專利名稱：miR-199a及其抑制劑的應(yīng)用的制作方法
miR-199a及其抑制劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)microRNA的研究領(lǐng)域，更具體地講，涉及miR_199a及其抑制物在心臟疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心臟病是心臟疾病的總稱，包括風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、高血壓性心臟病、 冠心病、心肌疾病等各種心臟病。心臟病是目前危害人類(lèi)健康的主要疾病之一。心臟在受到各種生理刺激，組織損傷或者內(nèi)分泌失調(diào)的情況下會(huì)產(chǎn)生肥厚性生長(zhǎng)以維持心臟血輸出量。在體內(nèi)，引發(fā)心肌肥厚的信號(hào)種類(lèi)繁多，包括超負(fù)荷的機(jī)械牽拉力， 血流動(dòng)力學(xué)壓力，以及神經(jīng)活動(dòng)，激素分泌等。通過(guò)模擬這些誘發(fā)因素，可以人為的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌肥厚模型。例如通過(guò)主動(dòng)脈縮窄方法建立整體壓力超負(fù)荷肥厚模型、α-腎上腺素能受體激動(dòng)劑誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大模型。在以往的研究中，通過(guò)這些模型，人們檢測(cè)出了對(duì)心肌肥厚具有正性激活或負(fù)性抑制的一系列重要因子，繪制與心肌肥厚相關(guān)的信號(hào)途徑。MicroRNA是近年來(lái)在果蠅、線蟲(chóng)、小鼠和人等多種生命體中被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的小分子RNA。這一內(nèi)源性的小分子RNA的大量發(fā)現(xiàn)得益于兩種技術(shù)，一種是 microRNA cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序技術(shù)；另一種是生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針捕獲，通過(guò)接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)。通過(guò)文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序，人們掌握了 microRNA的大量序列信息，通過(guò)對(duì)這些序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析，人們發(fā)現(xiàn)大部分microRNA在物種間高度保守，在進(jìn)化上高度同源。關(guān)于microRNAs的基因組定位，早期普遍認(rèn)為其位于基因間區(qū)域，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)大部分microRNAs位于基因的內(nèi)含子中，隨宿主基因的轉(zhuǎn)錄而轉(zhuǎn)錄，與宿主基因具有相似的表達(dá)譜；另一部分聚簇存在的microRNAs，能夠單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)水平受到多種因素的調(diào)節(jié)。例如miR-l的表達(dá)受到血清反應(yīng)因子(SRF)和MEF調(diào)控。這些microRNAs基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物須經(jīng)過(guò)多步剪切加工才能形成成熟的microRNAs，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。首先， microRNAs基因經(jīng)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，形成Pri_microRNA，再經(jīng)Drosha剪切，形成了具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的Pre-microRNA ；Exportin 5將其從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿后，經(jīng)Dicer酶剪切，成雙鏈 microRNA分子；最后，雙鏈分離，一條被降解，另一條成為成熟microRNAs，并與其它分子一起形成了 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。RISC通過(guò)與mRNA的3'端非編碼區(qū)相互作用，引起mRNA的降解或者翻譯過(guò)程的抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)microRNA可能直接調(diào)控上百個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了許多重要的細(xì)胞途徑和生理病理過(guò)程。例如=MicroRNAs能夠調(diào)控細(xì)胞的分裂、分化、增殖和凋亡；胚胎的發(fā)育，機(jī)體的能量代謝、激素分泌和造血功能以及應(yīng)對(duì)壓力脅迫等生理過(guò)程；腫瘤發(fā)生和心肌肥厚等病理過(guò)程。在心血管系統(tǒng)中，microRNAs參與了心臟和血管的疾病發(fā)生過(guò)程。MicroRNAs表達(dá)的紊亂，參與多種心血管疾病的發(fā)生過(guò)程，在心臟方面， William等將67個(gè)病人分為典型的四組疾病狀態(tài)缺血性心肌病、擴(kuò)張型心肌病、主動(dòng)脈縮窄和非心衰病人，然后對(duì)他們的心肌組織進(jìn)行全基因組microRNA表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多種 microRNAs的表達(dá)水平在各種人類(lèi)心臟疾病中均發(fā)生了顯著性改變。對(duì)于microRNAs作用機(jī)制的探討，目前認(rèn)為其通過(guò)負(fù)性蛋白的表達(dá)而參與各種生命活動(dòng)過(guò)程。