專利名稱：熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法。
背景技術：
腦惡性膠質瘤是中樞神經系統原發性惡性腫瘤中最常見的腫瘤。因生長速度快且沿神經纖維浸潤性生長，致使手術難以完全切除；同時對化療和放療僅為中度敏感。因此，目前現有的國際公認的常規手術、放療、化療的序貫治療方案，難以根治腦惡性膠質瘤。 免疫治療是通過調整、提高機體免疫系統功能，清除殘留的腫瘤細胞，達到真正的治愈的目的。目前，以DC為基礎的細胞疫苗治療是一種主動免疫治療，正成為研究的熱點。DC是體內最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell APC)，其抗原提呈能力可為其他提呈細胞的數百倍，能有效刺激靜息的T細胞誘發初次免疫應答，其在T細胞對腫瘤抗原的識別過程中起著重要的作用，DC能通過血腦屏障進入靶向區，從而發揮特異性抗腫瘤效應。DC 的體外培養在目前已經是一項常用的生物治療技術，國內外動物和臨床試驗研究的常用方法可分為四類1)特異性腫瘤抗原肽負載DC。腫瘤抗原肽可以通過人工合成、弱酸洗脫腫瘤表面的MHC-I類抗原肽獲得；2)腫瘤細胞抗原負載DC。利用超聲波破碎、反復凍融或放射線輻照腫瘤細胞等方法獲取腫瘤細胞性抗原，然后致敏DC制備的疫苗；幻腫瘤細胞-DC 融合體疫苗。DC與腫瘤細胞融合后的雜交細胞可獲得雙親本細胞的表型特性；4)腫瘤細胞 RNA或cDNA負載DC。如何選擇一種高效、安全的DC疫苗制備法是主動細胞免疫治療成敗的關鍵，對于臨床推廣價值意義重大。本方法屬于第二類，先將腫瘤細胞處于熱休克狀態， 誘導細胞高表達熱休克蛋白(heat shock proteins HSP)，再用化學藥物誘導細胞凋亡進而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細胞混合培養制備成熟的DC疫苗。

發明內容
為實現本發明的目的，本發明的熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法采用先將腫瘤細胞處于熱休克狀態，誘導細胞高表達熱休克蛋白(HSP)，再用化學藥物誘導細胞凋亡進而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細胞抗原，制備好的抗原與未成熟的 DC細胞混合培養獲得成熟的DC疫苗。熱休克腦膠質瘤細胞負載的DC疫苗具有較好的凋亡率，經流式細胞術檢測，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公認標志HLA-DR+CDl Ic+的平均值為90. 90%, DC的成熟標志⑶Ilc+⑶86+的平均值為73. 03%，⑶llc+CD83+的平均值為 86. 04%，高表達⑶83、⑶86。顯示采用熱休克法負載制備得到的DC疫苗成熟度高，可用于誘導免疫應答。具體的，所述的方法包括如下步驟Si.熱休克凋亡腦膠質瘤細胞的制備和檢測人腦膠質瘤細胞株U251引自美國ATCC，按常規方法傳代培養。用RPMI 1640培養基調整細胞濃度至106/ml，將細胞置于40°C，5% CO2培養箱中池，取出細胞培養瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細胞培養瓶移至37°C，5% CO2培養箱繼續培養誘導細胞凋亡。收獲凋亡細胞，加入無菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細胞抗原。腫瘤細胞經40°C處理汕后用FITC-Armexin-V和PI雙標細胞后進行流式檢測計
算凋亡率結果。軟瓊脂克隆法檢測細胞抗原體外成瘤能力，結果顯示凋亡細胞中無腫瘤細胞克隆生長；內毒素檢測按《中華人民共和國藥典》2005版第三部規定的方法進行；取制備抗原進行內毒素檢測。S2. DC腫瘤疫苗的制備和檢測采集3個自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上運輸至實驗室，2，0001~/1^11，101^11，201獲得血細胞，稀釋2倍后，Ficoll分離法分離血細胞獲取一次新鮮的外周血單個核細胞。用培養基重懸新鮮制備的PBMC后鋪于六孔細胞培養板中，放置于37°C，5% CO2培養箱中90min后，洗去未貼壁細胞，于培養板內加入含lOOng/mL GM-CSF, 50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培養基，第3d進行換液，第5d收獲未成熟DC (imDC)，加入凋亡腫瘤細胞抗原(DC與靶細胞抗原的比例為3 1)，至371，5%0)2培養箱共同培育 48h，收獲DC細胞，苔盼藍染色進行細胞計數與表型檢測。


通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法的步驟流程示意圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發明的熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法的步驟流程示意圖，所述實施例的具體步驟如下Si.熱休克凋亡腦膠質瘤細胞的制備和檢測人腦膠質瘤細胞株U251引自美國ATCC，按常規方法傳代培養。用RPMI1640培養基調整細胞濃度至106/ml，將細胞置于40°C，5% CO2培養箱中池，取出細胞培養瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細胞培養瓶移至37°C，5% CO2培養箱繼續培養誘導細胞凋亡。收獲凋亡細胞，加入無菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細胞抗原。