專(zhuān)利名稱(chēng)：包含血管周干細(xì)胞和nell-1蛋白的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及包含血管周干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的組合物及其使用和制備方法。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)是產(chǎn)生活的功能性組織以修復(fù)或替換因損傷或先天性缺損而引起的組織或器官功能喪失的方法。此領(lǐng)域通過(guò)刺激先前不可修復(fù)的器官來(lái)使其愈合，從而為體內(nèi)受損組織和器官的再生提供了廣闊的前景。再生醫(yī)學(xué)也使科學(xué)家們能夠在身體無(wú)法自身愈合時(shí)于實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)組織和器官，并且安全地將其植入。重要的是，再生醫(yī)學(xué)有可能解決與需要器官移植救命的患 者數(shù)量相比較，可從捐贈(zèng)獲得的器官短缺的問(wèn)題，并且有可能解決器官移植物排斥的問(wèn)題，因?yàn)槠鞴俚募?xì)胞將會(huì)匹配患者的細(xì)胞(馬森C (MasonC)，杜尼爾 P (DunnillP) (2008 年 I 月).“再生醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)明定義(Abriefdef initionofregenerativemedicine)”.再生醫(yī)學(xué)(RegenerativeMedicine) 3 (I):1_5)。再生醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)是干細(xì)胞生長(zhǎng)成各種組織或器官的能力。胚胎干(ES)細(xì)胞是能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖并分化成多種展現(xiàn)專(zhuān)能特性的譜系限制性細(xì)胞群的多能細(xì)胞(奧德瑞克(Odorico)等人，干細(xì)胞(StemCells) 19:193-204(2001))。歸因于這些特征，ES細(xì)胞，包括人ES細(xì)胞，可以變?yōu)閳?zhí)行多種功能的極為特殊的細(xì)胞類(lèi)型。盡管hESC為再生醫(yī)學(xué)提供了廣闊的前景，但例如長(zhǎng)期暴露于培養(yǎng)基中的動(dòng)物產(chǎn)品、畸胎瘤形成和可能需要免疫抑制等障礙仍為臨床上hESC的使用提出了重大的安全性問(wèn)題。以下的實(shí)施例將解決上述問(wèn)題和需求。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明一個(gè)方面中，提供一種純化的血管周干細(xì)胞(perivascularstemcells)(PSC)或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)群，所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和任選的⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-(周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-(外膜細(xì)胞)。一小組 PSC 或 iPS CasubsetofthePSCoriPS)被 CD146、CD45、CD34 和 CD31 抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-⑶31-(微血管周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-⑶31-(外膜細(xì)胞)。在本發(fā)明另一方面中，提供一種包含干細(xì)胞上清液(asupernatantof stemcel I)的組合物，所述干細(xì)胞上清液包含營(yíng)養(yǎng)因子，這些營(yíng)養(yǎng)因子刺激所需細(xì)胞的形成或所需祖細(xì)胞的募集，從而形成組織或器官，并且所述上清液包含干細(xì)胞培養(yǎng)基并且不含所述干細(xì)胞。在所述組合物的一些實(shí)施例中，所述干細(xì)胞被⑶146、⑶45、⑶34和任選的⑶31抗體鑒別為CD146+CD34-CD45-(周細(xì)胞)或 CD146-CD34+CD45-(外膜細(xì)胞)的 PSC 或 iPS。一小組 PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-⑶31-(微血管周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-⑶31-(外膜細(xì)胞)。所述上清液可以是液體，或半固體，或固體制劑。在一些實(shí)施例中，上清液是粉末。在一些實(shí)施例中，所述組合物另外包含藥學(xué)上可接受的載劑。在本發(fā)明另一方面中，提供一種組合物，所述組合物包含純化的PSC或iPS群和任選的誘導(dǎo)劑，所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和任選的⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-(周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-(外膜細(xì)胞)，并且所述誘導(dǎo)劑促進(jìn)PSC或iPS分化成所需的細(xì)胞或祖細(xì)胞，從而形成組織或器官。一小組PSC或iPS被⑶146、⑶45、CD34和CD31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-⑶31-(微血管周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-⑶31-(外膜細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，所述組合物另外包含賦形劑或藥學(xué)上可接受的載劑。所述組合物可以配制成任何合乎需要的制劑。在一些實(shí)施例中，所述組合物被配制成臺(tái)架(scaffold)、骨移植物、軟骨移植物、植入物或在植入式裝置上的涂層。植入式裝置的一個(gè)實(shí)例是可再吸收性或不可再吸收性支架或縫線。在一些實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)劑是Nell-1肽。在本發(fā)明另一方面中，提供一種治療或改善醫(yī)學(xué)病況的方法。所述方法包含對(duì)受檢者(subject)投予:純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群，包含純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群的組合物，或包含干細(xì)胞上清液的組合物，所述干細(xì)胞上清液不含所述干細(xì)胞，其中所述醫(yī)學(xué)病況與損傷或患病的組織或器官或者以其它方式受疾病或病原體損害的組織或器官有關(guān)。

在所述方法的一些實(shí)施例中，所述醫(yī)學(xué)病況與損傷或患病的組織或器官有關(guān)。舉例來(lái)說(shuō)，所述醫(yī)學(xué)病況可以是CNS (中樞神經(jīng)系統(tǒng))疾病；PNS (周?chē)窠?jīng)系統(tǒng))疾病；皮膚瘢痕；纖維化；腫瘤；軟骨損傷、缺損或疾病；骨損傷、缺損或疾病；心臟病；腎病；運(yùn)動(dòng)損傷；呼吸道疾病；或糖尿病。在一些實(shí)施例中，所述醫(yī)學(xué)病況是以下各項(xiàng)中的一種:阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ sdisease)、帕金森氏病(Parkinson’ sdisease)、肝纖維化、乳癌、骨質(zhì)疏松癥、心臟病發(fā)作、心臟缺血、腎缺血、中風(fēng)、腦缺血、脊髓損傷、半月板撕裂、哮喘、肺病或I型糖尿病。疾病的其它實(shí)例包括國(guó)際疾病分類(lèi)(InternationalClassificationofDiseaseS，IQ))和當(dāng)代操作術(shù)語(yǔ)集(CurrentProcedural Terminology, CPT)版本中所列的所有病況。在所述方法的一些實(shí)施例中，所述組合物是根據(jù)上文或下文所公開(kāi)的本發(fā)明任一實(shí)施例所述。在所述方法的一些實(shí)施例中，所述組織或器官是本發(fā)明組合物的實(shí)施例中所述的任何組織或器官。在本發(fā)明另一方面中，提供一種制造組合物的方法。所述方法包含:提供純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群或者不含所述干細(xì)胞的干細(xì)胞上清液，和形成包含所述純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群或者所述干細(xì)胞上清液的組合物。在所述方法的一些實(shí)施例中，所述組合物是根據(jù)上文或下文所公開(kāi)的本發(fā)明任一實(shí)施例所述。


圖1A-1H繪示周細(xì)胞MSC。所有人類(lèi)周細(xì)胞都表達(dá)⑶146 (A，綠色；內(nèi)皮⑶34為紅色；B，紅色；CD34為綠色)、NG2 (C，綠色；內(nèi)皮VE-鈣粘素為紅色)和PDGF-RP (D，紅色；內(nèi)皮范威氏因子(endothelialvonWi I lebrandfactor, vffF)為綠色)。E:周細(xì)胞是通過(guò)突光活化的細(xì)胞分選術(shù)(fluorescenceactivatedcellsorting, FACS)作為⑶45-⑶56-⑶146+⑶34-細(xì)胞來(lái)純化(紅色柵格)。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的周細(xì)胞:F，馮庫(kù)薩染色法(vonKossastaining);礦物沉積物呈黑色。G,菌素紅染色法；韓沉積物被染成紅色。H:將在BMP2存在下包埋在Gelfoam海綿中的周細(xì)胞植入SCID-NOD小鼠肌袋中。植入后第30天時(shí)進(jìn)行X射線分析；圖2A-2F繪示外膜MSC。(A, B)周細(xì)胞是從脂肪組織(紅色)以及CD146_CD34hi細(xì)胞(綠色)分選，同時(shí)被賦予干細(xì)胞潛能。(C)⑶146-⑶34high細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分成⑶31+細(xì)胞和⑶31-細(xì)胞，僅后者產(chǎn)生MSC。分選的⑶146-⑶34highCD31-細(xì)胞(x)未混有內(nèi)皮細(xì)胞或周細(xì)胞(D)。(E)⑶146-⑶34htD31-細(xì)胞(箭頭)都位于較大血管的外膜中(⑶34呈紅色)。(F)純化的外膜MSC在體外成骨(茜素紅染色)；圖3A-3F繪示狗周細(xì)胞。胎盤(pán)㈧用作犬周細(xì)胞源。vWF+內(nèi)皮細(xì)胞被⑶146+周細(xì)胞包圍(B)。與人類(lèi)細(xì)胞一樣，犬周細(xì)胞是作為CD146+CD34-細(xì)胞被分選(C中的柵格；與圖1E相比較)，共表達(dá)⑶90 (D)和⑶44(E)，并且是在長(zhǎng)期培養(yǎng)中產(chǎn)生(F)；圖4繪示大鼠股骨的2周的顯微CT切片。200 μ gNELL-1/TCP或生理鹽水/TCP(對(duì)照物)通過(guò)環(huán)鉆術(shù)缺損注射到大鼠股骨中；圖5繪示NELL-1增加人PSC礦化作用。PSC在存在或不存在300ng/mlNELL_l情況下培養(yǎng)9天，隨后用二甲酚橙熒光色素染色；圖6繪示PSC+NELL-1在TE 上的體外礦化作用。將100 μ I的TE ±300ng/mlNELL-1或載有2.5X 105P SC±300ng/mlNELL_l的TE**放入插入式24孔板中，在成骨條件下保持12天。使用倒置(頂圖)或體視(底圖)熒光顯微術(shù)評(píng)估礦化作用(茜素紅)。圖7繪示植入的人PSC的生物發(fā)光圖像。SCID小鼠(每組中n=4)經(jīng)肌肉內(nèi)植入100 μ I 總體積的 TE* ±2.5X IO5PSC+ 15 或 300 μ gNELL-1/TCP。在不含 PSC 的對(duì)照物中未檢測(cè)到熒光素酶；圖8繪示有關(guān)在植入后4周時(shí)PSC+NELL-1的結(jié)果。SCID小鼠植入100 μ I體積的TE* ±2.5X105PSC±NELL-1/TCP。相對(duì)于TEs (D)，觀察到在 PSC+NELL-1 組中大量新骨形成(A)(顯微CT中的紅色區(qū)域)，同時(shí)骨涎蛋白(BSP)染色增加(箭頭)，以及TE*粒子和髓隙形成的骨穩(wěn)固作用(H&E，箭頭)。觀察到在僅含TE:_的組中稀少的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和低活性骨形成(D)。=Ρ〈0.05高于僅含TE 的組(D) ；=Ρ<0.05低于僅含TE 的組(D)。圖9繪示有關(guān)在PSC+NELL-1移植物中血管生成的結(jié)果。按照?qǐng)D8對(duì)SCID小鼠進(jìn)行植入。I周(A-C)和2周(D-F)試樣的免疫染色顯示相對(duì)于TE*，在PSC組中內(nèi)皮vWF增力口(Α、Β—紅色箭頭)并且VEGF顯著增加(D、E—黃色箭頭)。抗人類(lèi)MHCI (H300)染色在PSC組中也增加，表明PSC持續(xù)存在(圖中未示)。圖10繪示有關(guān)針對(duì)結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)(接觸共培養(yǎng))的純化PSC的成骨分化實(shí)驗(yàn)的體外研究的結(jié)果。
