專利名稱：兩親性氨基酸嵌段共聚物、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑領域，涉及一種生物可降解性兩親性氨基酸嵌段共聚物作為藥物載體，本發明還涉及該載體的制備方法及其應用。
背景技術：
現代藥物傳遞系統的研究離不開新型材料的使用，特別是藥用高分子材料，殼聚糖、透明質酸、明膠、淀粉、海藻酸鈉、白蛋白、纖維素、聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸類、聚酯、聚醚類等已在藥劑學中展現出獨特的優勢。但生物相容性、生物降解性和安全性制約了藥用高分子材料的使用，開發安全新型功能的高分子材料屬于藥劑學研究的熱點領域。氨基酸是生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，是構成機體營養所需蛋白質的基本物質。選用一種或多種氨基酸合成聚合物能在體內酶的作用下降解為氨基酸，生物相容性好，安全無毒，聚氨基酸的研究已受到廣泛的關注。目前聚氨基酸作為藥物載體的研究主要集中在聚氨基酸-藥物偶聯物、聚氨基酸復合載體、氨基酸共聚物載體幾個方面。聚氨基酸與藥物通過化學鍵形成偶聯物，在體內酸性環境及酶的作用下化學鍵斷裂釋放藥物，達到緩釋、靶向的作用，并且可以降低藥物的毒性。聚氨基酸與其它高分子材料形成復合載體以克服單一材料的不足以及實現新的功能。 氨基酸共聚物亦可形成兩親性材料作為藥物載體，以提高藥物溶解性能，延長體內循環時間和實現靶向目的。1.聚氨基酸-藥物偶聯物聚氨基酸含有活性氨基和羧基端，可以通過共價鍵與藥物結合，形成偶聯物，該偶聯物在體內特定酸性環境及酶的作用下化學鍵斷裂釋放藥物，達到緩釋、靶向的作用，同時由于聚氨基酸的保護作用，提高藥物的穩定性，并且可以降低藥物的毒性。聚氨基酸-藥物偶聯物研究起源于上世紀七十年代初，美國猶它大學kim領導的課題組就成功地合成了聚谷氨酸材料，用氨基丙醇為側鏈基，以共價結合方式將留體避孕藥炔諾酮鍵入材料，并進行了體外及大鼠體內釋放試驗，其釋放時間達300d。實驗結果表明，聚谷氨酸在降解后可降解為單體并不在生物體內滯留。CN1321696A, CN101209350A, CN101707869A, US6262107, US6515017, US6730699, US6884817公開的均是采用聚氨基酸與藥物通過化學鍵偶合制備偶聯物的方法。由于該類載體是通過藥物與聚氨基酸共價鍵偶聯，針對每一藥物都需要設計合適的反應條件，并完成聚氨基酸-藥物偶聯物的制備、純化，增加了實施的難度、藥物損失大、提高了成本。2.聚氨基酸復合載體聚氨基酸與常用高分子材料通過化學鍵或物理作用結合形成復合載體，可以實現緩釋、降低毒性、提高生物藥物的轉染率、靶向、延長體內循環時間的目的。CN101619132B公開的聚氨基酸三嵌段共聚物可以用來制備凝膠。此方法制備的藥物制劑不適于靜脈注射。US20030232968A1公開的制備樹枝狀的聚氨基酸，制備工藝復雜，且樹枝狀結構較線性結構亦產生免疫反應。US20030147958A1公開的將聚氨基酸與親水性聚合物如聚乙二醇(PEG)偶聯， 提高轉染率，降低毒性。另有大量文獻報道采用PEG與聚氨基酸偶聯作為藥物載體。 如Prompruk K 等(Prompruk K, Govender T, Zhang S, et al. Synthesis of a novel PEG-block-poly(aspartic acid-statphenylalanine)copolymer shows potential for formation of a micellar drug carrier[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2005,297(1-2) :242 253)以PEG為親水段，天冬氨酸與苯丙氨酸(Phenylalanine) 隨機序列合成的聚合物作為疏水段，形成嵌段共聚物，天冬氨酸可以通過離子作用包載藥物，而苯丙氨酸的疏水性或者芳環相互作用有利于膠束成核，減緩膠束解離，延緩藥 白勺 # 方文；Kim SH φ (Kim SH, Jeong JH, Joe CO, et al. Folate receptor mediated intracellular protein delivery using PLL-PEG-F0L conjugate[J]. Journal of Controlled Release，2005，103 (3) :625 634.)制備聚賴氨酸PEG兩親性嵌段共聚物，并以葉酸修飾PEG，形成帶正電的PLL-PEG-F0L聚合物；Shu SJ等(Shu SJ, Zhang XG. , Teng DY, et al.Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly (L-aspartic acid)-polyethylene glycol for controlled protein release [J] · Carbohydr-ate Research, 2009, 344 (10) :1197 1204.)制備水溶性殼聚糖-聚天冬氨酸-PEG (WSC-Pasp-PEG)復合物。采用聚氨基酸與PEG制備復合載體可以達到靶向、提高載藥量、緩釋、體內長循環等作用，但PEG修飾的過程增加了制劑的成本和產生了雜質，PEG修飾后在動物模型反復用藥后表現出腎小管空泡，另外，應用PEG后在動物和人體也會產生抗體。采用更加安全的親水性聚氨基酸來替代PEG也可以達到長循環作。Romberg B 等(Romberg B, Metselaar JM, Baranyi L, et al.Poly(amino acid) s !Promising enzymeatically degradable stealth coatings for liposomes[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 331 (2) :186 189.)分別用 5% (摩爾比)聚天冬氨酸(PHEA，分子量3000Da)、聚谷氨酸(PHEG，分子量4000Da)修飾脂質體，并比較其半衰期， 未包裹脂質體半衰期9.幾，用聚天冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂質體半衰期分別為14. 4h和 11. 9h。采用親水性聚氨基酸修飾脂質體可以達到長循環作用，但是修飾的過程增加了工藝的復雜性，制劑的穩定性也很難達到要求。3.氨基酸共聚物載體采用一種或幾種氨基酸合成氨基酸共聚物作為藥物載體，由于代謝產物為氨基酸對人體無毒，比其它高分子材料具有更高的安全性，氨基酸來源豐富，價格便宜，組成人體氨基酸有20種，可以根據需要選擇，滿足不同藥物載體的需要，聚氨基酸分子鏈上具有很多活性基團(如氨基、羧基)，藥物或活性物質能方便與之結合。該類載體相比聚氨基酸-藥物偶聯物制備簡單、不需要復雜純化過程，與聚氨基酸復合載體相比簡化了工藝、制劑穩定、藥物載藥量高、安全性更高。因此氨基酸共聚物作為藥物載體也越來越受到關注。韓亞冬等(韓亞冬，夏加亮，何盼，等.聚L-谷氨酸擔載胰島素口服微球的制備與評價[J].高等學?；瘜W學報，2009，30 (12) :2521 25M.)以聚L-谷氨酸為載體材料，采用無水乳液法制備口服胰島素微球，微球直徑在5 20 μ m，載藥質量分數為5% 9%。但該方法載藥量低，制備的粒徑在5 20 μ m不適合靜脈給藥。
Akagi T 等(Akagi T，Kaneko T，Kida T，et al. Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on poly(g-glutamic acid) with 1-phenylalanine as a protein carrier[J]. Journal of Controlled Release， 2005,108(2-3) :2 236.)以γ-聚谷氨酸(Y-PGA)與L-苯丙氨酸乙酯接枝共聚，該載體將卵清蛋白包裹制備納米粒。該方法藥物的包封率在50%以下，包封率低，冷凍干燥后易發生聚集。Kima MS 等(Kima MS, Dayananda K，Choi ΕΚ, et al. Synthesis and characterization of poly(L-Glutamic acid)-block-poly-(L-phenylalanine) [J]. Polymer, 2009, 50 (10) :2252 2257)以L-谷氨酸Y -芐酯與L-苯丙氨酸合成嵌段供聚物，經脫去芐酯后形成兩親性共聚物制備泡囊，該載體在不同PH條件下形成不同粒徑的泡囊。該載體沒有作為藥物載體的應用報道，另外該載體在不同PH條件下形成的泡囊粒徑不同，雖然可以利用這個性質設計PH敏感性藥物載體，但也說明了該載體存在pH不穩定性， 因為大多數藥物只有在某一 PH范圍內才穩定，這就要求制劑的制備、儲存時要控制pH，但在該PH條件下不一定能發揮該載體的最大優勢，另外，在制劑制備、儲存過程中也會發生 PH的波動，pH敏感性藥物載體會產生穩定性問題?？梢姡壳安捎镁郯被嶙鳛樗幬镙d體存在工藝繁瑣、結構復雜易產生免疫原性， 形成的納米載體包載藥物有限，制劑穩定性不佳等缺陷。組成人體蛋白的氨基酸有二十種，發明者發現，若采用親水性的L-天冬氨酸與疏水性L-苯丙氨酸制備兩親性氨基酸嵌段共聚物，在水溶液中自組裝形成納米膠束，制備方法簡單；該兩親性氨基酸嵌段共聚物具有PH穩定性；另外在疏水基團作用下，可以顯著提高藥物的載藥量，穩定時間也顯著延長。本發明采用L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸制備兩親性氨基酸嵌段共聚物，自組裝納米膠束未見任何文獻和專利報道。

