穿心蓮內酯及其衍生物在制備防治手足口病藥物中的用途
【專利摘要】本發明涉及將一種現有的抗菌消炎藥穿心蓮內酯及其衍生物用作防治手足口病的新藥，為穿心蓮內酯類藥物提供了新的用途。具體而言，本發明涉及穿心蓮內酯類藥物在制備治療和/或預防手足口病病毒感染的藥物中的用途。所述穿心蓮內酯類藥物，例如穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、穿心蓮內酯磺化物、三乙酰穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯等，經藥效學研究，表明穿心蓮內酯及其衍生物是防治手足口病的高效藥物，可以制成各種常用的劑型用于臨床防治，具有療效好、毒性低、價廉的特點。本發明為臨床手足口病病人的防治提供了一種新的藥物，為發現新的理論和藥物作用新的靶點提供重要依據。
【專利說明】穿心蓮內酯及其衍生物在制備防治手足口病藥物中的用途

【技術領域】
[0001]本發明涉及穿心蓮內酯類藥物在制備治療和/或預防手足口病病毒感染的藥物中的用途，屬于中醫藥領域。

【背景技術】
[0002]手足口病是由小RNA病毒科，腸道病毒屬病毒引起的，現已成為危害嬰幼兒健康和公共衛生安全的重要傳染病。手足口病主要由腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA 16)所引起。手足口病通常為一過性的感染，從感染到出現臨床癥狀為3-6天，常在手、足、口部位出現丘疹、皰疹后不治自愈；但也有一部份病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會出現嚴重的并發癥，如病毒性腦膜炎，腦炎，類似小兒麻痹的癱瘓，以及心肌炎，心包炎，心肌病且病情進展迅速，引起的肺水腫、肺出血經常導致嬰幼兒在I天內快速死亡，痊愈后往往也存有嚴重的后遺癥。
[0003]流行病學資料顯示，EV71和/或CA16弓丨起的手足口病已在世界范圍內多次爆發流行，尤其是近10年來，手足口病流行在亞太地區猖獗，不僅發病人數多，而且死亡病例多。自2008年5月2日起，衛生部將手足口病納入丙類法定傳染病管理。此后，手足口病疫情在中國大陸蔓延，目前也仍得不到有效控制，據中國CDC的法定傳染病疫情通報可知，每年中國大陸手足口病發病超過百萬例，死亡近千例。
[0004]手足口病防治已迫在眉睫，可至今尚無有效的疫苗或藥物來防治手足口病，從而控制疫情的蔓延。目前，EV71型手足口病滅活疫苗進入臨床研究階段，距離臨床應用仍有一段距離，其成功與否仍是未知數；其它手足口病疫苗仍處于實驗室研究階段，短期內難以研究成功，預示著手足口病的防控在相當長的一段時間內不得不完全依賴藥物對癥治療，就是疫苗有效也不能對所有的人全部保護，并且現在研制的疫苗不能用于特殊人群的接種。
[0005]目前，對于手足口病患者的臨床治療，無特效藥，一般根據臨床分期，采用對癥輔助治療的方案。用于治療手足口病的藥物，常使用利巴韋林和干擾素，在乳鼠動物模型中具有一定的療效，且具有協同效果，但并沒有大規模的臨床驗證；用于治療重癥手足口病患者的藥物，根據《手足口病防控指南》，可以使用注射用丙種球蛋白和糖皮質激素沖擊療法，可是丙球來源受限，激素具有副作用，并且也沒有循癥醫學的證據。盡管乳鐵蛋白在實驗室階段，無論是在體內試驗，還是在體外試驗，均能防治EV71型手足口病病毒的感染，但在小規模的臨床實驗中并沒有顯示出有任何的防護效果；目前，僅有米力農(一種磷酸二酯酶抑制劑)在小規模的臨床實驗中報道對于EV71引起的肺水腫型重癥病人有一定的治療效果，但并沒有進行大規模的臨床試驗。其它防治手足口病的藥物均處于實驗室研究階段，距離臨床應用尚有很大距離，例如石蒜堿通過抑制手足口病病毒的繁殖，病毒中和抗體通過阻斷手足口病病毒感染，從而具有防治手足口病的能力，但石蒜堿存在毒性、中和抗存在抗體依賴感染增強現象，這類手足口病候選藥物能否成為臨床用藥均是未知數。由此可見，在醫學領域迫切需要發現和發展可以用來防治手足口病感染、同時具有副作用少、療效高的新藥物。
[0006]穿心蓮為爵床科植物穿心蓮的干燥地上部分，味苦，性寒。具有清熱解毒、涼血消腫之功效。穿心蓮內酯是穿心蓮中提取的二萜內酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，臨床上主要治療上呼吸道感染、細菌性痢疾等。經現代藥理學研究，發現穿心蓮內酯不僅具有抗菌消炎作用，還具有抗腫瘤、保肝利膽、抗病毒作用。目前，穿心蓮已經用于臨床治療腫瘤，有一定療效。業已證明，穿心蓮內酯在治療各種感染性疾病造成的炎癥性疾病中，均能取得較好的效果。關于穿心蓮內酯抗病毒研究已有很多報道，穿心蓮內酯對流感病毒、腺病毒有抑制作用，對皰疫病毒有一定的延緩作用；也具有抗黃病毒、痕病毒、丙肝病毒、SARS冠狀病毒、HIV病毒等作用。穿心蓮內酯還具有免疫調節的功能，抑制炎癥時毛細血管通透性的增加，從而減少炎癥滲出物的量；提高白細胞、中性粒細胞及巨噬細胞對細菌病毒的吞噬能力，提高血清中溶菌酶的含量，增加細胞免疫能力，從而具有廣譜抗病原微生物作用。
[0007]由于現今穿心蓮內酯的應用還處于開發階段，未能使穿心蓮內酯得到廣泛的應用。利用穿心蓮內酯磺化物喜炎平來治療手足口病，在臨床上有零星報道，但有效性證據仍不充分，目前尚未見在模型動物上研究的報道。本發明為穿心蓮內酯類藥物“老藥新用”提供了新用途和作用機理，為穿心蓮內酯類藥物臨床應用開拓了新前景。


【發明內容】

[0008]本發明的技術目的在于探究穿心蓮內酯類藥物在制備治療和/或預防手足口病的藥物中的新用途。
[0009]因此，本發明的第一方面提供一種穿心蓮內酯類藥物在制備治療和/或預防手足口病病毒感染的藥物中的新用途。其中所述穿心蓮內酯藥物為穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、穿心蓮內酯磺化物、三乙酰穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯等，優選地，所述穿心蓮內酯類藥物為穿心蓮內酯磺化物(喜炎平)。其中所述手足口病病毒為EV71、CA16、埃可病毒，優選地，手足口病病毒為EV71、CA16，更優選地，手足口病病毒為EV71。