圖11繪示有關(guān)在SCID小鼠股部肌袋中進(jìn)行植入后所評(píng)估的細(xì)胞命運(yùn)/存活率、血管生成和骨生成的體內(nèi)研究的結(jié)果。圖12繪示當(dāng)添加Nell-1時(shí)顯示周細(xì)胞增殖/存活率增加的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖13繪示當(dāng)添加Nell-1時(shí)顯示周細(xì)胞的VEGF表達(dá)增加的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明一個(gè)方面中，提供一種純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)群，所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和任選的⑶31抗體鑒別為CD146+CD34-CD45-(周細(xì)胞)或 CD146-CD34+CD45-(外膜細(xì)胞)。一小組 PSC 或 iPS被⑶146、⑶45、CD34和CD31抗體鑒別為CD146+CD34-CD45-CD31-(微血管周細(xì)胞)或CD146-CD34+CD45-CD31-(外膜細(xì)胞)。在本發(fā)明另一方面中，提供一種干細(xì)胞上清液。所述上清液包含營(yíng)養(yǎng)因子，這些營(yíng)養(yǎng)因子刺激組織或器官的形成。所述上清液包含干細(xì)胞培養(yǎng)基，并且不含所述干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述干細(xì)胞是PSC，例如周細(xì)胞或外膜細(xì)胞。上清液可以呈液體形式使用，或可以是干燥的，由此能以粉末形式使用。在一些實(shí)施例中，所述上清液可以包括載劑或賦形劑。在本發(fā)明另一方面中，提供一種組合物，所述組合物包含純化的PSC或iPS群。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以任選地包括誘導(dǎo)劑。所述組合物可以另外包括賦形劑或載齊U。在一些實(shí)施例中，所述載劑是藥學(xué)上可接受的載劑。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以被配制成臺(tái)架、骨移植物、軟骨移植物、植入物，或在植入式裝置上的涂層，例如涂在內(nèi)腔表面和/或支架的內(nèi)腔表面上的涂層。在本發(fā)明另一方面中，提供一種治療或改善醫(yī)學(xué)病況的方法。所述方法包含對(duì)受檢者投予本文中所公開(kāi)的純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群、干細(xì)胞上清液或組合物。所述醫(yī)學(xué)病況與損傷或患病的組織或器官或者以其它方式受疾病或病原體損害的組織或器官有關(guān)。在一些實(shí)施例中，所述醫(yī)學(xué)病況是任何損傷或患病的組織或器官。在一些實(shí)施例中，PSC或iPS可以經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以分化成為成纖維細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且上清液可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞或祖細(xì)胞的形成，從而治療、預(yù)防或改善受檢者(例如哺乳動(dòng)物)的瘢痕病況，例如纖維化。或者，PSC或iPS可以排出化學(xué)物質(zhì)，并且上清液包括化學(xué)物質(zhì)，從而治療、預(yù)防或改善受檢者(例如哺乳動(dòng)物)的瘢痕病況，例如纖維化。在一些實(shí)施例中，PSC或iPS可以經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以分化成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞或者結(jié)締組織細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且上清液可以促進(jìn)肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞或者結(jié)締組織細(xì)胞或祖細(xì)胞的形成，從而治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物體內(nèi)有關(guān)肌肉、脂肪、腱、結(jié)締組織等的病況。這些組合物在這一方面中的特殊應(yīng)用包括例如乳房組織再生、腱或結(jié)締組織再生等。在一些實(shí)施例中，PSC或iPS可以排出抗腫瘤化學(xué)物質(zhì)或因子，并且上清液包含抗腫瘤化學(xué)物質(zhì)或因子，從而治 療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物的腫瘤病況(例如癌癥)。在一些實(shí)施例中，PSC或iPS可以經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)以分化成血液細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且上清液可以促進(jìn)血液細(xì)胞或祖細(xì)胞的形成，從而治療、預(yù)防或改善哺乳動(dòng)物的血液病況。在一些實(shí)施例中，PSC或iPS和上清液可以與軟骨誘導(dǎo)劑(chondroinductiveagent)—起使用。軟骨誘導(dǎo)劑以治療有效量引起PSC或iPS分化成軟骨細(xì)胞或祖細(xì)胞譜系，從而產(chǎn)生軟骨。或者，軟骨誘導(dǎo)劑可以是一種化學(xué)或生物試劑，以治療有效量增進(jìn)PSC或iPS的存活性或植入，其中PSC或iPS提供營(yíng)養(yǎng)因子以刺激軟骨產(chǎn)生，從而治療、延緩或改善軟骨病況。PSC可以是人PSC或動(dòng)物PSC，并且可以是自體PSC、同種異體移植物PSC或異種移植物PSC。iPS可以是人iPS或動(dòng)物iPS，并且可以是自體iPS、同種異體移植物iPS或異種移植物iPS。PSC或iPS的密度可以為每毫升(每I毫升體積組合物)約IXio4到約I X IO8個(gè)。在一些實(shí)施例中，接種密度可以為每毫升約I X IO4到約I X IO6個(gè)、約I X IO4到約IX IO5個(gè)、約IXlO5到約I X IO7個(gè)、約IXlO5到約I X IO6個(gè)、約IXlO6到約I X IO7個(gè)或約I X IO7到約I X IO8個(gè)。接種密度的實(shí)例可以是例如每毫升0.5X104、1X104、0.5X105、I X IO5,0.5Χ106、1Χ106、0.5 X ΙΟ7、I X IO7 或 I X IO8 個(gè)。在一些實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)PSC可以是周細(xì)胞或外膜細(xì)胞。所述組合物可以配制成不同的制劑。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以是臺(tái)架。臺(tái)架可以包括一種或一種以上賦形劑。在一些實(shí)施例中，臺(tái)架可以包括多個(gè)孔，這些孔可以裝載PSC或iPS。在一些實(shí)施例中，可以將例如NELL-1蛋白等試劑包埋在臺(tái)架的主體中，并且將PSC或iPS接種于臺(tái)架中的各個(gè)孔中。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以是生物可降解或生物穩(wěn)定性的。在本發(fā)明另一方面中，提供一種植入式裝置。所述植入式裝置包含以上各種實(shí)施例的組合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“組織”和“器官”如以下所述:在任何上述組合物中，將由干細(xì)胞形成的組織可以是上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織或神經(jīng)組織，這些組織通常是由三個(gè)初級(jí)胚層發(fā)育而成:中胚層、外胚層和內(nèi)胚層。中胚層一發(fā)育成上皮組織、結(jié)締組織和 肌肉組織。外胚層一發(fā)育成神經(jīng)組織和上皮組織。內(nèi)胚層一發(fā)育成上皮組織。上皮組織是由細(xì)胞排列成具有一個(gè)或一個(gè)以上層的連續(xù)薄片而構(gòu)成，具有頂表面和基底表面。基底膜是細(xì)胞的基底表面與下伏的結(jié)締組織之間的連接。存在兩種上皮組織類(lèi)型:(1)被覆上皮與襯里上皮，和(2)腺上皮。細(xì)胞層的數(shù)量與頂層中細(xì)胞的形狀可以對(duì)上皮進(jìn)行分類(lèi):(I)單層上皮一一個(gè)細(xì)胞層；(2)復(fù)層上皮一兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞層；(3)假?gòu)?fù)層柱狀上皮一上皮組織的細(xì)胞都錨定于基底膜但并非所有細(xì)胞都到達(dá)頂部表面的情形；以及(4)腺上皮一(i)內(nèi)分泌:將激素直接釋放到血流中，和(ii)外分泌一分泌到導(dǎo)管中。結(jié)締組織含有許多不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括:成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。結(jié)締組織基質(zhì)是由兩種材料構(gòu)成:基質(zhì)物質(zhì)(groundsubstance)—蛋白質(zhì)和多糖；纖維一網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維。結(jié)締組織可以進(jìn)一步分類(lèi)為:(I)疏松結(jié)締組織一在明膠基質(zhì)中含纖維和許多細(xì)胞類(lèi)型，見(jiàn)于皮膚以及周?chē)堋⑸窠?jīng)和器官中；(2)致密結(jié)締組織一平行的膠原蛋白纖維與成纖維細(xì)胞束，見(jiàn)于腱和韌帶中；以及(3)軟骨一軟骨是由包埋在基質(zhì)糖蛋白中的膠原纖維和彈性纖維以及稱(chēng)為腱細(xì)胞的細(xì)胞構(gòu)成，見(jiàn)于小間隙中。此外，軟骨具有三種亞型:(I)透明軟骨一最脆弱、含量最豐富的類(lèi)型，見(jiàn)于長(zhǎng)骨的末端以及如耳和鼻等結(jié)構(gòu)處；(2)彈力軟骨一維持形狀，分支彈性纖維使其與透明軟骨相區(qū)分；和(3)纖維軟骨一最強(qiáng)健的類(lèi)型，具有致密的膠原蛋白和極少基質(zhì)，見(jiàn)于骨盆、顱骨和椎間盤(pán)中。肌肉組織分為3個(gè)種類(lèi):(1)骨骼肌一隨意肌，有條紋，條紋垂直于肌肉纖維，并且主要見(jiàn)于附著于骨；(2)心肌一非隨意肌，有條紋、分支且具有間盤(pán)；和(3)平滑肌一非隨意肌，無(wú)條紋，呈梭狀并且見(jiàn)于血管和胃腸道中。神經(jīng)組織由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)中的兩種細(xì)胞類(lèi)型組成:(1)神經(jīng)元一將刺激轉(zhuǎn)化成電脈沖傳送到腦部的細(xì)胞，和⑵神經(jīng)膠一支持細(xì)胞。神經(jīng)元是由細(xì)胞體、軸突和樹(shù)突構(gòu)成，具有三種亞型:(1)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元一將來(lái)自CNS的脈沖運(yùn)載到肌肉和腺體；(2)中間神經(jīng)元一解讀來(lái)自感覺(jué)神經(jīng)元的輸入并將最終反應(yīng)傳送到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；和⑶感覺(jué)神經(jīng) 元一接收來(lái)自環(huán)境的信息并傳送到CNS。同時(shí)，神經(jīng)膠是由CNS中的星形細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以及PNS中的雪旺細(xì)胞(Schwanncell)和衛(wèi)星細(xì)胞構(gòu)成。在4個(gè)主要組織類(lèi)型后，器官是接下來(lái)的體內(nèi)組織水平。器官是一種含有至少兩種不同類(lèi)型組織的結(jié)構(gòu)，這些不同類(lèi)型的組織一起作用以達(dá)到共同的目的。器官系統(tǒng)包含兩種或兩種以上不同的器官，這些器官一起作用以提供共同功能。體內(nèi)有10個(gè)主要的器官系統(tǒng):骨骼系統(tǒng)(例如，骨、軟骨、腱和韌帶)、肌肉系統(tǒng)(例如骨骼肌和平滑肌)、循環(huán)系統(tǒng)(例如心臟、血管和血液)、神經(jīng)系統(tǒng)(例如腦、脊髓和周?chē)窠?jīng))、呼吸系統(tǒng)(例如鼻、氣管和肺)、消化系統(tǒng)(例如口、食管、胃、小腸和大腸)、排泄系統(tǒng)(例如腎、輸尿管、膀胱和尿道)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如，下丘腦、垂體、甲狀腺、胰腺和腎上腺)、生殖系統(tǒng)(例如卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睪丸、儲(chǔ)精囊和陰莖)以及淋巴/免疫系統(tǒng)(例如，淋巴結(jié)和淋巴管、淋巴、白細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞)。