專利名稱：地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種地錦草乙醇提取物的應用，尤其涉及地錦草提取物在制備擴血管藥物中的應用。
背景技術：
高血壓是全球性常見的心血管疾病，患病率高，相關并發癥導致的死亡率和病殘率又位于人類疾病的前列，對人類健康危害極大，給社會和家庭帶來極大的負擔[1]。據全國普查結果和我國心血管病調查報告顯示，1991年我國高血壓的發病率為11. 9%，而到2004 年發病率則上升到18. 8% ；目前我國高血壓患者已經超過1. 6億，而且還在快速增長趨勢， 給社會造成了巨大負擔。高血壓作為心腦血管事件的重要危險因素，如不合理有效的治療， 任其發展，必將導致心、腦、腎、血管等靶器官損害，引發心腦血管事件。高血壓治療的目的不僅僅是降低血壓，更重要的是保護靶器官，降低心血管病的發生率、病死率和致殘率， 改善病人生活質量，延長患者壽命。現有降血壓藥物只能緩解癥狀，且藥物依賴性較強，副作用大。而中藥毒副作用較小，且資源豐富，開發應用前景廣闊。近十年來，從天然產物中尋找新的有生理活性的成分或先導化合物以開發新藥或保健食品成了全球關注和研究的熱點；尋求新一代低毒、多靶點天然降血壓藥物資源并對其功能因子進行剖析，進而開發生產出擴血管的新藥可望成為治療高血壓、冠心病等血管性疾病的新途徑。地錦草為大戟科大戟屬地錦(Aopoi^ia Awsi/^a Willd)或斑地錦(五maculata L.)的干燥全草。歷版《中國藥典》和《本草綱目》均收載地錦草。主要化學成分為黃酮類， 如槲皮素及其單糖苷、異槲皮苷、黃芪苷等；香豆素類，有東莨菪素、傘形花內酯、澤蘭內酯； 有機酸類，有沒食子酸及棕櫚酸等。已研究證實，地錦草具有抗菌、止血、抗氧化、保肝、抑制腎功能損傷、抗腫瘤、降血壓等作用[1’ 2]。臨床實踐和實驗研究已證實，地錦草對細菌性痢疾、慢性結腸炎、腹瀉、子宮出血、支氣管出血、胃出血等具有良好的療效。但是，地錦草作為清熱解毒藥是否可以單獨用于心腦腎等血管性并發癥的治療迄今為止尚不清楚。地錦草擴血管藥物的制備與開發，將能豐富我國的新藥市場，提高人民的健康生活水平，也必將產生良好的經濟效益。

發明內容
為實現上述目的，本發明提供了中藥地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用。所述地錦草乙醇提取物在制備降低血壓藥物中的應用。所述地錦草乙醇提取物與藥用賦形劑組合制備成制劑。所述制劑的劑型為固體制劑。所述固體制劑為片劑、膠囊劑、滴丸劑中的任一種。所述膠囊劑為軟膠囊。所述制劑的給藥形式為口服給藥。
為觀察地錦草乙醇提取物對動脈的直接調節作用，本發明采用離體血管張力測定方法，以排除活體實驗中各種神經、體液因素對地錦草擴血管作用的影響。結果發現，地錦草乙醇提取物對離體主動脈環具有濃度依賴性舒張作用，該作用是由內皮依賴性NO-CGMP 途徑介導的，其機制可能通過以下3種機制發揮作用(1)激活Akt-eNOS信號通路促進內皮細胞釋放一氧化氮(NO)的機制；(2)通過鈣池操縱的Ca2+內流(store-operated Ca2+ entry, SOCE)激活eNOS來促進內皮細胞釋放NO的機制；(3)部分與血管平滑肌上大電導鈣激活鉀通道開放有關。根據以上研究發現，地錦草乙醇提取物具有內皮依賴性擴張動脈的新的藥理作用，可舒張血管平滑肌，適用于治療高血壓和冠心病等血管性疾病。本發明的潛在效果是(1)對傳統中藥地錦草的新的藥理作用進行二次開發，拓展地錦草的藥用范圍；(2)利用地錦草的擴血管作用，將地錦草乙醇提取物應用于制備治療高血壓等血管性疾病的藥物。說明書附圖


圖1為示出地錦草乙醇提取物(EEH)對苯腎上腺素(PE)預收縮的內皮完整(+Endo)和內皮去除(-Endo)主動脈環舒張反應的影響(A)及一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME和鳥苷酸環化酶抑制劑ODQ預處理后對EEH使PE預收縮內皮完整主動脈環產生的舒張反應的影響 (B)的圖表；
圖2為示出無鈣液中(A)和L型鈣通道阻斷劑diltiazem預處理后(B)EEH使PE預收縮內皮完整主動脈環產生舒張效應的影響的圖表；
圖3為示出鈣池操縱的Ca2+內流(strore-operated Ca2+ entry，S0CE)調節劑預處理后EEH對PE預收縮內皮完整主動脈環舒張功能的影響的圖表；
圖4為示出Akt信號阻斷劑wortmarmin預處理后EEH對PE預收縮內皮完整主動脈環舒張功能的影響的圖表；
圖5為示出不同鉀通道阻斷劑預處理后EEH對PE預收縮內皮完整主動脈環舒張功能的影響的圖表；
圖6為示出環氧合酶抑制劑吲哚美辛預處理后EEH對PE預收縮內皮完整主動脈環舒張功能的影響的圖表。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明詳細說明。實施例1大鼠離體主動脈環的制備 1.實驗藥物