[0010]本發明的第二個方面提供一種防治手足口病的穿心蓮內酯類藥物組合物，所述藥物組合物包含安全、有效劑量范圍內的穿心蓮內酯類藥物和藥學上可接受的載體。其中，穿心蓮內酯類藥物的安全、有效劑量根據治療對象的年齡、體重、病情、病程、給藥途徑等具體情況來確定，6歲以下的兒童一般為5-20mg/kg.day,分一次或者多次給藥。特別地，穿心蓮內酯類藥物組合物也可以和臨床上其它藥物，例如利巴韋林、米力農等聯合使用。
[0011]優選地，所述藥物的劑型為注射劑、口服劑、吸入劑、噴霧劑、滴鼻劑。特別指出，藥學上可接受的載體取決于穿心蓮內酯類藥物的劑型，包括糖、淀粉、植物油、穩定劑等。
[0012]換言之，本發明利用EV71或/和CA16型手足口病病毒攻擊7日齡乳鼠建立了致死性動物模型，并證明炎性細胞免疫過強、獲得性免疫衰竭和以促炎因子、趨化因子等引起的細胞因子“風暴”是手足口病免疫損傷致病的主要機制，針對免疫系統的適時干預在治療手足口病病毒感染所導致的損傷中，有可能發揮重要作用。本發明利用穿心蓮內酯類藥物干預野生型乳鼠后再用手足口病病毒攻擊所述乳鼠，或者手足口病病毒攻擊乳鼠后再用穿心蓮內酯類藥物治療之，結果說明，穿心蓮內酯類藥物無論是在預防或/和治療手足口病病毒感染中均發揮了重要的保護作用，而藥物載體對照組均未發揮防治作用。因此，本發明證明了免疫損傷在手足口病病理過程中發揮重要作用，而穿心蓮內酯類藥物可以阻止或減緩手足口病病毒感染所造成的嚴重后果。
[0013]本發明的特點是提出穿心蓮內酯類藥物具有防治手足口病的作用，為發現新理論和藥物作用新靶點提供重要依據。
[0014]下面參考實施例對本發明作進一步說明。給出這些實施例只是為了舉例說明，它們不以任何方式限制本發明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0016]圖2:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內體重,繪制體重變化曲線。每組8只小鼠。
[0017]圖3:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內臨床疾病得分情況，繪制疾病得分變化曲線。每組8只小鼠。打分標準:0:健康；1:精神萎靡，活動減少；2:豎毛，弓背，共濟失調；3:消瘦，體重呈負增長；4:四肢麻痹；5:瀕死；6:死亡。
[0018]圖4:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株，
從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0019]圖5:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內體重，繪制體重變化曲線。每組8只小鼠。
[0020]圖6:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內臨床疾病得分情況，繪制疾病得分變化曲線。每組8只小鼠。打分標準:0:健康；1:精神萎靡，活動減少；2:豎毛，弓背，共濟失調；3:消瘦，體重呈負增長；4:四肢麻痹；5:瀕死；6:死亡。
[0021]圖7:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。于感染后第6天，拍攝乳鼠照片(A)，并取乳鼠肌肉組織(B)和腦組織(C)進行組織病理檢測。每組5只小鼠。
[0022]圖8:7日齡ICR乳鼠感染1.5\1081^105(|的0416型手足口病病毒耵08/07毒株后，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0023] 圖9:7日齡ICR乳鼠感染1.5 X 18TCID5tl的CA16型手足口病病毒BJ08/07毒株，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。

【具體實施方式】
[0024]下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。
[0025]下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。
[0026]實施例1:喜炎平可以預防EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0027]實驗材料:
[0028]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜(軍事醫學科學院實驗動物中心)、小鼠飼養籠(軍事醫學科學院實驗動物中心)、無菌胰島素注射器(購自美國BD公司)等。
[0029]2)主要實驗試劑:喜炎平(購自江西青峰藥業有限公司)、注射用生理鹽水(購自石家莊四藥有限公司)、消毒劑(84消毒液和75%酒精)等。
[0030]3)病毒:EV71型手足口病病毒BJ09/07株(GenBank JQ319054.1)，分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0031]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0032]實驗方法:
[0033]I)分組:喜炎平預防組、生理鹽水對照組；
[0034]2)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0035]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07株病毒液，感染病毒滴度為每只1.25X 17TCID50,每組8只乳鼠；
