尿病的療效則微乎其微。因此，研發(fā)具有預防和治療糖尿病作用的組合物及其應用方法是消除和修復糖尿病病因的關(guān)鍵技術(shù)和迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能夠消除上述缺點，具有藥性對癥、修復性強、方法簡單、單獨用藥，也可聯(lián)合用藥、可防可治、互惠增強效果好、治愈率高、可集預防和治療為一體等特點的用于治療糖尿病的組合物及其應用。開創(chuàng)了治療糖尿病的新方法和途徑。這個新方法和途徑是通過施用化合物伽馬一氨基丁酸及其組合物伽馬一氨基丁酸能分子，或者施用組合物的形式即伽馬一氨基丁酸能分子與腸泌素激素分子的聯(lián)合使用。伽馬一氨基丁酸能分子包括伽馬一氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬一氨基丁酸受體激動劑，可有效保護β-細胞的作用和抑制胰島β-細胞自身免疫的作用，以使胰腺胰島的β-細胞不被破壞。選用腸泌素激素包含至少以下多肽中的任一個GLP-1，GLP-I的抗DPP-IV形式(或者DPP-IV抑制劑)，ΕΧ4，GIP,或者是它們的變異體或者衍生物，以有效地促進胰島 β-細胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬一氨基丁酸的合成和分泌來達到對胰腺胰島β-細胞的保護及增強胰島β -細胞質(zhì)量。可以促進β -細胞的生長和抑制凋亡，促進免疫性耐受和阻滯自身免疫。尤其是當組合使用時，包括施用一個伽馬一氨基丁酸能分子(作為細胞生長因子和自身免疫抑制劑)和一個腸泌素激素分子(作為細胞生長因子和伽馬一氨基丁酸輔助物)的組合使用，實現(xiàn)了對I型糖尿病的預防和治療。具體地舉例，伽馬一氨基丁酸能分子與腸泌素的聯(lián)合使用、如伽馬一氨基丁酸與GLP-1/Ex4的聯(lián)合應用，實現(xiàn)了對I 型糖尿病的預防和治療。本發(fā)明的用于治療糖尿病的組合物，其主要成分構(gòu)成是由足以能抑制β細胞凋亡、促進β細胞再生并控制胰島自身免疫的有效給予劑量的化合物伽馬一氨基丁酸(或為Y-氨基丁酸)及其組合物的伽馬一氨基丁酸能分子，或者是上述分子在一個配藥學上可以接受的鹽溶液中。其中Y-氨基丁酸能分子包括伽馬一氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬一氨基丁酸受體激動劑；所述的組分繼而包含足以能抑制β細胞凋亡、 促進β細胞再生的有效治療劑量的腸泌素激素(incretin)，其可選自胰高血糖素樣肽 (GLP-1)、exendin-4(EX4)多肽，或者變異體或衍生物。或者是同時給予伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素，其中，所述的腸泌素激素是有效治療劑量的腸泌素激素(incretin)，其可選自胰高血糖素樣肽(GLP-1)、exendin-4(EX4)多肽，GIP多肽或者是以上所述多肽的變異體或者衍生物，該變異體選自GLP-I (7-37) 0H，或GLP-I (7-36)氨酰基_1，一個DPPIV抵抗型GLP-1及其片段和變異體，或DPPIV抵抗型GLP-I或GLP-I的融合蛋白。更具體地說，所述的γ -氨基丁酸能分子是Y -氨基丁酸，或者是GAD65，或者是 GAD67，或者是Y-氨基丁酸的變異體或者衍生物，或者是Y-氨基丁酸受體激動劑。伽馬一氨基丁酸能分子是伽馬一氨基丁酸，或者是GAD65，或者是GAD67，或者是伽馬一氨基丁酸受體激動劑或及其變異體或者衍生物。所述的Y-氨基丁酸是天然存在形式或者變異體或者衍生物，該變異體或者衍生物包含化學修飾或者對Y-氨基丁酸氨基基團通過用一個化學基團的替換，也包含但不限于蛋白融合形式或者化學耦合，或者化學修飾或者對伽馬一氨基丁酸氨基基團的替換，該變異體或者衍生物包含化學修飾或者對伽馬一氨基丁酸氨基基團通過用一個化學基團的替換。所述的化學耦合劑是配藥學上可用的物質(zhì)；N-末端修飾或者替換是通過用一個化學基團替換。其中，化學基團包含但不限于被一個鹵素基團置換， 或者一個烷基基團置換，或者一個環(huán)烷基基團置換，或者一個甲基基團替換，或者一個烷氧基基團置換，或者一個芳香族基團置換，或者一個雜苯基團置換，或者一個類似化學基團替換。所述的伽馬一氨基丁酸融合蛋白是伽馬一氨基丁酸分子與一個清蛋白分子、或者一個 IgG分子的融合；所述的融合蛋白是GLP-I或者Ex4分子與一個清蛋白或者一個IgG分子融合。其中所述的清蛋白分子即GLP-I-白蛋白是人清蛋白。或者，其中所述的IgG是人 IgG，并且人的IgG選自人IgGl、或人IgG2、或人IgG3或者人IgG4 ；尤其首選IgG2和IgG4。 所述的腸泌素激素多肽是天然存在的形式或者一個融合蛋白的形式，或者化學耦合型，或者化學修飾或者氨基酸替換。所述的DPPIV抵抗型GLP-I可選用GLP-1A8X，其中X是任何除A以外的氨基酸，可任意選自 GLP-1A8G，N-乙酰基-GLP-I, N-甲基化-GLP-I (N-me-GLP-l)，α -甲基化-GLP-I ( α -me-GLP-1)，脫氨基-GLP-1 (desamino-GLP-1)及咪唑-乳酸置換的 GLP-I (imi-GLP-1)，或者所述的N-端修飾的GLP-I如與脂肪酸鏈的共價結(jié)合，或所述的 GLP-I融合蛋白包含與IgG Fc或白蛋白的融合蛋白形成GLP-I-IgGFc或GLP-I-白蛋白。所述的GLP-I多肽變異體包括與序列號NO. 1的GLP-1序列有約70% -95%的同源性；Ex4多肽變異體包括與序列號NO. 2的Ex4序列有約70% -95%的同源性。所述的伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素是單獨的分子，或者融合成為一個單一的伽馬一氨基丁酸能分子/腸泌素激素融合肽分子。也就是說，所述的伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素是單獨的個體、或是由伽馬一氨基丁酸能分子(如伽馬一氨基丁酸)和腸泌素GLP-I或Ex4化合耦連形成的一個伽馬一氨基丁酸能融合物、或者是該伽馬一氨基丁酸能融合物的變量或者衍生物。上述的組分還包括一個輔助劑，其中該輔助劑是一種佐劑。本發(fā)明的藥用組合物是由含上述的組分組成，是由可藥用載體搭載，用于1型或 II型糖尿病的治療以及糖尿病的預防。它可通過經(jīng)由局部、或口服、或氣霧劑、或腹膜內(nèi)注射、或靜脈注射或肌肉注射的方式施用。上述的組合物的給予方式包括肌肉注射其編碼的核苷酸，其中該核苷酸載體是一個非病毒載體，或是一個病毒性的載體，或者用于細菌或者真核表達的載體。用于治療糖尿病的組合物的應用是由伽馬一氨基丁酸能分子給予劑量是 0. 01-10mmol/kg，腸泌素激素 0. 02 to 1000nmol/kg (如伽馬一氨基丁酸GLP_1/Ex4)或者是0. 002-2mg/kg的伽馬一氨基丁酸能分子和0. 2-1000nmol/kg的腸泌素激素等配制而成的藥用載體搭載；其中所述的伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素最好選自伽馬一氨基丁酸和GLP-1/Ex4。該組合物可選用基因治療的方式給予，分別編碼組合物中復合物的DNA的使用量是1 μ g/kg體重至10 μ g/kg體重；DNA疫苗的合適劑量是0. 1至1000 μ g DNA。本發(fā)明揭示了一種新的治療I型糖尿病的組合物及其應用方法，其作用機理包括兩方面內(nèi)容促進胰島β-細胞再生和同時抑制胰島β-細胞自身免疫。其組合物的重要的部分是伽馬一氨基丁酸能分子或者是伽馬一氨基丁酸能分子結(jié)合腸泌素激素。所述的伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素謹以伽馬一氨基丁酸和GLP-I為例。伽馬一氨基丁酸是一種重要的內(nèi)源性氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)作用生成。伽馬一氨基丁酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用已被廣泛研究。伽馬一氨基丁酸通過激活它的受體，即A、B及C型伽馬一氨基丁酸受體發(fā)揮作用。伽馬一氨基丁酸一直被認為是一種重要的位于哺乳動物大腦中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，但是在特定情況下，伽馬一氨基丁酸也可以通過A型伽馬一氨基丁酸受體產(chǎn)生興奮性作用。在大腦的發(fā)育和神經(jīng)元成熟過程中，伽馬一氨基丁酸作為一種營養(yǎng)性因子，調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞的增殖，遷移和分化。在胰腺中，伽馬一氨基丁酸由胰島β-細胞分泌，作為自分泌或者旁分泌調(diào)節(jié)因子通過其位于α-細胞和β-細胞的受體發(fā)揮作用。詳述之，伽馬一氨基丁酸通過激活A 型伽馬一氨基丁酸受體來抑制α-細胞胰高血糖素的分泌。伽馬一氨基丁酸能同時調(diào)節(jié)胰島β-細胞的代謝和胰島素分泌。伽馬一氨基丁酸的受體也在T-淋巴細胞中表達，為伽馬一氨基丁酸有可能直接作用于T-細胞提供了基礎。使用伽馬一氨基丁酸能抑制T-細胞的促炎作用和預防NOD 1型糖尿病模型小鼠的發(fā)病。在一種大鼠模型中，伽馬一氨基丁酸對STZ誘導糖尿病模型發(fā)病有一定預防作用。然而，先前公開的技術(shù)并沒有實驗證實伽馬一氨基丁酸可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生糖尿病患者的高血糖血癥，即有實際意義上的治療作用。