專利名稱：經改善貯藏穩定性的脂質體的制作方法
技術領域：
本發明涉及SPLA2可水解的脂質體的藥物遞送系統，其具有經改善的貯藏穩定性，尤其是經改善的于2-8攝氏度的貯藏穩定性。
背景技術：
用于藥物遞送的脂質體脂質體是于20世紀80年代作為藥物遞送媒介物/系統而開發的微球體。于20世紀90年代，第一種脂質體類藥物得以批準用于商業用途。脂質體具有能用來攜帯各種化合物比如藥物的三個不同腔室內部含水腔室；疏水雙層；和內和外層的極性中間相。取決于待包封化合物的化學性質，其可以在任一腔室中局域化。目前，市場上存在數種腸胃外脂質體-藥物配制劑。水可溶的藥物傾向于在脂質體含水腔中局域化，脂質體中包囊的藥物的實例是例如多柔比星(Doxil)，多柔比星(Myocet)和柔紅霉素(DaunoXone)。穿插于脂質體膜中的藥物的實例是例如兩性霉素B(AmBisome),兩性霉素(AlbelcetB),苯并卩卜啉(Visudyne)和胞壁酰三肽-磷脂酰こ醇胺yunovan)。脂質體被認為是有前景的藥物遞送系統，原因是它們被動地靶向腫瘤組織通過利用固體腫瘤的病理生理學特征比如增生和増加的血管滲透性以及淋巴引流的缺陷。這些特征使得便于納米粒子的外滲，而由于增強的滲透性和保留效果(EPR)脂質體能夠得以在組織中保留更長時間。脂質體作為藥物遞送媒介物的特性關鍵地取決于受脂質體組合物中脂質的顯著影響的它們的表面電荷、滲透性、溶解度、穩定性等。此外，待包封于脂質體中的藥物還需要符合其它要求以考慮用于制備穩定的脂質體配制劑。涉及安全性和藥物效力的考慮要求脂質體配制劑保持它們的特性，也即從制備直至給藥的時間都保持穩定。另外，希望的是在經治療的受試者中運輸直至它們到達其中藥物特異性釋放的靶標位點期間所述配制劑保持不變。已描述了脂質體的各種靶向策略，例如綴合至細胞特異性配體比如抗體。 SPLA2可水解脂質體基于分泌性磷脂酶A2 (SPLA2)在癌性組織中以及在炎癥位點的升高水平，又一途徑已得以提出。基本觀點是，能夠制備脂質體，其又可被SPLA2水解，而被SPLA2水解則導致脂質體中所包封藥物的釋放。此外，sPLA2水解的產品，溶血脂和脂肪酸充當細胞膜的透化齊U，導致藥物的増加的細胞攝取。由于sPLA2水平在癌性組織中和在炎癥位點升高，sPLA2活化脂質體可以用來將包封藥物優先地遞送至所述位點。SPLA2可水解的脂質體的貯藏穩定性在慮及貯藏穩定性吋，SPLA2可水解的脂質體帶來特別的挑戰。這些挑戰基于有效的sPLA2水解所必需的特別的脂質組合物。通常，許多參數影響貯藏穩定性，并且還難以預測改變緩沖劑組成對貯藏穩定性的影響，原因是這不僅影響摩爾滲透壓濃度，還影響膜穩定性。現有技術許多文獻已經描述了 SPLA2活化的脂質體，并且各種文獻已經研究了脂質體的貯藏穩定性。然而，這些文獻中均未研究SPLA2可水解的脂質體帶來的特定的貯藏問題。W00158910描述SPLA2活化脂質體包含單醚溶血磷脂的前藥。該文獻也描述其它生物學活性化合物的包封。W00176555提出脂質類藥物遞送系統用于治療與細胞外sPLA2在哺乳動物皮膚組織或皮下組織中的局部增加有關的疾病或病癥的用途，其用于給藥由SPLA2活化的醚-溶血脂的前藥。該系統進一步包含所謂的邊緣活性(edge active)化合物。W00176556表明脂質類藥物遞送系統用于治療或預防選自利什曼病、錐蟲病、痕疾、溶組織內阿米巴病(Entaboeba, Histolyticasis)和"東方肝吸蟲華枝睪吸蟲病(chlomorchis sinensis)"的寄生物感染的用途,其中所述系統含有由sPLA2活化的脂質衍生物形式的前藥。脂質體可以含有額外的生物學活性化合物。W006048017和W007107161確實也描述了 sPLA2活化的脂質體。US5094854公開溫度敏感的脂質體，其是加熱條件下穩定性和釋放優化的。描述于該文獻的脂質體優選具有比溫血動物體液高I. 2至2. 5倍的滲透壓且具有40-45攝氏度的相轉變溫度的內部溶液。公開于該文獻的脂質體并不是SPLA2的基質，原因是它們確實不具有適當的脂質組成。大多數脂質體配制劑在貯藏期間沒有滲漏問題。相反，這些配制劑過于穩定以致難以在期望場所釋放經包囊的化合物。
發明概要在第一方面，本發明提供組合物，其包含SPLA2可水解的脂質體，外部溶液，和脂質體中的內部溶液，-其中滲壓劑濃度在內部溶液中比在外部溶液中更高。該組合物改善SPLA2可水解的脂質體的貯藏穩定性，尤其是于2_8攝氏度儲存時。脂質體優選包囊順鉬。本發明也提供制備本發明組合物的方法。