[0036]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0037]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡，在進行統計時不予計算在內；
[0038]6)連續觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數、體重以及臨床疾病得分情況；
[0039]7)用Graphpad Prism5軟件統計小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0040]實驗結果:
[0041]7日齡ICR乳鼠經腹腔注射喜炎平或生理鹽水至感染第5天后，感染病毒滴度為
1.25 X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、體重變化以及臨床得分結果如圖1、圖2、圖3所示。
[0042]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理鹽水的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖1)，而體重變化結果(圖2)、臨床得分結果(圖3)與死亡率結果一致。*P < 0.05
[0043]此結果說明，喜炎平可以有效預防EV71型手足口病病毒感染所導致的嚴重病情，具有預防作用。
[0044]實施例2:喜炎平可以治療EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0045]實驗材料:
[0046]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜、小鼠飼養籠、無菌注射器等。
[0047]2)主要實驗試劑:喜炎平、注射用生理鹽水對照、消毒劑等。
[0048]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0049]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0050]實驗方法:
[0051]I)分組:喜炎平治療組、生理鹽水對照組；
[0052]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.25 X 17TCID50,每組8只乳鼠；
[0053]3)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升,從感染后第4天起,每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水；
[0054]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0055]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡，在進行統計時不予計算在內；
[0056]6)連續觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數、體重以及臨床疾病得分情況；
[0057]7)用Graphpad Prism5軟件統計小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0058]實驗結果:
[0059]7日齡ICR乳鼠從感染后第4天經腹腔注射喜炎平或生理鹽水治療，感染病毒滴度為1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、體重變化以及臨床得分結果如圖4、圖5、圖6所示。
[0060]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理鹽水對照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖4)，而體重變化結果(圖5)、臨床疾病得分結果(圖6)與死亡率結果一致。*P < 0.05
[0061]此結果說明，喜炎平可以有效治療EV71型手足口病病毒感染所導致的嚴重疾病，具有治療作用。
[0062]實施例3:喜炎平可以緩解EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠腦組織、肌肉組織病理損傷
[0063]實驗材料:
[0064]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜、小鼠飼養籠、無菌注射器、小動物手術器械、組織切片機、組織包埋機、顯微鏡等。
[0065]2)主要實驗試劑:喜炎平、注射用生理鹽水對照、多聚甲醛固定液、無菌PBS、消毒劑等。
[0066]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0067]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0068]實驗方法:
[0069]I)分組:喜炎平預防組、生理鹽水對照組；
[0070]2)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0071]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.25 X 17TCID50,每組5只乳鼠；
[0072]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0073]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡；
[0074]6)感染病毒后第6天，拍攝乳鼠照片后用腹腔注射過量麻醉劑的方法致死乳鼠；