地錦草購于山東泰安中藥材有限公司，經泰山醫學院中藥教研室鑒定；地錦草乙醇提取物(EEH)由泰山醫學院藥物研究所制備。藥材加入8倍量乙醇，回流提取2次，每次50 min,合并濾液，過濾，濃縮，冷凍干燥至干。2.實驗步驟
清潔級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重25(T300 g，由山東濟寧魯抗公司提供， 動物合格證號SCXK魯20080002。迅速游離SD大鼠胸主動脈，置于4°C含95% O2和5% CO2,混合氣體預飽和的K-H液中，剔除周圍結締組織，剪成2-3 mm長的血管環。根據實驗需要，采用棉簽磨擦血管環內表面去除內皮細胞，將部分血管環制備成去內皮的模型。將血管環懸掛于經37 °C預熱容量為5 mL K-H液的浴槽內，一端固定，一端通過張力換能器連接Medlab生物信號采集系統。 在持續通95% O2和5% CO2混合氣體的狀態下，調節其基礎張力至1. 0 g，并在37°C下穩定60 min，期間每15 min換液1次。用60 mmol .L—1 KCl刺激達峰值，然后用K-H液沖洗， 重復3次，以誘發血管環的最大收縮幅度。待血管環重新穩定后，用1 μπιο ·!/1苯腎上腺素(phenyl印hrine，ΡΕ)收縮血管環達峰值，加入1 μ mol Γ1乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)檢驗血管內皮完整性。加ACh后使PE預收縮的血管環舒張80%以上，可認為內皮完整；若加ACh后使PE預收縮的血管環不舒張或舒張10%以下，則認為內皮去除。以1 μ mol · Γ1 PE誘發最大收縮幅度為100%，以加入藥物后的血管張力幅度與PE誘發最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。實施例2地錦草乙醇提取物(EEH)對離體主動脈環舒張功能的影響根據實例1的方法，血管環穩定后觀察
(I)EEH對PE預收縮動脈環張力的影響(n = 6)
以PE (1 μ mol · L—1)預收縮血管達穩態后，采用累積加藥法，每3 min加入地錦草乙醇提取物1次，觀察累積加入EEH (0. Γ100 μ g -πιΓ1)對內皮完整和內皮去除血管環的作用。(2) L-NAME對EEH誘導的舒張反應的影響(/ = 6)
內皮完整的主動脈環用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME (10 μ mol · L—1)預處理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)觀察血管張力的變化。(3) ODQ對EEH誘導的舒張反應的影響(/ = 6)
內皮完整的主動脈環用鳥苷酸環化酶抑制劑ODQ (10 μ mol · L—1)預處理20 min后， 再用PE (1 ymol .Γ1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH觀察血管張力的變化。(4)結果
地錦草乙醇提取物呈現出內皮依賴性血管舒張作用(見圖1A)，該作用可被10 μ mol · Γ1 L-NAME和10 μ mol · Γ1 ODQ阻斷(爐<0. 01)，說明其內皮依賴性舒張血管作用是由NO-cGMP途徑介導的(見圖1B)。實施例3細胞外鈣離子內流和細胞內鈣離子釋放對EEH誘導的主動脈環舒張功能的影響
根據實例1的方法，血管環穩定后觀察
(I)EEH對無鈣液中PE預收縮動脈環張力的影響(m = 6)
在無鈣液中，以1 ymol "Γ1 PE預收縮大鼠主動脈環，采用累積加藥法，每3 min加入地錦草乙醇提取物1次，觀察不同濃度EEH (0.廣100 μ g -πιΓ1)對內皮完整血管環舒張作用的影響。(2) L-型鈣通道阻斷劑diItiazem對EEH誘導的血管舒張作用的影響(/ = 6)
內皮完整的主動脈環用L-型鈣通道阻斷劑diltiazem (10 μ mol化4)預處理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)觀察血管張力的變化。
(3)胞內鈣池操縱的Ca2+內流(SOCE)調節劑對EEH誘導的血管舒張作用的影響(/ =6)
內皮完整的主動脈環分別用SOCE激活劑thapsigargin (1 μ mol化―1)和SOCE抑制劑 GcT (10 μπιοΙ.Γ1) and 2-APB (75 μ mol .171)預處理 20 min 后，再用 PE (1 μ mol .171) 預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0.廣100 μ g · mL—1)觀察血管張力的變化。(4)結果
