專利名稱：連翹氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥提取物，特別涉及連翹氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中 的應用。
背景技術：
酪氨酸磷酸酶SHP2是酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)家族中的一個 重要成員，它的發現使人們第一次認識到蛋白激酶抗衡劑和抗衡機制的存在(Feng GS, Hui CC, Pawson T :SH2_containing phosphotyrosine phosphatase as a target of protein-tyrosine kinases. Science 1993，259 (5101) :1607_1611)。隨后大量的系統研 究表明，SHP2不單單作為蛋白激酶信號的抗衡劑而抑制信號傳導，也能促進多種細胞質信 號(2.Feng GS :Shp2_mediated molecular signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Res 2007，17 (1) :37_4L 3. Feng GS Shp2 as a therapeutic target for leptin resistance and obesity. Expert Opin Ther Targets 2006，10(1) :135_142· 4. Mohi MG，Neel BG :The role of Shp2 (PTPNll) in cancer. Curr Opin Genet Dev 2007，17(1) :23_30.)。在代謝性疾病方面，通過一系列組織 特異性轉基因動物模型，證明SHP2的正常活性是防止糖尿病的關鍵信號，其活性降低則誘 發糖尿病(5. Zhang SS, Hao E, Yu J, et al. Coordinated regulation by Shp2 tyrosine phosphatase of signaling events controlling insulin biosynthesis in pancreatic beta-cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2009,106(18) :7531_7536 ；6.Princen F,Bard E, Sheikh F,et al.Deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in muscle leads to dilated cardiomyopathy, insulin resistance, and premature death. Mol Cell Biol 2009, 29(2) 378-388 ；7.Krajewska Μ,Banares S,Zhang EE,et al. Development of diabesity in mice with neuronal deletion of Shp2 tyrosine phosphatase. Am J Pathol 2008, 172(5) 1312-1324 ；8. Zhang EE,Chapeau E,Hagihara K,et al. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101(45) 16064-16069 ；9.Bard-Chapeau EA，Yuan J, Droin N, et al. Concerted functions of Gab land Shp2 in liver regeneration and hepatoprotection. Mol Cell Biol 2006,26(12) 4664-4674 ； 10.Bard-Chapeau EA, Hevener AL, Long S, et al. Deletion of Gab Iin the liver leads to enhanced glucose tolerance and improved hepatic insulin action. Nat Med 2005，11 (5) :567_571.)