專利名稱：溫敏性核殼型囊泡控釋藥物載體、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及核殼結構型控釋藥物載體，更具體涉及囊泡表面高分子修飾的制備方法及作為藥物載體的應用。
背景技術：
表面活性劑具有兩親性的分子結構，常用于增強界面活性、降低界面張力，或自組裝形成各種形狀的膠束、液晶，在決定界面的流變學特性以及兩相物質傳遞方面起著十分重要的作用，在美容化妝品、醫藥品以及各種乳化分散技術中有重要的應用價值。天然生物表面活性劑是一類具有表面活性的天然化合物，它除了具有與一般化學表面活性劑相同的作用外，還以其安全、無毒、良好的生物可降解性和相容性，良好的熱及化學穩定性等優點，在生物醫藥、環保及石油工業等領域倍受重視。生物表面活性劑的親水基團可以是離子或非離子形式的單糖、二糖、多糖、羧基、氨基或肽鏈；疏水基團則由飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或帶羥基的脂肪酸組成。其種類很多，依據它們的化學組成和微生物來源可分為磷脂、糖脂、脂肽和脂蛋白等。其中，磷脂、糖脂是生命組織細胞膜骨架的重要組成，也是近年來的研究熱點之一。兩親性的磷脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結構的封閉囊泡，稱為脂質體。自從1965年英國科學家Bangham發現脂質體以來，由于其結構類似生物膜，作為藥物載體使用時，囊泡中心的親水區可包封水溶性藥物而囊泡的疏水基團的夾層中可包封脂溶性藥物，并且可以提高藥物穩定性及靶向性，降低藥物毒性，延緩釋放，因此得到廣泛而深入的研究。但是，脂質體囊泡仍然存在著文獻D. R. Khan，E. Μ. Rezler, J. L. -Fields and G. B. Fields :Chem. Biol. Drug Des. 71(2008),3 禾口 S. Sriwongsitanont and M. Ueno =Colloid Polym. Sci. 282(2004), 753報道的易聚集、沉降，結構穩定性差等問題，以及文獻S. K. E. Messerschmidt, A.Musyanovych, M.Altvater, P.Scheurich, K.Pfizenmaier, K. Landfester and R. Ε.Kontermann :J.Controlled Release 137 (2009),69、文獻 S.Sriwongsitanont and Μ. Ueno :Chem. Pharm. Bull. 50(9) (2002)，1238禾口S. Sriwongsitanont and Μ. Ueno =Colloid Polym. Sci. 282(2004),753報道的易被網狀內皮系統攝取，體內循環周期短等的缺陷，因此，需要進一步對脂質體囊泡結構進行修飾和加工。目前，雖然有人通過對脂質體囊泡的修飾來增加其體內循環時間和結構的穩定性，但是沒有制備成核殼結構的，且效果都不夠理
術g
；ο本發明者以脂質體囊泡為核心，依靠化學鍵、靜電力等作用使生物大分子和溫敏高分子在囊泡外表形成“復合凝膠外殼”，以增加囊泡的穩定性并達到多重釋放藥物的效果，從而完成了本發明。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種溫敏型核殼結構控釋藥物載體。
本發明提供的溫敏型核殼結構控釋藥物載體由內核囊泡和外層高分子復合凝膠構成。本發明的藥物載體中內核采用的囊泡為生物表面活性劑構成的脂質體囊泡，外層為天然生物大分子構成的溫敏性高分子凝膠。構成內核脂質體囊泡的生物表面活性劑可選自磷脂和糖脂，優選磷脂。本發明的藥物載體外層中的天然生物大分子為酸性多糖生物可降解材料，例如， 透明質酸(HA)、軟骨素、殼聚糖等，優選HA ；溫敏高分子可采用生物相容性和溫度敏感性聚合物，較佳為聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)。本發明藥物載體中的內核脂質體囊泡和多糖生物可降解材料間通過化學鍵進行鏈接。在一個優選實施方式中，本發明選擇透明質酸(HA)生物可降解材料，將透明質酸 (HA)與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)連接成HA-GMA，該鏈上的GMA分子內含有碳碳雙鍵， 可進行自由基反應，具有很高的反應靈活性，可與內核脂質體囊泡發生自由基反應，而形成外層高分子復合凝膠。