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在心臟發(fā)育早期的過(guò)表達(dá)，將促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，引起心臟發(fā)育停止，心室壁變薄；相反，miR-1的基因敲除小鼠中則出現(xiàn)心室壁變厚，室間隔缺損；進(jìn)一步研究表明這一效應(yīng)主要是通過(guò)miR-1抑制Hand2的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。MicroRNAs在心肌肥厚中的功能研究有助于我們更好的理解其發(fā)病機(jī)理，進(jìn)一步找到心肌疾病相關(guān)的藥物靶點(diǎn)，從而為這類(lèi)疾病的預(yù)防或治療提供行之有效的途徑。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供miR-199a及其類(lèi)似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，所述類(lèi)似物是指能夠生成類(lèi)似于miR-199a序列的重組質(zhì)粒或病毒載體或者是化學(xué)合成的類(lèi)似miR-199a的序列；所述miR-199a 序列為CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，所述miR-199a抑制劑是指能夠生成類(lèi)似于miR-199a反義互補(bǔ)序列的重組質(zhì)粒或病毒載體或者是化學(xué)合成的類(lèi)似miR-199a反義序列的RNA或DNA ；所述miR-199a 反義互補(bǔ)序列為GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-199a的體系；(2)檢測(cè)所述體系中miR_199a的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可增強(qiáng)或降低miR-199a的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。microRNA-199a(miR-199a)為一種本領(lǐng)域已知的 microRNA(miRNA)小分子，其對(duì)于調(diào)控RNA是有用的。然而，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于miR-199a生物學(xué)功能目前并不清楚。miR-199a具有如CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC所示的序列。其可以來(lái)自被分離細(xì)胞，或者可通過(guò)人工合成的方式獲得。在得知了 miR-199a的序列后，本領(lǐng)域人員可以方便地制備獲得mi R_199a或其抑制物。MiR_199a 的用途MiRNA參與心肌肥厚的多個(gè)方面包括心肌增殖，電傳導(dǎo)和纖維化等。然而， miR-199a是否參與心肌肥厚過(guò)程仍未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-133、 miR-499、miR-214、miR-24、miR-21和miR-199a等在心肌肥厚和慢性心衰中表達(dá)異常。通過(guò) Northern blot的方法，本發(fā)明人確定了 miR_199a主要表達(dá)于肺臟和心臟，在心臟中主要表達(dá)于心肌細(xì)胞，在心肌成纖維細(xì)胞僅有微量表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，本發(fā)明人確認(rèn)了缺氧誘導(dǎo)因子1是時(shí)1 -1993的一個(gè)靶基因。過(guò)表達(dá)1^1 -1993可以降低包含!1正-10 3， 非翻譯區(qū)的熒光素酶活性。在大鼠肥厚的心臟左室，miR-199a表達(dá)顯著上調(diào)。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-199a顯著增加細(xì)胞表面積，相反，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中抑制miR_199a的表達(dá)則降低細(xì)胞的表面積，另外，在苯腎上腺素誘發(fā)的肥大心肌細(xì)胞模型中抑制miR-199a的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞表面積。此外，miR-199a在心肌細(xì)胞的過(guò)表達(dá)能夠抑制心肌收縮蛋白 myh6的表達(dá)，表明miR-199a的表達(dá)異常參與心肌收縮紊亂。此外，在血清剝奪的心肌細(xì)胞中miR-199a過(guò)表達(dá)能夠抑制心肌損傷標(biāo)志分子anp和serCa2的表達(dá)，表明在心肌缺血中 miR-199a具有保護(hù)作用。基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種miR-199a的用途，用于保護(hù)缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的發(fā)生。MiR_199a抑制劑及其用途本發(fā)明人在深入研究后發(fā)現(xiàn)miR-199a的表達(dá)異常參與心肌收縮紊亂，能夠抑制心肌收縮蛋白myh6的表達(dá)。MiR-199a的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。深入研究后發(fā)現(xiàn)，MiR-199a的抑制劑能夠抑制心肌細(xì)胞肥大。因此，本發(fā)明還提供了 miR-199a抑制劑的用途，用于制備預(yù)防或治療心臟疾病的組合物。所述的心臟疾病特別是心肌疾病，尤其是心肌肥厚或心衰。miR-199a的抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可降低 miR-199a的活性、降低miR_199a的穩(wěn)定性、抑制miR_199a的表達(dá)、減少miR_199a的有效作用時(shí)間、或抑制miR-199a的轉(zhuǎn)錄和加工的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于預(yù)防或治療心臟疾病的有效物質(zhì)。所述的miR-199a的抑制劑也可以是經(jīng)過(guò)修飾的形式。