專利名稱：鹽酸阿比朵爾在制備抗腸道病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗病毒藥物，具體鹽酸阿比多爾在制備治療手足口病藥物中的用途。
背景技術：
手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒16型(CoxAie)最常見，以嬰幼兒和兒童發病為主。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔、臀等部位出現皮疹或皰疹為主要特征。少數患者可發生腦炎、腦膜炎、脊髓炎、周圍神經炎、急性弛緩性麻痹、心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，可因神經源性肺水腫、心肺功能衰竭而死亡。手足口病流行期間，可發生幼兒園、托兒所、學校集體感染和家庭聚集發病現象。其傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，短期即可造成較大范圍的流行，疫情控制難度大。帶毒者和輕型散發病例是流行間歇和流行期的主要傳染源。手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報道。近年來，東南亞地區手足口病發病率升高，并呈現季節性流行和全年散發趨勢。我國于1981年上海首次報道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等10幾個省(市)均有報道。2006年，全國共報告手足口病13 637例。2009 年，中國多地爆發手足口病疫情，并有353名嬰幼兒死亡。發病率較2008年遞增135. 13%， 死亡率增加180%。2010年時下，河南、山東、北京、云南、內蒙古等地又出現手足口病疫情， 且已有數例患兒死亡。衛生部公布2010年3月全國法定傳染病疫情，手足口病發病數共報道77756例，死亡數為40例，占丙類傳染病的90. 91%。報告病例仍以5歲及以下兒童為主 (占93. 96%);在實驗室確診的病例中，EV71型占75. 0%。根據手足口病病原學特點、2009年和2010年全國手足口病疫情數據分析認為，我國手足口病防控形勢比較嚴峻。手足口病疫情主要流行于農村地區，表現為分布廣、疫點多，幼兒比例大、持續時間長。手足口病傳染性強，傳播速度快，短時間內可在托幼機構、學校等人口密集的地區引起大流行，至今尚無疫苗預防也沒有特效藥物治療。因此，尋找抗該病病毒的藥物是開展手足口病防治研究的有效干預措施。鹽酸阿比朵爾(Arbidol Hydrochloride)，其化學名為6-溴-4- (二甲氨甲基)-5_羥基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-1Η-吲哚-3-羥酸乙酯鹽酸鹽-水合物，結構式為
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鹽酸阿比朵爾是非核苷類抗病毒藥物，可用于防治流行性感冒和其它急性呼吸道病毒感染，它對甲、乙型流感病毒的抗病毒活性最為顯著，該藥能抑制甲、乙型流感病毒復制的早期階段，能抑制病毒細胞漿膜的融合以及病毒與內吞囊泡之間的膜融合。同時阿比朵爾在體內還可誘導產生干擾素，對巨噬細胞的吞噬功能有顯著的活化作用，具有免疫調節作用。然而到目前為止，還沒有將鹽酸阿比多爾應用于手足口病的防治。

發明內容
本發明的目的在于提供鹽酸阿比多爾在制備抗腸道病毒藥物中的應用。本發明研究發現，鹽酸阿比多爾對腸道病毒具有明顯的抗病毒活性，尤其是引起手足口病的腸道病毒71型。進而本發明提供一種抗病毒藥物，其包括上述鹽酸阿比朵爾以及藥學上可接受的載體，其劑型可以是丸劑、片劑、膠囊或者是口服液等形式。鹽酸阿比朵爾在體外具有明顯抑制腸道病毒71型的作用。具體體現在在對病毒直接殺滅作用、抗病毒吸附作用和抑制病毒增殖作用上，其治療指數(treatment index, Tl)分別為3. 08 (直接殺傷病毒)、23.55 (阻斷病毒侵入)和2. 5 (抑制病毒增殖)。


圖1為鹽酸阿比朵爾對RD細胞的毒性實驗，左正常RD細胞；右阿比朵爾對細胞的毒性作用(lOyg/ml)。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的生化試劑為市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1鹽酸阿比朵爾對RD細胞的毒性作用
(1)根據Mosmarm建立MTT法檢測藥物的細胞毒性作用。用含有0.02% EDTA的胰酶將生長良好的細胞分散成單個細胞懸液，后用含10%小牛血清的細胞培養液將細胞調整至1 Xio5Ail的濃度分種于96孔板，每孔0.加1。置37°C， 5%C02培養箱中培養Mh。待細胞長成單層后，棄培養液上清，換含不同濃度的含藥維持液， 每孔200 μ 1。藥物的終濃度分別為62. 50、31. 25、15. 63、7. 81、3. 91 μ g/ml。每種濃度重復 4孔，實驗同時設正常細胞對照組。繼續培養4 后，用MTT法檢測細胞存活率。結果鹽酸阿比朵爾對RD細胞的毒性作用表現為細胞變圓，胞內顆粒增多，折光性變差，部分產生空泡(圖1右)等。正常RD細胞沒有這些特征(圖1左)。由于細胞代謝活性降低或死亡，MTT 法檢測到的活細胞數減少，故A值下降。且藥物對細胞的毒性作用在一定范圍內隨著藥物濃度的增加，細胞存活率降低。通過顯微鏡觀察細胞形態和MTT法測定A值，確定鹽酸阿比朵爾的 TC5tl 為 25. 86 μ g/ml。實施例2鹽酸阿比朵爾抗腸道病毒71型藥效學研究 1、鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型的直接殺傷作用