預防和治療在概念上是完全不同的。預防是指可以降低疾病發(fā)生的任何一種方法。預防可以在一定程度上阻止疾病的發(fā)生。而且，實施預防的過程常常是在一種疾病出現(xiàn)明顯癥狀之前。在自身免疫性疾病中，如1型糖尿病是由于胰島β-細胞的自身免疫性破壞和繼發(fā)的胰島素不足及高血糖血癥，如果阻止了自身免疫的發(fā)展也即可以有效地阻止 1型糖尿病的發(fā)生。相比較，治療是一種能夠解除疾病、有時能達到治愈的方法。在多數(shù)情況下，有效的治療是一個減輕或解除病癥的過程。在1型糖尿病發(fā)生時，患者體內(nèi)已有超過 70-80%的胰島β-細胞被破壞。由此可見，僅僅抑制胰島的自身免疫不足以緩解疾病的進程。顯然在給予特異的免疫抑制劑的同時，需要一種能夠促進胰島細胞再生的方案用于替換或更新已經(jīng)受損的胰島β-細胞。應用不同的小鼠糖尿病模型作為對糖尿病的預防和治療的范例，本發(fā)明揭示了一種預防和治療糖尿病的組合物和應用方法。本發(fā)明的重點是治療即逆轉(zhuǎn)1型糖尿病的病情。可以預見，一個有效的治療方法也可能是一種有效的預防方法。相反，一種有效的預防方法不一定能夠達到治療效果。本發(fā)明首次系統(tǒng)揭示了伽馬一氨基丁酸對已經(jīng)發(fā)生糖尿病性高血糖的糖尿病個體的治療作用。本發(fā)明的試驗數(shù)據(jù)顯示伽馬一氨基丁酸不僅阻止了多次低劑量STZ(MLM)誘導的糖尿病小鼠的高血糖，更重要的是伽馬一氨基丁酸組合物療法完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)病的MLDS 誘導1型糖尿病小鼠的糖尿病性高血糖。通過體外實驗顯示伽馬一氨基丁酸對MLDS誘導 1型糖尿病小鼠的預防和治療作用是通過促進胰島細胞生長、抑制細胞死亡、增強 β-細胞質(zhì)量及抑制自身免疫和/或炎癥對β-細胞的攻擊而實現(xiàn)的。本發(fā)明披露的數(shù)據(jù)還顯示，伽馬一氨基丁酸可以預防自身免疫性NOD小鼠的糖尿病性高血糖。這與降低NOD小鼠胰島內(nèi)免疫細胞浸潤，增加β-細胞質(zhì)量和提高循環(huán)胰島素水平有關(guān)。作為本發(fā)明的一個實施例，伽馬一氨基丁酸可以明顯減低MLDS和NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，同時，伽馬一氨基丁酸可以完全逆轉(zhuǎn)由藥物誘導的MLDS小鼠的糖尿病的發(fā)生。但是伽馬一氨基丁酸對已經(jīng)發(fā)病的自身免疫性NOD小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)作用雖然顯著但是是暫時性的。事實上，這個暫時性的逆轉(zhuǎn)作用會對人類糖尿病患者有著值得矚目的益處。需要強調(diào)的是，本發(fā)明揭示了一個幾乎完全有效的應用方案，即當伽馬一氨基丁酸與腸泌素GLP-1/Ex4結(jié)合使用時可以克服單獨使用伽馬一氨基丁酸治療時存在的暫時性逆轉(zhuǎn)作用的缺陷。正如本發(fā)明提供的實施例所示，伽馬一氨基丁酸和GLP-I結(jié)合使用可以完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)病的NOD 1型糖尿病。值得注意的是，伽馬一氨基丁酸對db/db 2型糖尿病小鼠的血糖水平?jīng)]有顯著作用(數(shù)據(jù)未提供)。總之，本發(fā)明開拓了開發(fā)1型糖尿病新的治療途徑。概括地，本發(fā)明揭示了一種基于伽馬一氨基丁酸能分子或者是伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素GLP-1/Ex4聯(lián)合用藥對1 型糖尿病有效治療的作用。以前的技術(shù)沒有揭示伽馬一氨基丁酸能分子對糖尿病逆轉(zhuǎn)的治療作用，也沒有揭示伽馬一氨基丁酸能分子與腸泌素的聯(lián)合使用和這種組合物的作用。本發(fā)明提供了一種預防和治療糖尿病的組合物及其應用方法。本發(fā)明的組合物和應用方法可以促進β-細胞的生長和抑制凋亡，促進免疫性耐受和阻滯自身免疫。本發(fā)明所述的組合物是伽馬一氨基丁酸能分子。本發(fā)明所述的組合物也包括一個伽馬一氨基丁酸能分子(作為細胞生長因子和自身免疫抑制劑)和一個腸泌素激素分子(作為 β-細胞生長因子和伽馬一氨基丁酸輔助物)的組合使用。這兩個組分作為一個組合物用于1型或者是2型糖尿病的預防和治療。但該療法尤其是對1型糖尿病的預防和治療極其有效。伽馬一氨基丁酸能分子包括伽馬一氨基丁酸及其變異體或者衍生物、或者是伽馬一氨基丁酸受體激動劑。其功效包括可以有效保護β-細胞的作用和抑制胰島β-細胞自身免疫的作用，以使胰腺胰島的β-細胞不被破壞。腸泌素激素包含至少以下多肽中的任一個GLP-1，GLP-I的抗DPP-IV形式或DPP-IV抑制劑，EX4，GIP，或是它們的變異體或衍生物，以有效地促進胰島β-細胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬一氨基丁酸的合成和分泌來達到對胰腺胰島β-細胞的保護及增強胰島β-細胞質(zhì)量。依據(jù)本發(fā)明的一方面，所述組合物的組分能抑制致糖尿病性⑶8+ T-細胞依賴的免疫反應。所述組合物的組分包含伽馬一氨基丁酸能分子或者是伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素GLP-1/EX4多肽的組合。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物是一個伽馬一氨基丁酸能分子與一個腸泌素激素的融合蛋白。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物包含一個伽馬一氨基丁酸能分子和GLP-I融合蛋白或者 ΕΧ4融合蛋白或者前述的腸泌素激素。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述組合物包含編碼-伽馬一氨基丁酸能分子，其變異體或者衍生物，或前述的腸泌素激素或者它們的融合蛋白核酸序列。本發(fā)明的一方面，所述組合物用于受試者的1型糖尿病的預防和治療。所述組合物包含一個伽馬一氨基丁酸能分子，來源于伽馬一氨基丁酸、伽馬一氨基丁酸前體GAD65、 或者GAD67、或者A型伽馬一氨基丁酸受體激動劑或者是它們的變異體或者衍生物；或包含一個GLP-I或者ΕΧ4分子或者其類似物或者變異體或者其的片段。本發(fā)明的一方面，所述組合物的核酸序列編碼一個伽馬一氨基丁酸能分子的前體，如伽馬一氨基丁酸，伽馬一氨基丁酸前體GAD65或者GAD67，伽馬一氨基丁酸受體激動劑或者其變異體或者衍生物；和一個前述的腸泌素激素分子GLP-I或者ΕΧ4或者變異體或者其的片段或者前述腸泌素激素的融合蛋白。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述方法用于1型糖尿病患者的預防和治療，包含施予患者一個有效治療量的所述組合物，可以增加患者β-細胞增殖，降低β-細胞凋亡和抑制 β-細胞自身免疫性。本發(fā)明的一方面，揭示用以預防和治療1型糖尿病的化合物的藥劑的制備。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點也可通過實施例的描述進一步體現(xiàn)。


圖1伽馬一氨基丁酸處理阻止了 MLDS⑶1小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)生。Α)每天給予伽馬一氨基丁酸阻止了小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)生；B)對照組小鼠在MLDS注射后7 天完全發(fā)生糖尿病高血糖，而伽馬一氨基丁酸處理的STZ小鼠沒有發(fā)生高血糖；C)伽馬一氨基丁酸對正常小鼠(Crl)的糖耐量沒有影響，未處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受不良，而伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受改善，水平與虛線所示的STZ 注射前的糖耐量實驗相近；D)伽馬一氨基丁酸處理沒有改變胰島素敏感性；E)伽馬一氨基丁酸顯著改善了 MLDS小鼠的胰高血糖素耐受；F)伽馬一氨基丁酸顯著改善了 MLDS小鼠的胰高血糖素耐受；G)伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出循環(huán)胰島素水平提高；H)伽馬一氨基丁酸使循環(huán)胰高血糖素水平下降；I)伽馬一氨基丁酸導致胰島素/胰高血糖素比例升高。圖2伽馬一氨基丁酸明顯改善MLDS小鼠的糖尿病癥狀。A)伽馬一氨基丁酸處理對體重的影響在未處理組和處理組間沒有統(tǒng)計學差異；B)伽馬一氨基丁酸處理對進食量的影響在處理與未處理組間沒有統(tǒng)計學差異；C)伽馬一氨基丁酸處理對體重指數(shù)的影響在未處理組和處理組間沒有統(tǒng)計學差異；D)伽馬一氨基丁酸明顯改善了糖尿病的多飲癥狀；E)伽馬一氨基丁酸明顯改善了糖尿病的多尿癥狀。圖3伽馬一氨基丁酸增進MLDS小鼠的胰島β -細胞質(zhì)量及降低循環(huán)中的炎癥因子。