專利名稱：miR-146a作為調節血管生長靶標的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及miR-146a作為調節血管生長靶標的用途。
背景技術：
血管內皮生長因子(VEGF)是一種促 進血管生長的因子，其表達上調代表著血管生長的促進；反之則血管生長緩慢。血管生長的失調與許多疾病相關，計入關節炎、腫瘤等。關節炎是常見的慢性疾病，由炎癥、感染、創傷或其他因素引起的關節炎性病變，常見的是骨關節炎(OA)和類風濕關節炎(RA)，我國關節炎患者估計有I億以上，且人數在不斷增加。據統計，我國50歲以上人群中半數患骨關節炎；65歲以上人群中90%女性和80%男性患骨關節炎。關節炎主要病理改變包括軟骨退行性破壞，滑膜增生等。在關節炎中許多細胞因子參與這一過程，而IL-1 β是主要的分解代謝因子，IL-1 β上調導致細胞外基質的降解，加重了軟骨的破壞。近年來發展了多種藥物和療法來減輕主要由關節炎的炎癥引發的疼痛，但是對于治愈受累部位的軟骨破壞卻無計可施。在過去的幾十年中，miRNA作為動物和植物中一類新的基因調控分子越來越受到矚目，超過三分之一的人類基因受到miRNA調節。Stanczyk等報道在RA滑膜中，miR-146表達上調[Stanczyk J, Pedrioli DM, Brentano F, Sanchez-Pernaute O, Rolling C, GayRE，et al. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovialtissue in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum2008 ;58 (4) :1001-9]。 Nakasa 等 艮道在來源于RA病人的滑膜組織中，miR-146a/b表達上升[Nakasa T，Miyaki S，Okubo A，Hashimoto M，Nishida K，Ochi M，et al. Expression of microRNA—146 in rheumatoidarthritis synovial tissue. Arthritis Rheum 2008 ；58 (5) :1284-92] 0 已有研究表明miR-146a在人類關節軟骨的所有層面表達，尤其是在軟骨表層[Yamasaki K，NakasaT，Miyaki S，Ishikawa M，DeieM, Adachi N，et al. Expression of MicroRNA_146a inosteoarthritis cartilage. Arthritis Rheum 2009 ；60 (4) :1035_41]o目前，miR_146a與血管生長、關節炎等的關系以及具體的作用靶點還屬未知。在藥物開發過程中，藥物靶點的研究是至關重要的。因此，本領域還有必要進一步研究miR-146a在調節血管生長過程中的作用機制和靶點。

發明內容
本發明的目的在于提供miR_146a作為調節血管生長靶標的用途。在本發明的第一方面,提供一種miR_146a調節劑(調節miR_146a的表達水平的試劑)的用途，用于制備調節血管生長的組合物。在一個優選例中，所述的血管生長是血管內皮生長因子(VEGF)介導的血管生長。在另一優選例中，所述的miR_146a調節劑是miR_146a抑制劑,用于制備抑制血管生長的組合物。
在另一優選例中，所述的組合物還用于促進Smad4基因的轉錄或蛋白的表達；抑制血管內皮生長因子的轉錄或表達；或抑制軟骨細胞的凋亡。在另一優選例中，所述的血管是骨，軟骨，滑膜中的血管。在另一優選例中，所述的miR_146a抑制劑包括(但不限于)化學合成的miRNA-146a抑制劑；以表達質粒為載體的抑制miRNA_146a的病毒和非病毒產品；與miR-146a互補的核酸序列或序列片段。在另一優選例中，所述的miR_146a 抑制劑是miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors。在另一優選例中，所述的miR_146a調節劑是miR_146a促進劑,用于制備增加血管內皮生長因子的轉錄或表達的組合物。在另一優選例中，所述的組合物促進血管生長、促進機體生長發育、促進損傷組織愈合、防治心血管疾病。在另一優選例中，所述的miR_146a促進劑是表達miR_146a的表達載體、病毒、化學合成的小分子化合物等。在另一優選例中，所述的表達miR_146a的表達載體中，包含有miR_146a的表達盒。在另一優選例中，所述的表達miR_146a的表達載體中，包含有miR_146a前體的表達盒。