圖I.等值線圖，展示在脂質體制備期間所用的蔗糖濃度和勻化壓力對顆粒尺寸的影響。在等值線圖內的數值是指顆粒尺寸。圖2. 脂質體中的總Pt濃度是顆粒尺寸的函數。
圖3.LPB0057-LPB0073在2-8 °C貯藏期間的顆粒尺寸變化。圖4.LPB0057-LPB0073 在 2-8°C貯藏期間的 PDI 變化。圖5.等值線圖，展示在脂質體制備期間所用的內部NaCl濃度和勻化壓力對初始DOE%的影響。在等值線圖內的數是指DOE %。圖6.LPB0057-LPB0073Pt在貯藏期間的濃度。圖7.LPB0057-LPB0073 在貯藏期間的外部 Pt (% )。圖8.在2-8°C貯藏期間自LPB0057-LPB0073的滲漏量。圖9.等值線圖，展示在2-8 V貯藏56d之后內部NaCl濃度和蔗糖濃度對DOE %的影響，其中勻化壓力保持于12，500KPa.等值線圖內的數值是指在2_8°C貯藏56d之后的D0E%。圖10.等值線圖，展示在2_8°C貯藏56d之后內部NaCl濃度和蔗糖濃度對％滲漏量的影響，其中勻化壓力保持于12，500KPa.等值線圖內的數值指出在2_8°C貯藏56d之后的％滲漏量。圖IL在2_8°C貯藏期間自脂質體順鉬配制劑的滲漏量。用變化滲透梯度制備各配制劑。詳見表3。圖12.在2_8°C貯藏期間，脂質體順鉬配制劑的顆粒尺寸。有關緩沖劑組成參見表3。圖13.表I顯示各因素和反應的真實實驗設置。圖14.表2顯示在后向消除之后模型的回歸系數和顯著性(P)值。圖15.表3顯示用變化的滲透梯度制備的脂質體順鉬配制劑的概覽。圖16.表4顯示用變化的分子量制備的不同的脂質體藥物配制劑的概覽。 發明詳述本發明基于這樣的發現自SPLA2可水解的脂質體的滲漏量可以通過在脂質體外部溶液中貯藏得以減少，所述外部溶液具有比脂質體內部溶液更低的滲壓劑濃度。待用于I期研究的包囊在SPLA2可水解的脂質體中的順鉬的貯藏中觀察到滲漏問題，所述I期研究涉及包囊在sPLA2可水解的脂質體中的順鉬等滲配制劑。在該配制劑中，內部溶液是O. 9% NaCl而外部溶液是pH 6. 5的IOmM磷酸緩沖劑、ImM NaCl和10%蔗糖。因為在2-8攝氏度儲存的高度滲漏情況，等滲配制劑必須儲存在-80攝氏度，這并不是商業產品的最佳解決方案。從而，并不是所有醫院都具有在-80度貯藏的設施。此外，在-80攝氏度的運輸非常笨重。額外地，在使用之前解凍小瓶時遇到小瓶斷裂的問題并且解凍引起自脂質體的顯
著滲漏。
如上所述，據信滲漏問題是關于SPLA2可水解的脂質體的脂質組合物的特定需求的結果。尤其是，據信滲漏由SPLA2可水解的脂質體不存在或存在少量穩定劑比如膽固醇而引起。此外，SPLA2可水解的脂質體的陰離子性質可以影響滲漏。因此，需要包含SPLA2可水解的脂質體的組合物，其于2_8攝氏度儲存時具有經減少的滲漏量。關于SPLA2脂質體的術語"經減少的滲漏量"和"經改善的穩定性"在本文中可互換使用。應理解，滲漏量涉及內部溶液中治療劑濃度(或量)優選隨時間的變化并且可以由其描述。在第一方面，本發明提供組合物，其包含SPLA2可水解的脂質體，外部溶液，和脂質體中的內部溶液，-其中內部溶液中的滲壓劑濃度高于外部溶液中的滲壓劑濃度。該組合物通常是藥物組合物。在優選的實施方式中，脂質體包含包囊于所述脂質體中的治療劑。該治療劑一般地溶于內部溶液。然而，治療劑還可以是部分或完全沉淀的，例如由于在貯藏期間與包囊期間的溶解度相比降低的溶解度。在包囊期間的溶解度可以較高，原因是溫度較高。優選的是，治療劑具有小于350g/mol的分子量,原因是滲漏問題一般對較小的試劑發生，并且據信較小的試劑能夠更容易地通過脂質體的脂質雙層。甚至更優選地，治療劑是順鉬(順式-ニ氨ニ氯鉬(II))。如上文所提及，包囊順鉬的SPLA2可水解的脂質體傾向于在貯藏期間滲漏。在優選的實施方式中，SPLA2可水解的脂質體中僅有的治療劑是順鉬。從而，內部溶液僅包含滲壓劑和順鉬和任選的緩沖劑。氯化物離子防止順鉬形成不希望的高度毒性的水化產品。因此，內部溶液優選包含濃度至少O. 2%或O. 4%，更優選O. 2-2. 5% w/w，或O. 4-1. 8%和最優選O. 8-1% ^ NaCl或KC1。在某些實施方式中，可以使用其它氯化物鹽。NaCl通常較KCl更優選。在某些實施方式中，外部溶液優選包含濃度至少O. 2%或0.4%，更優選O. 2-2. 5% w/w，或O. 4-1. 8%和最優選O. 8-1%的NaCl或KCl。典型的濃度是0.9%。