專利名稱：Bmp2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腦膠質瘤治療領域，具體涉及一種BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用。
背景技術：
腦腫瘤的發病率為21/10萬人，約占人類所有癌癥的2%，其中腦膠質瘤的發病率約占腦腫瘤的60%。在1996年第三屆(悉尼)國際腫瘤控制大會總結的資料中統計，腦膠質瘤的發病率為3 10/10萬，占全身惡性腫瘤的1% 3%，我國每年新發腦瘤病人大約有4萬人。手術加放化療的平均生存期僅為8 11個月至今我國還沒有腦膠質瘤大宗病例的長期追蹤隨訪資料。由于腦膠質瘤的惡性程度高，轉移快，復發率高，致殘致死率高，目前缺乏有效的治療手段。因此急待一種切實可行的治療方法。
目前國內外尚沒有治療腦膠質瘤的有效手段,基本以外科手術與化療為主,但效果不理想，復發率高。其中化療的的毒副作用大，病人反應強烈。本研究擬采用的BMP2/7誘導腦膠質瘤干細胞分化的方法是一種無毒的治療手段，在不增加病人痛苦的前提下，能夠有效緩解病人的痛苦，因此具有很高的臨床價值。本專利發明人采用柔性連接技術自行研制開發的BMP2/7的異源二聚體結構類似物與同類其它BMPs藥物相比，具有超群的生物活性，與膠原海綿復合后構成新型的BMP緩釋系統，能夠明顯增加局部的藥物濃度，提高藥效水平。將該緩釋系統植入腦組織，可以解決腦膠質瘤治療時藥物難以通過血腦屏障以及局部藥物濃度較低的困難，提高藥物的作用時間。同時，副反應小，毒性低，將成為良好的新型抗膠質瘤藥物。采用柔性連接技術表達BMP-2/7異源二聚體結構類似物1990年，Sampath等人從牛脫礦骨粉分離到一種蛋白，分子量約30，000左右，體內與體外都有明顯的骨生成作用。還原型SDS-PAGE電泳則發現該蛋白由兩個亞基組成，分別為18，000與16，000左右，經脫糖基處理后，分子量為16，000與14，000，測序后發現前者為BMP-7，后者為BMP-2，均為糖蛋白，但糖基化對二者的活性沒有影響。表明天然狀況下，就有BMP-2/7異源二聚體的存在。此后，獲得BMP-2專利的Genetics Institute公司的研究人員發現，BMP-2/7異源二聚體的活性明顯高于BMP-2與BMP-7的同源二聚體，體外實驗的結果為20倍左右，體內實驗為5-10倍。Wang等人發現，天然組織提取的BMP的誘骨活性比rhBMP2高10倍。Aki Aono等人的研究表明BMP-4/7異源二聚體也具有相同的情況，并猜測體內組織中BMP主要以異源二聚體的形式存在。雖然這一現象尚缺乏明確的理論依據，但許多研究者已將目標集中在此方面的工作上。根據以上的結果，本專利發明人通過基因重組的方式將BMP-2與BMP-7的碳端用一段柔性肽(GlyGlyGlyGlySer)4串連起來,并在Pichia Pastoris中得到異源二聚體的高效表達。柔性肽只有Gly與Ser兩種氨基酸，因為側鏈基團影響小，所以肽鍵的剛性很小，可以自由旋轉，有極強的柔順性，不會阻礙兩側肽鏈的自由折疊，又稱柔性連接技術，運用很廣。目前十分流行的人源化單抗ScFv，即是通過柔性肽的方式獲得表達的。好處表現在下述方面I.提高異源二聚體的產量與共表達BMP-2和BMP-7，在內質網中正確折疊，分泌到培養基中進行隨機配對形成二聚體的方法相比，將二者用一段柔性肽共價連接起來表達可以得到均一型的異源二聚體，減少同源二聚體雜質，提高了產率，降低了純化成本。2.提高重組蛋白的可溶性BMP單體有較多的疏水性氨基酸，但由于缺乏一個疏水中心，而將疏水集團暴露在單體分子表面，因此分子之間特別容易聚集，形成沉淀。將二者共價串連，可以減少單體之間的空間距離，使得二聚體更易發生，可溶性增加。3.有利于正確構象的形成活性形式的異源二聚體具有七對二硫鍵，其中一個是在分子之間形成的。串連起來的單體由于分子間的距離更加接近，更利于分子間二硫鍵的形成。4.活性有所提高由于BMP-2與BMP-7的協同作用，異源二聚體的比活比同源二聚體提高十幾倍。 5.具有自主知識產權這種新型的BMP由三部分組成，BMP_2、7和一段柔性肽，共同組成了一個完整的分子，我們把它叫做結構類似物，是一種有別于BMP2/7的新型分子，國內外均無報道。因此不會有知識產權的糾紛。應用共價結合肝素的膠原作為BMP的載體，這種設計方案國內外均未見報道理想的載體應該具有①生物相容性，使宿主不發生或僅發生輕微的炎癥反應，使骨誘導的干擾因素最小化；②生物降解性，在體內以水解的方式降解，產生天然的中間代謝產物排出體外；③可吸收性，使殘余載體對于骨修復生物機制特性的影響最小化。膠厘縣査原有良好的組織相容性和可吸收性，用膠原作為BMP的載體，可避免復合材料的移動，防止被過快吸收，具有緩釋作用。另外，膠原中含有一些生長因子，可以協同促進BMP的成骨作用。從牛腱重組的可吸收性的膠原海綿體和從牛骨提取的鹽酸胍來源的膠原基質，分別作為BMP-2和BMP-7的載體已經得到應用。本專利發明人將BMP的緩沖溶液直接涂布在膠原的表面，雖然可以得到較好的釋放動力學模式，但仍不足以維持足夠的時間來誘導成骨活動，如果使用化學方法增加BMP與膠原的親和力，使細胞因子的釋放維持更長的時間應該是一種理想的選擇。考慮到BMP分子上存在的肝素親和域，我們將肝素通過共價鍵固定存膠原表面，便可以實現BMP與載體的有效結合。同時，肝素的存在，對維持BMP的結構，防止BMP的降解具有十分重要的作甩。通過調整結合肝素的BMP數量，獲得了“二階段”釋放動力學模式，讓游離的BMP以“爆發”方式進行釋放，以形成誘導骨祖細胞的趨化環境，結合BMP以“緩釋”方式進行釋放，并維持較長時間，以維持局部的高濃度環境。作用機理不依賴于細胞毒性作用，降低了毒副作用，提高治療耐受性BMP2/7能夠直接靶向腦組織的腫瘤干細胞，促進其分化，抑制其生長，有別于傳統的化療藥物廣泛的細胞毒性作用，副作用低，損傷小。如果配合傳統的治療手段，如放療與化療，能夠在不同的水平，不同的途徑發揮作用，增加了消除腫瘤細胞的可能性。

發明內容