Α)免疫組織化學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLDS小鼠的β-細胞被大面積破壞，而伽馬一氨基丁酸處理的β-細胞質(zhì)量與正常對照鼠(Crl)沒有明顯區(qū)別；B)伽馬一氨基丁酸處理顯著逆轉(zhuǎn)了 β-細胞質(zhì)量；C)伽馬一氨基丁酸處理明顯降低了 α-細胞的質(zhì)量；D)伽馬一氨基丁酸處理對細胞因子IL-6在2組間沒有顯著差異；Ε)伽馬一氨基丁酸處理對Th2細胞因子IL-10沒有顯著影響；F)伽馬一氨基丁酸使促炎癥細胞因子IL-I β含量明顯降低；G) 伽馬一氨基丁酸處理使MLDS小鼠中的腫瘤壞死因子TNF-α明顯降低；H)伽馬一氨基丁酸明顯降低了循環(huán)中的炎癥因子IL-12 ；I)伽馬一氨基丁酸明顯降低了循環(huán)中的炎癥因子 TNF- γ ο圖4伽馬一氨基丁酸逆轉(zhuǎn)藥物誘導的MLDS糖尿病性高血糖，改善糖耐受及提高循環(huán)胰島素水平。Α)伽馬一氨基丁酸使已經(jīng)發(fā)病的NLDS小鼠血糖水平開始下降，注射后74 天，小鼠血糖水平恢復到幾近正常的范圍內(nèi)；B)葡萄糖耐量也基本和正常小鼠一致；C)經(jīng)過伽馬一氨基丁酸治療，MLDS小鼠的糖尿病被完全逆轉(zhuǎn)。D)胰島組織化學的研究結(jié)果顯示正常的對照組小鼠；Ε)未處理MLDS小鼠的β-細胞被廣泛破壞，胰島被大量的胰島α-細胞填充，周圍可見大量的淋巴細胞；F)伽馬一氨基丁酸處理MLDS小鼠表現(xiàn)基本正常的胰島形態(tài)并顯著保存了細胞質(zhì)量和降低了 α-細胞質(zhì)量；G)伽馬一氨基丁酸處理小鼠的 β -細胞質(zhì)量明顯提高；H)處理組的α -細胞質(zhì)量降低；I)處理組循環(huán)胰島素水平升高J) 處理組循環(huán)胰高血糖素水平下降；K)處理組循環(huán)胰高血糖素與胰島素的比值也顯著下降。圖5伽馬一氨基丁酸治療能完全逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的經(jīng)STZ誘導的MLDS糖尿病。Α)伽馬一氨基丁酸治療的第7天，IP伽馬TT的檢測結(jié)果顯示葡萄糖耐量已經(jīng)顯著改善；B)MLDS 小鼠經(jīng)伽馬一氨基丁酸注射后2周后檢測的時間點見有改善；C)MLDS小鼠經(jīng)伽馬一氨基丁酸注射8周后檢測的時間點都見有改善；D)注射后顯示飲水量明顯降低表明代謝狀態(tài)的正常化；Ε)顯示體重沒有發(fā)生變化；F)注射后顯示排尿量明顯減少，也佐證MLDS小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)。圖6伽馬一氨基丁酸阻止和預防了 NOD糖尿病模型小鼠的糖尿病發(fā)生。Α)胰島組織化學分析顯示對照PBS-NOD小鼠出現(xiàn)嚴重的胰島炎，大約90%的胰島區(qū)域都被淋巴細胞所占據(jù)；B)伽馬一氨基丁酸處理的NOD小鼠中>70%的胰島表現(xiàn)為正常形態(tài)且沒有淋巴細
9胞浸潤；C)淋巴細胞只占到胰島面積的20-30%，被影響的胰島也多是周邊的，也未見嚴重的胰島炎；D)免疫組織化學結(jié)果顯示治療的NOD小鼠的β-細胞凋亡下降；Ε) 18周齡后，未處理NOD小鼠發(fā)展出嚴重的高血糖血癥，但是伽馬一氨基丁酸處理的NOD小鼠仍保持較低的血糖水平；F)伽馬一氨基丁酸治療的小鼠保持相對穩(wěn)定的血糖，未見糖尿病癥狀；G)伽馬一氨基丁酸治療的小鼠保持近乎正常的葡萄糖耐量。H)伽馬一氨基丁酸治療的小鼠循環(huán) C-肽降低；I)未經(jīng)伽馬一氨基丁酸治療的小鼠保持信號胰高血糖素升高J)伽馬一氨基丁酸療法顯著提高胰島素/胰高血糖素比例，提示伽馬一氨基丁酸能顯著阻止NOD小鼠發(fā)展為嚴重的糖尿病性高血糖。圖7顯示伽馬一氨基丁酸對已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的逆轉(zhuǎn)作用。A)伽馬一氨基丁酸顯著降低NOD小鼠的血糖并保持低血糖水平近2周。之后伽馬一氨基丁酸處理小鼠的血糖開始上升并最終出現(xiàn)高血糖。B)伽馬一氨基丁酸處理小鼠未見嚴重的癥狀，處理組攝食量顯著降低；C)飲水量也顯著降低；D)排尿量也顯著降低E)伽馬一氨基丁酸療法顯著改善已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的代謝狀態(tài)。圖8伽馬一氨基丁酸通過抑制⑶8+T-細胞介導的胰島損害，阻止了 TCR-NOD小鼠的糖尿病發(fā)生。A)伽馬一氨基丁酸處理完全阻止了 8.3-TCR NOD小鼠的糖尿病性高血糖的發(fā)展；B)胰島組織學研究顯示PBS處理的糖尿病模型小鼠有嚴重的淋巴細胞浸潤胰腺胰島；C)而伽馬一氨基丁酸療法顯著阻止了這個過程；D-E)伽馬一氨基丁酸處理小鼠的胰島數(shù)量和質(zhì)量都被大幅度逆轉(zhuǎn)和提高，提示伽馬一氨基丁酸可以抑制CE8+細胞毒性淋巴細胞的致糖尿病作用。圖9伽馬一氨基丁酸能保留TCR-NOD小鼠的胰島素和GAD65/67含量。對TCR轉(zhuǎn)基因的NOD小鼠的胰腺進行GAD染色。結(jié)果顯示在正常鼠胰島β-細胞中高表達GAD65(上)； 在所有未處理的發(fā)生糖尿病高血糖的NOD小鼠中，整個胰腺均未檢測到GAD65 (中)，而在伽馬一氨基丁酸處理的小鼠中，胰島β-細胞質(zhì)量提高并與高含量GAD65相關(guān)(下)。圖10伽馬一氨基丁酸刺激β -細胞增殖及胰島素的分泌。Α)伽馬一氨基丁酸 (100 μ Μ)處理提高了 3Η-胸苷嵌入到分泌胰島素的INS-I細胞中的水平；B-C)其嵌入過程以一種時間依賴性的方式進行，提示與細胞有絲分裂檢測結(jié)果相一致；D)伽馬一氨基丁酸以劑量依賴性的方式刺激INS-I胰島細胞分泌胰島素，提示伽馬一氨基丁酸促進胰島 β-細胞增加并能預防和逆轉(zhuǎn)I型糖尿病模型的糖尿病。圖11給已經(jīng)發(fā)生糖尿病的動物模型每天聯(lián)合使用伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4， 可以增強已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的逆轉(zhuǎn)效應，達到了完全逆轉(zhuǎn)糖尿病的目的。
具體實施例方式結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容如圖1所示，由MLDS(i. p. 40mg/kg BW，連續(xù)4天)在小鼠誘導的糖尿病模型可以被每天注射伽馬一氨基丁酸的治療所阻斷。MLDS嚙齒類模型是常用的1型糖尿病模型，在 MLDS模型中由于STZ破壞了胰島β-細胞導致胰島素不足。在一定程度上，T-細胞介導的 β -細胞炎癥(胰島炎)也在MLDS誘導的糖尿病高血糖模型中見到。然而，單次高劑量(如 200-250mg/kg Bff)給予STZ不一定會引起胰島炎，因為這時的胰島β -細胞會被很快地破壞掉。所以，MLDS是一個β-細胞損傷模型，有一定的胰島炎，但不是一個理想的自身免疫疾病模型。每天腹腔內(nèi)給予伽馬一氨基丁酸Omg/鼠)阻止了 MLDS CDl小鼠的糖尿病高血糖的發(fā)展(圖1A)。在目前的實驗條件下，對照小鼠在MLDS注射后7天100% (8/8)發(fā)生糖尿病高血糖，但是伽馬一氨基丁酸處理的STZ小鼠只有1只發(fā)生嚴重的高血糖，這也使整組的血糖水平較給藥前有輕微的提高(圖1A)。伽馬一氨基丁酸對正常小鼠的糖耐量沒有影響，檢測的是STZ注射前7天的腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)。當未處理MLDS 小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受不良時，伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐受改善，水平與紅線所示的STZ注射前的IPGTT相近(圖1B，1C)。伽馬一氨基丁酸治療雖然沒有改變胰島素敏感性(圖1D)，但是顯著改善了 MLDS小鼠的胰高血糖素耐受(圖1E， 1F)。這些結(jié)果提示伽馬一氨基丁酸優(yōu)先作用于胰島素生成部位而不是外周的胰島素作用部位。伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠表現(xiàn)出循環(huán)胰島素水平提高(圖1G)和血液胰高血糖素水平下降(圖1H)，導致胰島素/胰高血糖素比例升高(圖II)。總的來說，每天注射伽馬一氨基丁酸阻止了糖尿病高血糖的發(fā)生，并在STZ注射后的53天內(nèi)MLDS小鼠始終維持在正常糖耐量水平。伽馬一氨基丁酸治療對體重和進食量的影響在未處理組和伽馬一氨基丁酸組間沒有統(tǒng)計學差異(圖2A-C)，但是伽馬一氨基丁酸明顯改善了糖尿病癥狀，如多尿和多飲(圖2D，2E)。以上結(jié)果也被進一步證實，如生理鹽水處理MLDS小鼠表現(xiàn)出明顯的病癥，而伽馬一氨基丁酸處理組在整個飼養(yǎng)過程中沒有任何一只小鼠發(fā)生糖尿病性病癥。為了確認伽馬一氨基丁酸阻止糖尿病高血糖發(fā)生和提高循環(huán)胰島素水平及降低胰高血糖素水平的機制，我們做了 MLDS小鼠胰腺的免疫組織化學研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未處理MLDS小鼠的β-細胞被大面積破壞，而剩下的胰島被大量的胰島α-細胞填充(圖3Α)。然而，伽馬一氨基丁酸治療相比未處理MLDS小鼠顯著逆轉(zhuǎn)β-細胞質(zhì)量，并明顯降低α-細胞質(zhì)量 (圖A-C)。伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠的β-細胞逆轉(zhuǎn)與胰島炎顯著下降有關(guān)，利用 HE染色可評價胰島中浸潤的淋巴細胞(結(jié)果未標出)。考慮到細胞因子在自身免疫性糖尿病中起重要作用，我們接下來檢測了伽馬一氨基丁酸處理和未處理MLDS小鼠的循環(huán)細胞因子水平。血清學檢測顯示IL-6和Th2細胞因子IL-10在2組間沒有顯著差異(DE)，促炎因子IL-I β (F)和TNF-α在伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠中明顯降低。伽馬一氨基丁酸療法也明顯降低了循環(huán)中炎癥因子IL-12(H)和INF-Y (I)的水平。這些結(jié)果提示伽馬一氨基丁酸通過阻斷炎癥因子達到對MLDS小鼠的抗炎作用，并且通過降低胰島的免疫細胞浸潤阻止MLDS誘導的糖尿病發(fā)生。為了觀察伽馬一氨基丁酸是否可以逆轉(zhuǎn)糖尿病，我們每天給予已經(jīng)發(fā)病的NLDS小鼠(血糖>30mM) —次伽馬一氨基丁酸。顯然，在伽馬一氨基丁酸注射后幾天就看到血糖水平開始下降(圖4A)。在觀察期內(nèi)血糖水平穩(wěn)步降低伴隨葡萄糖耐量的改善。在每天注射伽馬一氨基丁酸后74天，血糖水平恢復到幾近正常的范圍內(nèi)(圖4A)，葡萄糖耐量也基本和正常小鼠一致(圖4B)，說明經(jīng)過2個多月的伽馬一氨基丁酸治療，MLDS小鼠的糖尿病被完全逆轉(zhuǎn)。利用胰島組織化學來研究伽馬一氨基丁酸是否對已經(jīng)發(fā)病的糖尿病小鼠的胰島有保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠(圖4D)相比，未處理MLDS小鼠的β-細胞被廣泛破壞，而剩下的胰島被大量的胰島α-細胞填充，周圍可見大量的淋巴細胞(圖4Ε)。相反，伽馬一氨基丁酸處理MLDS小鼠表現(xiàn)基本正常的胰島形態(tài)并顯著保存了 β-細胞質(zhì)量和降低了 α-細胞質(zhì)量(圖4F-H)。而且，伽馬一氨基丁酸處理的MLDS小鼠的胰島中很少見到淋巴細胞(圖4F)。伽馬一氨基丁酸處理小鼠的β-細胞質(zhì)量提高和α -細胞質(zhì)量降低與循環(huán)胰島素水平升高(圖41)和循環(huán)胰高血糖素水平下降(圖4J)相關(guān)。這些結(jié)果提示伽馬一氨基丁酸逆轉(zhuǎn)MLDS小鼠糖尿病的作用與減輕胰島炎癥， 這與伽馬一氨基丁酸增加細胞質(zhì)量和增強細胞功能提高有關(guān)。伽馬一氨基丁酸對 MLDS小鼠的治療是速效的，這在經(jīng)伽馬一氨基丁酸治療的MLDS小鼠的葡萄糖耐量改善中得到證實。在伽馬一氨基丁酸注射后的第7天，IPGTT的檢測結(jié)果顯示葡萄糖耐量已經(jīng)顯著改善(圖5Α，5Α’)。MLDS小鼠經(jīng)伽馬一氨基丁酸注射后2周和8周的所有時間點檢測都見有穩(wěn)定改善的葡萄糖耐量(圖5B，5C)。代謝實驗中代謝狀態(tài)的正常化也可以佐證MLDS小鼠糖尿病的逆轉(zhuǎn)(圖5D-5F)。這些結(jié)果提示伽馬一氨基丁酸阻止和逆轉(zhuǎn)NLDS誘導的小鼠糖尿病性高血糖可能是通過其擴大β-細胞質(zhì)量和抑制β-細胞自身免疫的雙重作用有關(guān)。考慮到MLDS不是一個自身免疫性疾病和MLDS誘導的糖尿病性高血糖可能是因為藥物直接對β-細胞的毒性作用引起β-細胞凋亡和壞死，我們利用NOD小鼠觀察伽馬一氨基丁酸對糖尿病的阻止和治療作用。因為NOD小鼠自發(fā)自身免疫型糖尿病，在組織化學，血清學和臨床癥狀上與人類1型糖尿病相似。為了觀察伽馬一氨基丁酸對NOD小鼠糖尿病發(fā)展的作用，5周齡小鼠開始每天給予腹腔內(nèi)注射伽馬一氨基丁酸，PBS作為對照。對未出現(xiàn)明顯糖尿病性高血糖的13周齡的小鼠做胰島組織化學分析，顯示對照PBS-NOD小鼠出現(xiàn)嚴重的胰島炎，胰島炎評分結(jié)果是僅有10%的胰島表現(xiàn)正常形態(tài)，而> 70%的胰島有不同程度的淋巴細胞浸潤，其中20%的胰島有嚴重的胰島炎，大約90%的胰島區(qū)域都被淋巴細胞所占據(jù)(圖6Α)。相反，伽馬一氨基丁酸處理的NOD小鼠中>70%的胰島表現(xiàn)為正常形態(tài)且沒有淋巴細胞浸潤(圖6Β)；在該組中也未見嚴重的胰島炎，被影響的胰島也多是周邊的， 并且只有15%的胰島發(fā)生胰島炎，即淋巴細胞只占到胰島面積的20-30% (圖6C)。這些結(jié)果顯示伽馬一氨基丁酸有抗炎作用，阻止了 NOD小鼠的胰島炎發(fā)展。利用抗-caspase-3抗體的免疫組織化學結(jié)果顯示，伽馬一氨基丁酸處理NOD小鼠的β -細胞凋亡下降(圖6D)。 18周齡后，未處理NOD小鼠發(fā)展出嚴重的高血糖血癥，但是伽馬一氨基丁酸處理的NOD小鼠仍保持較低的血糖水平(圖6Ε)。在這個年齡之后，生理鹽水處理的NOD小鼠的高血糖水平也就超出了檢測范圍(圖6G，紅箭頭所示)。這些非處理NOD小鼠發(fā)展糖耐受不良(圖 6F，6G)，伴隨循環(huán)C-肽降低和信號胰高血糖素升高(圖61)。另外，這些非處理NOD小鼠表現(xiàn)嚴重的癥狀需要必須每天給予胰島素來維持生命。相反，伽馬一氨基丁酸的治療小鼠保持相對穩(wěn)定的血糖(圖6E)，伽馬一氨基丁酸治療的小鼠呈現(xiàn)正常的形態(tài)學，并未見糖尿病癥狀和近乎正常的葡萄糖耐量(圖6F，6G)。循環(huán)C-肽和循環(huán)胰高血糖素水平接近它們低齡時(5周齡)的水平(圖6E，6F)。伽馬一氨基丁酸療法顯著提高胰島素/胰高血糖素比例(圖6J)。這些結(jié)果提示伽馬一氨基丁酸能顯著阻止NOD小鼠發(fā)展為嚴重的糖尿病性高血糖。為了探討伽馬一氨基丁酸是否對已經(jīng)發(fā)病的NOD小鼠有作用，將已經(jīng)發(fā)生糖尿病性高血糖的NOD小鼠分為2組，分別給予伽馬一氨基丁酸和PBS。如圖所示(圖7A)，PBS 處理NOD小鼠的血糖水平在飼養(yǎng)期內(nèi)持續(xù)增加，但是伽馬一氨基丁酸處理NOD小鼠在開始治療后血糖水平很快就降低、并保持在一個較低的水平。PBS-NOD小鼠的血糖水平已經(jīng)超出檢測范圍(圖7，如紅色箭頭所示)，如果不是每天給予胰島素的話，小鼠會出現(xiàn)明顯的癥狀并導致死亡。相反，伽馬一氨基丁酸顯著降低NOD小鼠的血糖并保持低血糖水平近2周。 之后伽馬一氨基丁酸處理小鼠的血糖開始上升并最終出現(xiàn)高血糖。然而，伽馬一氨基丁酸處理小鼠未見嚴重的癥狀。伽馬一氨基丁酸療法顯著改善已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD小鼠的代謝狀態(tài)(圖7B-E)。這些結(jié)果提示單獨伽馬一氨基丁酸對已經(jīng)存在的NOD小鼠的高血糖的逆轉(zhuǎn)作用是顯著的但時間持續(xù)性上而言是暫時性的。但是，在整個試驗過程中伽馬一氨基丁酸對糖尿病癥狀的減輕作用是明顯而持續(xù)的。我們繼而用TCR NOD小鼠來研究伽馬一氨基丁酸對T細胞功能的潛在作用。8. 3-TCRN0D小鼠是一種嚴重的1型糖尿病模型，通常在其11周齡時發(fā)生糖尿病性高血糖。NOD小鼠的自身免疫性糖尿病是由T淋巴細胞破壞胰腺 β-細胞引起的。CD8+細胞毒性T淋巴細胞被認為是最初引起糖尿病中β-細胞損傷的原因。這個過程起始于!^as-依賴方式的β-細胞死亡過程。8. 3-TCR NOD小鼠的單克隆T細胞存在T細胞受體(8. 3-TCR)，以TCRs為代表，從NOD小鼠的早期胰島炎損傷部位繁殖的 CD8+細胞毒性T淋巴細胞。以前的研究顯示致糖尿病型CD8+細胞毒性T淋巴細胞是典型的參與自身免疫型糖尿病起始的細胞毒性T淋巴細胞。與生理鹽水處理小鼠相比，伽馬一氨基丁酸療法完全阻止了 8. 3-TCR NOD小鼠的糖尿病性高血糖的發(fā)展(圖8Α)。胰島組織學研究顯示PBS處理小鼠有嚴重的淋巴細胞浸潤胰腺胰島(圖8Β)，而伽馬一氨基丁酸療法顯著阻止了這個過程。伽馬一氨基丁酸處理小鼠的胰島數(shù)量和質(zhì)量都被大幅度逆轉(zhuǎn)和提高 (圖8D，8E)。這些數(shù)據(jù)提示伽馬一氨基丁酸可以抑制CE8+細胞毒性淋巴細胞的致糖尿病作用。GAD65被認為是引起1型糖尿病發(fā)病的主要抗原。基于伽馬一氨基丁酸對糖尿病模型糖尿病發(fā)展中的保護作用，我們假設，伽馬一氨基丁酸合成的限速酶GAD作為伽馬一氨基丁酸的前體在調(diào)節(jié)胰島功能中起重要作用。為了確定伽馬一氨基丁酸是否對GAD65的表達水平有影響，我們對TCR轉(zhuǎn)基因的NOD小鼠的胰腺進行GAD染色。結(jié)果顯示在糖尿病發(fā)病前，胰島β-細胞中高表達GAD65(圖9A上)；相反，在所有未處理的發(fā)生糖尿病高血糖的NOD小鼠中，整個胰腺均未檢測到GAD65 (圖9A中)，而在伽馬一氨基丁酸處理的小鼠中， 胰島β -細胞質(zhì)量提高并與高含量GAD65相關(guān)(圖9Α下)。這些結(jié)果說明內(nèi)源性GAD65的表達水平與胰島細胞質(zhì)量呈正相關(guān)。這些結(jié)果揭示在正常情況下，內(nèi)源性伽馬一氨基丁酸是重要的調(diào)節(jié)胰島細胞功能的因子。這些動物體內(nèi)試驗清楚地顯示-伽馬一氨基丁酸對1型糖尿病的預防和治療作用可能是通過兩種方式自身免疫調(diào)節(jié)(例如特異性地抑制致糖尿病性T細胞)和胰島β-細胞增殖和再生。為了確認伽馬一氨基丁酸是否確實促進 β -細胞生長，體外試驗采用胰島素分泌性β -細胞系INS-I。