從而，如果少量順鉬自脂質體滲漏而出，則氯化物離子的存在將使得毒性水化產品的形成最小化。再次，NaCl通常較KCl更優選。在一種實施方式中，外部溶液不存在ニ價陽離子，比如鈣離子。在又ー實施方式中，ニ價陽離子可以包括在外部溶液中。內部溶液確實一般不包括緩沖劑。此外，硫酸鹽通常不包括在內部溶液中。在組合物的一種實施方式中，內部溶液包含至少I. 4% NaCl或KCl和更優選1.8% NaCl或KCl且不包含粘度增強劑，所述粘度增強劑優選選自糖類比如乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖和親水聚合物比如淀粉、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯-吡咯烷酮、糊精、黃原膠和部分地水解的纖維素低聚物和蛋白和多肽。在組合物的又一實施方式中，內部溶液包含至少5%的粘度增強劑。優選，粘度增強劑選自糖類比如乳糖，蔗糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖和親水聚合物比如淀粉，右旋糖酐，聚乙烯醇，聚乙烯-吡咯烷酮，糊精，黃原膠和部分地水解的纖維素低聚物和蛋白和多肽。應認識到粘度增強劑也充當滲壓劑。在內部溶液包含粘度增強劑的情況下，濃度優選大于5% w/w0甚至更優選的是濃度大于6、7、8、9或10%%。在優選的實施方式中，粘度增強劑選自糖類比如乳糖，蔗糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖和親水聚合物比如淀粉，右旋糖酐，聚乙烯醇，聚乙烯-吡咯烷酮，糊精，黃原膠和部分地水解的纖維素低聚物和蛋白和多肽。最優選的是糖類，尤其是蔗糖。通常，外部溶液優選具有約300mM的滲壓劑濃度，原因是其為生理學滲壓劑濃度。從而，在實施方式中，外部溶液優選具有200至400mM，更優選250_350mM和最優選275至325mM的滲壓劑濃度。本發明組合物的特征在于，在內部溶液與外部溶液之間存在滲壓劑濃度差異。該差異在本文中也稱為滲透梯度。如實施例部分所示，27mM的滲透梯度(內部滲壓劑濃度減去外部滲壓劑濃度)不能充分降低滲漏。59mM的梯度減少滲漏，91mM的梯度也同樣減少滲漏。應注意滲壓劑濃度是全部溶質顆粒的總濃度，其常常稱為溶液的摩爾滲透壓濃度(Osm)。 在一種實施方式中，溶液的摩爾滲透壓濃度用溶質顆粒的滲透系數進行校正。優選的是滲透梯度應大于27mM。更優選的是滲透梯度大于59mM或大于91mM。甚至更優選大于IOOmM,比如大于150mM,大于 200mM，大于 250mM，大于 275mM 和大于 300mM。在一種實施方式中，假定內部溶液中的滲壓劑濃度與制備脂質體時使用的水化溶劑中的滲壓劑濃度相同。也即，由于其是水化溶劑中的滲壓劑濃度，在提及內部溶液中的滲壓劑濃度時，該濃度能夠容易地確定。內部溶液中的真實滲壓劑濃度可以不等同于水化溶劑中的滲壓劑濃度，原因是在形成之后水可以進入脂質體從而降低滲壓劑濃度(同時增加脂質體中的滲透壓)。最大滲透梯度是優選1500mM，更優選1200mM和最優選900mM。如果滲透梯度過高，據信脂質體最初就將滲漏，從而滲壓劑會通過膜直至建立最大可忍耐梯度，在此情況下之后的滲漏會最小。從而，滲透梯度一般是27至900mM，更優選200至600mM和最優選280至320mM。外部溶液的pH —般具有5至7的pH而內部溶液一般地具有5至7的pH。可以使用適當的緩沖液來將PH保持在所希望的值。然而，在一種實施方式中，內部溶液和/或外部溶液不包含緩沖劑，優選磷酸緩沖齊U。在某些實施方式中，磷酸緩沖液是不希望的，因為它們促進順鉬轉化為副產物。
特別優選的順鉬包囊在脂質體中的組合物包含下述成分I)內部溶液0. 8-1. 0% NaCl,比如 O. 9% NaCl 和 9-11%蔗糖，比如 10%蔗糖。外部溶液8-12mM磷酸緩沖劑(pH6. 5)，比如IOmM磷酸緩沖劑(pH6. 5)+9-11蔗糖％，比如10%蔗糖。2)內部溶液1. 6-2. 0% NaCl，比如 I. 8% NaCl外部溶液8-12mM磷酸緩沖劑(pH6. 5)，比如IOmM磷酸緩沖劑(pH6. 5)+9-11%蔗糖，比如10%鹿糖。3)內部溶液0. 8-1. 0% NaCl,比如 O. 9% NaCl 和 9-11%蔗糖，比如 10%蔗糖。外部溶液8-12mM磷酸緩沖劑(pH6. 5)，比如IOmM磷酸緩沖劑(pH6. 5)+0. 35% -O. 55% 比如 O. 45% NaCl+4-6%蔗糖，比如 5%蔗糖。