專利名稱：山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山香圓葉乙醇滲漉提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
目前流行性感冒病毒日益嚴(yán)重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身性疾病密切相關(guān)，我國是流感高發(fā)國家之一，不但人口眾多，而且生活習(xí)慣也有利于流感病毒的轉(zhuǎn)播，每年人平均發(fā)病次數(shù)達(dá)到O. 3 O. 7次不等，重點(diǎn)人群達(dá)到2 4次。流感對人類存在嚴(yán)重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會直接導(dǎo)致器官破壞和變態(tài)反應(yīng)致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病(流感)的方法和治療手段，如針對臨床癥狀進(jìn)行炎癥反應(yīng)治療，治標(biāo)不治本。目前最常見的預(yù)防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西藥磷酸奧司他韋(達(dá)菲)_神經(jīng)氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預(yù)防接種弊端在于接種人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護(hù)率不高，保護(hù)時(shí)間也較短(3 6個(gè)月)。目前大多數(shù)非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對流感病毒，且抗病毒作用機(jī)理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風(fēng)寒，西醫(yī)所認(rèn)為的感冒的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡單的說，不是所有的治療感冒的中藥組方都有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達(dá)菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨基-3(1-丙氧乙酯)-1_環(huán)己烯-I羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對流感病毒進(jìn)入細(xì)胞有特異性抑制作用，但是不僅價(jià)格昂貴，而且有一些患者服用后出現(xiàn)嘔吐、惡心、失目民、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應(yīng)。達(dá)菲是在體內(nèi)被位于肝臟和腸道的酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物而起著抑制神經(jīng)氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功能不正常也將影響其藥效，腎功能不全患者也要慎用。因此，針對性抑制流感病毒復(fù)制、抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表面唾液酸，從而導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生將是治療流感病毒性感冒的病因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種山香圓葉乙醇滲漉提取物，抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而能有效的抑制流感病毒復(fù)制，更重要地是克服藥物的副反應(yīng)弊端。本發(fā)明的另一目的是提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。本發(fā)明的另一目的是提供了含有山香圓葉乙醇滲漉提取物的藥物組合物。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取 方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時(shí)后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸潰24 72小時(shí)后，以I 7ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 13倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑，浸潰24 48小時(shí)后，以I 6m/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑，浸潰48小時(shí)后，以I 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 10倍量的滲漉液，回 收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。更優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。優(yōu)選的，具體的提取方法如下取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時(shí)后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。本發(fā)明還提供了山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，用于抑制流感病毒FMl。優(yōu)選的，用于抑制神經(jīng)氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。本發(fā)明還提供了一種山香圓葉乙醇滲漉提取物制劑，該制劑以所述的山香圓葉乙醇滲漉提取物為主要活性成分。本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分，山香圓葉乙醇滲漉提取物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)，山香圓葉乙醇滲漉提取物能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒對細(xì)胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的山香圓葉乙醇滲漉提取物，其是通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時(shí)后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 14倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例I制備方法取山香圓葉粗粉，用50%乙醇作為提取劑，浸潰24小時(shí)后，以7ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材11倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例2制備方法取山香圓葉粗粉，用60%乙醇作為提取劑，浸潰48小時(shí)后，以2ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例3制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰48小時(shí)后，以5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例4制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以2ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例5制備方法取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以4ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例6制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時(shí)后，以3ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例7制備方法取山香圓葉粗粉，用80%乙醇作為提取劑，浸潰24小時(shí)后，以6ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)施例8制備方法取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時(shí)后，以4ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)I、提取工藝優(yōu)化研究山香圓葉主要含黃酮類、有機(jī)酸等化合物，黃酮類化合物以乙醇提取效果較佳，因、此，我們以乙醇濃度(A)、收集乙醇量(B)、滲漉速度(C)、浸潰時(shí)間⑶四項(xiàng)作為考察因素，每一因素設(shè)三個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表I、表2)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，考察指標(biāo)為總黃酮提取率。表I因素水平表