在得知了 miR_199a對(duì)于心臟疾病的作用后，本領(lǐng)域人員可以方便地得知可以通過(guò)miR-199a抑制劑來(lái)防治心臟疾病的發(fā)生或發(fā)展。因此，任何miR-199a的抑制劑都可用于本發(fā)明，根據(jù)miR-199a的特性，本領(lǐng)域人員可以獲得多種miR_199a的抑制劑。所述的miR-199a的抑制劑例如包括但不限于特異性結(jié)合miR_199a的蛋白；特異性干擾miR-199a基因表達(dá)、加工的小干擾分子，如siRNA分子、miRNA分子、反義核苷酸寸。所述的miR-199a的抑制劑優(yōu)選為反義核苷酸，或是序列與其反義核苷酸的序列具有80%以上的相同性(較佳地具有85%以上的相同性)的反義核苷酸；它們均具有 miR-199a反義核苷酸相同的功能。所述的miR-199a的抑制劑可以是miR-199a的反義核苷酸。從理論上來(lái)講，根據(jù)反義技術(shù)獲得的反義分子可用于治療任何由基因表達(dá)或者基因缺失引起的疾病。所述的“反義核苷酸”還包括經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核苷酸的活性、穩(wěn)定性或治療效果。對(duì)反義核苷酸的修飾包括但不限于甲氧基化修飾、鎖核酸修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替。本發(fā)明對(duì)小干擾RNA的制備方法沒(méi)有特別的限制，包括但不限于化學(xué)合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本發(fā)明所提供的反義核苷酸的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達(dá)所述的反義核苷酸。所述的反義核苷酸可通過(guò)采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。篩選方法在得知了所述的miR-199a與心臟疾病的相關(guān)性后，可以基于該特征來(lái)篩選調(diào)節(jié) miR-199a的表達(dá)或活性，進(jìn)而可預(yù)防或治療心臟疾病的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達(dá)miR-199a的體系接觸；和檢測(cè)候選物質(zhì)對(duì)miR_199a的影響；若所述候選物質(zhì)可降低miR-199a的表達(dá)或活性，就表明該候選物是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。所述的體系包括(但不限于)溶液體系、亞細(xì)胞體系、細(xì)胞體系、組織體系、 器官體系、或動(dòng)物體系。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所述的 miR-199a抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所
接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的miR-199a抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。通常，當(dāng)本發(fā)明的miR-199a抑制劑每天以約0. 001-100mg/kg(優(yōu)選的為 0.01-20mg/kg)動(dòng)物體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開(kāi)的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為 0.005-100mg，較佳地約為0.008-50mg。可調(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉給予、局部給予、植入、緩釋給予、心臟內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明提供了一種miR_199a的用途，用于保護(hù)缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的發(fā)生，可通過(guò)改變miR-199a的基因表達(dá)來(lái)達(dá)到預(yù)防或治療這些疾病的目的，miR-199a及其抑制劑在治療相關(guān)疾病的藥物中具有廣闊的前景。

圖1.定量PCR或Northern blot對(duì)心肌高豐度microRNAs的組織表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期獲得心肌特異的microRNA，定量PCR結(jié)果如圖IA所示miR_21、miR-23、miR-24、 miR-181、miR-199a、miR-214、miR-451 為組織廣譜表達(dá)，而 miR-1、miR-133、miR-499 僅在肌組織表達(dá)，miR-126為組織廣譜表達(dá)(圖IB)；圖2.腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)建立大鼠心肌肥厚模型A，假手術(shù)對(duì)照組(Sham)及 AAC大鼠心臟的H&E染色，標(biāo)尺為2mm ；B,與對(duì)照組相比，腎上腹主動(dòng)脈縮窄后大鼠的心重 /體重比明顯升高；C，與對(duì)照組相比，腎上腹主動(dòng)脈縮窄后大鼠心肌組織的中anp和myh7 的mRNA表達(dá)水平顯著升高；D，心肌高豐度microRNAs在腹主動(dòng)脈縮窄1周表達(dá)異常，與對(duì)照組相比，miR-1、miR-133和miR-499表達(dá)顯著降低，而miR_199a表達(dá)顯著升高，心肌高豐度microRNAs在腹主動(dòng)脈縮窄4周表達(dá)異常，與對(duì)照組相比，miR_181a表達(dá)顯著降低，而miR-214、miR-24、miR-21 表達(dá)顯著升高；圖3. MiR-199a和miR-214在心肌肥厚中表達(dá)升高A，miR_199a和miR-214基因定位于非編碼RNA Dmn3os中，在人、小鼠、大鼠及斑馬魚(yú)物種間高度保守；B，在大鼠各器官中miR-199a主要表達(dá)心臟和肺臟，在心臟中，miR-199a主要表達(dá)于心肌細(xì)胞，在心肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)較低；C，MiR-214在AAC 