在本發明的另一方面，提供一種調節血管生長的方法，包括調節動物中miR_146a的表達。在另一優選例中，所述的調節血管生長是抑制血管生長；所述的方法包括給予動物有效量的miR-146a抑制劑。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖UIL-Ιβ促進miR_146a和VEGF的表達，同時下調Smad4。原代大鼠軟骨細胞在相應時間點用白介素處理。miR-146a、Smad4和VEGF的表達水平用實時定量PCR和Western檢測。A, miR-146a表達在24h內逐漸增加。B, IL-1 β刺激后Smad4的mRNA水平下降。C，IL-1 β上調VEGF水平。數值為3次獨立實驗的均值土標準差。D，Smad4和VEGF的蛋白水平在IL-1 β刺激下分別下調和上調。條帶底部數值表示蛋白以GAPDH為標準的相對表達水平。圖2、Smad4是miR_146a的直接靶基因。A，圖示Smad4的3’ UTR與miR_146a的結合位點，上行序列為Smad4野生型序列(Smad-WT),中行序列為miR_146a序列，下行序列為Smad4突變型序列(Smad-MT)。
B,miR-146a抑制Smad4 3’UTR的熒光素酶活性。HEK293T細胞分別轉染含Smad43’ UTR或相應突變3’ UTR的片段。過表達miR-146a導致野生型(WT) 3’ UTR熒光素酶活性降低，而突變后(MT)熒光素酶活性不受影響。數值為3次獨立實驗的均值土標準差。Vector為空質粒對照。
C，過表達miR_146a抑制Smad4的表達，增加VEGF的表達。NC表示陰性對照，即轉染了陰性對照(轉染的對照RNA，序列為sense :5’_UUC UCC GAA CGU⑶C ACG UTT-3’，ant1-sense :5’ -ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’ )的軟骨細胞內蛋白表達情況。D,下調miR_146a的表達導致Smad4上調和VEGF下調。條帶底部數值表示蛋白以GAPDH為標準的相對表達水平。其中Inhibitors NC表示抑制劑的陰性對照miRIDIANmicroRNA Hairpin Inhibitor Negative Control (購自 Dharmacon) ;miR_146a 抑制劑指miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors (購自 Dharmacon)。圖3、抑制miR-146a削弱IL-1 β弓丨起的Smad4下調和VEGF上調。用miR_146a抑制劑轉染軟骨細胞，然后用IL-1 β處理24h。A,miR_146a抑制劑能夠顯著降低IL-1 β引起的miR_146a升高。其中，InhibitorsNC 表不抑制劑的陰性對照 miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control。B, miR-146a抑制劑能夠拮抗IL_1 β對Smad4的抑制作用。C，由IL-1 β弓丨起的VEGF上調可被miR_146a抑制劑削弱。數值為3次獨立實驗的均值土標準差。D，蛋白水平，miR_146a抑制劑拮抗IL-1 β弓丨起的Smad4下調和VEGF上調。條帶底部數值表示蛋白以GAPDH為標準的相對表達水平。圖4、VEGF受Smad4調控。利用RNAi的方法降低Smad4的表達上調VEGF的蛋白水平。軟骨細胞轉染Smad4的siRNA。 A,針對Smad4的siRNA有效降低Smad4的RNA水平。數值為3次獨立實驗的均值土標準差。B，抑制Smad4增加VEGF的蛋白表達。其中siRNA ctrl表示無關序列對照。C，共轉miR_146a和Smad4的表達質粒逆轉miR_146a導致的VEGF上調。條帶底部數值表示蛋白以GAPDH為標準的相對表達水平。其中，Control為pcDNA3.1 (+)空載體，NC 為陰性對照(sense :5，-UUC UCC GAA CGU ⑶C ACG UTT-3，，ant1-sense :5，-ACG UGACAC GUU CGG AGA ATT-3，)。圖5、miR-146a導致軟骨細胞的凋亡。A-D，TUNEL檢測說明miR_146a增加軟骨細胞的凋亡。凋亡細胞核被標記上綠色熒光。所有的細胞核用Hoechst33342復染。放大倍數A，B，X200. C，D，X600。其中，NC表示未過表達砧1 -1463的情況，轉染對照觀4(861186 :5’-UUC UCC GM CGU⑶C ACG UTT-3’，ant1-sense :5’ -ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。)。E，TUNEL陽性細胞定量說明凋亡細胞增加了 40. 3%。圖6、miR_146a和Smad4在手術誘導的大鼠骨關節炎中呈現相反的表達。Α,ΟΑ組軟骨中miR_146a水平增加。每組10只大鼠，數值顯示為均值土標準差。*P < 0. 05 ；0A和假手術組(sham)股骨髁用番紅O染色，并且用Smad4和VEGF抗體進行免疫組化。