4)內部溶液1. 6-2. 0% NaCl，比如 I. 8% NaCl外部溶液8-12mM磷酸緩沖劑(pH6. 5)，比如IOmM磷酸緩沖劑(pH6. 5)+0. 8-1. 0% NaCl，比如 O. 9% NaCl.最終組合物中的治療劑濃度一般是O. lmg/ml至15mg/ml。在治療劑是順鉬的情況下，濃度優選是O. 5mg/ml至I. 5mg/ml。上述濃度能夠通過在脂質體制備期間在水化溶液中使用8mg/ml的順鉬濃度來實現。8mg/ml的濃度能夠通過將水化溶液加熱至65%攝氏度的溫度來實現。組合物的脂質體優選具有50至200nm,更優選75至160nm的平均尺寸(直徑)。在2至8攝氏度的溫度貯藏56天之后，組合物的脂質體應具有小于20%，15%或10%,更優選小于9%,8%或7%的滲漏量。如實施例部分所示,這能夠通過調節滲透梯度來實現。在提及的滲漏百分比時是指在透析或超濾步驟之后脂質體中的順鉬的量與在貯藏之后脂質體中的順鉬的量相比。在透析或超濾步驟之后，外部溶液可以包含組合物中順鉬總量的5%。從而，內部溶液包含組合物中95%的順鉬。在貯藏之后，內部溶液可以包含順鉬總量的85. 5%而外部溶液因而包含14. 5%。那么，滲漏量是9. 5/95 = 10%。在優選的實施方式中，第一方面的組合物通過第二方面的方法來制備。sPLA2可水解脂質體用于本發明組合物的SPLA2可水解的脂質體在下述實施方式中進ー步詳細定義。在其最寬泛實施方式中，術語SPLA2可水解脂質體是指在生理學條件下特別是在癌性組織中可水解的脂質體。優選，SPLA2可水解脂質體包含20%至45% (mol/mol)的陰離子脂質。陰離子脂質的含量影響脂質體的重要特征，比如脂質體的SPLA2介導脂質水解的速率以及對脂質體的免疫應答。隨陰離子脂質含量増加，SPLA2(和藥物釋放)介導的脂質水解速率也増加。已展示的是，合理的水解速率能夠通過20%至45%的陰離子脂質含量來實現。從而，在ー種實施方式中，陰離子脂質的含量是至少20%。在又一種實施方式中，陰離子脂質的含量是不超過45%。在又一種實施方式中，脂質體的陰離子脂質含量選自20%至45%，25%至45%，28%至 42%，30%至 40%，32%至 38%和 34%至 36%。如上所述，對脂質體的免疫應答也受陰離子脂質含量影響。因此，體內脂質體的清除速率可以通過將脂質體中陰離子脂質含量保持在某水平以下來降低，從而發明人已經認識到脂質體中陰離子脂質的含量能夠用來達成SPLA2水解速率和經網狀內皮系統的清除速率之間的平衡。、
優選地，陰離子脂質是磷脂，優選地，所述磷脂選自PI (磷脂酰肌醇)，PS (磷脂酰絲氨酸)，DPG (雙磷脂酰基甘油)，PA (磷脂酸)，PEOH (磷脂酰醇)，和PG (磷脂酰甘油)。更優選，陰離子磷脂是PG。優選，脂質包含硬脂酰鏈。從而，優選PG是DSPG等。親水聚合物在優選的實施方式中，用于本發明中的SPLA2可水解脂質體還包含親水聚合物，其選自PEG[聚(乙二醇)],PAcM[聚(N-丙烯酰基嗎啉)]，PVP[聚(乙烯基吡咯烷酮)]，PLA[聚(丙交酯)]，PG[聚(乙交酯)]，POZO[聚(2-甲基_2_噁唑啉)]，PVA[聚乙烯醇)]，HPMC(羥丙基甲基纖維素)，ΡΕ0[聚(環氧乙烷)]，脫乙酰殼多糖[聚(D-氨基葡萄糖)]，PAA[聚(氨基酸)]，聚HEMA[聚(2-甲基丙烯酸羥乙 酯)]及其共聚物。最優選地，聚合物是分子量IOODa至IOkDa的PEG。特別優選的是尺寸2_5kDa的PEG (PEG2000 至 PEG5000)，而最優選的是 PEG2000。將聚合物包含在脂質體上是技術人員熟知的并且能夠大致通過經網狀內皮系統降低清除率用來增加脂質體在血流中的半衰期。優選，將聚合物綴合至磷脂酰基乙醇胺的頭部基團。又一選擇是綴合至神經酰胺(盡管該脂質不可經SPLA2水解)。在聚合物綴合至磷脂酰基乙醇胺的情況下，負電荷得以引入，因此DSPE-PEG視為陰離子脂質(與DSPE相反，其視為中性脂質)。聚合物-綴合的脂質優選以至少2%的量存在。更優選，該量是至少5%和不超過15%。甚至更優選，聚合物-綴合的脂質的量是至少3%且不超過6%。含有陰離子磷脂和(2. 5%DSPE-PEG2000的脂質體在鈣存在下具有增加的聚集傾向。這能夠通常通過形成高粘度凝膠得以觀察到。含有陰離子磷脂和> 7. 5% DSPE-PEG2000的脂質體會導致脂質體沉淀或分相。脂質體中的電中性的脂質組分優選，待用于本發明中的脂質體也包含未帶電磷脂，其選自包含PC (磷脂酰膽堿)和PE (磷脂酰乙醇胺)的兩性離子磷脂。