專利名稱：一種抗tom22蛋白的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，具體而言本發明提供一種單克隆抗體，該抗體能特異識別線粒體中的Tom22蛋白；以及所述抗體在制備用于治療肝臟疾病的藥物中的應用，本發明還提供藥物組合物，其包含所述單克隆抗體作為活性成分。
背景技術：
抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑已有上百年的發展歷史。隨著基因工程抗體技術的發展和完善，抗體藥物已從鼠單克隆抗體發展到人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人源抗體。截至2010年美國FDA已批準超過40個抗體藥物。此外還有超過120種抗體藥物處于臨床研究，超過500種抗體藥物處于臨床前研究。這些抗體主要應用于自身免疫性疾病、感染性疾病以及腫瘤的治療。線粒體含有1000-2000種蛋白質，作為半自主性細胞器，其中，2%是由線粒體基因編碼;98%的蛋白是由核基因編碼的，它們經胞質核糖體合成后轉運進入線粒體，每一種蛋白在特定位置才能發揮功效，所以定向的將蛋白質轉運至線粒體的各部位十分重要。Tom復合體作為線粒體前體蛋白進入線粒體的門戶，它調節未折疊的前體蛋白通過線粒體外膜。Tom復合體包括 核心亞基Tom40、Tom22、Tom5、Tom6和Tom7,以及外周亞基Tom20和Tom70。其中hTom22、Tom20以及Tom7是線粒體前體蛋白定位到線粒體上的受體；Tom40是Tom復合體的核心組成,形成了蛋白轉運的通道(GIP) ;Tom5、Tom6和Tom7具有組裝以及穩固Tom復合體的功能。它們各司其職，實現線粒體前體蛋白的轉運。線粒體的不同前體蛋白的轉運不是一個重復的過程，具有不同的路徑，不同的機制，分別定位于外膜、內膜、基質以及膜間隙。高文祥等的“線粒體蛋白轉運的研究進展”綜述了有關轉位分子介導的線粒體蛋白轉運的研究進展，從不同復合物介導蛋白轉運角度出發敘述線粒體前體蛋白的轉運途徑:Τ0Μ- Μ23介導內膜蛋白轉運、Τ0Μ- Μ22介導內膜蛋白轉運、TOM-SAM介導外膜蛋白轉運、IMS蛋白轉運以及OXAl復合物介導蛋白向外轉運。孟紫強等的文章中簡述了線粒體前體蛋白轉運過程中的有意義部分:轉運需要的能量、分子伴侶、線粒體前體蛋白的導肽、Tom復合體、Tim復合體以及位于膜間隙的異型多亞基蛋白質復合物的作用。而楊福愉的“蛋白質跨線粒體膜的運送”一文中從轉送的目標位點出發，闡述了定位于基質蛋白質運輸途徑、定位于外膜的蛋白質運送途徑、定位于膜間隙的蛋白質運輸途徑。hTom22是線粒體外膜上轉運線粒體前體蛋白的重要組成成分。hTom22由三部分組成包括N-端、C-端以及虛擬存在的橫跨膜。hTom22 N-端暴露在細胞溶質區域，富含84個酸性氨基，包括19個負電荷域以及9個正電荷域。這一區域主要是通過靜電作用與線粒體前體蛋白帶正電荷的導肽(含有將要到達線粒體部位的信息，致使線粒體前體蛋白準確定位)結合，是線粒體前體蛋白結合的受體領域之一。對于組裝hTom22以及定位于線粒體外膜上hTom22正電荷域發揮著重要的作用，但是Court DA等提出hTom22的負電荷域卻不是必需的成分，也不是線粒體前體蛋白的結合以及轉運的必要成分。T0M22 N-端的轉移膜螺旋束縛著Tom40的兩個亞基，這樣的作用并不影響線粒體前體蛋白的前序列。hTom22C-端即IMS功能域暴露在膜間隙區域具有將自身組裝成Tom復合體以及轉運前體蛋白的作用，但是對于前體蛋白的定位以及結合不是必需的組成部分。hTom22的MS功能域對于T0M22-TIM23前體蛋白三聚物的穩定性是必需的。hTom22的MS功能域和Tim23 N-末端50個氨基酸殘基的片段可以促使前體蛋白由TOM復合物轉運至 Μ23復合物。DEBORAH A.COURT通過中斷方法使N.crassa的基因失活，使用遺傳學的方法分析特定突變的等位基因。通過實驗產生了 2種hTom22突變蛋白(缺乏2/3或者整個IMS)，發現hTom22的MS域不是hTom22組裝成Tom復合體必須的組成部分,也不是線粒體前體蛋白的轉運到線粒體的至關重要的組分，但是對于反式結合位點識別的前體蛋白的轉運具有提高效率的作用。hTom22的IMS可以方便的將線粒體前體蛋白釋放到線粒體外膜的脂質雙分子中或是IMS，也是Tom復合體與線粒體內膜的接口。肝是人體內十分重要的器官，俗稱“化工廠”，具有解毒以及代謝產物的作用。在Silvia Curado等的實驗中，他們提出了 T0MM22突變體為肝再生提供了模型，是一個重要的脊椎動物的遺傳模型，用來研究線粒體生物學和線粒體肝疾病。奧利弗突變體tom22s469在內胚層器官中高度的表達(如肝臟、腸)，是肝臟的特異性表型。他們在實驗中使用tom22mo誘導肝細胞的凋亡以及嗎啉反義寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表達。當使用tom22mo處理肝時誘發肝細胞的凋亡，肝細胞中出現奧利弗突變體tom22s469。用嗎啉反義寡核苷酸的方法抑制T0MM22基因的表達，使T0MM22基因瞬時中斷。當T0MM22出現中斷表達時，就會在tom22s469中出現肝細胞特異性再生表型并且可以達到野生水平并且在T0MM22恢復之時已經完成肝細胞的再生。T0MM22基因的臨時中斷對于成熟的肝細胞無影響。因此，我們可以發現，抑制T0MM22基因的表達或者抑制tom22蛋白的功能將有助于肝細胞和肝臟的再生恢復，本發明就是基于這個規律，篩選特異識別人源tom22蛋白的抗體，再運用該抗體來中和tom22蛋白的功能，從而為各種肝臟疾病患者的肝細胞再生提供一種新的治療藥物。