其它組織/器官/復(fù)雜結(jié)構(gòu)包括(但不限于)皮膚、肝、基質(zhì)、半月板、牙周組織、視網(wǎng)膜、角膜、眼、面部器官、肢體或其它身體部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)組織或器官應(yīng)意指哺乳動(dòng)物受檢者體內(nèi)的任何組織或器官。所述組織或器官可以是例如任何面部器官(例如，鼻、面部皮膚、唇、視網(wǎng)膜或耳)、肢體、動(dòng)脈、靜脈、脂肪，或任何內(nèi)部器官，例如口腔組織或器官(牙齒組織、牙周組織、舌、牙齒)、腦、心臟器官或組織(例如，心臟、心瓣膜、動(dòng)脈和靜脈)、肺組織或器官(例如，肺或氣管，或支氣管)、胃腸組織或器官、乳房、胰腺、肝、泌尿道、脊髓、骨髓、腎、半月板、膀胱或皮膚。在一些其它實(shí)施例中，所述組織可以是骨、軟骨、肌肉、髓、腱或韌帶，或者結(jié)締組織。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)因子”是指由干細(xì)胞分泌的任何養(yǎng)分或因子。所述營(yíng)養(yǎng)因子可以是例如免疫調(diào)節(jié)因子，例如TNF-a、IL-12、IL-10、IL-4、IgGCXCR4、IgMCXCR5、IgACR7、IFN- y , HGF, TGF-β1、防止或減少瘢痕形成的因子、促進(jìn)血管生成的因子、細(xì)胞保護(hù)或抗細(xì)胞凋亡因子、有絲分裂因子、促進(jìn)組織再生的因子或例如透明質(zhì)酸等細(xì)胞基質(zhì)材料。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指使PSC分化成軟骨細(xì)胞或祖細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)軟骨再生，或增進(jìn)PSC或iPS的存活性或植入(其中PSC或iPS提供營(yíng)養(yǎng)因子以刺激軟骨產(chǎn)生，從而治療、延緩或改善軟骨病況)所需的軟骨誘導(dǎo)劑(例如NELL-1因子)的劑量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑”是指促進(jìn)分化成或形成所需細(xì)胞或組織的局部或全身用物質(zhì)或條件。所述物質(zhì)的實(shí)例可以是細(xì)胞或組織、小分子、生物模擬物或動(dòng)態(tài)臺(tái)架(例如，施加機(jī)械力，http:// www.1bridgenetwork.0rg/ucm/dynamic-scaffolds-to-promote-cel!-differentiation)的全身或局部產(chǎn)物，或者促進(jìn)生長(zhǎng)/分化的條件(例如口服維生素 D 或 L-谷氨酉先胺補(bǔ)充，http: //www.springer I ink, com/content/a34m95177w5vn8tl/)或其組合(i列如，http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/19831634),這些在本令頁(yè)域中得至丨丨充分證明。舉例來(lái)說(shuō)，血管生成誘導(dǎo)劑包括生長(zhǎng)因子(ECGF1、FGFU FGF13、FGF2、FGFBPUFIGF, GRN、GRP、HGF、KITLG、LEP, MDK, PDGFB, PDGFD, PGF、PROKU TGFA, VEGFA)、細(xì)胞因子和趨化因子(BMP2、CCL15、CCL2、CSF3、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IL10、IL6、IL8、PPBP> PTN、TNF)(參看例如 http: //www.sabiosciences.com/rtper product/HTML/PAHS-024A.html),以及其它血管生成正調(diào)控因子(AGGF1、AMOT, ANG、ANGPTl、BTGl、EDIL3、EREG, FST、RHOB, RUNXl )。另外，血管生成抑制劑包括細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子(CXCL10、CXCL2、IFNG、IL12A、IL12B、IL17F、PF4、TGFBl)和其它血管生成負(fù)調(diào)控因子(ANGPT2、ANGPTL1、BAH、CD55、CD59、CHGA、C0L18A1、C0L4A3、FNl、IFNAl、IFNBl、KLK3、MLLT7、NPPB, NPRl、PLG、PRL、RNHl、SERPINC1、SERPINE1、SERPINF1、SPINK5、STABl、THBSl、TIEl、 ΜΡ1、 ΜΡ2、 ΜΡ3、TNNI2、TNNI3)。軟骨生成誘導(dǎo)劑的實(shí)例包括分泌蛋白的TGF-β超家族，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_β(TGF-β )和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)(例如，⑶F5、⑶F6、⑶F7、ΒΜΡ2、ΒΜΡ4和ΒΜΡ7)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、刺猬家族蛋 白(Hedgehogfamilyprotein)、脂質(zhì)修飾的Wnt糖蛋白的哺乳動(dòng)物家族、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(參看例如，康尼伯格(Kronenberg)等人，CSH專(zhuān)論(CSHMonographs)，第53卷(2009):骨骼系統(tǒng)(TheSkeletalSystem))。骨誘導(dǎo)劑的實(shí)例包括BMP、TGF_ β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、VEGF、血管生成素、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺激素(相關(guān)蛋白)(PTH/PTHrP)和白細(xì)胞介素(IL)，以及富血小板血漿(PRP)分離物(參看例如，科姆潘(Kempen)等人，組織工程:第B部分(TissueEngineering:PartB), 2010，16(6):551-566 ;諾斯(Nauth)等人，創(chuàng)傷骨科雜志(JOrthopTrauma), 2010;24:543-546)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“軟骨誘導(dǎo)劑”是指有效促進(jìn)軟骨形成或增進(jìn)PSC或iPS的存活性或植入，其中PSC或iPS提供營(yíng)養(yǎng)因子以刺激軟骨產(chǎn)生，從而治療、延緩或改善軟骨病況的化學(xué)或生物試劑。軟骨誘導(dǎo)劑的一個(gè)實(shí)例是NELL-1蛋白。如本文所用，術(shù)語(yǔ)生物試劑是指有關(guān)DNA或氨基酸的任何物質(zhì)，并且可以是例如細(xì)胞、細(xì)胞因子、基因療法、質(zhì)粒，或者蛋白質(zhì)或妝等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“NELL-1蛋白”、“NELL-1肽”與“NELL-1因子”有時(shí)可互換使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“醫(yī)學(xué)病況”、“疾病”與“病癥”可互換使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“運(yùn)動(dòng)損傷(sportinjury)”與“運(yùn)動(dòng)損傷(sportsinjury)”可互換使用并且是指軟組織或器官或者骨骼組織或器官的損傷或病況，例如神經(jīng)組織、肌肉組織、骨或軟骨損傷。在一些實(shí)施例中，這些損傷或病況可以是肌肉、腱、旋轉(zhuǎn)肌群(rotatorcuff)的損傷或病況，或者運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的任何事件，例如http: //www.childrensmemorial.0rg/depts/sportsmedicine/healthtopics.aspx 和 http://www.reportsnreports.com/reports/25322-us-market-for-orthopedic-soft-tissue-and-sports-medicine-2010.html中描述的這些事件。基于細(xì)胞的療法已經(jīng)充分證明，基于細(xì)胞的療法能通過(guò)細(xì)胞再生有效治療或改善病癥(參看例如，阿諾德1.卡普蘭(Arnoldl.Caplan)，人類(lèi)疾病的治療:使用成人間充質(zhì)干細(xì)胞的基于細(xì)胞的療法(TreatmentofHumanDiseases: Cell-basedTherapiesusingAdultMesenchymalStemCells)〃，新澤西生物材料與再生醫(yī)學(xué)專(zhuān)題論集(NJSympBiomat&Regen.Med.), 2008年10月8日)。以上公開(kāi)的各種實(shí)施例的PSC、iPS或上清液可以用于治療或改善任何所述病癥。可以用本文中公開(kāi)的各種實(shí)施例的PSC、iPS、組合物或上清液治療或改善的醫(yī)學(xué)病況可以是有關(guān)損傷或患病器官或組織的任何病況。這些器官或組織如上文所述。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病。所述CNS疾病可以涉及脊髓或腦，并且可以由外傷、感染、退化、結(jié)構(gòu)缺損、腫瘤或自體免疫障礙引起。所述CNS疾病的實(shí)例包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、腦炎、腦膜炎、熱帶痙攣性輕截癱、蛛網(wǎng)膜囊腫、亨廷頓氏病(Huntington，sdisease)、閉鎖綜合癥、圖雷特氏病(Tourette，s disease)和多發(fā)性硬化。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況與組織中瘢痕形成有關(guān)。所述醫(yī)學(xué)病況可以是例如皮膚瘢痕或纖維化。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的肌肉、脂肪、腱、結(jié)締組織等有關(guān)。這些組合物在這一方面中的特殊應(yīng)用包括例如乳房組織再生、腱或結(jié)締組織再生等。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤病況(例如癌癥)有關(guān)。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血液病況(例如白血病)有關(guān)。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況與軟骨損傷、缺損或疾病有關(guān)。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是骨相關(guān)病況，例如骨損傷。在一些實(shí)施例中，骨相關(guān)病況可以是與骨再生、肌肉骨骼損傷、骨修復(fù)或骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的任何病況。骨修復(fù)可以通過(guò)對(duì)需要治療的受檢者提供成骨干細(xì)胞、骨誘導(dǎo)表面和/或骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。舉例來(lái)說(shuō)，以上或以下描述的本發(fā)明的實(shí)施例可用于(I)腰椎融合術(shù)，如(例如)自體骨移植物代替單次應(yīng)用腰椎融合術(shù)；或(2)脛骨骨折修復(fù)以治療已經(jīng)用髓內(nèi)釘固定來(lái)穩(wěn)定的急性、開(kāi)放性脛骨干骨折。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是心臟病。所述心臟病可以是例如心臟缺血。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是腎病。所述腎病可以是例如腎缺血。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是腦部病況。所述腦部病況可以是例如中風(fēng)或腦缺血。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是脊柱病況。所述脊柱病況可以是例如脊髓損傷。在一些實(shí)施例中，醫(yī)學(xué)病況可以是運(yùn)動(dòng)損傷病況。所述運(yùn)動(dòng)損傷病況可以是例如半月板撕裂。其它示范性醫(yī)學(xué)病況包括例如哮喘或其它呼吸道疾病、I型糖尿病，以及國(guó)際疾病分類(lèi)(ICD)和當(dāng)代操作術(shù)語(yǔ)集(CPT)版本中所列的病況。在一些實(shí)施例中，基于細(xì)胞的療法是軟骨再生。軟骨再生可以使用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。使用間充質(zhì)干細(xì)胞的各種軟骨再生方法已有所報(bào)導(dǎo)(參看例如，厄馬蘇 K.(Uematsu, K.),生物材料(Biomaterials).26 (20): 4273-9 (2005))并且評(píng)述于陳(Chen)等人， 自然風(fēng)濕病學(xué)臨床應(yīng)用(NATURECLINICALPRACTICERHEUMATOLOGY) 2 (7):: 373-382 (2006);蓋勒 J.