最優選，所述兩性離子磷脂是PC。與陰離子磷脂相對，兩性離子磷脂充當脂質體中的電中性SPLA2-可水解脂質組分。通過在相同的脂質體中組合兩性離子磷脂和陰離子磷脂，則可能將其調節至希望的表面電荷密度，該表面電荷密度適應血液中的充分高的SPLA2水解速率和低的清除速率。脂質體中兩性離子磷脂的量是優選40%至75%和更優選50至70%。優選，脂質(陰離子脂質，中性脂質和聚合物綴合型脂質)包含硬脂酰鏈。從而優選PG是DSPG，PE優選是DSPE等醚-磷脂磷脂中某些或全部可以是醚-磷脂。從而，它們在磷脂甘油骨架的sn-Ι位可以具有醚-鍵而不是酯-鍵。在SPLA2水解該特別類型的磷脂的情況下，產生單醚溶血磷脂，而它們對例如癌細胞有毒性。也即醚磷脂可以視為單醚溶血磷脂的前藥，而本發明脂質體能夠用來將所述前藥遞送至癌細胞的SPLA2-增強環境，在該環境中所述前藥被SPLA2水解活化。醚-磷脂已描述于EP 1254143和TO 2006/048017，通過援引將其內容并入本文。在一種實施方式中，本發明所用的SPLA2活化脂質體不包含醚-磷脂。其它前藥
通過SPLA2釋放自脂質以形成溶血脂的部分也可以是藥物。從而，脂質體可以包含單醚溶血脂的前藥、通過SPLA2釋放自脂質的前藥和下文進ー步述及的其它治療劑。在一種實施方式中，本發明所用的SPLA2活化脂質體不包含通過sPLA2釋放自脂質的前藥。穩定劑脂質體還可以通過包含入作為脂質體膜組分的膽固醇而得以穩定化。然而，月旨質體中的高膽固醇量對通過SPLA2的水解具有負面效果，因此優選的是脂質體包含不超過10%的膽固醇。甚至更優選，脂質體包含小于1%的膽固醇，小于O. 1%的膽固醇或完全不包含任何膽固醇。構成脂質體的脂質的烷基鏈長可以進行調節，從而獲得最佳的PLA2水解速率和包埋化合物自脂質體的最小滲漏。優選，烷基鏈是C18或C16飽和鏈。如上所述，脂質體可以包含單醚溶血脂質的前藥和/或通過SPLA2釋放自脂質的部分的前藥以形成溶血脂。脂質體的理化特征脂質體能夠是單層或多層的。最優選，脂質體是單層的。脂質體的直徑應是50至400nm,優選80至160nm和最優選90至120nm。優選，本發明第二方面的脂質體配制劑的多分散性指數(PDI)不應超過O. 2，更優選是O. 10或更低。在該范圍內的PDI值表示配制劑中相對窄的顆粒尺寸分布。由上文可知，優選的是構成脂質體的脂質中的至少ー種當存在于脂質體中時是SPLA2的底物。在一種實施方式中，脂質體包含由SPLA2在sn-3位而不是在sn_2位水解的脂質。所述非天然脂質和包含非天然脂質的脂質體已公開于WO 2006/048017，通過援引將其內容并入本文。在最優選的實施方式中，本發明所用的脂質體包含70 % DSPC，25 % DSPG和5 %DSPE-PEG。制備的方法本發明的第二方面是包括下述步驟的方法a)通過將所選脂質溶于有機溶劑來制備脂質混合物b)用含水的水化溶劑來水化步驟a)的產品以便形成脂質體c)在加入含水水化溶劑之前或在加入含水水化溶劑之后除去步驟a)的有機溶劑d)將水化溶劑與具有比水化溶液更低的滲壓劑濃度的外部溶液交換e)由此形成在本發明第一方面中描述的組合物。水化溶劑可以通過離心、超濾、透析或相似方法交換。在將水化溶劑變為外部溶液之后，優選小于15%，小于10%或更優選小于8%或6%的治療劑存在于外部溶液中。優選，脂質體中的藥物包囊度應是> 70%，更優選> 95%和最優選> 99%。藥物包囊度是包囊的藥物與配制劑中藥物總量的比率。優選，在加入水化溶劑之前除去有機溶劑。該方法可以還包括高剪切混合以減小脂質體尺寸 。該方法可以包括通過濾器擠出在步驟c)中產生的脂質體以產生一定平均尺寸的脂質體的步驟。該方法還可以包括超聲脂質體配制劑以產生一定尺寸的脂質體的步驟。該方法還可以包括在壓力5000至20000KPa進行勻化。優選，脂質體是在本發明的第一方面中描述的脂質體，也即相應地選擇脂質。
脂質體可以與至少一種治療劑一起通過將藥物溶劑化于用來制備脂質體的有機溶劑或水化溶劑中加載。優選，治療劑溶劑化在水化溶劑中而治療劑優選是順鉬。另選地，可離子化治療劑能夠這樣加載入脂質體中首先形成脂質體，例如通過PH梯度跨最外層脂質體層建立電化學勢，然后將可離子化治療劑加入脂質體外部的含水媒介。