B-C, OA組番紅O染色減少。D-E，OA組Smad4免疫組化陽性細胞減少。F-G, OA組VEGF免疫組化陽性細胞增多。放大倍數B,C，X40 ；D-1, X400。
具體實施例方式本發明人經過長期的研究，意外地發現了 miR_146a在血管(特別是骨關節、滑膜區域的血管)生長中發揮作用，其通過上調VEGF而促進血管的生長。因此，miR-146a抑制劑可用于抑制血管生長，從而預防、緩解或治療血管過度生長相關的疾病，如關節炎；而miR-146a促進劑可用于促進血管生長，從而用于需要促進血管生長的疾病狀態，例如術后恢復時。 miR_146a 及其用途本發明中，所述的miR_146a是具有SEQ ID NO 1所示核酸序列的小核糖核酸21-ugagaacugaauuccauggguu(SEQ ID NO :1)-42miR_146a是一種已發現與免疫應答相關的小核糖核酸。其在體內多種細胞內均有分布。本發明人發現，miR_146a是一個新的、與血管生長密切相關的藥物靶點，其藉由抑制Smad4蛋白表達，進而提高VEGF的表達來實現對血管生長的促進作用；而VEGF是公知的促進血管生長的因子，其表達上調必定代表著血管生長的促進，這是本領域公知的。針對miR-146a的各種治療手段可以作為調節動物血管生長的新穎和有效的手段。miR_146a調節劑及其用途基于本發明人的上述新發現，本發明提供了一種miR_146a調節劑的用途，用于制備調節血管生長的組合物(如藥物)。作為本發明的一種優選方式，提供了一種miR_146a抑制劑的用途，用于制備抑制血管生長的組合物。所述的miR-146a抑制劑藉由抑制miR_146a的表達，下調VEGF的表達，從而實現對血管生長的抑制作用。146a抑制劑還用于促進Smad4基因的轉錄或蛋白的表達；抑制血管內皮生長因子的轉錄或表達；或抑制軟骨細胞的凋亡。如本文所用，所述的“miR_146a抑制劑”包括了拮抗齊IJ、下調齊IJ、阻滯齊U、阻斷劑等，只要它們能夠下調miR-146a的表達水平。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是抑制miR-146a表達的病毒產品O所述的miR_146a抑制劑是指任何可降低miR_146a的活性、降低miR_146a的穩定性、下調miR-146a的表達、減少miR_146a有效作用時間的物質,這些物質均可用于本發明，作為對于下調miR-146a有用的物質，從而可用于抑制血管的生長。例如，所述的抑制劑是核酸抑制物，蛋白抑制劑，核酸酶，核酸結合分子，只要其能夠下調miR-146a的表達。作為本發明的一種優選方式，所述的抑制劑選自化學合成的miRNA抑制劑；以表達質粒為載體的抑制miRNA的病毒和非病毒產品；與miR-146a互補的核酸序列或序列片段。較佳地，所述的 miR_146a 抑制劑是 miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors,其可以通過商購獲得。
作為本發明的一種優選方式，提供了一種miR_146a促進劑的用途，用于制備促進血管生長的組合物。所述的miR-146a促進劑藉由上調miR-146a的表達，進而上調VEGF，從而促進血管的生長。在一些疾病狀態下，促進血管生長是需要的，例如在術后的恢復階段。如本文所用，所述的“miR_146a促進劑”包括了激動齊IJ、上調齊IJ、穩定劑等，只要它們能夠上調miR-146a的表達水平，或維持miR_146a的穩定性，或增加miR_146a的有效作用時間等。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是上調miR-146a表達的病毒產品。所述的miR_146a促進劑是指任何可提高miR_146a的活性、提高miR_146a的穩定性、上調miR-146a的表達、增加miR-146a有效作用時間的物質，這些物質均可用于本發明，作為對于上調miR-146a有用的物質，從而可用于促進血管的生長。例如，所述的促進劑是表達miR-146a的質粒/病毒、化學合成的小分子化合物。