在無鈣液中，EEH誘導的濃度依賴性血管環舒張效應明顯被減弱(爐<0. 01)(見圖2A)。 然而，L-型鈣通道阻斷劑diltiazemdO μ mol · L—1)預處理對EEH誘導的血管環舒張無明顯影響(見圖2B)。說明在EEH誘導的血管舒張中Ca2+內流不是經過L-型鈣通道而是通過其他途徑實現的。近來的研究表明[3]，SOCE在血管舒張和激活eNOS方面發揮重要作用。 然而，Dimmeler等報道[4]，非鈣依賴性Akt_eN0S信號可激活eNOS。為證實EEH的血管舒張作用與鈣依賴性之間的關系，用SOCE調節劑觀察了其對血管舒張作用的影響。使用SOCE 激活劑thapsigargin (通過抑制肌質網/內質網Ca2+AIPase激活S0CE，an activator of SOCE via inhibition of sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase)予頁處理內皮完整血管環20 min后，發現EEH的舒張血管作用被明顯阻斷(爐<0. 01)(見圖3)。同樣，SOCE抑制劑Gd3+和2-APB也明顯阻斷EEH誘導的血管舒張作用(爐<0. 01)(見圖3)。 以上結果表明，地錦草乙醇提取物的舒張血管作用是通過激活SOCE-eNOS-cGMP信號途徑來實現的。實施例4 Akt/eNOS信號通路對EEH誘導的主動脈環舒張功能的影響
根據上述實驗結果，發現地錦草乙醇提取物是通過介導SOCE-eNOS-cGMP信號通路來發揮血管舒張作用的。然而，非鈣依賴性Akt/eNOS信號通路是否參與其中目前尚不清楚。 因此，我們對地錦草乙醇提取物誘導的血管舒張作用與Akt信號分子的關系進行了考察。 且根據實例1的方法，血管環穩定后觀察
(1)渥曼青霉素(wortmarmin)對EEH誘導的血管舒張作用的影響(/ = 6) 內皮完整的主動脈環用Akt信號阻斷劑wortmannin (100 nmol · Γ1)預處理20 min 后，再用PE (1 μ mol .L—1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0. TlOO yg-mL-1)觀察血管張力的變化。(2)結果
研究表明，生理狀態下Akt磷酸化及其下游eNOS的磷酸化是內皮細胞合成NO的重要途徑M。Dimmeler等報道[4]，非鈣依賴性Akt-eNOS信號可激活eNOS。從蛋白質水平來看，eNOS具有Akt作用底物的一般特征，并受Akt的調控。為了驗證地錦草乙醇提取物的血管舒張作用是否與非鈣依賴性Akt信號途徑有關，用Akt抑制劑觀察了其對血管舒張作用的影響。用Akt抑制劑wortmannin預處理內皮完整血管環，發現wortmannin明顯阻斷 EEH誘導的血管舒張作用(爐<0.01)(見圖4)。以上結果表明，地錦草乙醇提取物誘導的血管舒張作用是通過介導Akt-eNOS-cGMP信號途徑實現的。實施例5鉀通道對EEH誘導的主動脈環舒張作用的影響根據實例1的方法，血管環穩定后觀察
(I)EEH對鉀離子通道的影響
內皮完整血管環經鉀通道阻斷劑TEA 100 μ mol · Γ1,格列苯脲(glibenclamide) 10μ mol · L—1預處理20 min后，再用PE (1 μ mol · L—1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0.廣100 μ g · mL-1)觀察血管張力的變化。
(2)結果
血管平滑肌上主要有4種鉀通道大電導鈣激活鉀通道(BKca )；電壓依賴性鉀通道( Kv)；內向整流鉀通道(Kir) ；ATP敏感鉀通道(Katp )。是血管平滑肌上運載外向電流的優勢通道，在調節血管平滑肌舒縮和小動脈肌源性緊張方面有著重要作用，高血壓時血管平滑肌的BK。a敏感性增高，但并不引起舒張反應，而是減弱阻力血管的收縮增強趨勢；Katp 在一些血管平滑肌細胞生理狀態下基礎鉀離子電流的形成中非常重要，可能涉及到血管張力的調節，在心血管疾病時Katp的表達會發生改變te_8]，近年研究顯示鉀通道已是原發性高血壓基因治療的新靶點。本實驗結果發現，TEA和glibenclamide處理后EEH的舒張血管作用均被部分阻斷(爐< 0.01)(見圖5)。說明地錦草乙醇提取物舒張血管機制部分與血管平滑肌上大電導鈣激活鉀通道有關，而與ATP敏感鉀通道無關。
實施例6環氧合酶途徑對EEH誘導的主動脈環舒張作用的影響根據實例1的方法，血管環穩定后觀察
(1)吲哚美辛(indomethacin)對地錦草乙醇提取物誘導的血管舒張作用的影響(/ =
6)
內皮完整血管環經環氧合酶抑制劑吲哚美辛10 μ mol · L—1預處理20 min后，再用PE (1 μ mol · L-1)預收縮血管達穩態后，累計加入EEH (0.廣100 μ g · mL-1)觀察血管張力的變化。(2)結果