實施例實施例I，優化SPLA2可水解的脂質體的貯藏穩定性摘要已觀察到在2_8°C貯藏時，LiPlaCis (脂質體的順鉬)在前幾個月期間可以具有多至30%的滲漏量。滲漏在前兩個月期間最為普遍，而在該時間段之后僅發生少量滲漏。建立因子設計以試驗LiPlacis在2_8°C的穩定性。根據復合表面設計，用變化內部緩沖劑組成來制備配制劑，并在不同壓力下勻化。于3個水平測試3個因素內部NaCl 濃度(O. 9，I. 4，和 I. 9% )內部蔗糖濃度(0，5，和10% )在制備期間使用的勻化壓力(5000，12500，和20000KPa)。自配制劑的滲漏經展示受全部參數測試影響。在脂質體制備期間增加脂質體內部的蔗糖和NaCl濃度并具有低勻化壓力引起在貯藏期間的較高藥物保留。在貯藏2個月之后具有最高包囊度的配制劑用脂質體內部的I. 9% NaCl和10%蔗糖制備，并于5000KPa勻化。在貯藏期間未觀察到制備的任意配制劑的顆粒尺寸顯著變化。物質和方法制備sPLA2 脂質體(LiPlaCis)I，2_ 二(十八燒酸基)-sn_甘油_3_憐酸膽喊(DSPC), 1, 2_ 二(十八燒酸基)-sn-甘油-3-磷酸甘油(DSPG)，和1，2_ 二(十八烷酰基)磷脂酰乙醇胺_甲氧基聚(乙二醇)2000 (DSPE-PEG 2000)全部購自 Lipoid(Ludvigshafen,德國)。鹿糖購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。氯化鈉和磷酸二氫鈉分別購自Merck (Darmstadt,德國)和J. T. Baker (Deventer,荷蘭)。銥原子吸收標準溶液購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo)。Slide-A-Lyzer IOK MWCO 透析盒購自 Thermo Scientific (Rockford, IL)。Amicon Ultra-4Ultracel-30k 離心過濾裝置購自 Millipore (Bedford, MA)。制備LiPlaCis均質脂質混合物(DSPC/DSPG/DSPE-PEG200070 25 5mol_% )這樣制備將脂質溶于氯仿/甲醇9 I (v/v) 0在50°C的溫度，用溫和的氮氣流，將溶劑自脂質混合物蒸發。在真空下在 Martin Christ Dryers GmbH (Harz,德國)的 Christ Epsilon 2-4 凍干器中儲存過夜，殘余溶劑得以蒸發。多層囊泡(MLVs)這樣制備；將脂質膜分散于65°C熱水化介質中，其中含有8mg/mL順鉬和根據表I的變化濃度的蔗糖和氯化鈉。在65°C將脂質水化O. 5小吋。在水化期間，渦流攪拌樣品各5分鐘。在根據表I的變化壓力(5000-20，OOOKPa)下，將水化的脂質懸浮液在Avestin, Inc. (Ontartio,加拿大)的EmulsiFlex_C3中勻化。全部勻化步驟都在65°C的溫度進行。通過沉淀和透析從配制劑除去未包囊的順鉬。沉淀以2個步驟進行；首先在25 °C進行I小時，然后在5 °C進行I小吋。在含有10%蔗糖pH 6.5的IOmM磷酸緩沖劑中，分別相對IOOx體積透析18和24h2次。在制備之后立即將配制劑分入各小瓶含500μ I樣品的玻璃小瓶中。用蓋密封小瓶，井置于冷藏器(2-8°C)中。置于冷藏器的這天認為是初始日 期。在忙藏期間連續地取出樣品，并通過ICP-MS和Zetasizernano分別進行分析以確定Pt濃度和顆粒尺寸。確定顆粒尺寸將兩滴LiPlaCis混入IOmL Milli-Q水。將ImL混合物轉移入一次性池并在Malvern Inc. (Worcestershire, United Kingdom)的 Zetasizer Nano ZS 動態光散身寸裝直上測量顆粒尺寸。在25°C的溫度用水作為內部參比物質，測量顆粒尺寸三次。平均的Z-平均顆粒尺寸(也即直徑)基于這三次測量進行計算。確定包囊度將脂質體以因子100稀釋于透析溶液中。隨后，在25°C平衡經稀釋的脂質體lh。然后，在 15°C在 Millipore (Billerica,MA)的Amicoil Ultra 離心過濾裝置(30K MWC0)中，將稀釋脂質體的一部分于2500g離心30分鐘。將在離心之前(也即100倍稀釋的脂質體)和在離心之后(滲透)的樣品在Milli-Q水中稀釋100倍。I體積％的銥原子吸收標準溶液(1.05ppm)作為內標加入全部樣品。將配有錯流霧化器和Pt錐的感應偶聯等離子體裝置的 Perkin-Elmer PESCIEX Elan 6000 (Ontario，加拿大)用來測量LiPlaCis 樣品中的鉬水平。實驗設計和統計學分析用中央復合表面設計進行實驗以研究三個因素的線性、二次和叉乘效果，各因素以三個水平變化并且包括三個重復中心點。因素及其水平示于表I。選擇的三個因素是內部NaCl濃度(w/v% )，內部蔗糖濃度(w/v% )，和勻化壓力(KPa)。所用實驗設計示于表I。用軟件包(Modde 8. O, Umetri7Umeai Sweden)來將ニ次模型與獨立變量擬合。反應表面模型與下述公式擬合