本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的O. 00001-20wt% ;更佳的，O. 0001-10wt% )的所述的miR_146a調節劑，以及藥學上可接受 的載體。所述的組合物可用于調節(促進或抑制)血管生長。任何前述的miR-146a的調節劑均可用于組合物的制備。如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充齊U、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。在得知了所述miR_146a調節劑的用途后，可以采用本領域熟知的多種方法來將所述的調節劑或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優選的，所述給藥方式是非腸道給予的。所述的抑制劑較佳的給藥方式是局部部位的注射給藥，例如可采取關節內給藥的方式。本發明所述的miR_146a的調節劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的miR-146a的調節劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著的《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
1.材料和方法原代細胞培養和轉染原代軟骨細胞分離自SD大鼠的股骨髁和脛骨平臺。大鼠關節軟骨被切成小碎片，O. 25%胰酶消化半小時，O. 2%膠原酶37°C消化5小時。細胞懸液過濾，800g離心10分鐘。然后用含10% FBS的F12培養液重懸細胞。用Human Chondrocyte Nucleofector kit實現質粒 DNA 和 miRNA 在軟骨細胞中的共轉[Haag J, Voigt R, Soeder S, Aigner T. Efficientnon-viral transfection of primary human adult chondrocytes in a high-throughputformat. Osteoarthritis Cartilage 2009 ； 17 (6) :813-7]。質粒構建和定點突變如前所述構建miR_146a 的表達質粒[Tang Y LX, Cui H, Ni X, Yua n M, Guo Y,Huang X, Zhou H, de Vries N, Tak PP, Chen S, Shen N. MicroRNA-146Acontributes toabnormal activation of the type I interferon pathway in human lupus by targetingthe key signaling proteins. Arthritis Rheum. 2009 ;60 (4) :1065-7] 從基因組 DNA 中擴增miR_146a的前體序列，克隆到pSuper載體(Oligo-Engine, Seattle, WA)中。擴增miR-146a 的前體序列使用的引物對為 5’-GTGAGATCTGCATTGGATTTACC(正向，SEQ ID NO 1)和 5，-GACCTCGAGACTCTGCCTT CTGT(反向，SEQ ID NO :2)。Smad4 的 3’UTR 被克隆到 pGL3_control 載體(購自 promega)的 Xba I 位點。以基因組DNA為模板進行Smad4的3’UTR擴增。引物如下上游引物5’-CCGCTCGAGTGAAGGAATCATTCCAGTGCTAG-3 (SEQ ID NO: 3)’；下游引物5 ’-TGCTCTAGACTTGGTAAAATTAACTCACCCACA-3’ (SEQ ID NO 4)。基于前段構建的質粒，利用QuikChange site-directed mutagenesis kit 構建突變的3 ’ UTR熒光素酶報告質粒。含有突變位點的引物如下上游引物5 ’ -TTAAAGGCAGAGAACMGAGAAAGTTMTTCACC-3’(SEQ ID NO 5);下游引物5’_GGTGAATTAACTTTCTCTTGTTCTCTGCCTTTAA-3’ (SEQ ID NO :6)。 擴增產物的DNA序列都經過測序驗證。熒光素酶報告實驗用于轉染的質粒用QIAGEN plasmid purification kit 抽提。HEK293T 細胞(ATCC)用lipo2000瞬轉，pRL-SV40質粒(購自promega)用作轉染效率的內參。轉染后24小時，裂解細胞，測量Firefly和Renilla熒光素酶的活性。每個實驗重復至少3次。