在一個優選實施方式中，外層高分子復合凝膠中的溫敏高分子是聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，由N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)在交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA) 存在下交聯反應而形成，并且與酸性多糖分子鏈發生交聯反應，所形成的網絡狀復合凝膠結構能夠固定并包裹在脂質體的外側。本發明提供的藥物載體的制備方法包括以下步驟1)將生物表面活性劑溶于有機溶劑中，真空下旋轉容器蒸發溶劑至干，脂質膜均勻沉積在瓶壁上，真空干燥，于30-60°C水浴超聲預熱10-30min后加入磷酸緩沖溶液水化脂質膜；2)將酸性多糖溶于超純水中，加入等體積三乙胺和四丁基溴化銨，反應10_20h后進行冷凍干燥，加水，透析5-10天，然后與1)獲得的脂質體溶液超聲混合10-60min ；3)在2、所得分散液中加入交聯劑1重量份和溫敏高分子單體15重量份，于氮氣保護下滴加催化劑溶液，50-80°C反應2-5小時。本發明方法中所用的有機溶劑可選自無水氯仿，二氯甲烷和乙醇。所述溫敏高分子單體優選NIPAM，所述交聯劑優選MBA。本發明方法中，步驟1)可將第一種藥物與生物表面活性劑同時溶于有機溶劑中， 得到包裹第一種藥物的脂質體。本發明方法還可包括步驟4)將步驟幻的產物凍干，浸入溶解了第二種藥物的水溶液中，20-40°C保持10-20min后，靜置半天，得到包封第二種藥物的載體。根據需要，本發明的藥物載體可僅在脂質體囊泡中包裹第一種藥物，未包封的藥物通過葡聚糖微型凝膠柱分離除去；本發明的藥物載體也可僅在外層溫敏高分子復合凝膠包封第二種藥物，這第二種藥物通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內部，靜置后達到飽和吸附，未包封的藥物通過葡聚糖微型凝膠柱分離；更優選的是，在脂質體囊泡中包裹第一種藥物，在外層溫敏高分子復合凝膠中包封第二種藥物，使第二種藥物先釋放， 然后再釋放第一種藥物。在一個優選方案中，本發明的藥物載體制備方法包括以下步驟
1)薄膜超聲水化法制備納米脂質體將生物表面活性劑或生物表面活性劑及憎水性藥物溶于有機溶劑；30-60°C的恒溫水浴中旋轉蒸發除去有機溶劑，脂質沉積瓶壁后繼續抽干。解除真空后，從干燥箱中取出瓶，在瓶中注滿氮氣，放入30-60度的水浴超聲中預熱10-30min，在瓶中加入緩沖溶液水化脂質，最后，通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的藥物。2)合成HA-GMA復合物取HA(透明質酸)溶于水中，樣品的濃度是Ι-^ig/mL，加入等量的三乙胺，GMA(甲基丙烯酸縮水甘油酯)，四丁基溴化銨，反應10_20h后，在40-60°C下孵化2-5h。反應后的樣品冷凍干燥1-5天，分散至水中，放入透析袋透析5-10天。3)酸性多糖的包覆取2)透析后的樣品HA-GMA加入水中稀釋，在HA-GMA中逐滴加入囊泡溶液，并且超聲30-60min，此時溶液稱為GHA-Iip。4)殼層合成HA-PNIPAM凝膠GHA-Iip中加入MBA (N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，NIPAM (N-異丙基丙烯酰胺)配成溶液，另再將APS (過硫酸銨)溶于水后加入常壓漏斗里，抽真空通氮氣保護，緩慢滴加到溶液里，滴加完畢，50-80°C下反應2-5小時。5)核殼微粒的外層載藥親水性藥物代表熒光素二鈉將4)所得微粒凍干處理，稱量熒光素二鈉放入到溶解了脂質體的磷酸緩沖溶液(PH7.4)中。樣品升溫O0-40°C )保持10-20min后冷卻到室溫(25°C )，熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內部，靜置半天以使凝膠達到飽和吸附，最后通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的藥物。