本發明的特色是運用重組表達的tom22蛋白膜外區直接在非免疫鼠源ScFv噬菌體表面呈現表達庫中篩選。本發明提供的單克隆抗體命名為HX1，經過檢測單克隆抗體對特異性識別結合tom22蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體可與Tom22蛋白特異性結合，從而可以用于制備治療肝病的藥物。具體地，本發明提供以下:
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區由120個氨基酸殘基組成，序列如
下:Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lyslie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys GlnAla Leu Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro ThrTyr Val Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Asp Thr Thr AlaTyr Leu Gln lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg AspGly Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala LysThr
編碼重鏈可變區的cDNA序列為:
gaggtgaagcttgaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctggatataccttcagaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctctaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaacatatgttgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgacaccactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacgcggctacatatttctgtgtaagagatggttcttatggtatggactactggggtcaaggaactccagtcaccgtctcctcagccaaaacg
其輕鏈可變區由108個氨 基酸殘基組成，序列如下:
Thr Leu Cys Ser Pro Ser Leu Gln Gln He Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr He His Trp Tyr Gln Gln Lys SerGly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Val Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Asn Thr Met Glu AlaGlu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Ser Pro He Thr Phe GlyGly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg
編碼輕鏈可變區的cDNA序列為:
acattgtgctcacccagtctccagcaaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatacactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatgggtttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcaacaccatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaagtcacccatcacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg
2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區序列是與以上I和2所述的可變區的序列是一致的；該基因工程抗體可以是:人一鼠嵌合抗體(chimericantibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshapedantibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(single chain FVfragment, SCFv);或者是重鏈可變區和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ;或者是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。4.如權利要求書1-2所述的單克隆抗體或權利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結合能力。5.如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結合能力，并廣泛用于肝臟疾病的治療
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。7.如權利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種肝臟疾病。附圖表說明:

圖1.與恒定區連接后表達的全長HXl抗體的12% SDS-PAGE檢測。泳道1_4為經DTT還原后的HXl抗體重鏈和輕鏈；泳道5為蛋白標準分子量參考；泳道6-7為未還原的全長HXl抗體。
具體實施例方式為了更全面地理解和應用本發明，下文將參考實施例和附圖詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的范圍。本發明的范圍由后附的權利要求具體限定。實施例一、人源Tom22蛋白的重鉬表汰和鈍化
設計引物(Primerl: 5，G ATAT CC ATG GCT GCC GCC GTC G 和Primer2:5，GATACTCGA GCTATG CCC TGG A AA ACC TG)從人肝細胞cDNA中通過PCR擴增(PCR主要反應條件:94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸35秒；共30個循環)，得到的目的片段經NcoI/XhoI雙酶切后連接到表達載體pHAT2的Ncol/Xhol位點之間，篩選陽性克隆后，經測序發現得到的序列與理論序列完全一致:
ATGGCTGCCGCCGTCGCTGCTGCCGGTGCAGGGGAACCCCAGTCCCCGGACGAATTGCTCCCGAAAGGCGACGCGGAGAAGCCTGAGGAGGAGCTGGAGGAGGACGACGATGAGGAGCTAGATGAGACCCTGTCGGAGAGACTATGGGGCCTGACGGAGATGTTTCCGGAGAGGGTCCGGTCCGCGGCCGGAGCCACTTTTGATCTTTCCCTCTTTGTGGCTCAGAAAATGTACAGGTTTTCCAGGGCA ；
其編碼的氨基酸序列為:
MAAAVAAAGAGEPQSPDELLPKGDAEKPEEELEEDDDEELDETLSERLWGLTEMFPERVRSAAGATFDLSLFV
AQKMYRFSRA
得到的重組質粒pHAT2-tom22轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，從該轉化平板上挑單克隆于IOml新鮮培養基(含100ug/ml的氨芐青霉素)中37°C培養過夜；將過夜的IOml菌液轉入IL新鮮培養基(含100ug/ml的氨芐青霉素)于37°C培養4小時后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導目的蛋白的表達，誘導6小時；于4°C 6000rpm離心收集菌體沉淀。將得到的菌體沉淀用60ml裂解緩沖液(25mM Tris，pH8, 500mM NaCl)重懸后，超聲裂解細菌；15000rpm離心30分鐘(4°C )，收集上清，加入到經裂解緩沖液平衡好的Iml的N1-NTA填料中，上樣速度30ml/小時；再用裂解緩沖液清洗非親和結合的吸附蛋白；然后用 IOml 洗脫緩沖液(25mM Tris, pH8, 500mM NaCl,200mM imidazole)將目的蛋白洗脫下來，15%SDS-PAGE電泳分析純化結果。純化的蛋白脫鹽換到PBS緩沖體系中，_80°C凍存備用。實施例二、Panning篩選
噬菌體表面呈現文庫是專利申請者之前構建的一個非免疫鼠源ScFv表達庫。本專利就是從該文庫中篩選能特異識別Tom22蛋白的抗體。用Tom22蛋白抗原包被塑料培養皿后，將重組噬菌體上清傾至其上，37°C培養2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后將培養至對數生長期的TGl傾至免疫吸附后的培養皿上，37°C培養I小時。如此“吸附一洗脫一繁殖”的過程即為Panning篩選，再以M13K07超感染，就可生成富集克隆的噬菌體表面呈現文庫。以后按上述方法進行7輪篩選。
實施例三、單個重組噬菌體克隆的抗原結合活性的鑒定
1.制備單克隆重組噬菌體
Panning篩選后，將TGI茵液按原液；1:10 ;1:100 ；1:1000 4個稀釋度稀釋，鋪于SOBAG瓊脂板上，3 (TC倒置培養過夜。挑選90個單菌落，分別接種于100 u I的2XYTAG中，30°C培養過夜，取20u I培養物，加入200u I含5X10pfu/ml M13K07的2XYTAG中，37°C振蕩培養2h，離心，用2XYTAK 200u I重懸沉淀，30°C培養過夜.離心后的上清即為單個重組噬菌體。2.ELISA 檢測抗原結合活性(Douillard , et al., Enzyme-linkedImmunosorbent Assay for Screening monoclonal antibody production usingenzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74, 1983)