RNA和實時定量PCR總RNA包括小RNA用miRNeasy Mini Kit抽提。IygS RNA用特異性的莖環引物反轉成miRNA，隨機引物反轉成cDNA。定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq 在ABI 7900HTsystem儀器上進行。引物如下大鼠β-act in:上游引物:5，-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’(SEQ ID NO 7)；下游引物5，-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3’(SEQ ID NO 8)；大鼠Smad4:上游引物5，-CCACCAACTTCCCCAACATT-3’(SEQ ID NO 9)；下游引物5’-TGCAGTCCTACTTCCAGTCCAG-3’ (SEQ ID NO 10)；
大鼠VEGF:上游引物5’-TTGAGACCCTGGTGGACATCT-3，(SEQ ID NO 11)；下游引物5’-CTCCTATGTGCTGGCTTTGG-3’ (SEQ ID NO :12)。蛋白檢測預冷已加好蛋白酶抑制劑的裂解液，在冰上裂解細胞。蛋白通過SDS凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜。膜封閉后與一抗(抗Smad4，VEGF或GAPDH抗體，分別購自Santa Cruz,Santa Cruz, Kangcheng)雜交。Smad4 RNA 干擾 RNA 干擾用針對 Smad4 的 siGENOME SMARTpool siRNA 試劑(購自 Dharmacon)進行。原代軟骨細胞用Lipofectamine RNAiMAX reagent轉染。TUNEL 實驗轉染后48小時，細胞用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘。凋亡測定用In Situ CellDeath Detection Kit-Fluorescein 進行。手術誘導骨關節炎所有動物實驗均在健康科學研究所動物福利和管理委員會授權同意下進行。20只雄性SD大鼠隨機分成2組手術組和假手術組。通過切除膝關節內側副韌帶和移除內側半月板造成關節不穩來誘導骨關節炎[Kamekura S, Hoshi K, Shimoaka T, Chung U,Chikuda H,Yamada T, etal. Osteoarthritis development in novel experimental mousemodels induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage 2005 ； 13 (7)632-41]。假手術組不切除韌帶和半月板。手術后頭三天，給予大鼠青霉素，每天一次。術后8周殺老鼠，取關節軟骨進行分子生物學和組織學分析。組織學和免疫組織化學膝關節用4%的多聚甲醛固定過夜，然后石蠟包埋。組織切片(5μπι)經二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，PBS沖洗。切片用番紅0/快綠染色以識別蛋白聚糖的丟失[ZemmyoΜ, Meharra EJ, Kuhn K, Creighton—Achermann L, Lotz M. Accelerated, aging-dependentdevelopment of osteoarthritis in alphalintegrin-deficient mice. Arthritis Rheum2003 ；48(10) :2873-80]。對于免疫組化，切片經檸檬酸鈉修復后，內源性的過氧化酶活性用3%的過氧化氫處理。然后用5%的BSA封閉非特異性結合，一抗4°C過夜，二抗及DAB顯色使用EnVision detection Kit。正常免疫球蛋白和不加一抗的染色作為陰性對照。統計學分析數據以均值土標準差來表示，η代表實驗的次數。統計學分析通過學生t檢驗。P < O. 05被認為有顯著性差異。I1.實施例實施例1、白介素-1 β刺激改變了軟骨細胞中miR_146a的表達為了找出在關節炎發病過程中涉及的miRNA，本發明人用IL-1 β刺激原代軟骨細胞，這是研究關節炎最常用的體外細胞炎癥模型。在IL-1 β刺激下，很多miRNA發生了調變。