發明內容
本發明的目的針對上述問題提供一種以L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐和L-苯丙氨酸環內酸酐作為起始原料，通過聚合反應得到臨界膠束濃度低、載藥量高、穩定性好、不受PH影響的藥物增溶載體。本發明的另一個目的是提供上述載體的制備方法。本發明還有一個目的是提供上述載體在制藥中的應用。為達到上述目的，本發明提供一種新型藥物增溶載體，該載體采用聚天冬氨酸作為親水鏈，聚苯丙氨酸作為疏水鏈，使其具有兩親性質，在水介質中可自組裝為納米膠束。所述的藥物增溶載體的制備方法，包括下列步驟將L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-苯丙氨酸環內酸酐，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥，即得天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；或先將L-苯丙氨酸環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥，即得天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；稱取天冬氨酸芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物，加入濃度為0. 5 2Μ的NaOH溶液，室溫攪拌1 4h，溶液經透析袋透析后干燥，即得兩親性氨基酸嵌段共聚物。所述的藥物增溶載體，其中L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸分子個數比為1 5 5 I0所述的藥物增溶載體，其分子量為IKDa 50KDa。所述的藥物增溶載體的應用，其特征在于可以用于血管內或肌肉注射或口服或腔道或外用的藥學活性或藥理活性分子的載體。其中藥學活性或藥理活性分子選自維甲酸類、紫杉醇類、喜樹堿類、環孢素類、黃酮類、小檗堿類、二氫吡啶類、長春堿類、鬼白毒素類、 蒽醌類抗腫瘤藥物、留體類或非留體抗炎藥物、抗生素、心血管藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、免疫調節劑中的任一物質或其衍生物。該藥物增溶載體的制備方法包括以下步驟兩親性氨基酸嵌段共聚物與水按重量比為1 50 1000的比例溶解，得到兩親性氨基酸嵌段共聚物的納米膠束；將治療量的難溶或微溶于水的有機藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性氨基酸嵌段共聚物納米膠束混合后，經超聲或高壓勻質處理，溶劑用透析袋透析或超濾法或柱分離法除去有機溶劑和小分子，干燥，制得粒徑為10 IOOOnm的納米膠束。具體方案如下一、兩親性氨基酸嵌段共聚物的合成方法如下1.聚天冬氨酸-β芐酯或聚苯丙氨酸的合成L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解，加入活性端基氨，室溫攪拌12 72h，加入無水乙醇或無水乙醚，收集沉淀，干燥，即得聚天冬氨酸-β芐酯；或L-苯丙氨酸環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解，加入活性端基氨，室溫攪拌12 72h，加入無水乙醇或無水乙醚，收集沉淀，干燥，即得聚苯丙氨酸。2.兩親性天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物的合成聚天冬氨酸-β芐酯用二甲基甲酰胺溶解加入L-苯丙氨酸環內酸酐室溫攪拌 12 72h，加入無水乙醇或無水乙醚，收集沉淀干燥，即得兩親性天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；或聚苯丙氨酸二甲基甲酰胺溶解加入L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐室溫攪拌 12 72h，加入無水乙醇或無水乙醚，收集沉淀，干燥，即得兩親性天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物。3.兩親性氨基酸嵌段共聚物的合成稱取兩親性天冬氨酸-β芐酯-苯丙氨酸嵌段共聚物，加入0. 5 2Μ NaOH溶液室溫攪拌1 4h，加入透析袋透析，干燥，即得兩親性氨基酸嵌段共聚物。