(Galle1J.)等人，當(dāng)今醫(yī)藥化學(xué)(CurrentMedicinalChemistry),第 17 卷，11 月 21 日，2010 年 7 月，第 2274-2291 頁(yè)(18))中。據(jù)報(bào)導(dǎo)，PSC是MSC的血管周祖先(參看例如，克里斯安(Crisan)等人，細(xì)胞一干細(xì)胞(CellStemCell) 3:301-33(2008);科斯利(Corselli)等人，動(dòng)脈粥樣硬化、血栓與血管生物學(xué)(ArteriosclerThrombVaseBiol) 30:1104-1109 (2010))。使用PSC而非MSC進(jìn)行軟骨再生的益處是多方面的。大多數(shù)的細(xì)胞擴(kuò)增或培養(yǎng)程序是基于使用胎牛血清(FBS),它有發(fā)生異體免疫(xenoimmunization)[例如非人類(lèi)免疫原性唾液酸(Neu5Gc)]以及傳播已知(例如傳播牛海綿狀腦病的朊病毒)和未知病原體的風(fēng)險(xiǎn)。另外，不管培養(yǎng)基如何，離體培養(yǎng)增加了微生物或顆粒污染的風(fēng)險(xiǎn)以及遺傳不穩(wěn)定性(達(dá)錫爾J.A.(Dahl，J.A.)等人，在自體血清或胎牛血清中擴(kuò)增的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳不穩(wěn)定性(Geneticandepigeneticinstabilityofhumanbone marrowmesenchymalstemceIlsexpandedinautologousserumorfetalbovineserum).國(guó)際發(fā)育生物學(xué)雜志(IntJDevBiol)52，1033-42(2008))。從安全性的觀點(diǎn)看，使用新鮮采集和分選的PSC優(yōu)于培養(yǎng)的MSC (例如ASC)，因?yàn)樗档土酥旅庖摺⒏腥竞椭履[瘤的風(fēng)險(xiǎn)。PSC的使用優(yōu)于MSC的其它益處在于:1]自然組織定位、表型和發(fā)育潛能的精確表征(MSC追溯性地來(lái)源于原代、異源細(xì)胞培養(yǎng)物)和2]改良的營(yíng)養(yǎng)效力(已經(jīng)確定，PSC的肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子分泌量是經(jīng)典來(lái)源的脂肪組織和臍血MSC的10到20倍并且堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌量是經(jīng)典來(lái)源的脂肪組織和臍血MSC的3到7倍(陳C.W.(Chen, C.W).等人，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子評(píng)述(Cytokines andGrowthFactorsReviews), 20(5):429-434(2009)))。因此，從FDA管理觀點(diǎn)看，使用PSC將有助于產(chǎn)物身份、純度、無(wú)菌性、安全性和效力的論證。在一些實(shí)施例中，基于細(xì)胞的療法提供一種針對(duì)運(yùn)動(dòng)損傷或病況的療法。所述損傷或病況可以是軟組織或器官或者骨 骼組織或器官的損傷或病況，例如神經(jīng)組織、肌肉組織、骨或軟骨損傷。在一些實(shí)施例中，這些損傷或病況可以是肌肉、腱、旋轉(zhuǎn)肌群的損傷或病況，或者運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的任何事件，例如http://www.childrensmemorial.0rg/depts/sport smedicine/healthtopics.aspx 和 http: / / www.report snreport s.com/reports/25322-us-market-for-orthopedic-soft-tissue-and-sports-medicine-2010.html 中描述的這些事件。在一些實(shí)施例中，所述基于細(xì)胞的療法是前/后十字韌帶(ACL/PCL)重建、ACL/PCL固定、軟骨修復(fù)、半月板軟骨修復(fù)、旋轉(zhuǎn)肌群修復(fù)、肩盂唇修復(fù)、旋轉(zhuǎn)肌群移植物增強(qiáng)，或者神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)或再生。PSC 和 iPS如本文所用，術(shù)語(yǔ)血管周干細(xì)胞(PSC)應(yīng)涵蓋周細(xì)胞和外膜細(xì)胞。PSC的分離已得到充分證明。舉例來(lái)說(shuō)，在美國(guó)申請(qǐng)案第11/746979號(hào)中，周細(xì)胞是由皮奧特(Peault)和哈沃德(Huard)從各種組織分離。從各種組織分離外膜細(xì)胞已得到充分證明(數(shù)據(jù)未顯示)。已經(jīng)從基本上所有測(cè)試的組織分離出PSC，包括骨骼肌、胰腺、胎盤(pán)、脂肪、腦、心臟、皮膚、肺、眼、內(nèi)臟、骨髓、臍帶或牙齒。在一些實(shí)施例中，可以通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選術(shù)(FACS)從脂肪組織的基質(zhì)血管部分中純化出數(shù)量足以實(shí)現(xiàn)臨床功效的自體PSC，無(wú)需離體擴(kuò)增。以下描述從人骨骼肌組織分離周細(xì)胞PSC的實(shí)例:周細(xì)胞的分離.簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，從脂肪和大血管結(jié)構(gòu)分離骨骼肌，隨后切成小片。然后在含有DMEM (高糖；吉博公司(Gibco))、20%FBS (吉博公司)、1%青霉素-鏈霉素(PS)(吉博公司)并且補(bǔ)充有I型、II型和IV型膠原蛋白酶各0.5mg/ml的培養(yǎng)基中培育肌肉(例如，在37°C下45分鐘)。過(guò)濾所得到的細(xì)胞懸浮液以去除所有碎片。沖洗后，根據(jù)針對(duì)⑶146、NG2(在血管形態(tài)發(fā)生期間與周細(xì)胞有關(guān)的蛋白聚糖)和H)GF-R13的正表達(dá)以及造血(⑶45)、內(nèi)皮(⑶34)和生肌(⑶56)細(xì)胞標(biāo)記物的不存在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS分選。利用FACS，經(jīng)由碘化丙啶染色來(lái)排除死亡的細(xì)胞。接種分選的周細(xì)胞(例如，接種2 X IO4個(gè)細(xì)胞/平方厘米于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基2 (EGM-2，坎貝斯生物科技公司(CambrexBioscience))中)并培養(yǎng)(例如，在涂有0.2%明膠(卡爾生物化學(xué)公司(Calbiochem))的板中37°C下保持2周)。一周一次對(duì)周細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化并培養(yǎng)(例如，以1:3稀釋(從第I代到第5代)隨后1:10稀釋(第5代以后))。除第I代外，所有周細(xì)胞都培養(yǎng)在未涂覆的燒瓶中(例如，在DMEM/FBS/PS增殖培養(yǎng)基中)，以維持其初始表型。第9代與第11代之間的周細(xì)胞用于所有測(cè)試。外膜PSC的分離是由實(shí)例I中所述的程序例示說(shuō)明。iPS的形成已得到充分證明(參看例如，沖田K (Okita, K)等人，自然(Nature)448(7151):313-7(2007);馬赫拉力 N (MaheraliN)等人，細(xì)胞一干細(xì)胞，1:55-70 (2007)；和韋尼格M (Wernig，M)等人；自然，448 (7151): 318-24 (2007))。形成和分選iPS的示范性分步程序詳細(xì)描述于帕克(Park)等人，自然一實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(NatureProtocols), 2008, 3(7):1180-1186中，其教導(dǎo)內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。NELL-1 閔子如本文所用，“NELL-1因子”包括任何哺乳動(dòng)物來(lái)源(例如人類(lèi)、鼠類(lèi)、大鼠等)的野生型(即，天然存在的)Nelll蛋白。用于本發(fā)明中的示范性NELL-1因子包括人類(lèi)NELL-1蛋白(SEQIDN0:1)、鼠類(lèi) NELL-1 蛋白(SEQIDN0:2)和大鼠 NELL-1 蛋白(SEQIDN0:3)。如本文所用，“NELL-1因子”還包括野生型NELL-1蛋白的功能性衍生物。“功能性衍生物”是指經(jīng)過(guò)修飾的NELL-1蛋白，這種蛋白質(zhì)與野生型NELL-1蛋白相比具有一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、缺失或插入，并且實(shí)質(zhì)上保留了野生型NELL-1蛋白的活性。“實(shí)質(zhì)上”意指至少50%、至少75%或甚至至少85%的野生型NELL-1蛋白的活性。根據(jù)本發(fā)明，為了使功能性衍生物實(shí)質(zhì)上保留野生型NELL-1蛋白的活性或功能，所述功能性NELL-1衍生物與野生型NELL-1蛋白共有至少75%、至少85%、至少95%或甚至99%的序列一致性。NELL-1蛋白的結(jié)構(gòu)已得到表征(參看例如,庫(kù)洛達(dá)(Kuroda)等人，1999a ;庫(kù)洛達(dá)等人，1999b，德賽(Desai)等人，2006)。舉例來(lái)說(shuō)，鼠類(lèi)NELL-1蛋白(SEQIDN0:4)是具有810個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有分泌信號(hào)肽(氨基酸I到16)、N末端類(lèi)TSP模塊(氨基酸29到213)、層粘蛋白G區(qū)(氨基酸86到210)、范威氏因子C結(jié)構(gòu)域(氨基酸273到331和699到749)以及Ca2+結(jié)合類(lèi)EGF結(jié)構(gòu)域(氨基酸549到586)。NELL-1蛋白的分泌信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域是所述蛋白質(zhì)中通常參與將蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器中的氨基酸序列，在所述細(xì)胞器中，所述蛋白質(zhì)被加工以分泌到細(xì)胞外部。N末端類(lèi)TSP模塊一般與肝素結(jié)合有關(guān)，范威氏因子C結(jié)構(gòu)域一般涉及NELL-1的寡聚合。NELL-1蛋白的層粘蛋白G結(jié)構(gòu)域一般涉及NELL-1蛋白粘附到特定細(xì)胞類(lèi)型或其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。這些結(jié)構(gòu)域與其搭配物的相互作用一般與例如分化、粘附、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或調(diào)節(jié)特定細(xì)胞-細(xì)胞相互作用以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等過(guò)程有關(guān)。NELL-1的Ca2+結(jié)合類(lèi)EGF結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白激酶C β，它通常涉及生長(zhǎng)和分化中的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)路徑。