4周、8周、12周中的肥厚心肌中表達(dá)明顯升高， miR-199a在心肌肥厚過(guò)程表達(dá)異常，在AAC12周時(shí)，表達(dá)升高最為明顯；圖4. MiR-199a過(guò)表達(dá)促進(jìn)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大，使其表面積顯著增加A，定量 PCR和Northern blot檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞中miR_199a的表達(dá)，miR-199a的表達(dá)量約上調(diào)10倍左右；B，miR-199a過(guò)表達(dá)后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的肥大表型；隨機(jī)選取 10個(gè)視野的200個(gè)細(xì)胞，對(duì)其表面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明miR-199a過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞表面積增加；C，MiR-199a過(guò)表達(dá)抑制心肌收縮蛋白Myh6的表達(dá)；D， MiR-199a過(guò)表達(dá)抑制ANP、ATP2a2的表達(dá)；圖5. miR-199a反義寡核苷酸沉默miR_199a，抑制培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大A，定量 PCR和Northern blot檢測(cè)反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞中miR_199a的表達(dá)，miR-199a 的表達(dá)量約下調(diào)至心肌細(xì)胞基礎(chǔ)水平的左右；B，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-199a 的As-RNA 48h后，心肌細(xì)胞表面積明顯降低；C，在PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型中，沉默 miR-199a抑制心肌細(xì)胞肥大；圖6. Hifl α可能是miR_199a的靶基因A，miR_199a與缺氧誘導(dǎo)因子(Hifl α ) 和Sirtuinl的3'端非編碼區(qū)序列匹配程度較好；B，Luciferase實(shí)驗(yàn)表明，miR_199a能夠抑制融合Hifl α 3'端非編碼區(qū)的報(bào)告基因的表達(dá)，但不能抑制融合Sirtuinl 3'端非編碼區(qū)的報(bào)告基因的表達(dá)；C，Western blot結(jié)果表明miR_199a過(guò)表達(dá)不能抑制Sirtuin的
蛋白表達(dá)。
具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法RNA 制備 人心臟總RNA購(gòu)于Ambion，Inc.，小鼠、大鼠組織以及培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA用 TRIzol(Invitrogen)抽提。實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)方法抽提RNA，通過(guò)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的microRNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法定量，分析各樣本的microRNA濃度，并通過(guò)溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定基因擴(kuò)增的特異性。Northern blot 檢測(cè) miRNA
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總RNA經(jīng)PAGE尿素變性膠電泳后轉(zhuǎn)膜，行紫外交聯(lián)，然后與同位素標(biāo)記的特異性探針雜交過(guò)夜，洗膜后，-80°C條件下進(jìn)行X膠片顯影。以非編碼RNA TO或5.8S RNA作為內(nèi)參照分析mi croRNA的表達(dá)量。乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)和肥大模型取出生1-3天的SD乳鼠，無(wú)菌條件下取心室肌，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)并接種。常規(guī)培養(yǎng)2天后，再以無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)，然后給予ΙΟΟμΜ苯腎上腺素 (phenylephrine, ΡΕ)孵育48小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞肥大，觀察細(xì)胞表型并進(jìn)行microRNA、肥厚標(biāo)志分子等檢測(cè)。過(guò)表達(dá)microRNA的腺病毒載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染將microRNA前體序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒(可表達(dá)綠色熒光蛋白)， 線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞， 在293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，獲得第一代腺病毒。按IOMoI滴度，多次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得較高滴度的病毒液，經(jīng)氯化銫密度梯度離心純化。純化后的病毒原液以10倍梯度稀釋后， 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)呈綠色熒光的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以確定病毒滴度。腺病毒以50MoI、IOOMoI滴度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，以確定轉(zhuǎn)染效率；通過(guò)定量PCR和Northern blot檢測(cè)microRNA表達(dá)量以確定病毒的表達(dá)效率。 