二、兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束制備方法按每ImL水中溶解1 20mg兩親性氨基酸嵌段共聚物的比例，將制得的兩親性氨基酸嵌段共聚物溶于水中，經超聲處理(超聲處理的頻率及處理時間均是本領域普通技術人員所公知的，下同)，制備成粒徑為10 IOOOnm的兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束。三、以兩親性氨基酸嵌段共聚物為載體，制備含難溶性藥物的組合物兩親性氨基酸嵌段共聚物溶于水后，將難溶性藥物用適當溶劑(藥學上使用的能溶解該藥物的溶解)溶解，與兩親性氨基酸嵌段共聚物溶液經超聲處理，制得粒徑10 IOOOnm的聚合物膠束。四、采用兩親性氨基酸嵌段共聚物作為藥物載體制備藥物組合物，對難溶性藥物有增溶作用?？墒褂迷搩捎H性氨基酸嵌段共聚物作為載體的難溶性藥物包括全反式維甲酸、 紫杉醇、阿霉素、環孢素、喜樹堿、羥基喜樹堿、尼莫地平、替尼泊甙、依托泊甙、燈盞花素、銀杏內酯、水飛薊素、柔紅霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、萘普生，但并不局限于所列藥物。本發明的有益效果一、較低的臨界膠束濃度(Critical micelle concentrations,CMC):實施例 2 9中兩親性氨基酸嵌段共聚物的CMC皆在10 200mg/L范圍內，預示它有極好的稀釋穩定性。二、不受pH的影響采用兩親性氨基酸嵌段共聚物制備的空白膠束在pH3. 6、 Ph4. 0、pH4. 6、pH5. 0、pH5. 6、pH6. 0、pH6. 5、pH7. 0、pH7. 4、pH8. 0 溶液中粒徑沒有顯著改變，
載藥膠束粒徑、載藥量、穩定時間沒有顯著變化。三、對有機藥物、水不溶性或難溶性藥物和兩親性藥物具有較好的負載，例如，對全反式維甲酸的負載高達31. (w/w)，對紫杉醇的負載高達觀.4% (w/w)，對阿霉素的負載高達27. 5% (w/w)，對環孢素A的負載高達30. 4% (w/w)，對阿奇霉素的負載高達17. 4% (w/w)O四、良好的穩定性實施例中所制備的全反式維甲酸、紫杉醇、阿霉素、環孢菌素 A、阿奇霉素兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束，稀釋至1 :3mg/ml，置于4°C和25°C，全反式維甲酸兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束穩定性分別>5d，其余25°C穩定性均> 3d?？梢妰捎H性氨基酸嵌段共聚物膠束不僅有極高的載藥量，還具有非常優越的穩定性。五、本發明輔料亦可用于血管內或肌肉注射、口服、腔道或外用途徑給藥。本載體材料在體內降解為氨基酸，對人體安全。 綜上所述，本發明采用組成人體蛋白的L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸，合成兩親性氨基酸嵌段共聚物，在水介質中自發形成納米膠束，在體內具有良好的生物相容性、生物可降解性和穩定性，對藥物有較好的負載。本發明研究的兩親性氨基酸嵌段共聚物在水介質中自發形成納米膠束，不但可用于藥物的包載，控制藥物釋放，而且由于其親水的殼和疏水的核組成的納米膠束結構，可以延長體內循環，減少網狀內皮細胞的吞噬，增加腫瘤靶向，達到減少毒副作用，增加療效的目的。本發明提供的兩親性氨基酸嵌段共聚物臨界膠束濃度低、載藥量高、藥物包封率高、納米膠束穩定。本輔料毒性小，可作為難溶性有機藥物的載體，以納米級分散體系用于血管內或肌肉注射、口服、腔道或外用途徑給藥。本發明制備方法簡單，工藝成熟，適用于大規模連續生產。


圖1 兩親性氨基酸嵌段共聚物通式圖2 聚天冬氨酸- β芐酯紅外圖譜(實施例9)圖3 聚天冬氨酸-β芐酯1H NMR圖譜(實施例6)
圖4 兩親性氨基酸嵌段共聚物紅外圖譜(實施例9)圖5 兩親性氨基酸嵌段共聚物1HNMR圖譜(實施例6)圖6 兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束的粒徑圖譜。(實施例10)圖7 載有全反式維甲酸的兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束的粒徑圖譜(實施例11)圖8 兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束的電鏡圖譜(實施例10)圖9 載有全反式維甲酸的兩親性氨基酸嵌段共聚物膠束的電鏡圖譜(實施例11)