NELL-1蛋白的氨基酸序列高度保守，尤其是在哺乳動(dòng)物物種中。舉例來(lái)說(shuō)，鼠類(lèi)NELL-1蛋白與人類(lèi)NELL-1蛋白(SEQIDNO:1)共有約93%序列一致性，而人類(lèi)NELL-1蛋白又與大鼠NELL-1蛋白(SEQIDN0:2)共有約90%序列一致性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何眾所周知的分子克隆技術(shù)，同時(shí)考慮NELL-1的功能性結(jié)構(gòu)域(例如，分泌信號(hào)肽序列、N末端類(lèi)TSP模塊、層粘蛋白G區(qū)、范威氏因子C結(jié)構(gòu)域)來(lái)產(chǎn)生具有一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代、缺失或插入的NELL-1衍生物。參看例如，當(dāng)代分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(CurrentProtocolsinMoIecularCloning)(奧蘇貝爾(Ausubel)等人，約翰威立公司(JohnWiley&Sons),紐約(NewYork))οNELL-1功能性衍生物的最小長(zhǎng)度通常為至少約10個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，更通常為至少約20個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，甚至為至少約30個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，并且更通常為至少約40個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。如上文所陳述，野生型NELL-1蛋白為大致約810個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。NELL-1功能性衍生物可以為至多約810個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，NELL-1功能性衍生物可以至多約 820、805、800、790、780、750、600、650、600、550 個(gè)等氨基酸殘基長(zhǎng)。一旦制得NELL-1蛋白衍生物，就可以對(duì)這種蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，以確定這種衍生物是否實(shí)質(zhì)上保留了野生型NELL-1蛋白的活性或功能。舉例來(lái)說(shuō)，可以測(cè)試NELL-1衍生物結(jié)合PKCii的能力。用于評(píng)估NELL-1與PKCii的結(jié)合的適合分析描述于例如庫(kù)洛達(dá)等人(1999b)中。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)使用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，可以將經(jīng)過(guò)修飾的NELL-1蛋白與GAL4活化結(jié)構(gòu)域融合，并且可以將PKC的調(diào)控結(jié)構(gòu)域與GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。可以檢測(cè)酵母細(xì)胞中β_半乳糖苷酶的活性。此外，還可以測(cè)試NELL-1衍生物刺激軟骨細(xì)胞譜系中的前體細(xì)胞向成熟軟骨細(xì)胞分化的能力。可以從細(xì)胞方面(組織學(xué))和分子方面(心臟特異性蛋白質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)材料的表達(dá))評(píng)估軟骨細(xì)胞的成熟度。另外，作為一項(xiàng)替代性分析，可以通過(guò)檢測(cè)后期分子骨標(biāo)記物的表達(dá)或礦化作用(即，鈣沉積物)來(lái)測(cè)試NELL-1衍生物驅(qū)使成骨細(xì)胞前體成為成熟骨細(xì)胞的能力。通過(guò)在一個(gè)或一個(gè)以上分析(例如上文所述的分析)中比較NELL-1衍生物的活性與野生型NELL-1蛋白的活性， 應(yīng)該能夠確定這種衍生物是否實(shí)質(zhì)上保留了野生型NELL-1蛋白的活性或功能。NELL-1蛋白或其功能性衍生物可以由本領(lǐng)域中眾所周知的方法制備。一種此類(lèi)方法包括分離或合成編碼NELL-1蛋白的DNA，并通過(guò)任選地在重組載體中、適合宿主細(xì)胞(包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)所述DNA來(lái)產(chǎn)生重組蛋白。所述適用于合成DNA的方法例如卡瑟斯(Caruthers)等人,1985.科學(xué)(Science) 230:281-285以及DNA結(jié)構(gòu)，A部分:DNA的合成和物理分析(DNAStructure, PartA: SynthesisandPhysicalAnalysisofDNA),李雷 D.M.J.(Lilley, D.M.J.)和達(dá)哈伯格 J.E.) (Dahlberg, J.E.)(編)，酶學(xué)方法(MethodsEnzymoL)，211，學(xué)術(shù)出版有限公司(AcademicPress, Inc.),紐約(1992)所述。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指使PSC分化成軟骨細(xì)胞或祖細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)軟骨再生，從而治療、延緩或改善軟骨病況所需的劑量。精確劑量取決于軟骨細(xì)胞類(lèi)型、所治療的疾病狀態(tài)或病況，以及其它臨床因素，例如受檢者的體重和狀況、受檢者對(duì)療法的反應(yīng)、制劑類(lèi)型和投藥途徑。作為一個(gè)一般原則，供投予成年人的NELL-1組合物(B卩，包括NELL-1蛋白或核酸)的適合劑量在每公斤體重約0.0Olmg到約20mg范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，供投予成年人的NELL-1組合物的適合劑量是在每公斤體重約0.0lmg到約5mg范圍內(nèi)。然而，治療有效并且無(wú)害的精確劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。NELL-1蛋白和所述蛋白質(zhì)的制備方法已經(jīng)描述于美國(guó)申請(qǐng)案第10/544，553號(hào)、第11/392，294號(hào)、第11/713，366號(hào)和第11/594，510號(hào)以及美國(guó)專(zhuān)利第7，052，856號(hào)中。這些申請(qǐng)案和專(zhuān)利的教導(dǎo)內(nèi)容以引用的方式并入本文中。制劑和載劑本文公開(kāi)的組合物可以配制成不同的制劑。所述組合物可以包括獲得所需制劑的材料和載劑。舉例來(lái)說(shuō)，組合物可以包括可注射或可模制材料，這種材料可以在預(yù)定的放置時(shí)間段內(nèi)設(shè)置。所述預(yù)定時(shí)間段可以為例如10分鐘、30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)等。在一些實(shí)施例中，所述組合物可以包括化學(xué)凝膠，這種凝膠包括因pH、離子環(huán)境和溶劑濃度改變而形成的主鍵。這些化學(xué)凝膠的實(shí)例可以為(但不限于)多糖，例如殼聚糖、殼聚糖加離子鹽(例如β -甘油磷酸鹽、海藻酸鹽加Ba2+、Sr2+、Ca2+、Mg2+)、膠原蛋白、纖維蛋白、血漿或其組合。在一些實(shí)施例中，組合物可以包括物理凝膠，這種凝膠包括因溫度改變而形成的副鍵。這些物理凝膠的實(shí)例可以為(但不限于)海藻酸鹽、聚(乙二醇)_聚(乳酸-共-乙醇酸)_聚(乙二醇)(PEG-PLGA-PEG)三嵌段共聚物、瓊脂糖和纖維素。在一些實(shí)施例中，可以用于本文所述的組合物中的物理凝膠可以包括在高剪切下呈液態(tài)而在低剪切下膠凝成固態(tài)的物理凝膠。這些物理凝膠的實(shí)例包括(但不限于)透明質(zhì)酸或聚氧化乙烯。物理凝膠可以使預(yù)先形成的材料具有預(yù)定的尺寸和形狀。在一些實(shí)施例中，本文所述的組合物可以包括對(duì)刺激起反應(yīng)而降解或釋放活性劑的材料。所述刺激的一些實(shí)例是機(jī)械刺激、光、溫度改變、PH改變、離子強(qiáng)度改變或電磁場(chǎng)。所述材料是本領(lǐng)域中已知的。這些材料的一些實(shí)例為殼聚糖、海藻酸鹽、普朗尼克(pluronics)、甲基纖維素、透明質(zhì)酸和聚氧化乙烯。其它實(shí)例描述于布蘭德F(Brandl F)，索莫F (SommerF),喬普費(fèi)奇A (GoepferichA).“用于組織工程的水凝膠的合理設(shè)計(jì):物理因素對(duì)細(xì)胞行為的影口向(Rationaldesignofhydrogelsfortissueengineering:1mpactofphysicalfactorsonceIlbehavior)^,生物材料(Biomaterials).電子版 2006 年 9 月 29 日中。在一些實(shí)施例中，本文所述的組合物(包括上文所述的任何凝膠)可以另外包括交聯(lián)劑，以進(jìn)一步定制降解動(dòng)力學(xué)和受控釋放。或者，在一些實(shí)施例中，本文所述的組合物可以包括互穿相復(fù)合材料或互穿網(wǎng)絡(luò)(interpenetratingnetwork, IPN),包括上述任何凝膠。交聯(lián)劑的一些實(shí)例包括(但不限于)常用交聯(lián)劑(聚氧化烯、二甲基丙烯酸亞乙酯、N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、亞甲基雙(4-苯基異氰酸酯)、二甲基丙烯酸亞乙酯、二乙烯苯、甲基丙烯酸烯丙酯、羰基二咪唑、磺酰氯、氯代碳酸酯、η-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺酯、環(huán)氧化物、芳基鹵化物、磺基琥珀酰亞胺酯和順丁烯二酰亞胺)；基于PEG的交聯(lián)劑(例如，MAL-dPEGx-NHS-酯、MAL-dPEGx酸、雙-MAL_dPEGx等)以及光/光照活化的交聯(lián)劑、基于N-羥基琥珀酰亞胺的交聯(lián)劑、二賴(lài)氨酸、三賴(lài)氨酸和四賴(lài)氨酸。本文所述的組合物可以包括載劑。載劑可以是聚合物載劑或非聚合物載劑。在一些實(shí)施例中，載劑可以是生物可降解的，例如可通過(guò)酶促或水解機(jī)制降解。載劑的實(shí)例包括(但不限于)合成可吸收 聚合物，例如(但不限于)聚(α-羥基酸)，例如聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(-己內(nèi)酯)、聚(碳酸三甲酯)、聚(對(duì)二氧雜環(huán)己酮)、聚(-己內(nèi)酯-共-甘醇酸酯)、聚(乙交酯-共-碳酸三甲酯)聚(D, L-丙交酯-共-碳酸三甲酯)、聚芳基化物(polyarylate)、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亞胺)、丙烯-共-反丁烯二酸酯、聚內(nèi)酯、聚酯、聚碳酸酯、聚陰離子型聚合物、聚酸酐、聚酯-酰胺、聚(氨基酸)、均聚多肽、聚(磷腈)、poly (glaxanone)、多糖和聚(原酸酯)、聚輕基乙酸、聚乳酸、聚糖醒酸、聚丙烯酸、聚烷酸酯；其共聚物和混合物，以及任何衍生物和修飾。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利4，563，489和PCT國(guó)際申請(qǐng)案第W0/03024316號(hào)，以引用的方式并入本文中。載劑的其它實(shí)例包括纖維素類(lèi)聚合物，例如(但不限于)烷基纖維素、羥基烷基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素和其陽(yáng)離子鹽。載劑的其它實(shí)例包括合成和天然生物陶瓷，例如(但不限于)碳酸鈣、磷酸鈣、磷灰石、生物活性玻璃材料和珊瑚源性磷灰石。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案2002187104 ；PCT國(guó)際申請(qǐng)案W0/9731661 ;和PCT國(guó)際申請(qǐng)案W0/0071083，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以另外涂覆組合物，包括來(lái)源于溶膠-凝膠技術(shù)或來(lái)自浸潰技術(shù)的生物玻璃和或磷灰石，例如(但不限于)鈣和磷酸鹽濃度為天然血清濃度的約1.5倍到7倍并且通過(guò)各種手段調(diào)整成在約15到65攝氏度下pH范圍為約2.8-7.8的溶液的模擬體液。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利6，426，114和6，013，591 ;以及PCT國(guó)際申請(qǐng)案W0/9117965,以引用的方式并 入本文中。載劑的其它實(shí)例包括膠原蛋白(例如Collastat、Helistat膠原蛋白海綿)、透明質(zhì)燒(hyaluronan)、纖維蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽和明膠。參看例如，PCT國(guó)際申請(qǐng)案W0/9505846 ；W0/02085422,以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以包括肝素結(jié)合劑；包括(但不限于)類(lèi)肝素聚合物，例如硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸肝素、巖藻聚糖、海藻酸鹽或其衍生物；以及具有增加肝素親和力的氨基酸修飾的肽片段。參看例如，生物化學(xué)雜志(JournalofBiological Chemistry)(2003)，278(44)，第43229-43235頁(yè)，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物可以呈液體、固體或凝膠形式。在一個(gè)實(shí)施例中，基質(zhì)可以包括呈可流動(dòng)凝膠形式的載劑。所選凝膠可以為可注射的，例如可經(jīng)由注射器注射到需要形成軟骨的部位。凝膠可以是一種化學(xué)凝膠，這種化學(xué)凝膠可以是通過(guò)主鍵形成并受pH、離子團(tuán)和/或溶劑濃度控制的化學(xué)凝膠。凝膠還可以是一種物理凝膠，這種物理凝膠可以通過(guò)副鍵形成并受溫度和粘度控制。凝膠的實(shí)例包括(但不限于)普朗尼克、明膠、透明質(zhì)烷、膠原蛋白、聚丙交酯-聚乙二醇溶液和偶聯(lián)物、殼聚糖、殼聚糖與b-甘油磷酸(BST-凝膠)、海藻酸鹽、瓊脂糖、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧化乙烯、聚丙交酯/乙交酯于N-甲基-2-吡咯烷酮中。參看例如，解剖學(xué)記錄(AnatomicalRecord) (2001)，263 (4)，342-349，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以是可光聚合的，例如通過(guò)用至少約250nm波長(zhǎng)的電磁輻射聚合。