本發明的目的是提供BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用。為實現上述目的，本發明的BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用，其中BMP2/7的載體采用肝素化膠原蛋白。所述的肝素化膠原蛋白的制作步驟如下膠原蛋白的交聯取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) 100ml (PH5. O)。室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時。膠原蛋白的肝素化交聯的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按
I 0.6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2 %(w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。IOmin后，按每克膠原蛋白188. 3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時后，分別用O. IM的Na2HP04，4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。
本發明的BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用，其中采用柔性連接技術表達BMP2/7異源二聚體類似物。柔性連接技術參考本發明人的專利“一種BMP2/7異源二聚體結構類似物及其表達方法與應用”，專利200610034620. 2。將BMP2/7異源二聚體與肝素化膠原蛋白結合制成BMP2/7緩釋系統，結合步驟為將直徑IOmm的肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后滴入O. 25ml的BMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次。通過構建大鼠顱內荷瘤模型，在瘤體內注射BMP2/7緩釋載體，表明BMP2/7緩釋載體能夠明顯抑制腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果；BMP2/7緩釋載體能夠協同化療藥物抑制腫瘤的生長；緩釋系統不但提高了靶區腦組織的藥物濃度，同時降低了非靶區組織的濃度，避免藥物的毒副作用；所有大鼠均未發生明顯行為改變和神經功能缺陷，未出現全身或者局部毒性反應，表明BMP2/7緩釋載體的生物相容性良好。通過構建裸鼠顱內移植瘤模型，BMP2/7緩釋系統單獨作用能部分抑制腫瘤組織的形成，腫瘤組織對化療藥物不夠敏感，而兩者卻又明顯的協同作用，充分證明BMP2/7治療腦膠質瘤的潛在價值。通過構建裸鼠皮下移植U251膠質瘤模型，BMP2/7能夠協同化療藥物顯著抑制裸鼠皮下瘤的生長。綜上所述，本發明通過BMP2/7緩釋載體的大鼠荷瘤實驗、裸鼠顱內移植瘤實驗、裸鼠皮下移植瘤實驗，進行了 BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動力學特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究，闡明了采用復合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質瘤的局部可以形成高濃度的給藥環境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質瘤的增殖，促進其分化，如果配合傳統的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發揮作用，增加了消除腦膠質瘤細胞的可能性。


圖I :大鼠9L細胞神經干細胞球囊培養，其中A、B為無血清培養基中培養9L神經干細胞，C為含血清培養基誘導貼壁。圖2 :含血清培養誘導膠質瘤干細胞的分化。圖3 :不同濃度BMP2/7處理9L干細胞的分化檢測。圖4 :9L細胞接種后，大鼠研究外突，眶周出血，肢體偏癱，肌張力增高。圖5 :9L細胞接種2周后，大鼠腦膠質瘤的MRI成像，表現為腫瘤實質部分強化，中央無強化的液體壞死區(箭頭)。圖6 9L移植瘤病例表現(N :正常組織)。圖7 :9L原位移植大鼠的荷瘤生存曲線。圖8 BMP2/7治療大鼠移植腦膠質瘤的MRI檢測，藍色區域為計算機偽色。圖9 :小動物活體成像檢測BMP2/7緩釋系統與化療藥物協同治療大鼠顱內移植瘤。圖10 :肝素濃度與BMP2/7的結合能力。圖11 BMP2/7結合力與BMP2/7濃度的關系。 圖12 :復合BMP2/7肝素化膠原膜的緩釋動力學分析。圖13 :復合BMP2/7肝素化膠原膜的緩釋動力學分析。圖14 :緩釋系統組織相容性檢測，Al為正常腦組織(200倍)，BI為正常腦組織(400倍)，A2為植入腦組織后Id(200倍)，B2為植入腦組織后Id(400倍)，A3為植入腦組織后3d (200倍)，B3為植入腦組織后3d (400倍)，A4為植入腦組織后Iw (200倍)，B4為植入腦組織后Iw (400倍)，A5為植入腦組織后2w(200倍)，B5為植入腦組織后2w(400倍)A6為植入腦組織后3w(200倍)B6為植入腦組織后3w(400倍)。
