專利名稱：甲魚肽在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及甲魚肽的用途，尤其是涉及在抑制腫瘤藥物領域中的用途。
背景技術：
腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤，一般所說的癌即指惡性腫瘤，世界每年死于癌癥的人數多達數百萬人，而自1997年以來，癌癥成為中國人的第一死因，每年有近130萬人死于癌癥，現在抑制癌細胞的生長與轉移的方法主要有手術，化療和放療，一般對身體的傷害較大，容易使人的免疫力下降。申請號201010103157. 9專利文獻中公開了甲魚小分子多肽的制備方法；《中國食品學報》2008，02:徐懷德等“甲魚蛋白酶解產物體外ACE抑制和抗氧化活性研究”公開了體外實驗證實甲魚蛋白酶解物ACE抑制和抗氧化活性的作用；現有技術和專利中均未述及甲魚低聚肽關于輔助抑制腫瘤細胞生長或轉移應用的報導，也沒有關于分子量在1000以下的甲魚低聚肽在治療和預防抗腫瘤方面的報道。

發明內容
本發明的目的是提供甲魚肽的新用途，即在制藥中的新應用；本發明的另一目的是提供一種能抑制癌細胞生長和轉移，有較高的營養價值，吸收率高，不妨害人體身體健康的藥物或保健食品。本發明甲魚肽是以甲魚為主要原料，分子量分布在lOOOODalton以內的小分子肽，其中140-1000Dalton分子量范圍占50%以上。本發明還涉及甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。涉及分子量分布在lOOOODalton以內的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。涉及分子量分布在2000DaltOn以內的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。涉及分子量分布在140 lOOODalton范圍以內的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。
涉及分子量分布在300 700Dalton范圍以內的甲魚肽在作為制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。本發明的甲魚肽是鱉科動物鱉Trionyx sinensis Wiegmann的全體為原料制備的。為了更好地理解本發明的實質，下面將用分子量在140 lOOOODalton的甲魚低聚肽的藥理實驗及結果來說明其在制藥領域的新用途。分子量小于lOOOODalton的甲魚肽抑制腫瘤的生長和轉移的功效研究。1.材料與方法1.1樣品來源及處理受試藥為甲魚肽口服液干粉，Ig甲魚肽/干粉，由江中藥業股份有限公司提供，人臨床服用量為4g甲魚肽/d，100ml/do1.2實驗動物及環境清潔級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18_22g，江西中醫學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK(贛)2006 — 0001。動物飼養于江西中醫學院動物室，環境許可證SYXK (贛)2004-0001，飼養環境溫度21 23 °C，相對濕度50 60%。1.3實驗方法
1.3.1動物分組根據體重隨機分為4組，每組10只。設立空白對照組、甲魚肽口服液低、中、高劑量組。1. 3. 2劑量設計甲魚肽口服液每人每日推薦攝入量為4. 0g/60kg體重。由此推算出小鼠每日攝入量為低劑量組，3. 33g生藥/kg體重；中劑量組，6. 67g生藥/kg體重； 高劑量組，13. 34g生藥/kg體重，分別相當于人每日攝入量的5、10和20倍。將樣品以蒸餾水配制成相應濃度(0. 1665g干粉/ml、0. 3335g干粉/ml、0. 667g干粉/ml)的灌胃液進行實驗，小鼠灌胃量按0.2ml/10g體重計算。每日灌胃1次，連續30天。各組小鼠均飼以普通飼料，自由進食、飲水。30天后對各亞組小鼠進行輔助抑制腫瘤功能檢驗。1. 3. 3甲魚肽對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用將腹腔接種小鼠肉瘤S180細胞后8 天的昆明小鼠頸椎脫白處死，無菌條件下取出腹水，用生理鹽水1:2稀釋，給每只小鼠腋窩皮下接種瘤液0. 2ml。接種后次日，甲魚肽口服液低、中、高劑量給分別按3. 33g生藥/kg體重、6. 67g生藥/kg體重、13. 34g生藥/kg體重灌胃低、中、高濃度的甲魚肽藥液，每天1次， 連續給藥30天。末次給藥后24小時，頸椎脫白處死動物，分別稱體重、瘤重，計算腫瘤生長抑制率(％)，計算公式為
腫瘤生長抑制率％ =(對照均組平均瘤重-治療組平瘤重)+對照組平均瘤重X
100% ο1.3.4甲魚肽對小鼠移植性腫瘤Lewis肺癌的抑瘤作用用小鼠移植性腫瘤 Lewis肺癌生長良好的瘤源，無菌條件下取荷瘤動物的實體瘤組織，用剪刀剪成小碎塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無菌生理鹽水磨成勻漿，計數每ml勻漿液中的瘤細胞數，給每只動物皮下接種2X106細胞。接種后24小時分組給藥，甲魚肽口服液低、中、高劑量給分別按3. 33g生藥/kg體重、6. 67g生藥/kg體重、13. 34g生藥/kg體重灌胃低、中、高濃度的甲魚肽藥液，每天1次，連續給藥30天。末次給藥后24小時，頸椎脫白處死動物，分別稱體重、瘤重，計算腫瘤生長抑制率(％)，計算公式為
腫瘤生長抑制率％ =(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)+對照組平均瘤重X