伽馬一氨基丁酸(100 μ Μ)處理提高了 3H-胸苷嵌入到分泌胰島素的INS-I細胞中(圖10Α)，嵌入過程以一種時間依賴性的方式進行。這些結(jié)果與分離細胞有絲分裂檢測結(jié)果是一致的(圖10Β，10C)。另外，伽馬一氨基丁酸以劑量依賴性的方式刺激INS-I胰島細胞分泌胰島素(圖10D)。這些結(jié)果與我們所做的動物體內(nèi)實驗結(jié)果一致，-伽馬一氨基丁酸促進胰島細胞增加并能預防和逆轉(zhuǎn)1型糖尿病模型的糖尿病。我們的實驗表明，在糖尿病性高血糖發(fā)生后伽馬一氨基丁酸的單獨治療是不能完全逆轉(zhuǎn)NOD小鼠的病癥的。考慮到絕大部分病人在診斷為I型糖尿病時已經(jīng)有超過70%的胰島β -細胞遭到破壞，因此，單純運用胰島自身免疫抑制藥物的治療方案是不足以完全逆轉(zhuǎn)疾病的。我們以此設計了一種能夠使細胞再生和自身免疫抑制得以同時發(fā)生的組合應用方案，以達到對糖尿病的全面逆轉(zhuǎn)。如圖所示，給已經(jīng)發(fā)生糖尿病的模型每天注射伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4，可以明顯提高治療效果，此時的患病率顯著低于伽馬一氨基丁酸單獨治療組(圖11)。所以，同時給予伽馬一氨基丁酸和GLP-I/ ΕΧ4可以完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生糖尿病的NOD的糖尿病。在NOD小鼠中，這種聯(lián)合應用的效果與伽馬一氨基丁酸或者GLP-1/EX4單獨應用結(jié)果相比較有著非常顯著的優(yōu)點(圖7Α，圖11)。 其不單是伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4效果的疊加，正如前文中提到的GLP-1/EX4對NOD的糖尿病發(fā)生幾乎是沒有作用的。而伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4的聯(lián)合使用能達到一種獨特的增強效果。 體外實驗利用GLP-I分泌和/或胰島素分泌細胞，結(jié)果顯示腸源細胞STC-I合成和分泌GLP-I受到伽馬一氨基丁酸的調(diào)節(jié)，而β -細胞合成和釋放伽馬一氨基丁酸的作用又受到GLP-I的調(diào)節(jié)。這些分析的特異性通過包括使用伽馬一氨基丁酸受體拮抗劑或者 GLP-I受體拮抗劑得到確定。GLP-1/EX4對伽馬一氨基丁酸合成和釋放的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。胰島β-細胞GLP-I受體的阻斷通過GLP-1/EX4對伽馬一氨基丁酸合成和分泌的作用而減輕，提示GLP-1/EX4影響胰島β-細胞伽馬一氨基丁酸合成和分泌是通過激活β-細胞上GLP-I受體發(fā)揮作用的。體內(nèi)實驗所示的GLP-1/EX4和伽馬一氨基丁酸的協(xié)同作用可能提供了一種體內(nèi)機制，GLP-1/EX4和伽馬一氨基丁酸分別激活各自的活性系統(tǒng)并最終引起互惠的“正性-反饋-環(huán)”樣作用。聯(lián)合使用伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素治療的機理在我們的體內(nèi)和體外實驗中均非常明確地得到了證明。所以，本發(fā)明提供了一種特殊的組合藥和方法用于1型糖尿病患者的預防和治療。本組合物用于急需治療的患者，能促進β-細胞的增殖并降低細胞的凋亡和控制特殊免疫，最終提升細胞質(zhì)量以及增強細胞功能和促進胰島素分泌。本組合物包括一個伽馬一氨基丁酸能分子和一個腸泌素激素。伽馬一氨基丁酸能分子包括伽馬一氨基丁酸或者它的變異體或者衍生物或者它的前體，或者伽馬一氨基丁酸受體拮抗劑，可以有效保護β -細胞和抑制自身免疫，使胰腺胰島細胞不再被破壞。伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4的共同作用所引起的增強效應能產(chǎn)生其各自單獨作用而無法達到的效果。因為GLP-1/EX4對1型糖尿病是幾乎沒有療效的，因此，這種聯(lián)合應用伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4而增強的生物效應也非簡單的“ 1+1 = 2”的疊加。這種同時發(fā)生的伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4的協(xié)同作用對分別調(diào)節(jié)內(nèi)源性伽馬一氨基丁酸和GLP-I的合成及分泌顯然起到一個互惠和效果倍增的作用。所以本發(fā)明對1型糖尿病個體的胰腺胰島β-細胞有很好的保護和擴增作用。因此，對于患有I型糖尿病的患者同時給予伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4能對其胰島β -細胞施加獨特的保護和取得功能增強的效果。本發(fā)明的一個具體化體現(xiàn)是，組合物包含伽馬一氨基丁酸和配制其的鹽溶液。本發(fā)明另一個具體化體現(xiàn)是組合物包含伽馬一氨基丁酸和GLP-1/EX4 多肽。其中所述的，可以通過多種不同的化合物的組成來完成，包括伽馬一氨基丁酸/GLP-I 多肽或者伽馬一氨基丁酸前體GAD65/67和GLP-I或者它的類似物如ΕΧ4或DPP-4抑制劑。發(fā)明的另一個具體化體現(xiàn)是，腸泌素激素至少包括下列多肽中的任一個GLP-1，GLP-I 的抗DPP4型(或者DPP-4抑制劑)，EX4，GIP,他們的變異體或者衍生物，以使有效地阻止 β-細胞死亡和促進胰島β-細胞增殖和再生及抑制β-細胞自身免疫性。本發(fā)明的另一個具體化體現(xiàn)是，治療性組合物含伽馬一氨基丁酸能分子和GLP-I或GLP-I樣腸泌素，能有效地增加細胞質(zhì)量、增強細胞功能，同時又能特異性地抑制致糖尿病的T-細胞依賴的胰島β-細胞的自身免疫，從而有效地預防并逆轉(zhuǎn)胰島β-細胞在I型糖尿病發(fā)展過程中受到的破壞。本發(fā)明的另一個具體化體現(xiàn)是，治療性組合物能抑制致糖尿病性T-細胞依賴性對胰島β-細胞的免疫破壞。所述的致糖尿病性T-細胞是CD8+ T-細胞。目前已知在I型糖尿病患者中，持續(xù)的T-細胞依賴性對胰島β -細胞的特異性攻擊引起1型糖尿病患者的β-細胞破壞和減少繼而發(fā)生糖尿病性高血糖。伽馬一氨基丁酸能作用主要是通過激活伽馬一氨基丁酸受體而實現(xiàn)的。在胰腺胰島中，伽馬一氨基丁酸是由β-細胞特異合成的，而伽馬一氨基丁酸受體在β-細胞和α-細胞中均有表達的。重要的是伽馬一氨基丁酸受體在T-淋巴細胞中也有表達，這解釋了為什么伽馬一氨基丁酸能抑制T-細胞自身免疫的一個重要機制。GLP-I受體主要在胰島β-細胞中表達，在腸和腦中也有一定的表達。盡管未見GLP-I受體在T-淋巴細胞的報道，GLP-I對T-淋巴細胞的潛在作用很可能是通過調(diào)節(jié)胰島細胞的伽馬一氨基丁酸受體生成和分泌或者是通過周圍GLP-I敏感性組織的作用而實現(xiàn)的。本發(fā)明的另一個具體化體現(xiàn)是，組合物的組分可以全都以合適的載體及核酸序列的形式提供。相關(guān)核酸序列可以在組合物中以DNA載體的形式提供。通過注射DNA載體，組合物中的相關(guān)核酸序列可以在被注射個體中通過細胞機制被表達。質(zhì)粒的核酸序列編碼一個或者多個多肽可以誘導伽馬一氨基丁酸能分子和GLP-I的作用，用于提高胰島β-細胞的功能和耐受，以及抑制自身免疫的識別。根據(jù)質(zhì)粒編碼伽馬一氨基丁酸和GLP-I分子或編碼一個伽馬一氨基丁酸前體GAD65/67和一個腸泌素激素GLP-I或者 ΕΧ4。本發(fā)明的伽馬一氨基丁酸能分子包括伽馬一氨基丁酸，GAD65/67和伽馬一氨基丁酸受體激動劑。伽馬一氨基丁酸能分子的融合形式，如伽馬一氨基丁酸與清蛋白或者其他化學配體融合來發(fā)揮伽馬一氨基丁酸能的作用，也是可行的。根據(jù)發(fā)明，編碼腸泌素激素的質(zhì)粒包括至少以下多肽中的一個GLP-1，GLP-I (7-37) OH或者GLP-I (7_36)氨酰基，以及GLP-I 的抗DPP4形式(或DPP-4抑制劑)，EX4，GIP，它們的變異體或者衍生物，可以有效地促進胰島β -細胞的生長和刺激內(nèi)源性伽馬一氨基丁酸的合成和分泌，最終提高胰腺胰島細胞的質(zhì)量與功能。本發(fā)明中，組合物中腸泌素激素多肽包括活性GLP-I分子和IgG重鏈恒定區(qū)(GLP-1/IgG-Fc)。GLP-I與IgG-Fc分子以融合蛋白形式形成一個新的分子，同時擁有增強的GLP-I作用和IgG-Fc分子的優(yōu)勢，如增加配體親和力和免疫耐受性。GLP-I多肽是天然的或者DPP-4抵抗的。IgG是人源或者鼠源的。一個鼠IgG是IgGl。人IgG是來源于 IgGl, IgG2, IgG3或者IgGE或者IgGM。GLP-I多肽可能是天然序列的變異體或者一個片段。 GLP-I多肽可能是GLP-I (7-37) OH或者GLP-I (7-36)氨酰基。這樣的GLP-1/EX4融合蛋白可以與一個人白蛋白或者其他化學配體融合來延長GLP-1/EX4或者它的變異體或者衍生物在循環(huán)中的半衰期，以提高GLP-I的作用。 實驗技術(shù)描述本發(fā)明還提供了在體內(nèi)實驗和體外實驗中用到的方法。CDl小鼠， NOD小鼠和轉(zhuǎn)基因TCR NOD小鼠飼養(yǎng)在圣米高醫(yī)院動物部，恒溫，每天12小時光照，自由飲水飲食(正常飲食)。小鼠每天腹腔注射ang/鼠伽馬一氨基丁酸，使其循環(huán)濃度達到 100-200 μ M，PBS作為對照。在60天的試驗期內(nèi)每天都要給予藥物處理。伽馬一氨基丁酸和PBS處理后1周，腹腔內(nèi)注射低劑量鏈脲霉素(str印tozotocin，STZ, Sigma, 40mg/kg Bff) 連續(xù)5天。STZ注射后每3天從尾靜脈取血檢測血糖觀察高血糖發(fā)展，儀器為Ascensia的血糖儀。STZ誘導且伽馬一氨基丁酸未處理的發(fā)生嚴重糖尿病小鼠分為2組一組開始腹腔給予2mg的伽馬一氨基丁酸，而另一組給予PBS。處理持續(xù)75天。NOD小鼠的處理除了不給予STZ外與CDl小鼠處理相似。NOD小鼠是自發(fā)性自身免疫性1型糖尿病模型。TCR 轉(zhuǎn)基因8. 3-N0D小鼠是重癥自發(fā)性自身免疫性1型糖尿病模型。腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實驗 (Intra-peritoneal Glucose tolerance test, IPGTT)在處理前，處理后 1 周，3 周，5 周， 和處死前動物檢測IPGTT。IPGTT檢測，小鼠禁食過夜約15h，腹腔注射1.5g糖/kg BW。尾靜脈取血，注射后0，10，20，30，60，90和120分檢測血糖。胰島素，胰高血糖素耐量實驗 (Insulin/glucagon tolerance assays) :ITT 實驗小鼠不需要禁食，腹腔注射 2. 5unit 胰