具體實施例方式為詳細說明本發明的技術內容，所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附圖詳予說明。應理解，這些實施僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明的授權之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I大鼠荷瘤生存試驗(一 )材料與方法I、試劑DMEM/F12(1 I)培養基，B27 添加劑(Invitrogen), N2 添加劑(Invitrogen)胰蛋白酶(Sigma),人表皮生長因(EGF, Invitrogen),人堿性成纖維生長因子(bFGF,Invitrogen),白血病抑制因子(LIF, Chemieon),左旋谷胺酞氨(Sigma),特級胎牛血清(Hycl。ne)，胰島素、青霉素和鏈霉素(華北制藥)，左旋多聚賴氨酸(Sigma)，紅細胞裂解液(自配，含O. 155mol/LNH4CI,0. 01mol/LKHC03,0. IM EDTA)，免疫磁珠分選液O. 5% (v/v)BSA、2mM EDTA，加入 O. OlM PBS 至 100ml，用 IN NaOH 或 IN HCl 調節 pH 值為 7. 2，免疫磁珠(CD133+)細胞分選試劑盒為德國Miltenyi Biotec公司產品。2、Fisher344大鼠9L細胞腦膠質瘤模型的建立(1)9L細胞的復蘇和培養從_80°C取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，使其融化，約Imin左右；室溫下5min內，用低糖DMEM培養基稀釋至原來體積的10倍。800rpm/min低速離心5min。去上清，加含10%胎牛血清的新鮮培養基，接種細胞進行培養，細胞融合超過80%時進行傳代培養。(2)細胞接種液的制備對數生長期的單層培養細胞，O. 25%胰酶消化，用PBS液洗滌二次，離心機轉數為1000轉/min，部分細胞到置顯微鏡下細胞計數，制備成細胞懸液IOy L，待接種。部分細胞進行消化、洗滌后繼續培養，觀察其生長情況，做接種細胞的對照。結果細胞生長良好，細胞存活率>95%。9L細胞的細胞形態如圖所示。3、免疫磁珠法分離大鼠腦膠質瘤干細胞方法將大鼠膠質瘤細胞株9L分為兩組，一組用少量緩沖液(O. 5%牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7. 2 的憐酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS), 0. 22 μ m過濾除菌，保持4 8°C )充分混懸細胞(按O. 3ml/lX IO8細胞濃度即可)，加入⑶133抗體包被的超微磁珠，混勻后置4°C孵育30min。將分離柱安裝入磁場中，加入O. 5ml緩沖液，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱。將孵育完的細胞懸液加到分離柱中，自然流盡。洗柱兩次。從磁場中取下分離柱，插在試管口，加I 2ml的緩沖液，用針芯推盡液體，沖出陽性結合的細胞，用無血清培養基洗一次，離心IOOOrpm, 5min,接種到含EGF (20ng/ml),bFGF(20ng/ml), LIF (10ng/ml), B27(lx)的無血清培養基中，置入 37°C，5 % CO2，飽和濕度培養箱中培養，對照組臺盼藍染色計數后不進行磁珠分選，直接接種到上述培養基中。兩組視具體情況每2 4d換液一次。4、流式細胞儀檢測分選細胞中⑶133的表達 分別收集血清和無血清培養基中大鼠膠質瘤細胞，消化離心后重懸于10%的馬血清中，4°C孵育20分鐘，離心后棄上清。細胞與羊抗-⑶133多克隆抗體(I 200，Santacruz，美國)在4°C中孵育半小時，PBS洗兩次。再將細胞與驢抗羊Alexa488熒光二抗(Molecular protect，美國)混合，4°C避光孵育15分鐘，以PBS液洗滌。充分吹打成單細胞懸液后，用美國BD公司的流式細胞儀進行分析檢測。同時以小鼠IgG作為一抗的細胞懸液作為陰性對照.5、腫瘤細胞在含血清和無血清培養基中的相互轉化將原代無血清培養基中的懸浮克隆球消化后制備成單細胞懸液，以IxlOVml的密度接種到含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，二周后將細胞收集后以同樣密度接種到含生長因子的無血清培養基中培養二周，連續三次相同密度細胞在不同培養基條件轉化培養后，觀察細胞的克隆球形成能力以及生長狀況。6、單細胞懸液的制備和單細胞克隆分析9L膠質瘤細胞以1000-2000cell/cm，的克隆密度接種于5ml含生長因子的DMEM/F12培養基中，1-2周后收集克隆球細胞消化后重懸于PBS溶液中，輕輕吹打后經300目的濾網過濾，離心后將細胞重懸于DMEM/F12培養基中，充分吹打后制備成單細胞懸液，臺盼藍染色鏡下計數。將細胞梯度稀釋到1000cell/ml的濃度，在每個96孔板孔中加入l_2ul的細胞懸液，再分別加入250ul含生長因子的無血清培養基進行培養觀察。4小時后顯微鏡下仔細觀察每個孔中的細胞接種數目，記錄含有單個腫瘤細胞的孔。隔天觀察一次細胞的分裂生長情況，一個月后計數單細胞克隆形成率。單細胞孔克隆球長至100-200細胞以后，將克隆球連同培養液吸出，輕輕吹打后接種于新的96孔板中，觀察亞克隆形成情況。7、單細胞來源克隆球的分化檢測收集克隆密度下無血清培養基中的單細胞來源克隆球，將其接種于含蓋玻片的6孔板中，蓋玻片事先用多聚賴氨酸浸泡10分鐘。4小時后與5ug/ml Hoechst33342孵育lOmin，再用2%多聚甲醛固定20分鐘。2)將單細胞來源的克隆球消化解離后，接種到6孔板中，含血清培養基培養一周后進行下一步檢測。PBS緩沖液洗滌三次后加入EDTA修復液，于95°C水浴進行抗原修復15分鐘。用10%馬血清或羊血清封閉20分鐘后加入一抗羊抗-CD133多克隆抗體(I 200, Santa Cruz，美國)、于37°C水浴孵育兩小時，PBS沖洗三次，每次5 分鐘。加入羊抗兔Alexa fluor568 (I : 100)和驢抗羊Alexa fluor488 (I : 100)熒光二抗(Molecular Protect，美國)，4°C避光孵育45分鐘，PBS液洗滌三次，每次五分鐘。熒光顯微鏡下觀察拍照，注意要始終保持蓋玻片的濕潤，最后計算陽性細胞表達率。8、膠原海綿處理方法膠原海綿的膜片規格3mm直徑，Imm厚，將直徑3mm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低劑量組分別為400ng/ml, 100ng/ml, 25ng/ml),低溫真空干燥，備用。9、大鼠顱內成瘤實驗采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻 醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下，將腫瘤細胞懸液以I μ I/min的速度注射入靶區，除針前留針5min，使細胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫
八
口 ο造模后3天，按照完全隨機的方法將荷瘤大鼠分為以下四組高劑量組400ng/mlBMP2/7+3mm 海綿；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm 海綿；低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm海綿；膠原海綿組400ng/ml BSA+3mm海綿。每組大鼠10只。隨機分組完成后，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚,鉆孔(直徑3mm),將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下Imm處，將腫瘤細胞懸液以I μ 1/min的速度注射入靶區，除針前留針5min，使細胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。按照上述的方法進行膠原海綿移植，分組如下高劑量組原位移植400ng/ml BMP2/7+3mm海綿。中劑量組原位移植100ng/ml BMP2/7+3mm海綿低劑量組原位移植25ng/ml BMP2/7+3mm海綿膠原海綿組原位移植400ng/ml BSA+3mm海綿各組大鼠的行為學觀察治療各組細胞移植后，每日觀察大鼠的神態、進食、活動等狀態。各組大鼠的生存周期觀察治療后，每日觀察各組大鼠的存活情況，記錄生存時間。MRI檢測自治療后I周，每周對治療各組大鼠進行MRI檢查。采用10%水合氯醛對Fisher344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于特制固定架，分別取冠狀、矢狀及軸位掃描。掃描條件采用3英寸表面線圈，TIffITR =300ms, TE = 15ms，采集 2 次，T2WITR = 2000, TE = 90ms，層厚 3. 0_，采集 2 次.掃描矩陣256X256,掃描野為3cmX3cm。并測量腫瘤直徑。增強掃描時腹腔注射二乙三胺五乙酸軋(Gadoliniumdiethylene triaminepen taacetie acid, GDDTPA, 2ml/kg),然后進行掃描。腫瘤體積的計算取MRI掃描的最大冠狀面和矢狀面，測量最大前后徑(L)、寬徑(W)和高徑⑶，觀察腫瘤生長情況。腫瘤大小以下述公式計算腫瘤體積(V) v =(4/3X 31 XLXWXH) X 1/8 計算。10、種植瘤細胞的體外培養種植瘤取出后放入含PBS 緩沖液的平皿中，利用有齒鑷仔細剔除腫瘤中的血管成分和壞死組織，消化過程同步驟一。將細胞以I X 106/ml密度接種到無血清培養基中培養。裸鼠以過量麻醉處死。種植瘤細胞經一代培養后作進一步的96孔板單細胞克隆實驗免疫熒光抗原檢測實驗以及克隆球細胞接種裸鼠實驗11、組織切片免疫組織化學抗原檢測固定于4%多聚甲醛的種植瘤組織以及患者原始腫瘤組織經脫水、石蠟包埋、切片等步驟后，切片在60°C烘箱中烘干過夜。I) 二甲苯脫蠟在三個盛有二甲苯溶液的瓶中各浸泡10分鐘，以達到徹底脫蠟的效果。2)水化100%無水乙醇5分鐘，95%乙醇5分鐘，95%乙醇5分鐘，75%乙醇5分鐘。O. OlM的PBS緩沖液沖洗三次。3)將PH為9. O的EDTA修復液放入玻璃杯中煮沸，放入切片，保持15_20分鐘，注
意防止脫片。 4)室溫下放置45分鐘后冷卻，用PBS液沖洗三次。5)切片放入濕盒中，加入3% H2O2，室溫下10分鐘，PBS沖洗三次。6)加入10%的兔血清或者山羊血清封閉20分鐘,棄去封閉液,不洗。7)加入羊抗-CD133多克隆抗體、兔抗-GEAP多克隆抗體、兔抗-NSE多克隆抗體于37°C孵育2小時。用PBS液仔細沖洗三次。8)加入SP試劑盒中的兔抗山羊或山羊抗兔二抗，室溫孵育15分鐘，PBS沖洗三次。9)加入SP試劑盒中辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育10分鐘，PBS沖洗三次。10)加入現配的DAB工作液，鏡下觀察待胞漿變黃后用自來水沖洗。11)蘇木素溶液中浸染5-10分鐘，自來水沖洗。12)鹽酸酒精分化I秒，自來水沖洗。13)氫氧化氨水溶液或60°C水浴中藍化10分鐘14)在95% -100%的梯度酒精中脫水各2分鐘。15)待切片干燥后用中性樹脂封片，鏡下觀察。16)隨機選擇10個高倍視野，計數不少于200個細胞，計算陽性細胞所占腫瘤細胞
百分率。12、免疫熒光法檢測多抗原共表達現象收集原代無血清培養基中的懸浮克隆球接種到含蓋玻片的6孔板中，加含血清培養基培養，分別在接種后4小時、2周時用2%的多聚甲醛固定細胞進行免疫熒光檢測。常規步驟同前，經馬血清封閉后，每個玻片同時與混合一抗進行孵育，二抗為羊抗兔Alexafluor568(l 100)和驢抗羊Alexa f luor488 (I 100)熒光二抗混合液，避光孵育45分鐘。固定細胞前均要與5ug/ml Hoechst33342孵育lOmin，以標記細胞核。熒光顯微鏡下，同一視野分別用不同波長的激發光觀察，拍照記錄。13、統計學分析各組計量資料均采用i^SD表示，細胞生長曲線采用重復測量方差分析，不同時間點的組間比較采用oneway AN0VA，多重比較采用LSD法比較分析；生存周期采用Kaplan-Meier, Long-rank分析；其余實驗數據采用oneway ANOVA,多重比較采用LSD法比較分析。采用SPSS13. O統計軟件包處理，P < O. 05時認為差異具有顯著意義。( 二 )結果與分析I、大鼠9L腫瘤干細胞培養在無血清培養基中，可在24-48小時后發現有單個或多個成簇懸浮細胞的形成，Iw后細胞球明顯增多，增大，形狀多規則，由數量不等的圓形細胞組成，2周后可達到數百 個細胞以上，晃動培養瓶時可見細胞球滾動。大部分細胞在無血清培養基中仍呈貼壁生長，隨培養時間的延長貼壁細胞數有所減少(圖I)。