MicroRNA反義序列的設(shè)計(jì)及沉默效率分析Mirbase獲得microRNAs成熟序列，設(shè)計(jì)其反義互補(bǔ)RNA，化學(xué)合成該序列，并進(jìn)行堿基的2'甲氧修飾。將反義序列按照40nM濃度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，孵育48小時(shí)，通過(guò)定量PCR 和Northern blot分析其對(duì)靶microRNA的沉默效率。生物信息學(xué)法預(yù)測(cè)microRNAs的靶基因利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站和軟件，對(duì)大鼠的microRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，尋找序列匹配程度高、二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、靶序列在物種間高度保守的基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。雙熒光報(bào)告基因法檢測(cè)microRNA的靶基因?qū)谢虻?’非編碼區(qū)中能與microRNA相互作用的序列克隆至pGL3質(zhì)粒中熒光素酶的3’非編碼區(qū)，構(gòu)建重組的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將其與表達(dá)相應(yīng)microRNA的 PSuper載體按一定的比例共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞。24小時(shí)后裂解細(xì)胞，采用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)量，從而反映microRNA在離體體系中能否調(diào)控靶基因表達(dá)。大鼠心肌肥厚模型采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄方法建立大鼠心肌肥厚模型，具體操作如下成年健康SD 大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下開(kāi)腹，分離腹主動(dòng)脈，在右腎動(dòng)脈上方沿腹主動(dòng)脈用4號(hào)絲線將其與外徑為0. 6mm的注射針管一并扎緊，后迅速將針管移去，縫合關(guān)腹，對(duì)照組不做絲線結(jié)扎，其它處理相同。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)動(dòng)物，定期處死動(dòng)物并取心肌，通過(guò) HE染色、肥厚標(biāo)志分子檢測(cè)、心重/體重比值等監(jiān)測(cè)心肌肥厚發(fā)生情況。組織學(xué)分析取sham和AAC組大鼠心臟，用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋。石蠟切片(4 μ m) 后用蘇木精&伊紅染色(H&E)，觀察分析。
細(xì)胞免疫熒光及細(xì)胞表面積分析4%多聚甲醛細(xì)胞固定15分鐘后用0. Triton X-100通透15分鐘，5%山羊血清室溫封閉1小時(shí)，以1 500稀釋度加入anti-α -actinin抗體(Sigma) 4°C孵育過(guò)夜。用 PBS洗三遍后加入Alexa-555 (Molecular Probes)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。細(xì)胞核用 4，，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)標(biāo)記，最后封片。細(xì)胞表面積用軟件 AxioVision 4. 7. 1 (Carl Zeiss, Inc)進(jìn)行計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對(duì)于相對(duì)基因表達(dá)分析，對(duì)照組的平均值定義為 1。用非配對(duì)Student’ s t test進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。Sigma plot程序用于數(shù)據(jù)分析。P < 0. 05為顯著差異。實(shí)施例l、miR-199a在心肌肥厚中表達(dá)升高，可能是心肌肥厚的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)MicroRNA，特別是心肌高豐度特異的microRNAs的表達(dá)異常，在心血管疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。本課題組在前期工作中已確定多種心肌高豐度的microRNAs。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)定量PCR或Northern blot對(duì)這部分microRNAs的組織表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期獲得心肌特異的 microRNA。結(jié)果如圖 IA 所示miR-21、miR-23、miR-24、miR-181、miR-199a、 miR-214、miR-451為組織廣譜表達(dá)，而miR-l、miR-133、miR-499僅在肌組織表達(dá)(圖1B)。心肌組織中存在多種高豐度的microRNAs。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的腎上腹主動(dòng)脈縮窄的方法，成功建立了大鼠心肌肥厚模型(圖2)。大鼠在腹主動(dòng)脈縮窄1周后，腎素-血管緊張素系統(tǒng)被激活，同時(shí)外周阻力增大，引起心臟的后負(fù)荷增加。