15島素/kg BW。尾靜脈取血，注射后0，20，30，40，60，90和120分檢測血糖。胰高血糖素耐量實驗(GTT)的小鼠禁食15h，腹腔注射50ng胰高血糖素/g BW。尾靜脈取血，注射后0， 10，20，30，60，90和120分檢測血糖。代謝檢測在給予伽馬一氨基丁酸和PBS前和實驗結(jié)束時在代謝籠中檢測小鼠進食量，飲水量和尿量。為了檢測脂質(zhì)分布，分離并稱重腹腔內(nèi)脂墊，腹腔后，腸系膜和附睪周圍脂肪。同時也檢測了皮下脂肪。生化檢測在所示時間點隱靜脈采血200 μ L和實驗結(jié)束時心臟采血ImL用于檢測胰島素，胰高血糖素和細胞因子譜。 離心后取血清存于-80°C待使用。利用胰島素ELISA試劑盒和胰高血糖素RIA試劑盒檢測血清中胰島素和胰高血糖素的濃度。通過GLP-IRIA試劑盒檢測GLP-I循環(huán)水平。通過多重磁珠法檢測樣本血清中細胞因子濃度。胰腺摘取和組織處理胰腺摘取和組織處理方法可簡述為動物麻醉后心臟穿刺，迅速將胰腺組織和周圍組織分離，去掉脂肪和淋巴結(jié)，吸干胰腺上附著的水分并承重，之后放到備好的福爾馬林-乙酸溶液中。從心臟穿刺到將胰腺放到固定液中，整個過程要在5分鐘內(nèi)完成。固定過夜后，胰腺用冷的流水沖洗并切割成 10-12塊。之后在乙醇和二甲苯中脫水，同一個胰腺中的所有小塊都要包埋在同一個石蠟塊中，用萊卡(LeiCa)RM2145半自動旋轉(zhuǎn)顯微切割機切成5-μπι厚的切片。這樣，一個切面即可以用于分析整個胰腺。 β -細胞和α -細胞質(zhì)量分析切片經(jīng)過脫蠟，脫水后，在0. 3% H2O2水溶液中孵育30分鐘，以滅活切片中的內(nèi)源性過氧化物酶活性，之后在Wi6. 0 IOmM乙酸鈉溶液中于 70°C加熱30分鐘以恢復抗原性。10%的正常山羊血清PBS溶液封閉非特異性結(jié)合位點， 之后用鼠抗胰島素多克隆抗體4°C孵育過夜，用于胰島素染色；另外，兔抗人胰高血糖素抗體(1 800 ；DAK0)室溫孵育2小時，用于胰高血糖素染色。PBS洗滌5分鐘后，切片在生物素標記的小鼠抗豬IgG或者生物素標記的大鼠抗兔IgG中室溫孵育1小時。PBS洗滌5 分鐘，之后在抗生物素蛋白-生物素復合物中室溫孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木精-伊紅 (HE)中復染。kar^cope CS下觀察，利用Imag必cope程序分析。畫出整個胰腺的面積，利用Positive Pixel Count Algorithm(Aperio technologies)計數(shù)整個區(qū)域內(nèi)強陽性信號 (Nsp)，代表胰島素或者胰高血糖素染色。Algorithm也用于檢測陽性和陰性信號的總數(shù)，代表整個胰腺的面積。每個胰腺的β-細胞質(zhì)量通過計數(shù)總的代表性β-細胞面積(Nsp)與總的胰腺面積和固定前胰腺的質(zhì)量的比例表示。β-細胞凋亡檢測胰腺胰島β-細胞凋亡是通過檢測caspase-3染色(CellSignaling)來評價的。caspase-3是一個常用的胰島 β-細胞凋亡標記。為了確認研究對象是胰島β-細胞，同時使用胰島素雙染色，方法如前所述。用原位細胞死亡檢測試劑盒和TMR紅(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)于石蠟包埋的胰腺切片定量進行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素UTP剪切和標記。用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚G’-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進行核染色，DAPI染色時，胰腺切片先用小鼠抗胰島素IgG(l 1000)和Cy3-耦連的抗小鼠IgG(l 500)染色，之后 M DAPI (1 μ g/ml PBS溶液，5min，Sigma，密蘇里州，美國)孵育。凋亡的β -細胞具有典型的形態(tài)學改變，包括染色質(zhì)濃縮和片段化。TUNEL檢測時，胰腺切片先用豬抗胰島素IgG染色，和FITC標記的二抗與TUNEL反應混合物孵育(60分鐘，RT，暗室)。胰腺切片在共聚焦檢測前先用DAPI染色。3H-胸腺嘧啶嵌入實驗檢測細胞增殖在12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)INS-I 細胞，80-85%的匯合度，血清饑餓M小時后，用不同濃度的伽馬一氨基丁酸和3mM的葡萄糖處理。一些細胞在處理前先用伽馬一氨基丁酸受體拮抗劑孵育20小時。37kg/ml 3H-胸腺嘧啶孵育4小時用于DNA合成。之后用冰預冷的PBS液洗滌細胞2次，Iml 5%的三氯乙酸冰上孵育30分鐘用于沉淀DNA。吸出液體層，加入250 μ 1 0. lmol/1 NaOH，室溫孵育 30分鐘，低速震蕩。溶解的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到5ml的閃爍液中，液體閃爍計數(shù)用于放射計數(shù)。流式細胞檢測:FITC-或者PE-標記的大鼠抗小鼠CD4，CD25，CD86 (B7. 1)，CD152 (CTLA-4)抗體，和同型IgG購自BD公司。非標記和生物素標記的小鼠抗人/小鼠LAP-TGF β來自R&D 公司。兔抗大鼠/小鼠神經(jīng)菌毛素l(neuropilinl，Nrpl)多克隆IgG由Oncogene提供。 抗LAP-TGFP和小鼠同型IgG按照說明書用Alexa Fluor488標記(Molecular Probes)。 抗-Nrpl IgG和兔正常IgG用Alexa 647標記，標記產(chǎn)物加到同型抗體中，終濃度0. 2%， 用于校正標記的一種基質(zhì)蛋白-明膠可能結(jié)合到淋巴細胞上。統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)用均值士標準差的方式表示。統(tǒng)計分析用Mudent’ s-t檢驗或者ANOVA檢驗，軟件為SAS或者 GraphPad Prism 3.0。糖尿病發(fā)病率用Kaplan-Meier法繪制，用log-rank進行統(tǒng)計學比較。胰島炎評分的顯著性差異通過Chi-squared分析確定。體外試驗和細胞因子釋放分析的組間差異使用ANOVA分析。ρ < 0. 05認為有統(tǒng)計學差異。本發(fā)明包括使用所有前述組合物來制備用于預防和治療糖尿病的藥物，其中1型糖尿病更為適宜。本發(fā)明還包括一個藥物組合物，如一個預防藥物，用于所有前述的用途中。對于化學當量或者化學性質(zhì)相似的氨基酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在結(jié)構(gòu)和序列上與伽馬一氨基丁酸或者GLP-1/EX4相同的聯(lián)合治療藥物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而且可能易于檢測以確定它們是否適合用于發(fā)明的方法中。GLP-I的衍生物和變異體。本發(fā)明多肽的變異體可能是自然突變，或者人為突變，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如在替代氨基酸中常用的定點突變技術(shù)。例如，一個疏水基團，如甘氨酸可能被另一個疏水氨基酸丙氨酸代替。丙氨酸也可能被一個更加疏水的基團亮氨酸，纈氨酸或者異亮氨酸代替。一個帶負電的氨基酸如天門冬氨酸可能被谷氨酸代替。一個帶正電的氨基酸如賴氨酸可能被另一個帶正電的氨基酸如精氨酸所代替。伽馬一氨基丁酸是一個氨基酸，分子式是C4H9NO2，分子量是103. 12g/mol。本發(fā)明伽馬一氨基丁酸結(jié)構(gòu)的變異體可能是自發(fā)生成的，或用化學修飾或者其他常用于氨基酸修飾的相關(guān)方法。