本發明以脂質體囊泡為核心，依靠化學鍵、靜電力等的作用，使生物大分子在囊泡外表吸附形成“凝膠外殼”，從而提供一種溫敏型核殼結構脂質體控釋藥物載體。該核殼構型不但可以增加囊泡的穩定性，達到高包封率，同時具有溫敏凝膠的快速響應性。本發明選用具有良好的生物相容性的酸性多糖和具有溫敏性的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，制備溫敏性混合凝膠，這樣使得凝膠的殼層不僅保持酸性多糖的良好生物相容性的優異性，還具有聚N-異丙基丙烯酰胺PNIPAM的快速溫度響應，并且凝膠外殼的機械強度也得到了很大的提高。本發明首次在脂質體外側修飾溫敏性凝膠層，制備了具有溫敏特性的核殼微凝膠，該微粒內核的雙層脂質體囊泡和外層的溫敏性生物高分子凝膠都可以作為藥物載體載藥，隨著溫度的上升，外層的凝膠會發生相變化而皺縮，外層凝膠包裹藥物通過調溫可以快速釋放出來，而內層脂質體的包容物因為外層凝膠的存在則可以進行緩慢釋放，從而達到多維釋放的效果。本發明的溫敏型核殼結構脂質體控釋藥物載體具有良好的生物相容性和快速溫度響應性，在室溫為可注射型制劑，發生相變化后沉淀附著于固體表面，可達到定向釋放的目的。本發明的產品可以用于化妝品領域，也可作為埋植藥物的載體，應用于開放型手術植入，微創手術注射或借助內窺鏡植入。


圖1是殼層凝膠化的脂質體顆粒用原子力顯微鏡觀察到的形貌圖，掃描范圍是 5X5 μ m。圖2是殼層凝膠化的脂質體顆粒用透過顯微鏡觀察到的結構。圖3、圖4分別是不同分子量HA制成核殼結構顆粒后粒徑和透過度隨溫度的變化。 HA 分子量■ :3604g mo Γ1 ；· :1. IXlO4g mo Γ1 ;▲ :3. OXlO5g mo Γ1 ；▼ 8. 0 X lO'gmor1圖5和圖6分別是外層及內層藥物釋放效應比較。圖中曲線為37°C下釋放情況， 藥物濃度在熒光分光光度計上進行檢測。
具體實施例方式以下用實施例對本發明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發明最佳實施方式的描述，并不對本發明的范圍有任何限制。實施例11.取透明質酸溶于超純水中，濃度為2mg/mL，加入重量比為1 1 1的三乙胺， 四丁基溴化銨和GMA (甲基丙烯酸縮水甘油酯)，室溫反應IOh后，在40°C下孵化池，然后冷凍干燥2天，透析5天。2.將磷脂溶液中加入Img羅丹明6G，溶液移入圓底燒瓶中，蒸發溶劑，室溫下真空干燥2-4h，制備含有羅丹明6G的磷脂膜。解除真空后，放入50度的水浴中預熱20min ；加緩沖液水化后制備出包裹羅丹明6G的脂質體，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分，可獲得包裹了羅丹明6G的脂質體。3.將步驟1所得的反應液加入超純水稀釋，逐滴加入步驟2所得脂質體的溶液，超聲 30min。4.將步驟3所得的反應液加入1重量份MBA(N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，10份 NIPAM(N-異丙基丙烯酰胺)，再將1重量份APS (過硫酸銨)，溶于水里面放入常壓漏斗里， 抽真空通氮氣保護，緩慢滴加IOmL的APS到溶液里，滴加完畢，50°C下反應5小時。5.將步驟4所得溫敏性顆粒凍干處理，取熒光素二鈉(固體)放入到溶解了固體溫敏脂質體的磷酸緩沖溶液中，熒光素二鈉的最終濃度是0. 027mg/ml。熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內部，使凝膠達到飽和吸附，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分。6.顆粒中模擬藥物的釋放外層取洗脫液0. 5mL放入透析帶中，再將透析帶放入裝有30mL pH7. 4的磷酸緩沖液中，恒溫37°C，每隔20min外圍重新換上已預熱的空白緩沖液，并測試緩沖液的熒光強度值。內層繼續透析，每隔2- 外圍重新換上已預熱的空白緩沖液，并測試緩沖液的熒光強度值。實施例21.取軟骨素溶于超純水中，濃度為％ig/mL，加入0. 6mL三乙胺，0. 6g四丁基溴化銨和0. 6mLGMA,室溫反應20小時后，在60°C下孵化2h，然后冷凍干燥5天，透析8天。2.將磷脂溶液中加入0. 5mg羅丹明6G，冷凍干燥制備含有羅丹明6G的脂膜。