其中，本發明人選擇miR-146a進行進一步的研究，因為已有文章報道miR_146a介導炎癥反應[Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, Baltimore D. NF-kappaB-dependentinduction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins ofinnate immune responses. Proc Natl Acad Sci U SA 2006 ；103 (33) :12481-6],且其表達在 OA 中上調[Yamasaki K, Nakasa T, MiyakiS, Ishikawa M, Deie Μ, Adachi N, etal. Expression of MicroRNA_146a in osteoarthritis cartilage. Arthritis Rheum2009 ；60(4) :1035-41]，本發明人認為miR_146a很有可能在慢性炎癥性疾病，如類風濕性關節炎和骨關節炎中發揮作用。大鼠原代軟骨細胞經IL-1 β刺激不同時間。miR-146a迅速被誘導，而且它的表達在24小時內逐漸上升(圖1A)，提示miR-146a影響細胞信號級聯中一些重要的關鍵調節分子。經過反復分析，本發明人集中研究了 Smad4，因為TGF-β能夠拮抗一些IL-1 β引起的軟骨破壞的效應，而Smad4是TGF-β通路關鍵的信號分子。由于miRNAs —般是在轉錄后水平抑制其靶基因的表達，本發明人檢測了 IL-Ιβ刺激后，Smad4在軟骨細胞中的表達水平。如圖1B所示，IL-Ιβ以時間依賴性的方式下調Smad4的表達,提示Smad4是miR_146a的祀基因。Irmgard Schwarte-Waldhoff等報道在人胰腺癌細胞中Smad4通過抑制血管生成來抑制腫瘤形成，同時血管內皮生長因子(vaseular endothelial growth·factor, VEGF)下調[Schwarte-Waldhoff I, Volpert 0V, Bouck NP, Sipos B, Hahn SA,Klein-Scory S, et al. Smad4/DPC4_mediated tumor suppression through suppressionof angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 ；97(17) :9624-9]。而 VEGF 上調對 OA中的炎癥和病理性血管生成有作用[Bonnet CS, Walsh DA. Osteoarthritis, angiogenesisand inflammation. Rheumatology (Oxford) 2005 ；44 (I) :7-16],提不在骨關節炎中可能存在一個包含miR-146a和Smad4的調控網絡，該調控網絡與炎癥相關的血管生成相關。檢測的結果與假設相一致，本發明人觀察到IL-1 β使VEGF的mRNA和蛋白水平表達上升，與miR-146a表達上調的趨勢一致(圖1C和1D)。實施例2、miR-146a通過與Smad4的3’ UTR結合直接調控Smad4的表達接著,本發明人進一步研究Smad4是否確實是miR_146a的祀基因，尋找smad4編碼或非編碼區中含有miR-146a結合位點的序列(圖2A)，位于Smad4的3’UTR區域。進一步把這一序列克隆到熒光素酶報告載體中熒光素酶編碼基因的上游。共轉miR-146a和報告質粒使熒光素酶活性顯著降低，然而通過突變破壞了 miR-146a的結合位點后這一抑制作用被削弱(圖2B)。本發明人又在蛋白水平來確證這種抑制作用，將miR_146a表達質粒轉化原代軟骨細胞。結果，在原代軟骨細胞中過表達miR-146a顯著抑制Smad4的蛋白水平，說明miR-146a通過轉錄后水平調控Smad4的表達。而且，過表達miR_146a導致VEGF的上調(圖2C)。反之，本發明人用miRNA 抑制劑(miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors,購自Dharmacon)來減少內源性miR_146a的水平,發現miR_146a下調增加了 Smad4的表達，同時VEGF的表達減少(圖2D)。實施例3、IL-1 β 通過 miR-146a 調控 VEGF為了闡明miR_146a在介導IL-1 β通路中的作用，本發明人利用miR_146a的抑制齊[J (miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors,購自 Dharmacon)來阻斷它的功能。軟骨細胞在使用或者不使用miR_146a抑制劑的情況下用IL-Ιβ處理24小時。用其抑制劑可以顯著下調IL-1 β引起的miR-146a升高(圖3A)。