具體實施例方式下面通過實施例對本發明加以進一步的說明，但下述實施例并不局限本專利的權利范圍。實施例1 :L_天冬氨酸-β芐酯環內酸酐及L-苯丙氨酸環內酸酐的制備參考文獻(Prompruk K, Govender T, Zhang S, et al. Synthesis of a novel PEG-block-poly (aspartic acid-statphenylalanine)copolymer shows potential for formation of a micellar drug carrier[J]. International Journal ofPharmaceutics, 2005,297(1-2) :242-253.)進行。其中L-天冬氨酸-β芐酯及L-苯丙氨酸購自上海翰鴻化工股份有限公司，三光氣購自上海晶純試劑有限公司。(I)L-苯丙氨酸環內酸酐制備10gL_苯丙氨酸加入無水四氫呋喃100ml，磁攪拌， 升溫至50°C，然后加入三光氣15g，懸濁液變澄清后充氮氣30min，以除去反應生成的氯化氫氣體及剩余的光氣，將反應液濃縮，倒入過量的無水正己烷中，充分結晶后過濾，用無水正己烷洗滌、干燥得粗品。將粗品用無水乙醚/正己烷重結晶得到鮮片狀有光澤的白色針狀晶體即為L-苯丙氨酸環內酸酐。產率85%。合成路線如下
權利要求
1.通式為式(I)的兩親性氨基酸嵌段共聚物，其中，m = 1 200的正整數；η = 1 150的正整數；X 為活性端基氨，Y為堿金屬。
2.權利要求1所述的兩親性氨基酸嵌段共聚物，其特征在于m= 5 50的正整數，η =5 50的正整數，m與η之比為1 5 5 1 ；其分子量為
3.權利要求1所述的兩親性氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，所述X為正丙胺、正丁胺、 正戊胺或正己胺。
4.權利要求1所述的兩親性氨基酸嵌段共聚物的制備方法，該方法包括將L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室溫條件下攪拌12 72h， 加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入 L-苯丙氨酸環內酸酐，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物， 收集沉淀，干燥，加入濃度為0. 5 2M的NaOH溶液，室溫攪拌1 4h，溶液經透析袋透析后干燥，即得式(I)嵌段共聚物；或先將L-苯丙氨酸環內酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀， 干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-天冬氨酸-β芐酯環內酸酐，室溫條件下攪拌12 72h，加入無水乙醚或無水乙醇沉淀反應產物，收集沉淀，干燥，加入濃度為0. 5 2M的NaOH 溶液，室溫攪拌1 4h，溶液經透析袋透析，干燥，即得式(II)嵌段共聚物。
5.權利要求1所述的兩親性氨基酸嵌段共聚物在藥物增溶中應用。
6.權利要求5所述的應用，其特征在于所述的藥物選自維甲酸類、紫杉醇類、喜樹堿類、環孢素類、黃酮類、小檗堿類、二氫吡啶類、長春堿類、鬼白毒素類、蒽醌類抗腫瘤藥物、 甾體類或非留體抗炎藥物、抗生素、心血管藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、免疫調節劑中的任一物質或其衍生物。
7.權利要求6所述的應用，其特征在于所述的藥物選自全反式維甲酸、紫杉醇、阿奇霉素、阿霉素或環孢素A。
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于該兩親性氨基酸嵌段共聚物藥物增溶載體的制備方法包括以下步驟與水按重量比為1 50 1000的比例溶解，得到兩親性氨基酸嵌段共聚物的納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性氨基酸嵌段共聚物納米膠束混合后，經超聲或高壓勻質處理，溶劑用透析袋透析或超濾法或柱分離法除去有機溶劑和小分子，干燥，制得粒徑為10 IOOOnm 的納米膠束。
全文摘要
本發明涉及兩親性氨基酸嵌段共聚物、制備方法及其應用。通式為式(I)的兩親性氨基酸嵌段共聚物及其鹽，其中，m＝1～200的正整數；n＝1～150的正整數；X為活性端基氨，Y為堿金屬。將一種氨基酸的環內酸酐與活性端基氨反應后再與另一種氨基酸的環內酸酐反應后用堿金屬氫氧化物脫去芐基，可制得該嵌段聚合物。該聚合物制備的膠束臨界膠束濃度低、不受pH影響、穩定性好、載藥量高，可作為有機藥物、水不溶性或難溶性和兩親性藥物的載體，用于血管內或肌肉注射、口服、腔道或外用途徑給藥。本發明制備方法簡單，工藝成熟，適用大規模連續生產。
文檔編號A61K47/34GK102504245SQ20111034024
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者周建平, 姚靜, 湯繼輝, 石靜波, 臧洪梅, 陳飛虎 申請人:中國藥科大學, 安徽醫科大學