撤去無血清培養基，換含血清培養基,導致球囊開始貼壁,分別檢測神經干細胞標記物Nestin、膠質細胞標記物GFAP、神經元標記物Tuji的表達,如圖2所示結果,Oh時,只能檢測到Nestin的表達，表明細胞處于未分化狀態，24h后GFAP與Tuji的表達水平明顯增力口，Nestin標記幾乎很難檢測到，充分說明大鼠腦膠質瘤干細胞9L具有分化為膠質細胞與神經元細胞的能力(圖2)。我們嘗試用不同濃度的BMP2/7處理9L干細胞，24h后檢測分化水平，發現三種濃度的BMP2/7都能夠明顯促進分化，而且與單純有血清培養相比，時間明顯縮短(圖3)。2、荷瘤大鼠的行為學觀察Fisher344大鼠接種9L細胞I周后，表現為自行覓食、飲水較正常鼠減少，體重下降，反應遲鈍，少動，并可出現行走不穩。接種后14天逐漸出現進行性顱內高壓癥狀，部分鼠出現眶周出血、眼球外突，后期可有癲癰樣發作、偏癱及肌張力增高等癥狀(圖4)。未干預組大鼠均于21天內逐漸死亡，死亡前出現肢體屈曲，不自主搐動。高劑量組400ng/mlBMP2/7+3mm膠原海綿移植組約3周左右，中劑量100ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組約4周左右出現進行性顱內壓增高癥狀。3、荷瘤大鼠的MRI及病理表現腫瘤種植2周后MRI顯示大鼠腦內均有不同大小的膠質瘤生長，證明接種成功。常規MRI膠質瘤表現為圓形或類圓形腫塊，邊界較清楚，周圍有片狀水腫區，增強后腫瘤實質部分不同程度地強化，中央多出現無強化的液化壞死區(圖5)。腫瘤最大直徑在3. 5-12mm之間，平均6. 8上3. 1mm。HE染色光鏡下腫瘤細胞密集，核漿比例高，核分裂像少見，并有部分分化現象(圖6)。4、各組荷瘤大鼠的生存周期經生存周期分析發現各組大鼠的中位生存期分別為生理鹽水組18天，95%可信區間為15. 078-20. 922天；高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組57天，95%可信區間為47. 703-66. 297天；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組25天，95 %可信區間為23. 482-26. 518天；低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組23天，95%可信區間為18.868-27. 123天。高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組大鼠的生存時間最長，40%大鼠存活時間超過60天，與其余各組比較有顯著性差異P < 0. 01 ;高中劑量BMP2/7膠原海綿移植組大鼠生存時間較生理鹽水組明顯延長P < O. Ol ;低劑量BMP2/7膠原海綿移植組與對照組之間無顯著性差異P = O. 924(圖7)。5、各組大鼠腫瘤大小的變化根據每周MRI檢查的結果，計算各組大鼠腫瘤的體積變化，統計學分析表明7天、14天時BMP2/7膠原海綿高中低劑量組與BSA膠原海綿組比較有顯著性差異(P < O. 01)，高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm海綿；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm海綿與低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm海綿和對照組400ng/ml BSA+3mm海綿比較有顯著性差異(P <0.01)；而低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm 海綿與 400ng/ml BSA+3mm 海綿(7 天時=O. 725 ; 14 天時P = O. 620)無顯著差異。21天時400ng/ml BSA+3mm海綿組大鼠全部死亡，高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm海綿與對照組 400ng/ml BSA+3mm海綿有顯著性差異(P < O. 01) ；28天，56天時高劑量組大鼠的腫瘤體積仍相對較小分別為32. 40 ±2. 15和45. 35 ±2. 52 (表I)。MRI的結果顯示，與對照組相比，中劑量與高劑量BMP2/7能夠明顯移植腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果(圖8)。
實施例2緩釋載體與化療藥物的協同作用(一)材料與方法1、9L細胞的復蘇和培養從-80°C取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，使其融化，約Imin左右；室溫下5min內，用低糖DMEM培養基稀釋至原來體積的10倍。800rpm/min低速離心5min。去上清，加含10%胎牛血清的新鮮培養基，接種細胞進行培養，細胞融合超過80%時進行傳代培養。2、免疫磁珠法分離大鼠腦膠質瘤干細胞方法將大鼠膠質瘤細胞株9L分為兩組，一組用少量緩沖液(O. 5%牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7. 2 的憐酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS), 0. 22 μ m過濾除菌，保持4 8°C )充分混懸細胞(按O. 3ml/lX IO8細胞濃度即可)，加入⑶133抗體包被的超微磁珠，混勻后置4°C孵育30min。將分離柱安裝入磁場中，加入O. 5ml緩沖液，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱。將孵育完的細胞懸液加到分離柱中，自然流盡。洗柱兩次。從磁場中取下分離柱，插在試管口，加I 2ml的緩沖液，用針芯推盡液體，沖出陽性結合的細胞，用無血清培養基洗一次，離心IOOOrpm, 5min,接種到含EGF (20ng/ml),bFGF(20ng/ml), LIF(10ng/ml), B27(lx)的無血清培養基中，置入 37°C，5% CO2，飽和濕度培養箱中培養，對照組臺盼藍染色計數后不進行磁珠分選，直接接種到上述培養基中。兩組視具體情況每2 4d換液一次。3、膠原海綿處理方法膠原海綿的膜片規格3mm直徑，Imm厚，將直徑3mm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低劑量組分別為400ng/ml, 100ng/ml, 25ng/ml),低溫真空干燥，備用。4、動物模型制備采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下，將腫瘤細胞懸液以I μ I/min的速度注射入靶區，除針前留針5min，使細胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫
口 ο5、抗膠質瘤化療藥物替尼泊式(teniposide,VM-26),順鉬(cis-diamminedichlo-roplatin, CDDP)，長春新堿(vincristine, VCR)。按Limburg推薦的公式計算藥物的血衆峰濃度(peak plasmaconcentration,PPC) ( μ g/ml) = 50XD/5000X2X 103，其中 D 為臨床化療劑量(mg/kg/d),分別選用O. I X PPC、1 X PPC、10 X PPC為實驗用藥濃度。聯合用藥根據各藥半數有效濃度(50% inhibiting concentration, IC50)來確定實驗用藥濃度。見下表2。 6、實驗動物的分組造模后3天，按照完全隨機的方法將荷瘤大鼠分為以下八組BMP2/7+化療藥物干預BMP2/7+VM-26 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +0. 05ug/mlVM_26BMP2/7+CDDP 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +0. 3ug/mlCDDPBMP2/7+VCR 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +3. Oug/mlVCR單純化療藥物VM-26 組400ng/ml BSA+3mm 海綿 +5. Oug/mlVM-26CDDP 組400ng/ml BSA+3mm 海綿 +3. Oug/mlCDDPVCR 組400ng/ml BSA+3mm 海綿+3. Oug/mlVCR對照組BMP2/7 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿膠原海綿組400ng/mlBSA+3mm 海綿每組各10只大鼠。7、荷瘤大鼠的膠原海綿移植隨機分組完成后，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下，除針前留針5min，使細胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。按照上述的方法進行膠原海綿移植，分組如下BMP2/7+VM-26 組；BMP2/7+CDDP 組；BMP2/7+VCR 組；VM_26 組；CDDP組；VCR組；BMP2/7組對照組；膠原海綿組對照組。8、結果觀察(I)各組大鼠的行為學觀察治療各組細胞移植后，每日觀察大鼠的神態、進食、活動等狀態。(2)各組大鼠的生存周期觀察治療后，每日觀察各組大鼠的存活情況，記錄生存時間。(3)腫瘤體積的計算取MRI掃描的最大冠狀面和矢狀面，測量最大前后徑(L)、寬徑(W)和高徑(H),觀察腫瘤生長情況。腫瘤大小以下述公式計算腫瘤體積(V) V =(4/3X 31 XLXWXH) X 1/8 計算。9、統計學分析
各組計量資料均采用i±SD表示，細胞生長曲線采用重復測量方差分析，不同時間點的組間比較采用oneway ANOVA,多重比較采用LSD法比較分析；生存周期采用Kaplan —Meier, Long-rank分析；其余實驗數據采用oneway AN0VA,多重比較采用LSD法比較分析。采用SPSS13. O統計軟件包處理，P < O. 05時認為差異具有顯著意義。(二)結果與分析I、生存周期分析經生存周期分析發現，各組大鼠的中位生存期見下表3。2.各組大鼠腫瘤大小的變化根據每周MRI檢查的結果(見表4)，計算各組大鼠腫瘤的體積變化，統計學分析表明7，14天BMP2/7組與化療藥物干擾組比較無顯著差異，而與膠原海綿對照組比較P <0.01有顯著差異。21-56天BMP2/7與化療藥物干擾組出現顯著差異，P <0.01。BMP2/7與單純的化療藥物組比較也表現顯著差異，說明BMP2/7可以協同化療藥物抑制腫瘤生長。同時，我們采用小動物成像系統檢測BMP2/7的協同作用，結果如圖9所示，具有明顯的協同效應。實施例3緩釋載體的藥物分布動力學特征EDC是一種具有良好水溶性的碳二亞胺類化合物，容易與醇、羧酸、胺等化合物中的活潑氫發生加成反應，轉化為結構穩定的化合物，因而是一種應用廣泛的縮合劑。它能夠激活膠原中谷氨酸和天冬氨酸殘基上羧基，使之與膠原中的賴氨酸或羥基賴氨酸上的氨基形成酰胺鍵，從而提高膠原的機械性能及其熱穩定性。而肝素是一種線型陰離子多糖，其含有的多種-OH、-C00H、-S03H、NH2等官能團，均能用于高分子材料的肝素化反應，因此本試驗條件下，肝素中的羧基經EDC活化后，與膠原膜中的-NH2等基團發生交聯反應。(一)材料與方法I、膠原蛋白的交聯取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) 100ml (PH5. O)。室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時。2、膠原蛋白的肝素化交聯的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按I : O. 6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2% (w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。IOmin后，按每克膠原蛋白188. 