相應的，Smad4和VEGF的mRNA經實時定量PCR檢測，發現IL-1 β誘導的Smad4下調可被miR-146a的抑制劑逆轉(圖3B)。同時，miR-146a的抑制劑削弱IL-1 β誘導的VEGF上調(圖3C和3D)，說明炎癥情況下miR-146a在介導VEGF表達中發揮重要作用。實施例4、miR-146a對VEGF的上調是通過Smad4實現的為了闡明IL-Ιβ使VEGF上 調是否是由Smad4的下調引起的，本發明人進行了 RNA干擾實驗。軟骨細胞用干擾Smad4的siRNA進行轉染，然后在mRNA和蛋白水平檢測Smad4的下調情況。如圖4A和4B所示，針對Smad4的siRNA有效地減少了內源性Smad4的mRNA和蛋白水平。當Smad4表達被下調，VEGF的表達呈現出與過表達miR-146a類似的結果。VEGF的蛋白水平上調(圖4B)。隨后，本發明人用Smad4的表達質粒和miR_146a共轉軟骨細胞來恢復Smad4的表達，發現miR-146a介導的VEGF上調被Smad4逆轉(圖4C)。這些結果說明IL-1 β誘導的VEGF上調是由miR-146a和Smad4介導的。實施例5、miR_146a增加軟骨細胞的凋亡軟骨細胞凋亡增加是OA的一個顯著特征，而且IL-1 β可以誘導軟骨細胞的凋亡[Lopez-Armada MJ, Carames B, Lires-Dean M, Cillero-Pastor B, Ruiz-Romero C,Galdo F, et al. Cytokines, tumor necrosis factor-alpha and interleukin—lbeta,differentially regulate apoptosis in osteoarthritis cultured humanchondrocytes. Osteoarthritis Cartilage 2006 ； 14(7) :660-9]。所以接著，本發明人通過TUNEL檢測過表達miR-146a是否對細胞凋亡有影響。結果顯示，過表達miR_146a增加了軟骨細胞中TUNEL陽性細胞的數量(圖5)，說明miR-146a參與介導IL-1 β誘導的凋亡。實施例6、大鼠關節炎模型中miR_146a、Smad4和VEGF的表達本發明人還制備了大鼠關節炎(OA)模型，測定其中miR_146a、Smad4和VEGF的表達變化。結果，OA模型中，miR-146a的表達高于假手術組。MicroRNA通過與靶mRNA的互補序列結合發揮調節作用，從而抑制基因表達。Smad4的表達在OA模型的軟骨中較低，VEGF的表達在關節炎模型中較高，見圖6。II1.討論在體外關節炎炎癥細胞模型中，本發明人發現關節炎(類風濕性關節炎與骨關節炎)核心致病因子IL-Ιβ明顯提高miR-146a的表達，在培養的人軟骨細胞中本發明人觀察到類似的結果。大鼠關節炎(OA)模型中miR-146a的表達高于假手術組。MicroRNA通過與靶mRNA的互補序列結合發揮調節作用，從而抑制基因表達。本發明人發現Smad4是miR-146a的一個新的靶基因。Smad4的表達在OA軟骨中較低，和miR_146a的高表達相符。進一步本發明人的結果顯示軟骨中上調的miR-146a抑制Smad4，而這種抑制作用致使VEGF上調，而VEGF最終促進關節軟骨及滑膜中病理性血管生成。在關節炎病程中起著關鍵作用。許多促血管生成和抗血管生成的因子是血管生成的正調控者和負調控者，包括生長因子、炎癥因子、趨化因子及其受體等。在這些介導分子中，VEGF是生理病理狀態下主要的血管生成調控分子。一方面，在慢性炎癥性疾病的發病機制中，炎癥經常伴隨著血管生成。炎癥細胞能分泌細胞因子和生長因子以促進血管生成，同時新形成的血管能夠加重炎癥。無論是OA還是RA中，滑膜關節的炎癥都促進血管生成。RA和OA軟骨和滑液中存在IL-1 β和許多其他的炎癥介導分子。本發明人證明IL-1 β刺激VEGF的表達，而且這一過程是由miR_146a和Smad4介導的。VEGF在關節炎的滑膜中上調。Hiroyuki Enomoto等證明VEGF能夠在人類正常和關節炎膝關節標本中被檢測到，而且VEGF陽性細胞的比例在關節炎軟骨中顯著增加。VEGF在關節炎發病機理中充當炎癥和血管生成的橋梁。如前所述，VEGF的表達是肥大軟骨細胞的特征之一，誘導血管入侵軟骨。在大鼠關節炎模型中，本發明人發現VEGF在軟骨中上調，同時伴隨著Smad4下調。這一結果與體外結果相符軟骨細胞中Smad4下調導致VEGF上調，并且miR-146a和Smad4共轉軟骨細胞逆轉了 miR_146a對VEGF的作用。另一方面，VEGF上調與骨關節炎軟骨內骨化密切相關。軟骨內骨化是指無血管的軟骨被血管化的骨組織所取代。