設I個陰性對照孔，I個陽性對照孔，90個待測孔。100 u 10.5% BSA包被陰性對照孔，100 u I羊抗M13噬菌體抗體包被陽性對照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待測孔。1%BSA 3 7°C封閉I小時。對照孔加M I 3噬菌體，待測孔加5 O u I待測上清與5 O u I封閉液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 uI工作濃度的HRP/羊抗M13噬茵體抗體，37 V反應I小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在 4 I O n m 測每孔 OD 值。
實施例四、陽性克隆的ScFv基因序列測定，真核表達和純化
選擇篩選獲得的陽性克隆分別送公司進行DNA測序。設計引物將陽性克隆的輕重鏈可變區與鼠源IgG的對應的輕重鏈恒定區連接后插入到真核表達；然后分別轉染CHO細胞篩選穩定表達株。取Iml的ProteinG-sepharose FF介質到柱子中，經PBS平衡后，將收集的細胞培養上清經ProteinG-sepharose FF柱子純化，然后用PBS清洗50柱體積后，用IOOmMGlycine (pH3)將目的蛋白洗脫到IM Tris, pH8.5平衡液中。在分別透析到PBS緩沖液中。10%SDS-PAGE鑒定純化得到的抗體純品。
實施例五、抗體的活性鑒定
設I個陰性對照孔，I個陽性對照孔，4個待測孔。IOOul 10.5% BSA包被陰性對照孔，100 u I羊抗鼠抗體包被 陽性對照孔，100 u I/孔(10 u g/ml) Tom22蛋白抗原包被待測孔。1%BSA 3 7°C封閉I小時。對照孔加IgG，待測孔加5 O u I待測抗體與5 O u I封閉液的混合物，3 7°C孵育I h。用P B S T洗板3次，各孔加100 u I工作濃度的HRP/羊抗鼠抗體，37°C反應I小時。PBST洗板4次，加新鮮配制的H202-ABTS，在4 I O n m測每孔OD值。結果發現一株抗體與抗原有很強的反應。命名為HX1。
參考文獻
Curado S et al.The mitochondrial import gene tomm22 is specificallyrequired for hepatocyte survival and provides a liver regeneration model.DisModel Mechj 2010，3(7-8): 486 - 495
Shiota T et al.1n vivo protein-1nteraction mapping of a mitochondrialtranslocator protein Tom22 at work.PNASj 2011， 108(37): 15179-15183
Pusnik M et al.Mitochondrial Preprotein Translocase of Trypanosomatids Hasa Bacterial Origin.Curr Biol, 2011， 21(20): 1738-43
Poynor M， Eckert R and Nussberger S.Dynamics of the PreproteinTranslocation Channel of the Outer Membrane of Mitochondria.BiophysicalJournal, 2008，95: 1511 - 1522.Court DA et al.Role of the Negative Charges in the Cytosolic Domain ofT0M22 in the Import of Precursor Proteins into Mitochondria.Mol Cell Biol,1998，18(6): 3173 - 3181
Yano M.et al.1dentification and Functional Analysis of Human Tom22 forProtein Import into Mitochondria.Mol Cell Bioj 2000，20(19): 7205 - 7213
Deborah A.et al .Role of the Intermembrane-Space Domain of the PreproteinReceptor Tom22 in Protein Import into Mitochondria.Molecular And CellularBiology, 1996，16(8): 4035 - 4042