3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時后，分別用O. IM的Na2HPO4,4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。3、rhBMP2/7與肝素化膠原蛋白的結合將直徑IOmm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml的125I標記的rhBMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次，Y液閃計數器測定放射強度。4、rhBMP2/7的125I標記按常規方法進行。5、rhBMP2/7 釋放實驗取復合了 rhBMP2/7的IOmm肝素化膠原膜(對照為非肝素化膠原膜)，置于C2C12細胞培養液中(10% FBS,DMEM), 37 0C 5% C02培養箱中溫育，每24h換液I次，_20°C凍存，IOd后ELISA檢測培養液中rhBMP2/7的濃度。6、rhBMP2/7體內釋放實驗采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。分別于術后4h及l、2、3、7、15d 6個時間點處死動物，取出腦組織內殘余緩釋微球，去離子水沖洗表面，冷凍干燥以除去殘留水分。液閃計數器檢測BMP2/7殘余量，與植入時膠原中BMP2/7量比較，繪出不同劑量膠原海綿的釋放曲線，并進行對比。7、體內rhBMP2/7藥物分布將35只大鼠按時間點隨機分成7組，每組5只。采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒 低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種靶點，其坐標為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。分別于術后4h及1、2、3、
7、10、15d 7個時間點處死動物，取大鼠腦植入部位、對側對稱部位腦組織各Ig及血O. 5ml,以4N濃度NaOH溶液37 °C水浴消化組織，過濾，置入5ml放射液閃溶液中進行放射性計數。8、腦組織對復合膠原海綿的炎癥反應7只雄性SD大鼠，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規消毒，安裝立體定向接種針。選定右側額葉為接種祀點，其坐標為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚,鉆孔(直徑3mm),將BMP2/7復合膠原海綿植于額葉腦皮質下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。每天2次觀察動物，尤其注意警惕性降低、被動、煩躁、易激惹、恐懼等行為改變以及運動障礙和步態不穩等神經功能障礙。分別于術后4h及1、2、
3、7、10、15d 7個時間點處死動物，取出完整腦組織，10%福爾馬林固定lw，12林m切片，常規HE染色，光鏡下觀察。9、數據處理實驗數據以均數土標準差x(±) s表示，組間比較采用方差分析，SAS件進行統計學處理，P < O. 05為差異有顯著的統計學意義。(二)結果與分析I、肝素化載體結合能力與肝素濃度的關系125I標記的rhBMP2/7與肝素化的膠原蛋白結合，檢測載體結合rhBMP2/7的能力，肝素化膠原載體的結合能力與肝素濃度有一定的相關性，肝素濃度為30-40mg/g膠原時(EDCiHep為O. 4-0. 6)結合的rhMP2/7最多，以后進入平臺期，肝素濃度繼續增高時結合rhBMP2/7的量有一定下降。(見圖10)2、肝素化載體結合能力與rhBMP2/7濃度的關系我們又分析了肝素化膠原載體(EDC = Hep為O. 4)結合能力與rhBMP2/7濃度的關系，結果表明二者之間呈線性關系，而且各作用濃度下，肝素化膠原結合的重組蛋白明顯高于非肝素化的對照組。(見圖11)
3、rhBMP2/7 的緩釋性能我們將rhBMP2/7復合肝素化膠原浸泡于C2C12細胞的培養基中，在體外研究復合載體的緩釋動力學特征。起始條件下，肝素化膠原蛋白(EDC:HepS0.4)與對照膠原蛋白結合rhBMP2/7的量分別為27ng與49ng。48h內對照載體有41 %的重組蛋白釋放，而實驗組只釋放約15%的重組蛋白，IOd之后對照組累積釋放22. 4ng(83% )的rhBMP2/7，而實驗組的釋放水平為20ng(42% )，其緩釋能力明顯優于對照組。(見圖12)4、rhBMP2/7的體內緩釋能力我們將rhBMP2/7復合肝素化膠原植于大鼠皮層下Imm處，在體研究復合載體的緩釋動力學特征。4h時，肝素化膠原蛋白(EDC:!fepS0.4)與對照膠原蛋白結合rhBMP2/7的緩釋程度分別為30%與10%。48h內對照載體有60%的重組蛋白釋放，而實驗組只釋放約40 %的重組蛋白，15d之后對照組累積釋放92 %的rhBMP2/7，而實驗組的釋放水平為56 %，其緩釋能力明顯優于對照組。(見圖13) 5、緩釋載體植入后體內藥物分布實驗數據以均數土標準差x(±) s表示，組間比較采用方差分析，P < O. 05為差異有顯著的統計學意義。按照緩釋載體植入的不同位置進行方差分析，不同位置的放射計數不同，P < O. 01。按照緩釋載體植入后的不同時間進行方差分析，不同時間的放射計數不同，P < O. 01 (見表5)。結果表明，BMP2/7緩釋載體植入局部腦組織的BMP2/7濃度明顯高于血清及對側組織P (均< O. 0001)，48h以內大腦組織的每分鐘計數為血液中的6-15倍。2W時緩釋微球植入側腦組織藥物濃度是血清濃度的70倍，說明緩釋系統不但提高了靶區腦組織的藥物濃度，同時降低非靶區組織藥物濃度，避免藥物的毒副作用。血清中的BMP2/7緩釋載體植入體內BMP2/7藥物分布情況如見表6。實施例4緩釋系統的生物相容性研究(一 )材料與方法同實施例3。(二)結果與分析大鼠腦組織與緩釋系統的生物相容性(見圖14)所有動物均未發現明顯行為改變和神經功能缺陷，未出現全身或局部毒性反應，均存活到預計處死時間點，體重均增加。系統置入大鼠皮層后4h和ld，HE染色發現置入區周圍組織水腫伴有少量出血，伴有小膠質細胞和少枝膠質細胞。植入后2d腦組織表現為壞死、炎性反應、中性白細胞侵潤。植入后3d HE染色周圍腦組織水腫，小膠質細胞浸潤，類似腦梗塞表現。植入后7d HE染色膠質細胞侵潤。植入后15d HE染色星形細胞增生。植入后21d HE染色星形細胞、膠質細胞增生、神經元呈缺血表現。微球置入后臨近及周圍腦組織呈現膠質細胞反應，包括多量肥大星形細胞，21d后膠質細胞反應開始減輕。Tdays14days21days28days56days