。 SHP2 是糖尿病禾口 肥胖癥的關鍵調控蛋白，SHP2在前腦剔除后，小鼠發生肥胖癥，體重明顯高于正常小鼠，血 液胰島素和瘦素升高，產生高血糖、胰島素、瘦素抵抗等II型糖尿病癥狀，隨后發展則出現 多種糖尿病的典型并發癥。而SHP2在前腦持續表達高活性時，小鼠不論進食多少，都不發 胖。另外，應用SHP2在肝臟、胰腺組織特異性剔除或激活的轉基因小鼠，證明SHP2具有促 進和維護胰島素的分泌，促進胰島素調控肝細胞糖代謝的作用。連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspense(Thunb. ) Vahl的干燥果實。性微寒，味苦。具有清熱解毒，消腫散結的功效。傳統應用主要用于外感風熱、咽喉腫痛、癰腫瘡癤、 瘰疬等疾病的治療。連翹中的化學成分主要是木脂素類、黃酮類、苯乙醇及其苷類及C6 C2天然醇類、萜類等。藥理研究表明，連翹具有抗菌、抗病毒、抗炎、治療心血管疾病、抗內 毒素、抑制彈性蛋白酶活力、抑制cAMP磷酸二酯酶活力、保肝作用等藥理作用(11.張海 燕.連翹化學成分及藥理活性的研究進展.中藥材，2000，23 (10) :10)。但連翹在降糖方面 的應用卻沒有研究報道，因此，以SHP2為靶點，開發新型的連翹降糖藥物具有十分重大的
眉、ο

發明內容
本發明的目的在于提供連翹氯仿提取物在制備酪氨酸磷酸酶SHP2促進劑和制備 治療糖尿病藥物中的應用。所述連翹氯仿提取物通過如下方法制備將干燥連翹經乙醇浸泡，加熱回流后合 并提取液，減壓干燥得連翹總提取物；再將連翹總提取物與硅藻土混合，或將連翹總提取物 用水混懸，采用氯仿萃取，減壓濃縮，干燥，即得連翹氯仿提取物。經過氯仿萃取后的剩余連翹提取物可依次采用乙酸乙酯、乙醇(正丁醇)以及水 萃取，再分別減壓濃縮，干燥，可得其它連翹提取物。所述連翹氯仿提取物能夠促進酪氨酸磷酸酶SHP2的活性，發揮降低血糖濃度的 作用，在制備治療糖尿病的藥物上具有廣泛的應用。利用酶和底物的反應，建立一個成熟有效的SHP2酶活性分析體系，可高通量的篩 選影響SHP2酶活性的成分。利用GST蛋白純化的方法，從細菌中提取和純化SHP2蛋白。將 SHP2 蛋白與它的催化底物 DiFMUP (8-diXuoro-4-methylumbelliferyl phosphate)發生熒 光反應，利用酶標儀讀數，確立理想的SHP2蛋白和催化底物DiFMUP的使用量，建立靈敏高 效的SHP2酶活性分析模型。利用所述SHP2酶活性分析模型，對2000余個中藥分離餾分的 活性進行篩選，發現所述連翹氯仿提取物具有明顯的SHP2酶活性促進作用，并通過動物實 驗證實所述連翹氯仿提取物能夠通過SHP2這個靶點起到治療糖尿病的作用。


圖1為不同連翹提取物對酪氨酸磷酸酶SHP2酶活性的促進作用。在圖1中，橫坐 標為不同連翹提取物，濃度均為3. 84 μ g/mL，縱坐標為酪氨酸磷酸酶SHP2酶活性(％ )。圖2為不同濃度連翹氯仿提取物對多種酪氨酸磷酸酶的作用。在圖2中，橫坐標 為連翹氯仿提取物濃度(μ g/mL)，縱坐標為連翹氯仿提取物對于不同酪氨酸磷酸酶的促進 率(% )；標記 為 SHP2，·為 SHP1，▲為 H印tp，·為 VHR。
具體實施例方式實施例1 連翹提取物的提取干燥連翹5kg，6倍量60%乙醇浸泡，加熱回流4次，每次2. 5h，合并提取液，減壓 干燥得連翹總提取物1000g。連翹總提取物用3 5倍量的硅藻土混勻，或將總提取物用水 混懸，混懸液用等體積的氯仿萃取，減壓濃縮，干燥，即得連翹氯仿提取物260g。經過氯仿萃取后的剩余連翹提取物(水混懸液)再根據同樣的方法用乙酸乙酯、