為了維持正常的泵血功能，心臟開(kāi)始出現(xiàn)代償性的肥厚反應(yīng)，表現(xiàn)為收縮蛋白合成增多，從而引起心臟重量增加， 因此通過(guò)對(duì)心重/體重比這一指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，將有助于我們了解整個(gè)模型的病理進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中，我們分別對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄后1周、4周、8周、12周的大鼠心重/體重比進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，表明在腹主動(dòng)脈縮窄1周后，腹主動(dòng)脈縮窄(AAC)組的心重/體重比明顯高于假手術(shù)(sham)組，并且隨縮窄時(shí)間的延長(zhǎng)，心重/體重比持續(xù)升高，在第8周時(shí)達(dá)到最高峰，但在12周時(shí)AAC組的心重/體重比仍高于sham組(圖2B)。在心肌肥厚的過(guò)程中，許多胎兒期基因?qū)⒅匦卤磉_(dá)，心房鈉尿肽(ΑΝΡ)、β-重鏈肌球蛋白(β MHC)、內(nèi)皮素-I(ET-I)分子表達(dá)水平可以間接反映心肌肥厚和損傷的程度。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)定量PCR檢測(cè)這些分子標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明與sham組相比，ANP在腹主動(dòng)脈縮窄1周時(shí)，即顯著上調(diào)，并持續(xù)升高至4周，隨著心臟代償機(jī)制的激活，其表達(dá)量在4周后略有下降，但仍明顯高于對(duì)照組；8周后，ANP的mRNA水平又持續(xù)升高至12周(圖2C)。β MHC與ANP有類(lèi)似的變化趨勢(shì)，表現(xiàn)為雙峰相1周時(shí)，表達(dá)急劇升高，后逐漸下降，但隨心肌損傷的加劇，其表達(dá)在8周、12周又再次被激活(圖2C)。ΑΝΡ、β MHC,ET-I這些分子的mRNA表達(dá)水平，表明心肌肥厚建立成功。腎上腹主動(dòng)脈縮窄1周大鼠的心臟，縱切面和橫斷面H-E染色，結(jié)果表明-MC組與sham組相比，大鼠心臟左心室壁已明顯增厚，左心室變小，表明心肌肥厚模型建立成功。腹主動(dòng)脈縮窄1周時(shí)，肥厚心肌microRNAs表達(dá)異常，其中miR-l、miR-133和 miR-499表達(dá)顯著降低，而miR-199a表達(dá)顯著升高，最為明顯。腹主動(dòng)脈縮窄4周時(shí)，肥厚心肌 microRNAs 表達(dá)異常，其中 miR_23a、miR-133、miR-145、miR-199a 和 miR-499 表達(dá)未發(fā)生改變，miR-181a表達(dá)顯著降低，而miR-21、miR-24和miR-214表達(dá)顯著升高(圖2D)。Northern blot結(jié)果表明，miR_199a主要表達(dá)于心臟和肺臟(圖3B)。為了進(jìn)一步分析miR-199a在心臟各個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的表達(dá)譜，本發(fā)明人分離了大鼠心臟的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并檢測(cè)了 miR-199a的表達(dá)水平。通過(guò)Northern blot方法，miR_199a主要在心肌細(xì)胞檢測(cè)到，而在成纖維細(xì)胞表達(dá)量較低(圖3B)。因此本發(fā)明人的結(jié)果表明，miR-199a 主要表達(dá)于心肌細(xì)胞。前一工作中，我們通過(guò)定量PCR對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄1周、4周大鼠的肥厚心肌進(jìn)行 microRNAs表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-199a和miR-214表達(dá)異常最為明顯；我們將進(jìn)一步探討這2 種microRNAs在整個(gè)心肌肥厚病理進(jìn)程中的異常表達(dá)，探索其可能的病理意義。結(jié)果表明 miR-199a在前期表達(dá)顯著升高，在12周時(shí)間點(diǎn)上，表達(dá)升高最為明顯，提示了在心肌肥厚的病理進(jìn)程中，miR-199a可能主要在心肌由代償期向失代償期過(guò)渡中起作用；miR-214的表達(dá)量在AAC 1周時(shí)沒(méi)有變化，4周時(shí)表達(dá)開(kāi)始升高達(dá)sham組的1. 5倍，12周的表達(dá)量較 sham組升高1倍左右，提示miR-214可能在心肌肥厚的發(fā)生過(guò)程起重要功能(圖3C)。實(shí)施例2、過(guò)表達(dá)miR-199a可誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。MiR-199a過(guò)表達(dá)腺病毒以IOOMoI的量轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞48h后(圖4A)，行免疫熒光染色，結(jié)果如圖4B所示miR-199a過(guò)表達(dá)后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的肥大表型；隨機(jī)選取10個(gè)視野的200個(gè)細(xì)胞，對(duì)其表面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明miR-199a過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞表面積增加。實(shí)施例3、MiR-199a沉默抑制培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大。前一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR_199a過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞肥大。為更好的探討miR-199a的內(nèi)源性功能，本工作通過(guò)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染2’甲氧修飾的 miR-199a的反義RNA，進(jìn)而沉默內(nèi)源性的miR_199a。通過(guò)定量PCR和Northern blot檢測(cè)表明miR-199a的As-RNA能夠顯著抑制內(nèi)源性的miR_199a的水平(圖5A)。