子浸漬時(shí)間(h)收集乙醇量滲漉速度~乙醇濃度(％)
水平^"^ A_(倍)B_C_P17281 380%248102-460%
312123-670%取山香圓葉藥材27份，每組平均三份，共九組，按表1L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果見表2。表2L9 (34)正交試驗(yàn)表
素"~~I"總黃酮含~總黃酮提取
試量(％)率(％)
111118.7159.69
212229.7266.64
3133310.8874.60
421239.5562.06
5223110.2570.25
Γ 623129.4264.56
731328.8060.29
83 2 1 3 10.1669.65 _9_3_3_2_I_9.7967.12
Kl200.93182.04193.9197.06
捍
^ Κ2196.87206.54195.82191.49 Κ3197.06206.28205.14206.31 __R4.06 24.511.2414.82方差分析將正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。表3以總黃酮提取率為指標(biāo)的方差分析
方差來源離差平方和自由度方差F值顯著性
誤差 e(A)3.5021.75B131.99265.9937.7*
C24.10212.056.9
_D_37.36_2_18.68_IOJ_Fl-O. 05(2,2) — 19. OFl-O. 01(2,2) — 99. O
結(jié)論直觀分析可知，收集乙醇量(B)對提取效果影響較大，浸潰時(shí)間(A)、滲漉速度(C)及乙醇濃度(D)對提取效果影響較小。表3方差分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了直觀分析結(jié)論，即因素B對提取效果有較大影響。結(jié)合K值分析，確定提取條件為取山香圓葉，用70%乙醇浸潰72小時(shí)后，以3 6ml/kg/分鐘滲漉，收集藥材10倍量滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2 :山香圓葉乙醇滲漉提取物對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用取實(shí)施例4制備方法所獲得的山香圓葉乙醇滲漉提取物，加適量水使溶解，應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制劑鑒定試劑盒測定山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經(jīng)氨酸酶(NI)的效價(jià)見表I。(I).標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ I神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液；b.每孔再分別加入O、I、2、5、7. 5、10 μ I Η5Ν1神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入O 20 μ IMilli-Q 水。(2).樣品檢測的準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ I神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液；b.每孔再加入10 μ I Η5Ν1神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入O 10 μ I山香圓葉乙醇滲漉提取物樣品；d.每孔再加入O 10 μ I Milli-Q水。(3).檢測步驟a.振動混勻約Imin ；b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5N1神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品也一起孵育；c.每孔加入10 μ I神經(jīng)氨酸酶熒光底物；d.再振動混勻約Imin ；e. 37°C孵育20 30min后進(jìn)行突光測定。激發(fā)波長為360nm,發(fā)射波長為440nm。(4).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品對于H5N1神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度曲線后計(jì)算出山香圓葉乙醇滲漉提取物對于H5N1神經(jīng)氨酸酶的IC50。山香圓葉乙醇滲漉提取物達(dá)到對神經(jīng)氨酸酶的抑制率IC50為13. 35mg/ml。見表4。表4.山香圓葉乙醇滲漉提取物抑制神經(jīng)氨酸酶的活性
權(quán)利要求
1.山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預(yù)防和治療流感并發(fā)癥疾病的藥物的用途，所述并發(fā)癥是指腎功能衰竭，其中所述提取物通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25 90%乙醇作為提取劑，浸潰12 72小時(shí)后，以I 8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用30 85%乙醇作為提取劑，浸潰24 72小時(shí)后，以I 7ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用35 80%乙醇作為提取劑，浸潰24 48小時(shí)后，以I 6m/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用45 75%乙醇作為提取劑，浸潰48小時(shí)后，以I 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
5.如權(quán)利要求3所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用55 70%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以2 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5 8倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用65%乙醇作為提取劑，浸潰36小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材5倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
7.如權(quán)利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用60 70%乙醇作為提取劑，浸潰12小時(shí)后，以3 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4 6倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
8.如權(quán)利要求I所述的用途，具體的滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用70%乙醇作為提取劑，浸潰72小時(shí)后，以4 5ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及山香圓葉乙醇滲漉提取物用于制備預(yù)防和治療流感并發(fā)癥疾病的藥物的用途，所述并發(fā)癥是指腎功能衰竭，其中所述提取物通過將山香圓醇滲漉提取得到，醇滲漉提取方法如下取山香圓葉粗粉，用25～90％乙醇作為提取劑，浸漬12～72小時(shí)后，以1～8ml/kg/分鐘的速度進(jìn)行滲漉，收集藥材4～9倍量的滲漉液，回收乙醇，減壓濃縮至稠膏或干燥得山香圓葉乙醇滲漉提取物。
文檔編號A61P31/16GK102631382SQ201110290528
公開日2012年8月15日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者劉地發(fā), 呂武清, 唐春山, 廖祝元, 李志勇, 楊小玲, 楊金火, 王燕平, 蔡元魁, 謝寧 申請人:江西山香藥業(yè)有限公司