YiYin—\ YiY = P0^yjパス+ Σガス2 + Σ Σε
i=\i=\i=\ ノ.=/+1其中Y是反應變量，Xi是第i個獨立變量，β ο是截距，β i是一次模型系數，β π是變量i的二次系數和β 是因素i與因素j之間的相互作用的模型系數，ε是各因素實驗誤差的組合。二次項使得可能獲得有關反應曲度的信息。用決定系數(R2)和不貼合性(lack-of-fit)試驗來確定構建的模型是否適于描述觀察到的數據。R2 >0.8指出模型可接受。在可能的情況下，通過去掉經方差分析不顯著(P >0.05)的項目來簡化模型。然而，如果R2變得低于0.8則不從模型去掉項目。用RSM來評價所選因素對初始顆粒尺寸、在制備之后立即的D0E%、在2_8°C貯藏56d之后的D0E%和滲漏量的效果。結果和討論
模型擬合通過多回歸和反向消除來確定最佳擬合模型。觀察值和預測值充分地相關。計算反應變量的模型系數和可能性(P)值的統計數據(表2)。產生的模型一般對于評價是令人滿意的，原因是觀察結果和預測結果良好地相關。根據方差分析對于任意產生的模型都不存在不貼合性。顆粒尺寸數據顯示勻化壓力對顆粒尺寸具有最顯著的影響。隨在制備期間所用的勻化壓力升高，則顆粒尺寸減小。在制備期間使用的蔗糖濃度也展示對顆粒尺寸具有顯著影響。增加的蔗糖濃度引起較大的顆粒尺寸。如圖I所示的等值線圖展示在脂質體制備期間使用的內部蔗糖濃度和勻化壓力對顆粒的影響。自圖2能夠看到，較大的顆粒尺寸通常意味著較高的包囊順鉬量。由于顆粒尺寸較大，則也會期望內部體積會增加，這允許更多Pt被包囊。在貯藏期間顆粒尺寸和roi的變化示于圖3-4。在冷藏期間所制備的任意脂質體配制劑未觀察到顆粒尺寸顯著變化。初始包囊度)配制劑具有84至92%的初始包囊度。經展示NaCl對初始包囊度(DOE)具有最顯著影響。水化溶液中所用的鹽濃度越高則獲得越高的初始D0E。另外在制備期間使用的較高勻化壓力引起較低的D0E。這可能是由于在較高勻化壓力獲得較小脂質體，從而能夠期望脂質體外部存在更多的鉬。如圖5所示的等值線圖展示在脂質體制備期間所用的內部NaCl濃度和勻化壓力對初始D0E%的影響。在2_8°C貯藏56d之后，各參數對0(^%和滲漏量的影響在忙藏期間的Pt分析(總Pt含量,脂質體外部Pt含量和滲漏量)示于圖6-8。經展示內部NaCl和蔗糖濃度在貯藏56d之后對包囊度(DOE)具有顯著影響。月旨質體內部的NaCl和蔗糖濃度越高，則獲得的DOE越高。對于勻化壓力未觀察到主要效果；然而觀察到了在勻化壓力與蔗糖之間的相互作用。在高內部蔗糖濃度和低勻化壓力下，與較高勻化壓力相比，引起較高D0E。在貯藏56d期間順鉬自配制劑滲漏的量取決于所檢查的全部因素。然而，對滲漏量具有最顯著效果的因素是蔗糖濃度。觀察到增加內部NaCl和蔗糖濃度會增長在貯藏期間的藥物保留。與在較高壓力制備的那些相比，能觀察到自在低壓力制備的脂質體更多滲漏。對于用含有10%蔗糖和1.9% NaCl的水化溶液制備并于20000KPa勻化的配制劑觀察到最低滲漏量。在2-8°C貯藏56d之后具有最高DOE的配制劑是用含有10%蔗糖和I. 9% NaCl的水化溶液制備并于5000KPa勻化的。結論反應模型令人滿意地表達在所選參數與反應之間的關系。結果展示內部NaCl和 蔗糖濃度對在2-8°C貯藏期間自LiPlacis配制劑的滲漏量具有顯著影響。在貯藏期間對藥物保留具有最顯著影響的因素是蔗糖。增加NaCl也改善藥物保留。對于在脂質體內部具有高NaCl和蔗糖濃度的配制劑觀察到在56d之后的最高包囊度。DOE經展示通過增加水化媒介中的NaCl濃度得以改善。
與在高壓制備的脂質體相比，于低壓力制備的脂質體的滲漏最為顯著。對于在較低壓カ制備的脂質體初始DOE也較高。由于勻化壓カ對于顆粒尺寸具有主要影響，該結果指出藥物保留在某種程度上受顆粒尺寸影響。i在!)t減2個月之后具有最聞包囊度的配制劑是用在脂質體內部的I. 9% NaCl和10%蔗糖制備并在低壓カ勻化的。對于制備的任意配制劑，在貯藏期間為觀察到顆粒尺寸的顯著變化。實施例2脂質體順鉬配制劑通過膜水化隨后擠出來制備。水化溶液用變化的滲壓劑濃度制備。在擠出之后，在不同媒介中透析脂質體。制備的配制劑具有不同的滲透梯度(在內部與外部之間的摩爾滲透壓濃度差異)，如表3所示。為了比較，其它化療藥物的脂質體配制劑如表4所示而制備。全部配制劑置于2-8°C的冷藏器，在貯藏期間連續地取出樣品。