100% ο1. 3. 5 甲魚肽對S180小鼠、Lewis肺癌小鼠脾淋巴細胞轉化的影響接種瘤液與給藥同1. 3. 3和1. 3. 4。末次給藥后24小時取脾臟，分別在篩網上研磨、離心、計數單個細胞，配成終濃度，頸椎脫臼處死動物。無菌條件下取出脾為2. 5X IO6個細胞/ml，分別加入96孔板中，同時設空白對照孔。置37°C 5% C02培養箱中培養72小時，培養結束前6 小時向每孔加入[3H]_TdR，終濃度為1 μ Ci/孔。多頭收集器將細胞收集于玻璃纖維濾紙上， 烤干，放入加有4ml閃爍液的測量瓶中，液閃儀上測定每個樣品的cpm值。1.3.6 甲魚肽對S180小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響接種瘤液與給藥同1. 3. 3末次給藥后24小時處死小鼠，按4 mL/只腹腔注射含小牛血清Hank’ s液，輕輕按摩腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2ml于試管內(或用注射器)，用Iml加樣器吸取腹腔洗液0. 5ml加入盛有0. 5mll% 雞血紅細胞懸液的試管內，混勻，用注射器(裝大針頭)吸取0. 5ml混合液，加入玻片的瓊脂圈內，放置孵箱內37°C孵育15 20min，孵育結束 后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，于甲醇液中固定lmin，姬姆薩液染色15min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干，油鏡下計數巨噬細胞， 每張片計數100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數，以吞噬百分率或吞噬指數表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。吞噬百分率％ =(吞噬雞紅細胞的巨噬數/計數巨噬細胞數)X 100% 吞噬指數=被吞噬雞紅細胞數/吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數。1.3.7 甲魚肽對Lewis肺癌小鼠碳粒廓清實驗的影響接種瘤液與給藥同 1. 3. 4。小鼠末次給藥后，從尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3-4倍印度墨汁0. lml/10g體重，分別于注入墨汁后2 min和10 min時分別從小鼠眼內眥靜脈叢取血20 yL，并立即加到2 mLO. l%Na2C03溶液中，混勻，在600 nm波長處測光密度值(OD)，以0. l%Na2C03溶液作為空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙擦干，
分別稱重，計算胸腺/體重和脾臟/體重。以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力。1. 3. 7甲魚肽對Lewis肺癌小鼠NK細胞活性的影響(乳酸脫氫酶測定法) 接種瘤液與給藥同1.3. 4。小鼠末次給藥后，頸椎脫白處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’ s液的小平皿中，研磨脾臟，制成單細胞懸液，經200目篩網過濾，用Hank’ s 液洗2次，每次離心IOmin (IOOOr · min _ ”，棄上清液將細胞漿彈起，加入015mL滅菌水20s，裂解紅細胞后再加入0. 5mL 2倍Hank，s液及8mLHank，s液，離心IOmin (IOOOr -min _ O，用ImL 10 %小牛血清RPMI1640完全培養液重懸，用1 %乙酸稀釋后計數，臺盼藍染色計數活細胞數(均在95 %以上)，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為2 XlO7個/ mL。試驗前24h將靶細胞(YAC21細胞)傳代培養，應用前以Hank's 液洗3次，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為4 X IO5個/ mL。取YAC21細胞和脾細胞各100 μ L (效靶比50 1)加入U型96孔培養板中，YAC21細胞自然釋放孔加 YAC21細胞和培養液各100 μ L，上述各項設3個平行孔，于37 °C、5 %C02培養箱中培養4h，然后將96孔培養板以1500r · min _ 1離心5min，每孔吸取上清液100 μ L置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100 μ L，反應8min，每孔加入lmol _1的 HCl 30yL ,在酶標儀490nm處測定光密度值。1.3.84統計方法實驗數據以 i±S表示，采用單因素方差分析，比較模型對照組、甲魚伏組之間的差異，P<0. 05判斷為差
異具有顯著性。2 結果
2. 1甲魚肽口服液對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用
甲魚肽口服液中、高劑量對小鼠肉瘤S180有較強的抑制作用，抑制率分別為30. 86% 和 46. 91% (Ρ<0· 05)，見表 1。表1甲魚肽口服液對小鼠肉瘤S180的抑瘤作用的影響(_ )
權利要求
1.甲魚肽在制備防治腫瘤疾病的藥中的應用。
2.根據權利要求1所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在lOOOODalton以內。
3.根據權利要求2所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在2000DaltOn以內。
4.根據權利要求3所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在140 IOOODalton范圍以內。
5.根據權利要求4所述的甲魚肽，其特征在于甲魚肽分子量分布在300 700DaltOn 范圍以內。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種甲魚肽的新用途，即在制藥中的新應用；本發明的另一目的是提供一種能抑制癌細胞生長和轉移，有較高的營養價值，吸收率高，不妨害人體身體健康的藥物或保健食品，本發明甲魚低聚肽是以甲魚為主要原料，分子量分布在10000Dalton以內的小分子肽，其中140-1000分子量范圍占50%以上。
文檔編號A61P35/00GK102319419SQ20111023623
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者劉根云, 盧建中, 易敏之, 鐘虹光, 馬莉 申請人:江中藥業股份有限公司