[0075]7)將乳鼠固定于小動物手術臺，移除皮膚及頭蓋骨，暴露腦，將鼠腦取出，再移除后肢皮膚，暴露后肢肌肉，將后肢肌肉取出，用無菌PBS洗去表面血液，置于4%多聚甲醛固定液中室溫固定48小時；
[0076]8)固定后的樣品由軍事醫學科學院疾病預防控制所病理實驗室進行包埋、切片、HE染色等處理；
[0077]9)病理切片置于顯微鏡下觀察，記錄。
[0078]實驗結果:
[0079]從圖7A中可見，生理鹽水對照組小鼠發生了嚴重的癱瘓現象，而喜炎平組表現正常，這也從圖7B和C(*200倍，HE染色)病理照片所顯示的一致:感染病毒滴度為
1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07后，腹腔注射生理鹽水對照的13日齡的ICR乳鼠肌肉組織(B)、腦組織(C)中出現嚴重的病理損傷。肌肉組織正常結構被破壞，肌肉組織紋理紊亂，出現肌纖維斷裂，炎性滲出、炎癥細胞浸潤等病理損傷，而腦組織中出現大量炎癥細胞浸潤，神經細胞減少；
[0080]感染相同滴度的 EV71型手足口病BJ09/07病毒后，注射喜炎平的乳鼠肌肉組織病理損傷明顯減輕(B)，無明顯的肌肉纖維斷裂，僅有輕微的炎癥細胞浸潤，并且腦組織中炎癥細胞浸潤明顯減輕(C)。
[0081]此結果說明，喜炎平可以有效減輕EV71型手足口病病毒感染所導致的嚴重免疫病理損傷，從而改善臨床癥狀及預后。
[0082]實施例4:喜炎平可以預防CA16型手足口病病毒BJ08/06株感染所致乳鼠死亡
[0083]實驗材料:
[0084]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜、小鼠飼養籠、無菌注射器等。
[0085]2)主要實驗試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0086]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07 (GenBank: JX068833)，分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0087]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠:購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0088]實驗方法:
[0089]I)分組:喜炎平預防組、生理鹽水對照組；
[0090]2)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0091]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.5 X 18TCID5tl，每組8只乳鼠；
[0092]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0093]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡，在進行統計時不予計算在內；
[0094]6)連續觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數、體重以及臨床疾病得分情況；
[0095]7)用Graphpad Prism5軟件統計小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0096]實驗結果:
[0097]7日齡ICR乳鼠經腹腔注射喜炎平或生理鹽水至感染第5天后，感染病毒滴度為
1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率結果如圖8所示。
[0098]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水對照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖8)，而體重變化結果、臨床疾病得分結果與死亡率結果一致。*P < 0.05
[0099]此結果說明，喜炎平可以有效預防CA16型手足口病病毒感染所導致的嚴重病情，具有預防作用。
[0100]實施例5:喜炎平可以治療CA16型手足口病病毒BJ08/07株感染所致乳鼠死亡
[0101]實驗材料:
[0102]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜、小鼠飼養籠、無菌注射器等。
[0103]2)主要實驗試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0104]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07
[0105]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0106]實驗方法:
[0107]1)分組:喜炎平治療組、生理鹽水對照組；
[0108]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.5 X 18TCID5tl，每組8只乳鼠；
[0109]3)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或注射用生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水；
[0110]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0111]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡，在進行統計時不予計算在內；