探討環氧合酶是否參與地錦草乙醇提取物的血管舒張作用，內皮完整的血管環用 indomethacin預處理后，發現地錦草乙醇提取物使PE預收縮的血管產生舒張的作用無明顯的變化(見圖6)。說明地錦草乙醇提取物的舒張血管作用與環氧合酶途徑無關。本發明涉及的部分參考文獻褚小蘭，范崔生.地錦類中草藥的化學成分和藥理研究概況[J].中國野生植物資源，1998，17 (2) 18 ；張仁俠，張炳盛，孫永慶，等.斑地錦降壓作用的初步研究[J].中國醫藥導報， 2009，6(34): 114-115 ；Parekh AB, Putney Jff, Jr. Store-operated calcium channels. Physiological Reviews,2005, 85， 757-810;Dimmeler S, Fleming I, Fisslthaler B, et al. Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt—dependent phosphorylation. Nature, 1999, 399, 601-605.Fulton D, Gratton JP, McCabe TJ, et al. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt. Nature, 1999，399( 10) : 597- 601.RenY, Xu X, Wang X. Altered mRNA expression of ATP-sensitive and inward rectifier potassium channel subunits in streptozotocin-induced diabetic rat heart and aorta. J Pharmacol Sci, 2003， 93 (4) : 4782483 ；[7]Chatterjee S, Al-Mehdi AB, Levitan I, et al. Shear stress increases expression of a Katp channel in rat and bovine puirnonary vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol, 2003， 285 (4): C959-C967 ；RenYJ, Xu XH, Zhong CB, et al. Hypercholesterolemia alters vascular functions and gene expression of potassium channels in rat aortic smooth muscle cells. Acta Pharmacol Sin, 2001， 22 (3): 274—278。
權利要求
1.地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于地錦草乙醇提取物在制備降低血壓藥物中的應用。
3.根據權利要求1或2所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于地錦草乙醇提取物與藥用賦形劑組合制備成制劑。
4.根據權利要求3所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于所述制劑的劑型為固體制劑。
5.根據權利要求4所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于所述固體制劑為片劑、膠囊劑、滴丸劑中的任一種。
6.根據權利要求5所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于所述膠囊劑為軟膠囊。
7.根據權利要求3所述的地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，其特征在于所述制劑的給藥形式為口服給藥。
全文摘要
本發明公開了中藥地錦草乙醇提取物在制備擴血管藥物中的應用，本發明的中藥地錦草可與藥效學允許的藥用賦形劑組合制備成制劑，制劑主要為固體制劑，主要包括片劑、膠囊劑(含軟膠囊)、滴丸劑。本發明研究證實，地錦草乙醇提取物具有濃度依賴性擴張動脈的新的藥理作用，該作用通過內皮依賴性方式產生，其機制與Akt-和SOCE-eNOS-cGMP信號途徑和部分與血管平滑肌上大電導鈣激活鉀通道開放有關。本發明利用地錦草提取物的擴血管作用，將地錦草用于不同血管性疾病的治療，拓展了傳統中藥地錦草的藥用范圍，可用于心腦血管疾病治療藥物的制備。
文檔編號A61K36/47GK102429952SQ20111040374
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者周廣海, 文今福, 王婷婷, 金松南 申請人:泰山醫學院