分別將50TCID5Q EV71與鹽酸阿比朵爾藥液不同濃度混合，終濃度分別為8、4、2、1、0. 5 μ g/ml，4 °C作用6h后加至已長成單層的RD細胞上，吸附2h后，棄去上清，加入細胞維持液，37°C、5%C02培養箱中繼續培養。每日觀察CPE，當病毒對照病變達+++ ++++時， 用MTT法檢測病毒抑制率。采用治療指數作為評價指標來衡量藥物對病毒的抑制效力。同時設病毒對照和細胞對照。以TI作為藥物對EV71抑制效力的評價指標，TI=TC50/IC50, TI 值越大，藥物抑制EV71的作用越強。結果病毒對照組EV71所致RD細胞的CPE表現為 細胞形態皺縮，變圓，折光性減弱，胞核圓縮和破裂，細胞最終脫落壞死。與病毒對照組相比，細胞對照組細胞形態較為正常，呈扁圓形，排列整齊且緊密。光鏡下觀察阿比朵爾抑制 EV71的CPE情況與病毒對照組相比，鹽酸阿比朵爾作用孔細胞病變隨藥物濃度大小呈梯度變化，藥物濃度最大孔CPE : +。經Probit線性回歸分析，鹽酸阿比朵爾類似物的EC 50為 12. 55士2.52 μ g/ml，治療指數TI為19. 40士2. 04 μ g/ml，TI為3. 08，表明其也具有直接滅活EV71作用。(2)鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型侵入阻斷作用
根據細胞毒性實驗結果，在藥物無毒范圍內，將已長成單層的RD細胞預先用100μ 1不同濃度藥液處理。藥液濃度分別為16、8、4、2、1μ g/ml，37°C，5%C02孵育2h后棄去藥液，每孔加入50μ1 IOOTCID5ci的RV，吸附2h，棄病毒上清，加細胞維持液，同上法培養與觀察。光鏡下觀察，藥物作用孔細胞病變效應與病毒對照組相比較輕，多數的細胞形態較為正常，阿比朵爾在一定程度上抑制了 EV71病毒感染細胞所致CPE，提示該藥對EV71感染有一定的預防作用。阿比朵爾在不同藥物濃度(μ g/ml)和病毒抑制率呈一定的劑量依賴關系，阿比朵爾EC50為16. 97士2. 4，TI為23. 55，說明阿比朵爾能夠阻斷腸道病毒71型入侵細胞。(3)鹽酸阿比朵爾對腸道病毒71型生物合成抑制作用
于已長成單層細胞的96孔板上，每孔接種50 μ 1 IOOTCID5ci的EV71，吸附2h，棄病毒上清，根據細胞毒性實驗的結果，在藥物無毒濃度范圍內，依次加入同上5個濃度梯度的含藥維持液每孔0. 2mL,同上法培養與檢查。通過光鏡下觀察，藥物作用孔細胞病變效應與病毒對照組相比很輕，多數的細胞形態正常，阿比朵爾在一定程度上抑制了 EV71病毒感染細胞所致CPE，藥物最高濃度的CPE :+，最低濃度CPE :+++。阿比朵爾類似物的EC50為 18. 28 士 1. 70，TI為2. 5。這些結果提示該藥對EV71感染細胞有抑制作用。實施例3 阿比朵爾體內抗EV71的實驗研究
40只雌性BALB/c小鼠(7-9 g)隨機分成4組①正常動物對照組，灌服生理鹽水 ’② 病毒感染模型組，病毒感染后，灌服生理鹽水；③高劑量治療組(0. Ig · kg—1 · Cf1);④低劑量治療組(0. 05g · kg—1 · cf1)。小鼠經乙醚麻醉，以15LD5Q病毒液口服感染，每只0. 05mL,正常動物對照組用生理鹽水代替病毒液口服感染。感染后2h開始灌胃給藥，每天給藥2次，每次0. lmL，連續給藥 5d。觀察15天。小鼠處死前禁食8h，摘除眼球放血脫頸椎處死動物，取腸組織置勻漿器中， 加生理鹽水，在冰浴中研磨制成勻漿，反復凍融兩次釋放病毒，離心后取上清按常規方法進行病毒滴定。觀察動物的一般表現，正常對照動物未見死亡，病毒對照動物在感染后5天開始死亡，死亡率80%，高、低劑量組動物死亡率分別為25%和50%。體內實驗結果顯示該藥對 EV-71感染小鼠有保護作用。
權利要求
1.鹽酸阿比多爾在制備抗腸道病毒藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述腸道病毒為腸道病毒71型。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述藥物鹽酸阿比多爾和藥學上可接受的載體。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述藥物的劑型為丸劑、片劑、膠囊劑或口服液。
全文摘要
本發明公開了鹽酸阿比朵爾在制備抗腸道病毒藥物中的新用途。本發明研究表明鹽酸阿比朵爾在細胞內和動物體內具有抗手足口病病毒(即腸道病毒71型)的作用，且其在病毒感染前、感染后的給藥方式抗病毒均有效。由該化合物作為抗病毒藥物在對病毒直接殺傷作用和對病毒感染細胞的阻斷預防作用上，其治療指數(treatmentindex，TI)分別為3.08(直接殺傷病毒)、23.55(阻斷病毒侵入)和2.5(抑制病毒增殖)。本發明為治療手足口病病毒感染提供了新的有效途徑，具有實際應用價值。
文檔編號A61K31/4045GK102440988SQ20111044516
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者侯煒, 凌佳馨, 劉媛媛, 劉強, 楊占秋, 熊海蓉, 王雨, 羅凡, 肖紅 申請人:武漢大學