例如，氨基基團可能被其他的化學基團或者結(jié)構(gòu)所代替，如Fmoc基團產(chǎn)生 Fmoc伽馬一氨基丁酸或者伽馬一氨基丁酸的N端乙酰化形成乙酰化伽馬一氨基丁酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解能用多種技術(shù)來構(gòu)建多肽類似物，該類似物具有所需的與本發(fā)明的相應多肽化合物相同或類似的性質(zhì)，但在溶解度、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂兔附獾拿舾行苑矫婢哂懈玫幕钚浴Ａ硗猓枚喾N技術(shù)來構(gòu)建多肽類似物，該類似物具有所需的與本發(fā)明的相應多肽化合物相同或類似的性質(zhì)，但在溶解度、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂兔附獾拿舾行苑矫婢哂懈玫幕钚浴１景l(fā)明多肽類似物可以依據(jù)已知的技術(shù)制備。例如，通過化學方法改變本發(fā)明中GLP-1/EX4多肽一個旁側(cè)基團的極性如將一個疏水基團轉(zhuǎn)化為另一個親水或者氨基基團。類似物包括組成完整氨基酸的序列或者包括氨基酸和修飾的氨基酸或者其他有機分子的雜交序列。本發(fā)明也包括伽馬一氨基丁酸能分子與腸泌素激素的雜交產(chǎn)物，例如一個氨基酸序列與一個核苷酸序列連接。本發(fā)明的一個具體體現(xiàn)是，氨基基團可以被鹵素基團置換，包括但不限于氟，氯，溴，碘等。本發(fā)明的另一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被烷基基團置換，包括但不限于甲基化基團，乙烷基團，丙烷基團，異丙烷基團，丁烷基團，t-丁烷基團，戊烷基團，己烷基團，庚烷基團等。本發(fā)明的一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被環(huán)烷基基團置換，包括但不限于環(huán)戊烷，環(huán)己烷等。 本發(fā)明的另一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被烷氧基基團置換，包括但不限于烷氧基，甲氧基，乙氧基，丙烷基等。本發(fā)明的另一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被鏈烯基置換，包括但不限于乙烯基、丙烯基等。本發(fā)明的另一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被芳香族基團置換，包括但不限于苯基團，萘基團，蒽基，聯(lián)苯基團，芘基基團，二萘嵌苯等。本發(fā)明的一個具體體現(xiàn)，氨基基團可以被雜苯基團置換，包括但不限于雜苯基團，吡啶基團，雙氮苯基團，三嗪基團，吖啶基團，噻吩基團，咪唑基團，1，3-氧氮雜戊基團，噻唑基團，三唑基團，喹啉基團，異喹啉基團等。本發(fā)明的另一個具體體現(xiàn)，碳基基團可以被化學基團置換，包括但不限于上述的化學基團。利用化學工程技術(shù)，如化學處理是常見的化學基團修飾或者置換方法。 本發(fā)明的一方面，通過選擇性定點突變，-伽馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素組合物的活性可能升高也可能降低。一個DNA質(zhì)粒或者表達載體，包括核酸分子或者一個序列一致的核酸分子也用于這些研究中，利用Wiarmacia Biotech的U. S. E (單一位點缺失)突變試劑盒或者其他可以買到的突變試劑盒或者PCR。一旦突變產(chǎn)生，可通過DNA序列分析證實， 將通過一個表達系統(tǒng)表達突變的融合蛋白并且檢測活性。本發(fā)明包括-伽馬一氨基丁酸能和和腸泌素激素的組合物，具體而言，-伽馬一氨基丁酸，-伽馬一氨基丁酸前體GAD65/67 和GLP-I或者EX4，與本發(fā)明的序列(或其部分序列)至少約> 20%、> 25%、>觀％、 > 30%,> 35%,> 40%,> 50%,> 60%,> 70%,> 80%或> 90%更優(yōu)選約> 95%、> 99%或>99. 5%相同的序列的融合蛋白。一致性的檢測依據(jù)常見方法。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法計算一致性。最優(yōu)選使用BLAST 2.1程序的高級搜索評估序列的一致性，BLAST是一套復合程序。本發(fā)明中的伽馬一氨基丁酸能分子是指包括但不限于伽馬一氨基丁酸和伽馬一氨基丁酸前體谷氨酸脫羧酶(GAD65)。GAD65是一種酶，主要在胰腺胰島細胞中生成。 在哺乳動物，GAD存在2種同型異構(gòu)體，分別由2個不同的基因編碼-Gadl和feid2。這些同性異構(gòu)體GAD67和GAD65的分子量分別是67和65kDa。GAD被認為是自身免疫反應中早期自身反應性T細胞的主要靶點。盡管GAD65長期被認為是1型糖尿病自身免疫的一個主要目標抗原，但GAD65在調(diào)節(jié)胰島β -細胞生長/增殖，分泌和功能方面的作用還不清楚。 在本發(fā)明中，通過自身免疫去掉GAD陽性胰島β-細胞可能降低胰島內(nèi)伽馬一氨基丁酸水平，這將引起細胞破壞的不斷累積。這個假設在NOD小鼠中得到支持，高表達人GAD65 的NOD小鼠在發(fā)生糖尿病方面受到保護，而低表達GAD65的NOD小鼠不被保護。本發(fā)明的組合物可以提供一些輔助試劑。具體地，這些輔助試劑可能是佐劑，所述和其它專利中常見的試劑。另外，具體地，本專利的組合物也可以提供細胞刺激劑，本發(fā)明的組合物可能提供細胞因子，但不限于趨化因子，干擾素，白介素和其他專利中已知的用于調(diào)節(jié)免疫反應的因子。本發(fā)明中組合物一方面，用于表達伽馬一氨基丁酸能和腸泌素激素和融合DNA序列疫苗，突變將引起核酸疫苗序列的一部分氨基酸序列改變，這部分并不參與提供活性或者這部分提供活性以致DNA疫苗的活性升高或者降低。通過選擇性位點特異性突變，DNA疫苗的活性可能被升高或者降低。一個DNA質(zhì)粒或者表達載體，包括核酸分子或者一個序列一致的核酸分子也用于這些研究中，利用Wiarmacia Biotech的U. S. E (單一位點缺失)突變試劑盒或者其他可以買到的突變試劑盒或者PCR。一旦突變產(chǎn)生，并通過DNA序列分析證實， 將通過一個表達系統(tǒng)表達突變的融合蛋白并且檢測活性。本發(fā)明還包括一個藥物組合物， 如一個預防藥物，用于所有前述的用途中。本發(fā)明的藥物組合物做成制劑包括前述的成份或者在一個DNA載體形式中，并可以通過多種途徑應用于人類或動物，且并不局限于局部施用，如口服、噴霧、氣管內(nèi)灌輸、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射和基因療法。施用劑量取決于患者需要，期望取得的效果和施用途徑。例如人類的施用量可以為0. Ol-lOmmol/kg體重或是0. 02 lOOOnmol/kg體重(伽馬一氨基丁酸GLP_1/Ex4)。當使用基因治療時，人的DNA注射濃度可以為1 μ g/kg體重或是0. 1 100 μ g/kg體重。使用的DNA疫苗合適濃度是0. I-IOOOyg DNA。用體內(nèi)脂質(zhì)體或是病毒轉(zhuǎn)運載體可以將融合蛋白導入細胞。適用于本發(fā)明的多種轉(zhuǎn)運載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。本發(fā)明的組合物可以每日、每周或是遵醫(yī)囑施用持續(xù)需要的時間。本發(fā)明的融合蛋白可以單獨有效使用，也可以在藥物組合物中與其他如藥用載體的成分一起使用。本發(fā)明的藥用組合物可用公知的能施用給患者的可藥用載體的方法制備，從而使有效量的核苷酸或多肽分子與可藥用的載體結(jié)合形成混合物。這些適合的載體，在此基礎上，所述藥用組合物可以包括與一種或多種可藥用的載體或稀釋液相結(jié)合、并存在于具適當PH值并與生理液體等滲的緩沖液中的活性化合物或物質(zhì)， 例如復合核酸分子、多肽分子或融合蛋白。結(jié)合活性分子和載體或?qū)烧吲c稀釋劑結(jié)合的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。所述組合物可包括用于運送活性化合物到組織內(nèi)特定部位的靶向制劑(targetingagent)。本發(fā)明的組合物可以與已知的I型和/或II型糖尿病的治療措施如使用降糖藥物或結(jié)合胰島素共同進行治療。例如，治療糖尿病的藥物可以包括Actos、Amaryl、avandia、DiaBeta、Diabinese、Dymelor> Glucophage> GlucophageXR、 Glucotrol> Glucotrol XL、Glucovance、Glynase、PresTab> Glyset、Micronase、Orinase、 Pandin、Precose、Starlix 禾口 Tolinase。例如，適合的姨島素包括Aspart、Insulin Glargine(Lantus)、Lente、Lispro (Humalog)、NPH 和 Ultralente。本發(fā)明適用于任何需要此類治療的個體。這些個體有可能發(fā)展成糖尿病、或新近診斷為糖尿病的患者或是已經(jīng)診斷為糖尿病的患者。本發(fā)明與預防和治療如本文所述的I型和II型糖尿病相關(guān)。例如，這樣的個體可以為肥胖的人或有糖尿病遺傳史但尚未發(fā)病的人、或新近診斷為或已經(jīng)診斷為糖尿病的人。世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)定義肥胖。BMI是用Kg體重除以身高米數(shù)的平方得來。