Moczko M et al.The intermembrane space domain of mitochondrial Tom22functions as a trans binding site for preproteins with N—terminal targetingsequences.Mol Cell Biol, 1997，17(11): 6574 - 6584
Bellot G et al.T0M22， a core component of the mitochondria outer membraneprotein translocation pore,is a mitochondrial receptor for the proapoptoticproteinCell death and differentiation.2007， 14(4): 1-10
Yamano K et al.Tom20 and Tom22 Share the Common Signal Recognition Pathwayin Mitochondrial Protein Import.J Biol Chemj 2008， 283(7): 3799-3807
Anandatheerthavarada HKj Sepuri NB, Avadhani NG.Mitochondrial Targeting ofCytochrome P450 Proteins Containing NH2_terminal Chimeric Signals Involves anUnusual T0M20/T0M22 Bypass Mechanism.J Biol Chemj 2009，284(25): 17352 - 17363Mager F.et al.LILBID—mass spectrometry of the mitochondrial preproteintranslocase TOM.Journal of Physics Condensed Matter, 2010， 22(45):454131-454132
Rammohanj K.W.，H.F.McFarland, W.J.Bellini, J.Gheuensj and D.E.McFarlinj 1983， Antibody-mediated modification of encephalitis induced byhamster neurotropic measles virus, J.1nfect.Dis., 147(3): 546-550.Douillard ，et al.， Enzyme-1 inked Immunosorbent Assay for Screeningmonoclonal antibody production using enzyme-labeled second antibody, Meth.Enzymol,.92:168-74，198權利要求
1.一種單克隆抗體，其特征在于，它的重鏈可變區由120個氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:1所顯示；其輕鏈可變區由108個氨基酸殘基組成，序列如SEQ ID NO:2所顯/Jn ο
2.一種單克隆抗體，其特征在于，它的序列與權利要求書I所述的單克隆抗體的氨基酸序列有90%或90%以上的序列同源性。
3.一種基因工程抗體，其特征在于，它所含有的重鏈和輕鏈可變區序列是與權利要求書I和2所述的可變區的序列是一致的；該基因工程抗體可以是:人一鼠嵌合抗體(chimeric antibodies);或者是人源化抗體(humanized antibody, HAb)或改形抗體(Reshaped antibody, RAb);或者是抗體的功能性片段Fab ;或者是單鏈抗體(singlechain FV fragment, SCFv);或者是重鏈可變區和完整輕鏈的融合的抗體功能性片段VH-L ；或者是重鏈和輕鏈的一個或多個CDR的排列、串聯或組合而成的抗體功能性片段；或者是上述抗體或抗體功能片段和其他各種蛋白或多肽進行連接、拼接、融合而得到的類抗體的功能性的融合蛋白。
4.如權利要求書1-2所述的單克隆抗體或權利要求書3所述的基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體 中的Tom22蛋白具有特異的結合能力。
5.如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體，其特征在于，它與線粒體中的Tom22蛋白具有特異的結合能力，并廣泛用于肝臟疾病的治療。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有如權利要求書1-4所述的單克隆抗體或基因工程抗體；以及藥學上可接收的載體或緩沖液或添加劑或賦形劑。
7.如權利要求書6所述的藥物組合物，其特征在于，它可用于治療各種肝臟疾病。
全文摘要
本發明提供了一種能特異性結合線粒體Tom22蛋白的單克隆抗體及其在治療肝病中的功用。該單克隆抗體穩定性好、特異性強。本發明提供了該抗體的可變區序列。本發明還提供了一種藥物組合物。
文檔編號A61P1/16GK103183737SQ20111044498
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者安祺 申請人:北京和信非凡生物技術有限公司