在軟骨內骨化過程中，軟骨細胞進行肥大分化，然后肥大軟骨細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)和VEGF，前者啟動細胞外基質重塑，后者誘導血管侵入 肥大化的軟骨。隨后，軟骨細胞凋亡，被成骨細胞和破骨細胞取代。而且，軟骨內骨化在關節炎發病中也有重要作用。例如，OA中骨贅的形成與軟骨內骨化相關，骨贅部位的肥大軟骨細胞有VEGF表達。近年來的研究表明，VEGF在類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)病理過程中起著關鍵作用。VEGF通過與其受體結合發揮生物學作用，可增加血管通透性，提高炎性滲透.促進內皮細胞生長、遷移和新生血管形成，RA血管增殖確保了滑膜血管翳的發生和發展，維持血管翳的侵襲性，促進軟骨和骨破壞及關節重塑，最終造成關節畸形和強直，功能喪失。本發明人的研究發現，miR_146a通過抑制Smad4上調VEGF。抑制血管生成將會抑制骨關節炎骨贅的形成及類風濕性關節炎滑膜血管翳的形成，這為骨關節炎及類風濕性關節炎的治療提供新的有效的治療策略。且本發明人發現過表達miR_146a使軟骨細胞凋亡增加。關節軟骨中細胞組分減少對于骨關節炎的發生和發展具有重要意義。OA病人軟骨中凋亡細胞的比例增加。凋亡的標志性分子，如caspase-3和caspase_8在其中表達增加。因此，miR_146a不僅通過直接靶向Smad4刺激VEGF的表達，而且調控軟骨細胞的生存。綜上所述，本發明人發現一條新的miR_146a介導的信號級聯，此通路對于IL-1 β在關節炎中造成的病理現象，如血管生成和細胞凋亡，是非常關鍵的。本發明人的結果首次證實Smad4是miRNA_146a的直接祀基因。在關節炎中，miR-146a介導的Smad4下調使VEGF表達增加，鑒于VEGF在骨關節炎及類風濕性關節炎中的關鍵地位。miR_146a毋庸置疑是關節炎(骨關節炎及類風濕性關節炎)極有前途的治療靶標。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種miR-146a調節劑的用途，用于制備調節血管生長的組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血管生長是血管內皮生長因子介導的血管生長。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a調節劑是miR-146a抑制齊U，用于制備抑制血管生長的組合物。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 促進Smad4基因的轉錄或蛋白的表達； 抑制血管內皮生長因子的轉錄或表達；或 抑制軟骨細胞的凋亡。
5.如權利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述的血管是骨，軟骨，滑膜中的血管。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a抑制劑包括化學合成的miR-146a抑制劑；以表達質粒為載體的抑制miR_146a的病毒和非病毒產品；與miR-146a互補的核酸序列或序列片段。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a抑制劑是miRIDIANmicroRNA Hairpin Inhibitors。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-146a調節劑是miR-146a促進齊U，用于制備增加血管內皮生長因子的轉錄或表達的組合物。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的組合物促進血管生長、促進機體生長發育、促進損傷組織愈合、防治心血管疾病。
10.一種調節血管生長的方法，包括調節動物中miR-146a的表達。
全文摘要
本發明涉及miR-146a作為調節血管生長靶標的用途。首次公開了miR-146a在血管生長中發揮作用，其通過上調VEGF而促進血管的生長。因此，miR-146a抑制劑可用于抑制血管生長，從而預防、緩解或治療血管過度生長相關的疾病，如關節炎；而miR-146a促進劑可用于促進血管生長，從而用于需要促進血管生長的疾病狀態。
文檔編號A61P43/00GK102988985SQ20111027446
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者張曉玲, 李晶, 戴尅戎 申請人:中國科學院上海生命科學研究院