可光聚合的聚合物的實(shí)例包括聚乙烯(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物、反丁烯二酸亞丙酯-共-乙二醇、聚乙烯醇衍生物、PEG-共-聚(_羥基酸)二丙烯酸酯大分子單體，以及改性多糖，例如透明質(zhì)酸衍生物和葡聚糖甲基丙烯酸酯。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利5，410，016，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物可以包括溫度敏感性載劑。實(shí)例包括由N-異丙基丙烯酰胺(NiPAM),或具有降低的下臨界溶液溫度(lowercriticalsolutiontemperature, LCST)并通過(guò)并入甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺增進(jìn)肽(例如NELL-1)結(jié)合的改性的NiPAM ;或甲基丙烯酸烷酯，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷酯制成的載劑(參看例如，W0/2001070288 ;美國(guó)專(zhuān)利5，124，151，二者以引用的方式并入本文中)。在一個(gè)實(shí)施例中，其中載劑可以具有一個(gè)表面，此表面用可以經(jīng)由受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)附著的細(xì)胞粘附分子、粘附肽和粘附肽類(lèi)似物和/或可以經(jīng)由非受體介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)粘附的分子部分修飾和/或固定，從而結(jié)合于例如(但不限于)聚陽(yáng)離子型聚氨基酸肽(例如聚賴(lài)氨酸)、聚陰離子型聚氨基酸肽、Mefp類(lèi)粘附分子和其它富含DOPA的肽(例如聚賴(lài)氨酸-D0PA)、多糖和蛋白聚糖。參看例如，W0/2004005421 ；W0/2003008376 ；W0/9734016,以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以包括各種天然存在的基質(zhì)或其組分，例如失活的軟骨基質(zhì)、去礦物質(zhì)的骨基質(zhì)，或來(lái)源于同種異體移植物、異種移植物，或者來(lái)源于原核生物界、原生生物界、真菌界、植物界或動(dòng)物界的任何其它天然存在材料的其它組分。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以包括一種或一種以上螯合劑，例如(但不限于)膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、聚(乙二醇)、烷基纖維素(包括羥基烷基纖維素)，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素和羧甲基纖維素、血液、纖維蛋白、聚氧化乙烯、半水合硫酸鈣、磷灰石、羧基乙烯基聚合物和聚(乙烯醇)。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利6，620，406，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可 以包括表面活性劑，以促進(jìn)NELL-1肽在載劑材料內(nèi)穩(wěn)定和/或分布，例如(但不限于)聚氧酯(例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或普朗尼克F-68)。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以包括緩沖劑，例如(但不限于)甘氨酸、鹽酸谷氨酸、氯化鈉、胍、肝素、鹽酸谷氨酸、乙酸、琥珀酸、聚山梨醇酯、硫酸葡聚糖、蔗糖和氨基酸。參看例如，美國(guó)專(zhuān)利5，385，887，以引用的方式并入本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，載劑可以包括例如上文所列材料等材料的組合。舉例來(lái)說(shuō)，載劑可以是PLGA/膠原蛋白載劑膜。所述膜可以浸泡在包括NELL-1肽的溶液中。植入物可以包括成形為支架、網(wǎng)格、釘、螺釘、板或假關(guān)節(jié)形狀的基質(zhì)。植入物可以包括可再吸收的基質(zhì)，例如包括膠原蛋白的基質(zhì)。所述組合物也可以包括用以形成藥物組合物的可接受的載劑。可接受的載劑可以含有生理學(xué)上可接受的化合物，這種化合物用于例如使所述組合物穩(wěn)定，或者增加或減少試劑的吸收。生理學(xué)上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，例如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質(zhì)；減少抗有絲分裂劑的清除或水解的組合物；或者賦形劑，或其它穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。其它生理學(xué)上可接受的化合物包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑或防腐劑(特別適用于防止微生物生長(zhǎng)或作用)。各種防腐劑為眾所周知的并且包括例如酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，載劑(包括生理學(xué)上可接受的化合物)的選擇取決于例如投藥途徑。所述組合物可以根據(jù)投藥方法以多種單位劑型投予。舉例來(lái)說(shuō)，適合的單位劑型可以包括粉劑，或者可注射或可模制的糊劑或懸浮液。本發(fā)明的組合物可以包含藥學(xué)上可接受的載劑，例如用于水溶性肽的水性載劑。可以使用多種載劑，例如緩沖生理鹽水等。這些溶液是無(wú)菌的，并且一般不含不合需要的物質(zhì)。這些組合物可以通過(guò)常規(guī)、眾所周知的滅菌技術(shù)來(lái)滅菌。所述組合物可以視需要含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，以接近生理?xiàng)l件，例如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中的NELL-1肽的濃度可以變化極大，并且主要基于流體體積、粘度、體重等，根據(jù)所選特定投藥模式和患者的需求來(lái)選擇。所述組合物可以包括呈各種群體密度的PSC。PSC的密度可以為每毫升(每I毫升體積組合物)約I X IO4到約I X IO8個(gè)。在一些實(shí)施例中，接種密度可以為每毫升約IXlO4到約IX IO6個(gè)、約IXlO4到約IX IO5個(gè)、約IXlO5到約IX IO7個(gè)、約IXlO5到約IXlO6個(gè)、約I X IO6到約I X IO7個(gè)或約I X IO7到約I X IO8個(gè)。接種密度的實(shí)例可以是例如每毫升 0.5Χ104、1Χ104、0.5Χ105、1Χ105、0.5 X IO6U X IO6,0.5 X ΙΟ7、I X IO7 或 I X IO8 個(gè)。所述制劑可以呈任何劑型。在一些實(shí)施例中，它為粉末制劑。在一些實(shí)施例中，它為液體制劑。在一些實(shí)施例中，它為半固體/半液體制劑，例如凝膠劑或糊劑。在一些實(shí)施例中，所述制劑是植入式裝置，例如骨植入物。在一些實(shí)施例中，所述制劑是一種臺(tái)架。NELL-1的劑量方案可以由所涉及的臨床指征以及各種患者變量(例如體重、年齡、性別)和臨床表現(xiàn)(例如損傷程度、損傷部位等)決定。一般說(shuō)來(lái)，NELL-1是呈足以使PSC分化成軟骨(例如軟骨細(xì)胞或血管細(xì)胞)或祖細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)軟骨再生(例如心肌再生或心血管再生)的濃度。NELL-1的劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，基于試劑類(lèi)型、疾病以及例如年齡和性別等其它因素來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施例中，NELL-1因子的劑量可以用每單位面積組合物或每單位重量組合物的量來(lái)描述。在利用或不利用特 定載劑或臺(tái)架的情況下，NELL-1的劑量范圍一般為
0.001pg/mm2 到 lpg/mm2,或更優(yōu)選為 0.001ng/mm2 到 lng/mm2,或更優(yōu)選為 0.001 μ g/mm2 至IjI μ g/mm2,或更優(yōu)選為0.001mg/mm2到lmg/mm2,或更優(yōu)選為0.001 g/mm2到lg/mm2。在另一實(shí)施例中，在利用或不利用特定載劑或臺(tái)架的情況下，NELL-1的劑量范圍一般為0.001pg/ml到lpg/ml,或更優(yōu)選為0.001ng/ml到lng/ml,或更優(yōu)選為0.001 μ g/ml到I μ g/ml,或更優(yōu)選為0.001mg/ml到lmg/ml,或更優(yōu)選為0.001g/ml到100g/ml。在另一實(shí)施例中，在利用或不利用特定載劑或臺(tái)架的情況下，NELL-1的劑量范圍一般為0.0Olpg/kg到lpg/kg,或更優(yōu)選為0.001ng/kg到lng/kg,或更優(yōu)選為0.001 μ g/kg到I μ g/kg,或更優(yōu)選為0.0Olmg/kg 到 lmg/kg,或更優(yōu)選為 0.001gm/kg 到 lgm/kg,更優(yōu)選為 0.0Olkg/kg 到 lkg/kg。在一些實(shí)施例中，NELL-1的劑量可以用每公斤體重的量來(lái)描述。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于投予成年人，NELL-1的劑量范圍可以為每公斤體重約0.1 μ g到約100mg。在一些實(shí)施例中，供投予成年人的NELL-1組合物的適合劑量是在每公斤體重約0.0Olmg到約20mg范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，供投予成年人的NELL-1組合物的適合劑量是在每公斤體重約0.005mg到約IOmg范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，供投予成年人的NELL-1組合物的適合劑量是在每公斤體重約0.0lmg到約5mg范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，供投予成年人的NELL-1組合物的適合劑量是在每公斤體重約0.05mg到約1.0mg范圍內(nèi)。然而，治療有效并且無(wú)害的精確劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。此外，應(yīng)了解，所有劑量都可以是連續(xù)給予或分成按照指定時(shí)間段給予的劑量。時(shí)間段的實(shí)例包括(但不限于)每I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，或者每周、2周、4周，或每個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月等等。裝置所述組合物可以配制成呈任何所需形式的可注射或植入式裝置。一些示范性裝置可以用于間盤(pán)髓核置換、膝半月板置換、腕部三角纖維軟骨置換、顳下頜關(guān)節(jié)置換、關(guān)節(jié)軟骨置換，并且可以由以下各物組成:具有預(yù)成形的形狀和用以錨定下層骨的連接特征的多孔臺(tái)架；可以通過(guò)手工操作再成形并通過(guò)施加光而固化成新形狀的具有預(yù)成形的形狀的粘性凝膠；或者可以原位聚合的低粘度液體。舉例來(lái)說(shuō)，所述組合物可以配制成單一混合物(singlemixture)(或簡(jiǎn)單混合物)以形成軟骨。在一些實(shí)施例中，組合物可以配制成含有經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)的組織特異性層的單一裝置，例如可能需要具有用以錨定于硬組織的骨層，接著是緊鄰骨層的軟骨層。在一些實(shí)施例中，組合物可以配制成允許多種組織形成和自組裝的單一混合物，例如具有兩親官能團(tuán)的聚合物或單體可以自組裝成宏觀結(jié)構(gòu)。在包括本文所述組合物的裝置具有細(xì)胞的一些實(shí)施例中，所述裝置可以經(jīng)歷預(yù)植入刺激。舉例來(lái)說(shuō)，所述裝置可以放在具有受控制的機(jī)械性刺激(頻率、占空比、振幅等)的機(jī)械生物反應(yīng)器中；據(jù)報(bào)導(dǎo)，頻率在0.0lHz到10，OOOHz范圍內(nèi)，占空比高于10% ;并且振幅在0.1-100%應(yīng)變范圍內(nèi)具有增強(qiáng)的細(xì)胞功能。在一些實(shí)施例中，本文所述的裝置可以放在具有受控制的微流體流量和剪切應(yīng)力的機(jī)械生物反應(yīng)器中，所述剪切應(yīng)力是在至少一個(gè)流動(dòng)路徑或通道具有小于1_的一個(gè)尺寸的時(shí)候產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，本文所述的裝置可以在細(xì)胞采集后立即經(jīng)由直接植入而植入人體中。