加緩沖液水化后制備出包裹羅丹明6G的脂質體，使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分，獲得包裹了羅丹明6G的脂質體。3.將步驟1所得的反應液加入超純水稀釋，逐滴加入步驟2所得脂質體的溶液，超聲 30min。4.將步驟3所得的反應液加入1份MBA (N，N-亞甲基雙丙烯酰胺)，10份 NIPAM(N-異丙基丙烯酰胺)，再將1重量份APS (過硫酸銨)溶于水里面放入常壓漏斗里， 抽真空通氮氣保護，緩慢滴加APS到溶液里，滴加完畢，70°C下反應3小時。5.將步驟4所得溫敏性顆粒凍干處理，稱量適量的熒光素二鈉(固體)放入到溶解了固體溫敏脂質體的磷酸緩沖溶液中。熒光素二鈉通過溫敏凝膠外層的相變化被吸附滲入到凝膠層內部，使凝膠達到飽和吸附。使其通過葡聚糖微型凝膠柱分離未包封的部分。研究結果顯示溫敏性核殼結構微粒用動態光散射DLS和紫外光度計UV考察其溫敏性，最低臨界溶解溫度都接近34°C，外層的凝膠層包裹一種親水性的模擬藥物熒光素二鈉，包封率72. 96%，累積釋放時間lh，累積釋放率81. 16% ；內核脂質體包裹一種疏水性的模擬藥物羅丹明6G，由于外層凝膠的交聯覆蓋作用，內部包裹的模擬藥物會達到緩慢釋放的效果，其包封率52. 64%,累積釋放時間40h，累積釋放率82. 28%.兩種不同釋藥方式，不同藥物的釋放時間差從而達到二維釋放。
權利要求
1.一種溫敏型核殼結構脂質體控釋藥物載體，由內核脂質體和外層溫敏高分子復合凝膠構成。
2.如權利要求1所述的控釋藥物載體，其中所述內核為生物表面活性劑構成的脂質體囊泡，所述外層溫敏高分子復合凝膠由天然生物大分子和溫敏高分子構成。
3.如權利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述生物表面活性劑選自磷脂。
4.如權利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述天然生物大分子選自酸性多糖透明質酸、軟骨素、殼聚糖。
5.如權利要求2所述的控釋藥物載體，其中所述溫敏高分子為PNIPAM，由NIPAM在交聯劑MBA存在下進行交聯反應而形成。
6.權利要求1所述控釋藥物載體的制備方法，包括以下步驟1)將生物表面活性劑溶于有機溶劑中，真空下旋轉容器蒸發溶劑至干，脂質膜均勻沉積在瓶壁上，真空干燥，于30-60°C水浴超聲預熱10-30min后加入磷酸緩沖溶液水化脂質膜；2)將酸性多糖溶于超純水中，加入等體積三乙胺和四丁基溴化銨，反應10-20h后進行冷凍干燥，加水，透析5-10天，然后與1)獲得的脂質體溶液超聲混合10-60min ；3)在2、所得分散液中加入交聯劑1重量份和溫敏高分子單體15重量份，于氮氣保護下滴加催化劑溶液，50-80°C反應2-5小時。
7.如權利要求6所述的制備方法，其中所述的有機溶劑選自無水氯仿，二氯甲烷和乙
8.如權利要求6所述的制備方法，其中所述溫敏高分子單體為OTPAM，所述交聯劑為MBA。
9.如權利要求6所述的制備方法，其中所述步驟1)將第一種藥物與生物表面活性劑同時溶于有機溶劑中，得到包裹第一種藥物的脂質體。
10.如權利要求6或9所述的制備方法，其中還包括步驟4)將步驟幻的產物凍干，浸入溶解了第二種藥物的水溶液中，20-40°C保持10-20min后，靜置半天，得到包封第二種藥物的載體。
11.權利要求1所述控釋藥物載體在制備控釋藥物或化妝品領域的用途。
全文摘要
本發明提供一種溫敏型核殼結構囊泡釋藥載體，由內核脂質體和外層溫敏高分子復合凝膠構成。核殼構型不但可以增加囊泡的穩定性，其內核的脂質體和外層的溫敏性生物高分子凝膠都可以作為藥物載體載藥。隨著溫度的上升，外層的凝膠會發生相變化而皺縮，外層凝膠包裹的藥物通過溫控可以快速釋放出來，而內核脂質體的包容物因為外層凝膠的存在則可以進行緩慢釋放，從而達到多維釋放的效果。本發明的釋藥載體具有良好的生物相容性和快速溫度響應性，可以用于化妝品領域，也可作為埋植藥物的載體，應用于開放型手術植入，微創手術注射或借助內窺鏡植入。
文檔編號A61K8/14GK102198098SQ20111014712
公開日2011年9月28日 申請日期2011年6月2日 優先權日2011年6月2日
發明者劉洪來, 徐首紅, 李成亮, 翟春濤, 藺肖肖 申請人:上海萊博生物科技有限公司, 華東理工大學