BMI為18. 5 25則體重正常。個體的BMI為25 30則為超重，等于或超過30則為肥胖。這些個體也可以是血糖高于相同年齡與體重的正常值(正常血糖可以是根據(jù)醫(yī)學參考資料常規(guī)測定的)的人，盡管還不至于診斷為糖尿病。這些個體也可以是有糖尿病遺傳史但是還沒有發(fā)展成為糖尿病的人。當血糖值高于普遍認可的正常范圍時即可診斷為糖尿病。根據(jù)ADA和CDA的標準，當個體的空腹血糖值超過7. Onmol/L, 或是隨機血糖值(任意時段的血糖值)超過11. lnmol/L可認定為始患糖尿病。一旦診斷為糖尿病，任何對患者進行的對抗高血糖癥的努力/方法都屬于治療措施而不屬于預防措施。施用本發(fā)明的化合物以預防或治療I型糖尿病。I型糖尿病是指通常有遺傳性易患病體質(zhì)、或具有胰島β -細胞損傷、或具有缺乏胰島素反應第一期的“前”糖尿病、或是剛剛診斷為糖尿病的個體。在新近診斷為I型糖尿病的患者中，免疫系統(tǒng)攻擊并破壞產(chǎn)生胰島素的胰島細胞的結(jié)果是他們的胰腺不產(chǎn)生或是產(chǎn)生很少的胰島素。此外，有些人盡管還沒有診斷為糖尿病，但有發(fā)展為II型糖尿病的高風險。為降低或減少其發(fā)展為II型糖尿病的高風險，施用本發(fā)明的化合物同樣適用于預防和/或治療II型糖尿病。本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的組合物聯(lián)合用藥可以通過基因治療的方法直接在體內(nèi)表達。這些質(zhì)粒沒有傳染潛質(zhì)，僅能引起局部輕微的炎癥反應，也不會引起插入性突變。這避免了許多病毒載體的缺點。這種非病毒基因治療簡単，便宜，并可以在醫(yī)院外不需要醫(yī)生的情況下使用。-伽 馬一氨基丁酸能分子和腸泌素激素一同給予，通過注射裸質(zhì)粒DNA到骨骼肌而不是其他組 織中。而且，通常轉(zhuǎn)基因表達時間比在其他組織中長，可能因為線性肌細胞屬于非分裂和長 壽命的細胞。目前還沒有這種技術(shù)在自身免疫性疾病如1型糖尿病中的禁忌癥。
概述地，我們發(fā)明了ー種方法，単獨使用伽馬ー氨基丁酸能分子或利用聯(lián)合伽 馬一氨基丁酸能和腸泌素激素促進日細胞再生同時控制免疫原性，用于預防和治療1型糖 尿病。這種聯(lián)合治療提供了一種互惠的協(xié)同效果，包括促進日細胞再生同時抑制胰島自身 免疫。在利用MLDS-誘導的糖尿病CDl小鼠(ー種0細胞破壞模型)和1型糖尿病傾向 型的NOD小鼠或者轉(zhuǎn)基因TCR NOD小鼠中，均見到明顯的改善效果。聯(lián)合伽馬-氨基丁酸 能分子和腸泌素激素，例如本發(fā)明中聯(lián)合伽馬-氨基丁酸和GLP-1/EX4治療完全改善了 NOD 小鼠已發(fā)生的高血糖。而在已經(jīng)發(fā)病的1型糖尿病病人中，單純伽馬-氨基丁酸治療或者 GLP-1/EX4均不能完全改善糖尿病。所以，本發(fā)明提供了一種預防和治療發(fā)生糖尿病性高血 糖的1型糖尿病患者。可以理解的是以上涉及優(yōu)選實施方案的描述僅以實施例的方式給 出。由于計算機系統(tǒng)或是由于提呈本發(fā)明專利的方法弓I起的一些變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言是顯而易見的，而且這樣明顯的變化無論是否表達描述都是在本發(fā)明描述和要求保護 的范圍內(nèi)。
表1 伽馬-氨基丁酸的分子式和結(jié)構(gòu)，GLP-1/EX4，胰高血糖素，GIP，胰島素，GAD65和 其他與本發(fā)明相關(guān)分子的序列，詳見下文
權(quán)利要求
1 一種用于治療糖尿病的組合物，其特征在于是足以能抑制β細胞凋亡、促進β細胞再生并控制胰島自身免疫的有效給予劑量的化合物伽馬-氨基丁酸及其組合物的伽馬-氨基丁酸能分子，或是上述分子在一個配藥學上可以接受的鹽溶液中。
2.如權(quán)利要求1所述的用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的組分繼而包含足以能抑制β細胞凋亡、促進β細胞再生的有效治療劑量的腸泌素激素(incretin)，其可選自胰高血糖素樣肽(GLP-I)、exendin-4(EX4)多肽，或者變異體或衍生物。
3.如權(quán)利要求1所述的用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的伽馬-氨基丁酸能分子是伽馬-氨基丁酸，或者是GAD65，或者是GAD67，或者是伽馬-氨基丁酸的變異體或者衍生物，或者是伽馬-氨基丁酸受體激動劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的伽馬-氨基丁酸是天然存在形式或者變異體或者衍生物，該變異體或者衍生物包含化學修飾或者對伽馬-氨基丁酸氨基基團通過用一個化學基團的替換。
5.如權(quán)利要求2所述的用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的組分或其變異體選自GLP-I (7-37) 0H,或GLP-1 (7-36)氨酰基_1，或DPPIV抵抗型GLP-1或GLP-1的融合蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的DPPIV抵抗型GLP-I是GLP-1A8X，其中X是任何除A以外的氨基酸，可任意選自GLP-1A8G，N-乙酰基-GLP-I，N-甲基化-GLP-1 (N-me-GLP-l)，α -甲基化-GLP-I ( α -me-GLP-l)，脫氨基-GLP-1 (desamino-GLP-1)及咪唑-乳酸置換的GLP-1 (imi-GLP-1)，或者所述的N-端修飾的GLP-I如與脂肪酸鏈的共價結(jié)合，或所述的GLP-I融合蛋白包含與IgG Fc或白蛋白的融合蛋白形成GLP-I-IgGFc或GLP-I-白蛋白。
7.如權(quán)利要求1或2所述用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的Y-氨基丁酸能分子和腸泌素激素是單獨的分子，或者融合成為一個單一的Y -氨基丁酸能分子/腸泌素激素融合肽分子。
8.如權(quán)利要求6所述用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的GLP-I-白蛋白是人清蛋白，或者，其中所述的IgG是人IgG，并且人的IgG選自人IgGl、或人IgG2、或人IgG3 或者人IgG4，可首選IgG2和IgG4。
9.如權(quán)利要求2所述的用于治療糖尿病的組合物，其特征在于所述的GLP-I多肽變異體包括與序列號NO. 1的GLP-I序列有約70% -95%的同源性；Ex4多肽變異體包括與序列號NO. 2的Ex4序列有約70% -95%的同源性。
10.一種藥用組合物，其特征在于該藥用組合物由含有上述權(quán)利要求1至9中任一項所述的組分組成，其中該組合物可由可藥用載體搭載。
11.如權(quán)利要求10所述的用于治療糖尿病的組合物的應用方法，其特征在于所述的組合物是用于I型或II型糖尿病的治療以及糖尿病的預防。
12.如權(quán)利要求11所述的用于治療糖尿病的組合物的應用方法，其特征在于所述的組合物是通過經(jīng)由局部、或口服、或氣霧劑、或腹膜內(nèi)注射、或靜脈注射或肌肉注射的方式施用。
13.如權(quán)利要求1-9所述的用于治療糖尿病的組合物的應用方法，其特征在于所述的組合物的給予方式是包括肌肉注射其編碼的核苷酸，其中該核苷酸載體是一個非病毒載體，或是一個病毒性的載體，或者用于細菌或者真核表達的載體。
14.如權(quán)利要求1-9所述的用于治療糖尿病的組合物的應用方法，其特征在于所述的組合物中-氨基丁酸能分子給予劑量是0. 01-10mmol/kg,腸泌素激素0. 02 to IOOOnmol/ kg (如-氨基丁酸GLP-1/Ex4)或者是0. 002-2mg/kg的伽馬-氨基丁酸能分子和 0. 2-1000nmol/kg的腸泌素激素；其中-氨基丁酸能分子和腸泌素激素可選_氨基丁酸和 GLP-1/Ex4。
15.如權(quán)利要求14中所述的用于治療糖尿病的組合物的應用方法，其特征在于所述的組合物可用基因治療的方式給予，分別編碼化合物中復合物的DNA的使用量是1 μ g/kg體重至10 μ g/kg體重，DNA疫苗的合適劑量是0. 1至1000 μ gDNA。
全文摘要
用于治療糖尿病的組合物是有效給予劑量的化合物伽馬-氨基丁酸及其組合物的伽馬-氨基丁酸能分子(GABAergic)，或者是γ-氨基丁酸能分子和腸泌素(increatin)的組合。其具體應用是在I型糖尿病受試者體內(nèi)，給予γ-氨基丁酸能抑制β細胞凋亡、促進β-細胞再生、同時能抑制針對胰島β-細胞的自身免疫反應，繼而達到明顯逆轉(zhuǎn)糖尿病的功效。本發(fā)明描述的腸泌素僅以GLP-1或exendin-4為例。雖然GLP-1/exendin-4本身對I型糖尿病的作用極為有限，但其與γ-氨基丁酸協(xié)同作用時十分顯著地增強了γ-氨基丁酸的功效。這種在受試者體內(nèi)同時給予γ-氨基丁酸和GLP-1/exendin-4獲得了增強的生物效應，它對I型糖尿病個體同時給予γ-氨基丁酸和GLP-1/exendin-4可實現(xiàn)完全逆轉(zhuǎn)糖尿病的高血糖血癥。
文檔編號A61K38/26GK102389413SQ201010143359
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者王慶華, 耐普頓·索爾塔尼 申請人:王慶華