在一些實(shí)施例中，本文提供的組合物可以形成以下任何裝置實(shí)例，這些實(shí)例將說(shuō)明而不應(yīng)解釋為限制所主張的發(fā)明:含有NELL-1蛋白的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射/植入椎間盤(pán)中以促進(jìn)軟骨形成；浸透NELL-1因子的盤(pán)髓核置換裝置，這種裝置可以設(shè)計(jì)成置換椎間盤(pán)的內(nèi)部部分(髓核)或者椎間盤(pán)的內(nèi)部和外部部分；含有NELL-1蛋白的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射到各種關(guān)節(jié)間隙(例如膝、顳下頜關(guān)節(jié)、腕)中，或者通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放式地植入各種關(guān)節(jié)間隙中；含有NELL-1蛋白的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射/植入椎間盤(pán)中以促進(jìn)軟骨形成；浸透NELL-1蛋白的盤(pán)髓核置換裝置，這種裝置被設(shè)計(jì)成置換椎間盤(pán)的內(nèi)部部分(髓核)或者椎間盤(pán)的內(nèi)部和外部部分；含有NELL-1因子或蛋白質(zhì)的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射到各種關(guān)節(jié)間隙(例如膝、顳下頜關(guān)節(jié)、腕)中，或者通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放式地植入各種關(guān)節(jié)間隙中；含有NELL-1蛋白的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射/植入椎間盤(pán)中以促進(jìn)軟骨形成；浸透NELL-1蛋白的盤(pán)髓核置換裝置，這種裝置可以設(shè)計(jì)成置換椎間盤(pán)的內(nèi)部部分(髓核)或者椎間盤(pán)的內(nèi)部和外 部部分；本發(fā)明的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射到各種關(guān)節(jié)間隙(例如膝、顳下頜關(guān)節(jié)、腕)中，或者通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放式地植入各種關(guān)節(jié)間隙中；本發(fā)明的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射/植入椎間盤(pán)中以促進(jìn)軟骨形成；浸透NELL-1蛋白的盤(pán)髓核置換裝置，這種裝置被設(shè)計(jì)成置換椎間盤(pán)的內(nèi)部部分(髓核)或者椎間盤(pán)的內(nèi)部和外部部分；本發(fā)明的可注射/植入式裝置，這種裝置可以直接注射到各種關(guān)節(jié)間隙(例如膝、顳下頜關(guān)節(jié)、腕)中，或者通過(guò)關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放式地植入各種關(guān)節(jié)間隙中。在一些實(shí)施例中，所述裝置是ACL/PCL固定裝置；或用于軟骨修復(fù)、半月板軟骨修復(fù)、旋轉(zhuǎn)肌群修復(fù)、肩盂唇修復(fù)的裝置；旋轉(zhuǎn)肌群移植物增強(qiáng)裝置；或者神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)的裝置。在一些實(shí)施例中，所述裝置是用本發(fā)明的PSC或iPS接種的縫線，或以其它方式包括本發(fā)明的PSC或iPS的縫線。在一些實(shí)施例中，所述縫線可以包含本發(fā)明的組合物。所述縫線可以是可再吸收的·或不可再吸收的(參看例如，姚(Ya0)等人，手外科學(xué)雜志(JHandSurg.)，2011，36A:252-258)。細(xì)胞接種所述制劑可以呈適于接種PSC或iPS群的任何合乎需要的形式。在制劑是臺(tái)架或植入物的一些實(shí)施例中，制劑可以為多孔的，以便接種PSC或iPS。制劑中的孔可以具有能夠容納接種密度的PSC或iPS的體積。PSC或IPS的接種可以通過(guò)充分確立的細(xì)胞接種程序?qū)崿F(xiàn)(參看例如，安達(dá)勒(Undale)等人，梅奧診所學(xué)報(bào)(MayoClinProc), 84 (I): 893-902 (2009);坎森達(dá)(Cancedda)等人，生物材料，28:4240-4250(2007);和馬卡西(Marcacci)等人，組織工程(TissueEngineering), 13(5):947-955) (2007))并且可以根據(jù)組合物的劑型而變化。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于液體制劑，接種可以通過(guò)將群體放到制劑中來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)。接種多孔植入物或臺(tái)架的實(shí)例描述于何偉(WeiHe)等人，基于周細(xì)胞的人組織工程化的血管移植物(Pericyte-BasedHumanTissueEngineeredVascularGrafts),生物材料,31 (32): 8235-8244 (2010)。PSC或iPS的接種密度可以在每毫升(每I毫升體積組合物)約I X IO4到約IXlO8個(gè)間變動(dòng)。在一些實(shí)施例中，接種密度可以為每毫升約IXio4到約IXlO6個(gè)、約IXlO4到約IX IO5個(gè)、約IXlO5到約I X IO7個(gè)、約IXlO5到約I X IO6個(gè)、約IXlO6到約I X IO7個(gè)或約I X IO7到約I X IO8個(gè)。接種密度的實(shí)例可以是例如每毫升0.5X104、1X104、0.5X105、I X IO5,0.5Χ106、1Χ106、0.5 X ΙΟ7、I X IO7 或 I X IO8 個(gè)。以下描述在臺(tái)架中接種PSC或iPS的實(shí)例:接種PSC.將hPSC懸浮液經(jīng)由索勒提(Soletti)等人，生物材料，27(28):4863-70(2006)所述的真空旋轉(zhuǎn)接種裝置接種到ES-TIPSPEUU臺(tái)架中。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，將臺(tái)架連接到氣密性腔室內(nèi)部的兩個(gè)共軸不銹鋼三通。將所述腔室連接到室內(nèi)真空(housevacuum)以維持恒定負(fù)壓(-130mmHg),從而誘導(dǎo)細(xì)胞懸浮液跨臺(tái)架的透壁流動(dòng)。注射泵將細(xì)胞懸浮液(I X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升)以2.5mL/min輸注到手動(dòng)旋轉(zhuǎn)的臺(tái)架中，以在不到2分鐘內(nèi)達(dá)到每個(gè)臺(tái)架3X IO6個(gè)細(xì)胞，從而產(chǎn)生具有均勻分布的細(xì)胞的臺(tái)架。經(jīng)過(guò)接種的臺(tái)架立即進(jìn)行靜置培養(yǎng)，保持3小時(shí)，這足以供細(xì)胞附著(參看例如，索勒提等人，生物材料，29(7):825-33(2008))。隨后將臺(tái)架轉(zhuǎn)移到含200mL培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)瓶中，以15rpm攪拌培養(yǎng)2天，之后，將其植入大鼠體內(nèi)。接種后立即在SEM下觀察臺(tái)架。在2天的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)后進(jìn)一步評(píng)估經(jīng)過(guò)接種的臺(tái)架的組織學(xué)(H&E)、細(xì)胞分布(F-肌動(dòng)蛋白和核染色)和附著(SEM)。對(duì)于F-肌動(dòng)蛋白染色，對(duì)冷凍切片進(jìn)行滲透(0.l%Triton)，保持30分鐘，阻斷(2%BSA) 30分鐘，隨后與偶聯(lián)Alexa488的鬼筆環(huán)肽(phalloidin) (1:500,西格瑪公司(Sigma)) 一起培育I小時(shí)。以下陳述的實(shí)例將說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。所有參數(shù)和數(shù)據(jù)都不限制本發(fā)明實(shí)施例的范圍。一般方法通過(guò)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)量和成骨分化來(lái)評(píng)價(jià)體外功效；通過(guò)遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)體外安全性；通過(guò)成像、外科病理學(xué)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和細(xì)胞跟蹤研究來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)功效和安全性。應(yīng)注意，如實(shí)例中所用，術(shù)語(yǔ)“最佳化的”或“opt”用于指出在指定條件下獲得一個(gè)或一個(gè)以上較佳結(jié)果的一個(gè)或一個(gè)以上實(shí)施例。這些術(shù)語(yǔ)決不應(yīng)解釋為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例或最佳模式。討論在本文所述的研究中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種基于成體血管周干細(xì)胞的PSC+NELL-1組合產(chǎn)品，這種產(chǎn)品超出了當(dāng)前骨再生療法的功效和安全性。這些研究顯示，當(dāng)與NELL-1組合時(shí)，脂肪來(lái)源的PSC是用于骨再生的更安全并且更有效的干細(xì)胞。研究人員已經(jīng)將兩種截然不同的人血管周細(xì)胞群標(biāo)記并純化至均質(zhì):微血管周細(xì)胞(CD146+CD34-CD45-CD31-)和外膜細(xì)胞(CD146-CD34+CD45-CD31-)。這些細(xì)胞，無(wú)論是剛分離的還是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)的，都不能與常規(guī)MSC相區(qū)分，因此統(tǒng)稱(chēng)為術(shù)語(yǔ)血管周干細(xì)胞或PSC (克里斯安M.(Crisan, M.)等人，細(xì)胞一干細(xì)胞，3，301-13 (2008) )。PSC在培養(yǎng)中以及在體內(nèi)穩(wěn)固地形成骨、主動(dòng)地遷移、刺激血管生成并分泌各種各樣的生長(zhǎng)因子(克里斯安，2008 ;陳，2009)。研究人員已經(jīng)證實(shí)，無(wú)需培養(yǎng)物擴(kuò)增就可以從脂肪組織純化出足量的PSC (數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是，研究人員已經(jīng)確定，這一 PSC純化方案能夠從目前所測(cè)試的所有人類(lèi)組織中分離所有的專(zhuān)能干細(xì)胞群，不含內(nèi)皮細(xì)胞。概括起來(lái)，PSC優(yōu)于MSC的優(yōu)勢(shì)包括:1 一無(wú)需培養(yǎng)(可以降低致免疫、感染和遺傳不穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)(蓋德S.C.(Gad, S.C.)制藥手冊(cè):管理和質(zhì)量(Pharmaceuticalmanufacturing handbook:regulationsandquality)，ρ.(約翰威立公司，新澤西州霍博肯(Hoboken，N.J.) , 2008);達(dá)哈爾J.A.(Dahl, J.A.)等人，國(guó)際發(fā)育生物學(xué)雜志，52，1033-42(2008) )) ;2—自然組織定位、表型和發(fā)育潛能的精確表征(相反，MSC僅追溯性地來(lái)源于原代、異源細(xì)胞培養(yǎng)物)和3—改良的營(yíng)養(yǎng)效力(已經(jīng)確定，PSC的肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(heparin bindingepidermalgrowthfactor,HB-EGF)分泌量是經(jīng)典來(lái)源的脂肪組織和臍血MSC的10到20倍并且堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor, FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)的分泌量是經(jīng)典來(lái)源的脂肪組織和臍血MSC的3到7倍(陳，2009))。因此，從FDA管理觀點(diǎn)看，使用PSC可以有助于產(chǎn)物身份、純度和效力的一致性論證。NELL-1被用于在骨誘導(dǎo)環(huán)境中提供PSC或iPS以促進(jìn)可預(yù)測(cè)的骨生長(zhǎng)。NELL-1在各種小動(dòng)物(參看 例如，柯旺CM.(Cowan，CM.)等人，骨與礦物質(zhì)研究雜志(JBone MinerRes) 22，918-30 (2007))以及綿羊(魯S.(Lu，S.)等人，骨與礦物質(zhì)研究雜志，22，S171 (2007))和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的椎體間融合模型中可再現(xiàn)地誘導(dǎo)骨再生。NELL-1的高骨特異性部分地來(lái)源于其直接受Runx2調(diào)控，而Runx2是成骨細(xì)胞分化的主導(dǎo)控制基因(特隆T.