制備脂質體配制劑將磷脂(DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000，70 25 5mol%)溶于 9 I (v/v)氯仿 /甲醇。然后，將溶解的脂質混合物的溶劑在氮氣流下在50°C熱水浴中蒸發，直至經觀察為干燥。樣品進一歩在真空下干燥過夜。在65°C的溫度，將含有化療藥物的水化液體(根據表3和4變化鹽和蔗糖濃度)加入干燥的脂質混合物用于制備多層囊泡(MLV)。將脂質懸浮液保持在65°C至少30分鐘以便確保完全水化。在該時間段期間，每5分鐘將脂質懸浮液渦旋。大單層囊泡(LUV)通過于65°C經定義的孔徑尺寸(IOOnm)的膜擠出而制備。隨后，將LUV轉移至透析盒(MWC0 :IOkDa)以便除去未包埋的藥物。在不同的緩沖溶液中透析脂質體配制劑，如表3和4所示。在制備之后立即將配制劑分入玻璃小瓶中。玻璃小瓶用蓋密封井置于冷藏器(2-80C )中。將置于冷藏器中這天視為初始日期。在貯藏期間連續地采樣，測定顆粒尺寸和藥物濃度(外部和總和)。結果用順鉬、奧沙利鉬、MTX、博來霉素或5FU制備脂質體配制劑。在內部與外部之間的滲透梯度低的情況下，含有小分子量藥物(< 350g/mol)比如順鉬和5FU的配制劑經觀察是滲漏的。含有較高分子量(> 350g/mol)的藥物的脂質體配制劑經展示在2-8°C貯藏期間是基本上不滲漏的。増加順鉬配制劑滲透梯度的試驗經展示是最小化貯藏期間滲漏量的有效方式。在內部與外部之間滲透梯度差異是> 282m0sM，觀察到貯藏期間的滲漏量保持在可接受的水平(參見表3和圖11)。在2_8°C貯藏期間，為觀察到顆粒尺寸的變化(圖12)。從而，配制劑的顆粒尺寸不受順鉬配制劑中較高滲透梯度的影響。
權利要求
1.一種組合物，包含 sPLA2可水解的脂質體， 外部溶液， 和脂質體中的內部溶液， -其中滲壓劑濃度在內部溶液中比在外部溶液中更高。
2.權利要求I的藥物組合物，其中所述脂質體包含包囊于所述脂質體中的治療劑。
3.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述治療劑具有小于350的分子量。
4.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述治療劑是順鉬。
5.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述僅有的治療劑是順鉬。
6.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述內部溶液包含濃度O.8-1% w/w的NaCl 或 KCl。
7.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述外部溶液包含濃度O.8-1% w/w的NaCl 或 KCl。
8.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中內部溶液與外部溶液之間的滲壓劑濃度差異(內部滲壓劑濃度減去外部滲壓劑濃度)是至少91mM。
9.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中內部溶液與外部溶液之間的滲壓劑濃度差異(內部滲壓劑濃度減去外部滲壓劑濃度)是至少275mM。
10.前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述脂質體在2至8攝氏度貯藏2個月之后具有小于30%的滲漏量。
全文摘要
本發明提供組合物，其包含sPLA2可水解的脂質體，外部溶液，和脂質體中的內部溶液，-其中滲壓劑濃度在內部溶液中比在外部溶液中更高。該組合物改善sPLA2可水解的脂質體的貯藏穩定性，尤其是于2-8攝氏度儲存的情況下。脂質體優選包囊順鉑。本發明也提供制備本發明組合物的方法。
文檔編號A61K9/127GK102639114SQ201080047402
公開日2012年8月15日 申請日期2010年10月25日 優先權日2009年10月23日
發明者A·F·維克吉格, M·W·麥德森, S·A·彼得森 申請人:拜奧貝德斯特有限責任公司