4乙醇(或正丁醇)依次萃取，分別減壓濃縮、干燥各提取物。得連翹乙酸乙酯提取物90g，連 翹乙醇(或正丁醇)提取物221g以及連翹水提取物400g。實施例2 連翹提取物對SHP2的促進作用1、SHP2促進作用的活性評價方法利用酶和底物的反應，建立一個成熟有效的酶活性分析體系，可高通量的篩選影 響SHP2酶活性的成分。利用GST蛋白純化的方法，從細菌中提取和純化SHP2蛋白。將SHP2 蛋白與它的催化底物 DiFMUP (8-diXuoro-4-methylumbelliferyl phosphate)發生熒光反 應，利用酶標儀讀數，確立理想的SHP2蛋白和催化底物DiFMUP的使用量，建立靈敏高效的 SHP2活性分析模型。利用96孔酶標板，將不同的餾分或天然小分子加入處理SHP2活性分 析體系，篩選促進SHP2活性的陽性小分子。將篩選得到的陽性小分子處理其他酪氨酸磷酸 酶VHR、Heptp, SHPl的活性分析體系，分析它們是否是SHP2活性的特異性促進劑。2、活性評價結果對實施例1中的不同連翹提取物(3. 84 μ g/ml)進行SHP2酶活性促進作用評價， 結果顯示，連翹氯仿提取物具有很好的SHP2酶活性促進作用，連翹乙酸乙酯提取物，連翹 乙醇(正丁醇)提取物以及連翹水提取物對于SHP2酶活性促進能力較弱或無促進作用(參 見圖1)。隨后，用不同濃度的連翹氯仿提取物，處理SHP2及酪氨酸磷酸酶家族的另外三個 成員VHR、!feptp、SHPl，觀察連翹氯仿提取物對各蛋白酶活性的促進作用，評價其對SHP2酶 活性的促進作用是否具有特異性。結果顯示連翹氯仿提取物對SHP2酶活性的促進作用隨 餾分濃度增加而增加，表現出良好的濃度依賴性，其對酪氨酸磷酸酶家族的另外3個成員 VHR,Heptp,SHPl的酶活性沒有明顯的促進作用。表明連翹氯仿提取物對于SHP2的促進作 用具有特異性(參見圖2)。實施例3 連翹氯仿提取物的降糖作用采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠模型實施。小鼠選用昆明小白鼠雌雄各 半，4周齡時購入，自由飲水攝食適應一周，開始利用鏈脲佐菌素造模。將小鼠分成2組，糖 尿病誘導組、注射檸檬酸緩沖液組。注射前將各小鼠稱重，小鼠在注射鏈脲佐菌素液時應該 先禁食6小時。糖尿病誘導組按照小鼠體重40mg/kg的比例腹腔注射STZ-檸檬酸緩沖液 (STZ溶于0. lmol/L pH4. 5的檸檬酸緩沖液中)；對照組注射等量的檸檬酸緩沖液；連續注 射5天。隨后，小鼠置于正常環境下飼養，每7天測血糖值(剪尾取血)，連續3周，非禁食 條件下血糖值在16. 7mmol/L以上的小鼠即為糖尿病小鼠模型。按血糖值均衡隨機分組，每 組20只小鼠，每組小鼠血糖均值基本一致。以鹽酸二甲雙胍為陽性對照藥，連翹氯仿提取 物的溶劑為陰性對照，連翹氯仿提取物設100mg/kg、400mg/kg、800mg/kg 3個劑量。另取1 組小鼠，腹腔注射生理鹽水作為正常對照組，根據小鼠體重按照0. 02ml/g的量對小鼠進行 灌胃，每日一次，連續兩周。在每日上午10時對小鼠進行禁食，禁食6小時后再對小鼠進行 灌胃。在第7天和第14天，禁食3h各測血糖一次。結果如表1所示，3個不同劑量的連翹氯仿提取物均表現出明顯的降低血糖的作用。表1連翹氯仿層提取物對小鼠血糖的作用
5 a.與溶劑模型組比較，t-檢驗的ρ值。*p < 0. 05，< 0. 01。
權利要求
連翹氯仿提取物在制備酪氨酸磷酸酶SHP2促進劑中的應用。
2.連翹氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中的應用。
全文摘要
連翹氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中的應用，涉及一種中藥提取物。提供連翹氯仿提取物在制備酪氨酸磷酸酶SHP2促進劑和制備治療糖尿病藥物中的應用。所述連翹氯仿提取物通過如下方法制備將干燥連翹經乙醇浸泡，加熱回流后合并提取液，減壓干燥得連翹總提取物；再將連翹總提取物與硅藻土混合，或將連翹總提取物用水混懸，采用氯仿萃取，減壓濃縮，干燥，即得連翹氯仿提取物。所述連翹氯仿提取物能夠促進酪氨酸磷酸酶SHP2的活性，發揮降低血糖濃度的作用，在制備酪氨酸磷酸酶SHP2促進劑和制備治療糖尿病的藥物上具有廣泛的應用。
文檔編號A61K131/00GK101912446SQ20101025647
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月19日 優先權日2010年8月19日
發明者呂忠顯, 布艷艷, 石濤, 蒙明慧, 陳全成, 陳海峰 申請人:廈門大學