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Km 0.050,3 3,0表2三種藥物的血漿峰濃度(ug/ml)和IC5C)(ug/ml)Means and Medians for Survival Time
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權利要求
1.一種BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于BMP2/7的載體采用肝素化膠原蛋白；所述的肝素化膠原蛋白的制作步驟 步驟I :膠原蛋白的交聯，取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) IOOml (PH5. O);室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時； 步驟2 :膠原蛋白的肝素化，交聯的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按I : O. 6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2% (w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液；IOmin后，按每克膠原蛋白188.3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時后，分別用O. IM的Na2HP04，4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于BMP2/7采用異源二聚體類似物。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于采用柔性連接技術表達BMP2/7異源二聚體類似物；柔性連接技術參考本發明人的專利“一種BMP2/7異源二聚體結構類似物及其表達方法與應用”,專利200610034620. 2。
5.根據權利要求2和權利要求4的應用，其特征在于BMP2/7異源二聚體與肝素化膠原蛋白結合制成BMP2/7緩釋系統，結合步驟如下 將直徑IOmm的肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后滴入O. 25ml的BMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次。
6.根據權利要求5的應用，其特征在于通過構建大鼠顱內荷瘤模型，進行BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動力學特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究。
7.根據權利要求6的應用，其特征在于在瘤體內注射BMP2/7緩釋載體，能夠明顯抑制腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果；BMP2/7緩釋載體能夠協同化療藥物抑制腫瘤的生長；緩釋系統不但提高了靶區腦組織的藥物濃度，同時降低了非靶區組織的濃度，避免藥物的毒副作用；所有大鼠均未發生明顯行為改變和神經功能缺陷，未出現全身或者局部毒性反應，表明BMP2/7緩釋載體的生物相容性良好。
8.根據權利要求5的應用，其特征在于通過構建裸鼠顱內移植瘤模型，BMP2/7緩釋系統單獨作用能部分抑制腫瘤組織的形成，腫瘤組織對化療藥物不夠敏感，而兩者卻又明顯的協同作用，充分證明BMP2/7治療腦膠質瘤的潛在價值。
9.根據權利要求5的應用，其特征在于通過構建裸鼠皮下移植U251膠質瘤模型，BMP2/7能夠協同化療藥物顯著抑制裸鼠皮下瘤的生長。
10.根據權利要求7、權利要求8、權利要求9的應用，其特征在于采用復合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質瘤的局部可以形成高濃度的給藥環境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質瘤的增殖，促進其分化，如果配合傳統的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發揮作用，增加了消除腦膠質瘤細胞的可能性。
全文摘要
本發明公開了BMP2/7緩釋系統在腦膠質瘤治療上的應用，其中BMP2/7的載體采用共價結合肝素的膠原。本發明通過BMP2/7緩釋載體的大鼠荷瘤實驗、裸鼠顱內移植瘤實驗、裸鼠皮下移植瘤實驗，進行了BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動力學特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究，闡明了采用復合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質瘤的局部可以形成高濃度的給藥環境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質瘤的增殖，促進其分化，如果配合傳統的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發揮作用，增加了消除腦膠質瘤細胞的可能性。
文檔編號C08H1/06GK102772786SQ201210302569
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者吳培誠, 孫奮勇, 康賢通 申請人:廣州華燦醫藥科技有限公司