[0112]6)連續觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數、體重以及臨床疾病得分情況；
[0113]7)用Graphpad Prism5軟件統計小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0114]實驗結果:
[0115]7日齡ICR乳鼠從感染后第4天經腹腔注射喜炎平或注射用生理鹽水治療，感染病毒滴度為1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率結果如圖9所示。
[0116]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水對照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖9)，而體重降低結果、臨床得分結果與死亡率結果一致。*P < 0.05
[0117]此結果說明，喜炎平可以有效治療CA16型手足口病病毒感染所導致的嚴重疾病，具有治療作用。
[0118]實施例6:喜炎平可以預防或/和治療EV71型或/和CA16型手足口病病毒不同毒株感染所致乳鼠死亡
[0119]實驗材料:
[0120]I)主要實驗儀器:二級生物安全柜、小鼠飼養籠、無菌胰島素注射器等。
[0121]2)主要實驗試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0122]3)病毒:EV71型手足口病病毒TS株(GenBank JQ708210.1) ,CA16型手足口病病毒TS10/08 (GenBank: JX068829)，均分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0123]4)實驗動物:SPF級7日齡ICR乳母鼠，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。
[0124]實驗方法:
[0125]I)分組:喜炎平預防組、喜炎平治療組、生理鹽水對照組；
[0126]2)用無菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，預防組，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時，感染后每天腹腔給予喜炎平至第5天；治療組，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平；
[0127]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢，用無菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病TS株病毒液，感染病毒滴度為每只17PFU,每組8只乳鼠，或者用無菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病毒TS10/08株病毒液，感染病毒滴度為每只
2.5 X 19TCID50 ；
[0128]4)將乳鼠放置于鼠籠內，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0129]5)感染后每天15時觀察，4天內發生死亡的小鼠為非特異死亡，在進行統計時不予計算在內；
[0130]6)連續觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數、體重以及臨床疾病得分情況；
[0131]7)用Graphpad Prism5軟件統計小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0132]實驗結果:
[0133]7日齡ICR乳鼠經腹腔注射喜炎平或生理鹽水后，感染相同滴度的EV71型/CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠，而體重變化結果、臨床得分結果與死亡率結果一致。*P<0.05
[0134]此結果說明，喜炎平可以有效預防或/和治療EV71型/CA16型手足口病病毒感染所導致的嚴重病情，具有防治作用。
【權利要求】
1.穿心蓮內酯類藥物在制備治療和/或預防手足口病病毒感染的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的穿心蓮內酯類藥物，包括穿心蓮內酯及其衍生物，例如穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、穿心蓮內酯磺化物、三乙酰穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯等。
3.如權利要求1所述的穿心蓮內酯類藥物的應用，其特征在于穿心蓮內酯類藥物可以制成各種劑型應用，如注射型穿心蓮內酯磺化物、口服型穿心蓮內酯滴丸、噴霧型穿心蓮內酷等。
4.如權利要求1所述的手足口病病毒，包括71型腸道病毒(EV71)、A16型柯薩奇病毒(CA16)、埃可病毒等手足口病病毒。
5.如權利要求1所述的治療和/或預防手足口病病毒感染的穿心蓮內酯類藥物，其特征在于，該類藥物可以單獨使用，也可以與現有的防治手足口病的其他藥物聯合使用。
6.如權利要求1-5所述的治療和/或預防手足口病病毒感染的穿心蓮內酯類藥物可用于不同年齡的手足口病感染人群。
【文檔編號】A61K31/7048GK104042621SQ201310093766
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月14日 優先權日:2013年3月14日
【發明者】趙忠鵬, 王希良, 任忠義, 謝寧, 管晨, 王玉光 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 江西青峰藥業有限公司, 首都醫科大學附屬北京中醫醫院