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-199a的As-RNA 48h后，細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果表明與對(duì)照組相比， 心肌細(xì)胞的肥大表型受到明顯抑制；隨機(jī)選取10個(gè)視野的200個(gè)細(xì)胞，對(duì)其表面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明miR-199a沉默后能夠顯著抑制基礎(chǔ)水平的心肌細(xì)胞肥大(圖5B)。為了進(jìn)一步探討miR-199a能否抑制PE誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大，本實(shí)驗(yàn)將在PE誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中進(jìn)一步沉默miR-199a，觀察其對(duì)肥大心肌細(xì)胞的影響。結(jié)果如圖5C所示miR-199a沉默后抑制心肌細(xì)胞肥大，隨機(jī)選取10個(gè)視野的200個(gè)細(xì)胞，對(duì)其表面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明miR-199a過(guò)表達(dá)抑制PE誘導(dǎo)條件下心肌細(xì)胞表面積增加。實(shí)施例4、MiR-199a過(guò)表達(dá)引起心肌細(xì)胞收縮蛋白的表達(dá)異常。重鏈肌球蛋白的異構(gòu)體轉(zhuǎn)變是心肌肥厚中肌纖維發(fā)生的一個(gè)顯著性改變。我們通過(guò)定量PCR對(duì)這兩種肌收縮蛋白進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果如圖4C所示miR-199a過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制myh6的mRNA表達(dá)水平，而對(duì)myh7的mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例5、MiR-199a降低心肌損傷的生物標(biāo)志分子的表達(dá)。通過(guò)前期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)miR-199a能夠明顯的改善心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)鑒于miR-199a在AAC 12周時(shí)表達(dá)升高最為明顯，我們推測(cè)其可能在心力衰竭的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。為此我們通過(guò)定量PCR檢測(cè)心肌損傷的生物標(biāo)志分子 ANP、ATP2a2的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖4D所示ANP、ATP2a2的mRNA表達(dá)均下調(diào)，暗示了 miR-199a在基礎(chǔ)水平有可能具有改善心肌細(xì)胞的功能。實(shí)施例6、MiR-199a作用靶基因的尋找及驗(yàn)證。
通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Ddrl、MAP3kll、SIRTl、Hifl α、、JUNB, Gsk3 β、 Arhgapl2、均可能是miR-199a的潛在靶基因(表1)。表1. miR-199a靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
權(quán)利要求
1.miR-199a及其類(lèi)似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，所述類(lèi)似物是指能夠生成類(lèi)似于miR-199a序列的重組質(zhì)粒或病毒載體或者是化學(xué)合成的類(lèi)似miR-199a的序列；所述 miR-199a 序列為CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。
2.miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，所述 miR-199a抑制劑是指能夠生成類(lèi)似于miR-199a反義互補(bǔ)序列的重組質(zhì)粒或病毒載體或者是化學(xué)合成的類(lèi)似miR-199a反義序列的RNA或DNA ；所述 miR-199a 反義互補(bǔ)序列為GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。
3.一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-199a的體系；(2)檢測(cè)所述體系中miR-199a的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可增強(qiáng)或降低miR-199a的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了miR-199a及其類(lèi)似物在制備治療心肌缺血損傷藥物中的應(yīng)用，以及miR-199a抑制劑在制備治療抑制心肌細(xì)胞肥大及慢性心衰藥物中的應(yīng)用，并且在此基礎(chǔ)上，公開(kāi)了一種篩選預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)的方法，包括如下步驟(1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)miR-199a的體系；(2)檢測(cè)所述體系中miR-199a的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可增強(qiáng)或降低miR-199a的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療心臟疾病的潛在物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102266569SQ20101019305
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者宋曉偉, 李青, 秦永文, 荊清, 袁文俊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)