腫瘤細胞經40°C處理汕后用FITC-Armexin-V和PI雙標細胞后進行流式檢測計算凋亡率結果顯示，凋亡率平均值為66. 23%。軟瓊脂克隆法檢測細胞抗原體外成瘤能力，結果顯示凋亡細胞中無腫瘤細胞克隆生長。內毒素檢測按《中華人民共和國藥典》2005版第三部規定的方法進行。取制備抗原進行內毒素檢測。S2. DC腫瘤疫苗的制備和檢測采集3個自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上運輸至實驗室，2，0001~/1^11，101^11，201獲得血細胞，稀釋2倍后，Ficoll分離法分離血細胞獲取一次新鮮的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)。用 RPMI 1640 培養基重懸新鮮制備的PBMC后鋪于六孔細胞培養板中，放置于37°C，5% CO2培養箱中90min 后，洗去未貼壁細胞，于培養板內加入含100ng/mL GM-CSF，50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培養基，第3d進行換液，第5d收獲未成熟DC(imDC)，加入凋亡腫瘤細胞抗原(DC與靶細胞抗原的比例為3 1)，至37°0，5%0)2培養箱共同培育48h，收獲DC細胞，苔盼藍染色進行細胞計數與表型檢測。進行流式檢測HLA-DR+CDllc+、⑶llc+CD86+、⑶Ilc+⑶83+。經流式細胞儀FACS分析顯示，DC的公認標志HLA-DR+⑶Ilc+的平均值凋亡組為90. 90%, DC的成熟標志⑶Ilc+⑶83+的平均值凋亡組為73. 03%,DC的成熟標志⑶llc+CD86+的平均值凋亡組為86. 04%。本研究方法采用先將腫瘤細胞處于熱休克狀態，誘導細胞高表達熱休克蛋白 (HSP)，再用化學藥物誘導細胞凋亡進而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細胞混合培養獲得成熟的DC疫苗。熱休克腦膠質瘤細胞負載的DC疫苗具有較好的凋亡率，經流式細胞術檢測，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公認標志HLA-DR+CDlIc+的平均值為90. 90%, DC的成熟標志CDllc+CD86+的平均值為73. 03%, ⑶llc+CD83+的平均值為86. 04%，高表達⑶83、⑶86。顯示采用熱休克法負載制備得到的 DC疫苗成熟度高，可用于誘導免疫應答。本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
權利要求
1. 一種熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其包括如下步驟.51.熱休克凋亡腦膠質瘤細胞的制備和檢測，包括采用的人腦膠質瘤細胞株U251引自美國ATCC，按常規方法傳代培養；用RPMI1640培養基調整細胞濃度至106/ml，將細胞置于40°C，5% CO2培養箱中池，取出細胞培養瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細胞培養瓶移至37°C，5% CO2培養箱繼續培養誘導細胞凋亡；收獲凋亡細胞，加入無菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細胞抗原；腫瘤細胞經40°C處理池后用FITC-Armexin-V和PI雙標細胞后進行流式檢測計算凋亡率結果；軟瓊脂克隆法檢測細胞抗原體外成瘤能力；取制備抗原進行內毒素檢測；.52.DC腫瘤疫苗的制備和檢測，包括采集人體外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上運輸至實驗室，2，OOOr/ min，10min，2(TC獲得血細胞，稀釋2倍后，Ficoll分離法分離血細胞獲取一次新鮮的外周血單個核細胞；用RPMI 1640培養基重懸新鮮制備的PBMC后鋪于六孔細胞培養板中，放置于37°C， 5% CO2培養箱中90min后，洗去未貼壁細胞，于培養板內加入含lOOng/mL GM-CSF, 50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培養基，第3d進行換液，第5d收獲未成熟DC (imDC)，加入凋亡腫瘤細胞抗原，至37°C，5% CO2培養箱共同培育48h，收獲DC細胞，苔盼藍染色進行細胞計數與表型檢測；進行流式檢測 HLA-DR+CDl 1 c+、CDllc+CD86+、CDllc+CD83+。
全文摘要
本發明提出一種熱休克凋亡腦膠質瘤負載樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，所述法采用先將腫瘤細胞處于熱休克狀態，誘導細胞高表達熱休克蛋白(HSP)，再用化學藥物誘導細胞凋亡進而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細胞混合培養獲得成熟的DC疫苗。熱休克腦膠質瘤細胞負載的DC疫苗具有較好的凋亡率，經流式細胞術檢測，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公認標志HLA-DR+CD11c+的平均值為90.90％，DC的成熟標志CD11c+CD86+的平均值為73.03％，CD11c+CD83+的平均值為86.04％，高表達CD83、CD86。顯示采用熱休克法負載制備得到的DC疫苗成熟度高，可用于誘導免疫應答。
文檔編號A61P35/00GK102552891SQ20111044780
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者陸華 申請人:陸華