(Truong, T.)等人，骨與礦物質(zhì)研究雜志，22，7-18 (2007) )。NELL-1特異性地抑制脂肪生成和過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體Y (peroxisomeproliferatoractivated rec印tor Y，PPAR Y)信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)促進(jìn)骨髓MSC中β -鈣結(jié)合蛋白依賴(lài)性Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(阿格魯Τ.(Aghaloo, Τ.)等人，分子療法(MolTher )15，1872-80(2007))，使得此生長(zhǎng)因子適合于老年或骨質(zhì)疏松的個(gè)體，其中骨髓干細(xì)胞的成脂分化導(dǎo)致骨損失的發(fā)病(參看例如，杜奎 G.(Duque, G.),風(fēng)濕病學(xué)新見(jiàn)(CurrOpinRheumatol)20，429-34(2008))。以下研究顯示了對(duì)于促進(jìn)骨生成來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)中以及在體內(nèi)NELL-1對(duì)純化的PSC的有效作用。骨誘導(dǎo)研究1.有關(guān)hPSC安全性/功效與hSVF細(xì)胞安全性/功效的比較研究這些研究顯示，當(dāng)與NELL-1組合時(shí)，脂肪來(lái)源的PSC是用于骨再生的更安全并且更有效的干細(xì)胞源。這些研究證實(shí)，就細(xì)胞活力、純度、干細(xì)胞含量、營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)量、成骨分化、維持遺傳穩(wěn)定性(致腫瘤性)、命運(yùn)/存活率、血管生成和骨生成來(lái)說(shuō)，人類(lèi)PSC至少與全組織基質(zhì)(在這一情形中為脂肪組 織SVF)和常規(guī)體外來(lái)源的MSC同樣有效，并且可能優(yōu)于全組織基質(zhì)和常規(guī)體外來(lái)源的MSC。方法和技術(shù)1-將脂肪組織來(lái)源的PSC (S卩，通過(guò)FACS分選的混合但未在體外擴(kuò)增的周細(xì)胞和外膜細(xì)胞)與以下各物相比較:2_未經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的總基質(zhì)血管部分(SVF ;即，總脂肪，較少脂肪細(xì)胞)、3-維持在培養(yǎng)中的與I相同的PSC群以及4-以常規(guī)方式從SVF的原代長(zhǎng)期培養(yǎng)物獲得的ASC (脂肪組織源性干細(xì)胞)，全部都來(lái)自同一個(gè)人的抽脂樣品。在第1、4、8和14代后，測(cè)試所有經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞。為確保可再現(xiàn)性，用來(lái)自不同供體的數(shù)份抽脂樣品執(zhí)行類(lèi)似研究，這些供體的年齡(年輕對(duì)年老)、性別、樣品的解剖學(xué)位置和體重指數(shù)都受到控制。這些測(cè)試顯示，NELL-1有利地影響PSC存活/增殖和分化(數(shù)據(jù)未顯示)，這一點(diǎn)得到了圖10和11中的實(shí)例的進(jìn)一步支持。按照方案(克里斯安M.等人，干細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CurrProtocStemCellBiol)第2章2B21-2B213單元(2008))分離出脂肪抽吸物SVF和PSC。在SVF中以及在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的ASC和PSC細(xì)胞群中定量周細(xì)胞(⑶146+NG2+PDGF-RP+⑶34-⑶31-⑶45-)和外膜細(xì)胞(^146-如2- 06 -1^-^34+^31-^45-)的相對(duì)百分含量。也測(cè)量在SVF和ASC細(xì)胞部分中內(nèi)皮細(xì)胞(⑶34+⑶31+⑶45-)的數(shù)量，因?yàn)檫@些細(xì)胞可以抑制PSC分化。從脂肪抽吸物回收的PSC和SVF部分的初始活力是用DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定。通過(guò)比較由PSC (預(yù)培養(yǎng)或未培養(yǎng)的)、SVF和ASC的FACS結(jié)果，以及內(nèi)皮、造血和成纖維細(xì)胞譜系標(biāo)記物的實(shí)時(shí)PCR (RT-PCR)分析來(lái)評(píng)估細(xì)胞純度。與間充質(zhì)干細(xì)胞含量的估算相同，低密度接種SVF和PSC以測(cè)試并定量其產(chǎn)生克隆成纖維細(xì)胞(CFU-F)和成骨細(xì)胞(CFU-OB)集落的能力。為評(píng)價(jià)MSC祖先隨時(shí)間的維持性,如所述(皮特格M.F.(Pittenger, M.F.)等人，科學(xué)，284，143-7 (1999))對(duì)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的PSC以及經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的SFC源性ASC執(zhí)行CFU-F和CFU-OB分析。使用每孔數(shù)種蛋白質(zhì)的多元夾層ELISA分析(這種分析允許進(jìn)行定量測(cè)量)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光來(lái)測(cè)量經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)因子(HB-EGF、VEGF、FGF和TOGF-BB)產(chǎn)生情況(陳，2009)。在第一代就已存在顯著可測(cè)量的量的這些生長(zhǎng)因子(陳，2009)，這為我們提供了由未經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的PSC和總SVF分泌的生長(zhǎng)因子的近似值，如與長(zhǎng)期培養(yǎng)的PSC和ASC相比較。對(duì)于成骨分化，在抗壞血酸和甘油磷酸存在下培養(yǎng)PSC (預(yù)培養(yǎng)或未培養(yǎng)的)、SVF和ASC。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR (Runx2、Osterix、骨橋蛋白和骨鈣素)(阿格魯T.等人，美國(guó)病理學(xué)雜志(AmJPathol) 169, 903-15 (2006))、喊性憐酸酶(alkalinephosphatase, ALP)表達(dá)和茜素紅染色(柯旺CM.等人，骨與礦物質(zhì)研究雜志22，918-30 (2007))定量地檢測(cè)成骨細(xì)胞分化。使用純化的PSC而非總SVF部分作為治療性成骨細(xì)胞源的另一原因是內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)調(diào)控例如ASC或BMSC等MSC的分化潛能(雷佳謝卡G.(Rajashekhar, G.)等人，干細(xì)胞(StemCells) 26，2674-81 (2008);莫瑞T.(Meury，T.)等人，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(JCellBiochem)98, 992-1006 (2006))(以及我們未公開(kāi)的結(jié)果)。為確定并證明這些結(jié)果，對(duì)與從相同脂肪組織樣品分選的內(nèi)皮細(xì)胞(E)結(jié)合培養(yǎng)(接觸共培養(yǎng))的純化的PSC重復(fù)相同的成骨分化實(shí)驗(yàn)(圖10)。為分析致腫瘤潛能，首先在以各種密度接種于增殖培養(yǎng)基中的軟質(zhì)瓊脂中后，分析細(xì)胞的錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)。在接種后第2周和第3周對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)，將來(lái)自不同群體的待分析細(xì)胞接種于一片Gelfoam上，并植入SCID小鼠后肢的骨骼肌袋中。通過(guò)身體觸診來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的腫瘤形成,最終處死動(dòng)物并分析腫瘤的存在(鄭B.(Zheng, B.)等人，自然一生物技術(shù)(NatBiotechnol) 25，1025-34(2007))。另外，對(duì)固定的中期染色體分析在研究時(shí)所有細(xì)胞群的核型以檢測(cè)可能發(fā)生的異常(托拉J.(Tolar，J).等人，干細(xì)胞，25，371-9(2007))。在植入SCID小鼠股部肌袋中后，評(píng)估細(xì)胞命運(yùn)/存活率、血管生成和骨生成(圖11,表2)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[使用慢病毒熒光素酶或綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)],接種于無(wú)細(xì)胞同種異體移植骨的臺(tái)架±300ygNELL_l上,并從兩側(cè)植入小鼠股二頭肌中(總體積=100微升/側(cè))。除非另作規(guī)定，否則在此方案中的所有體內(nèi)研究都利用在具有確定組成和孔隙度的200-300 μπιβ-磷酸三鈣載體粒子(β -tricalciumphosphatecarrierparticle, β -TCP)凍干的NELL-1以獲得增強(qiáng)的生物化學(xué)穩(wěn)定性(當(dāng)在室溫下儲(chǔ)存時(shí) 保持生物活性長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月)和生物效率(李W.(Li，W.)等人，組織工程(TissueEng), 16(9):2861-2870(2010))。測(cè)試從限定的脂肪抽吸物體積(Iml)或限定的細(xì)胞數(shù)量(2.5 X IO5個(gè))分離的兩種細(xì)胞。使用生物發(fā)光成像(bioluminescenceimaging, BLI)和熒光素酶免疫染色(短期:1-8周)以及GFP/組織學(xué)(長(zhǎng)期:3個(gè)月)來(lái)追蹤人類(lèi)細(xì)胞持久性和遷移。hPSC介導(dǎo)的血管向內(nèi)生長(zhǎng)和骨形成是通過(guò)組織學(xué)(蘇木素-伊紅)、組織形態(tài)測(cè)定術(shù)(馬森三色染色(Massontrichrome))和免疫染色(vWF、VEGF、BSP、OCN和I類(lèi)人MH C)評(píng)估。定量骨體積/組織體積、骨表面積/體積、礦化密度以及骨小梁厚度、數(shù)量和分離(波拉(Borah，B.)等人，骨與礦物質(zhì)研究雜志，15，1786-1797(2000))是通過(guò)高分辨率顯微CT(SkyScan ;比利時(shí)孔蒂赫(Kontich, Belgium))來(lái)評(píng)估,并且分析是使用Skyscan CT分析軟件執(zhí)行(張 X.(Zhang, X.)等人，臨床研究雜志(JClinInvest) 110,861-70.(2002))。
權(quán)利要求
1.一種純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)群，所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、CD34和任選的CD31抗體鑒別為CD146+CD34-CD45-(周細(xì)胞)或CD146-CD34+CD45-(外膜細(xì)胞)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PSC或iPS群，所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-⑶31-(微血管周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-⑶31-(外膜細(xì)胞)。
3.一種包含干細(xì)胞上清液的組合物，所述干細(xì)胞上清液包含營(yíng)養(yǎng)因子，所述營(yíng)養(yǎng)因子刺激所需細(xì)胞的形成或所需祖細(xì)胞的募集，從而形成組織或器官，其中所述上清液包含干細(xì)胞培養(yǎng)基，并且不含所述干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述干細(xì)胞是被⑶146、⑶34和⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-(周細(xì)胞)或⑶34+⑶31-⑶146-(外膜細(xì)胞)的PSC或iPS。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述PSC或iPS被⑶146、⑶45、⑶34和⑶31抗體鑒別為⑶146+⑶34-⑶45-⑶31-(微血管周細(xì)胞)或⑶146-⑶34+⑶45-⑶31-(外膜細(xì)胞)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述上清液是以粉末形式提供。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，另外包含藥學(xué)上可接受的載劑。
8.一種組合物，包含權(quán)利要求1或2所述的純化的PSC或iPS群和任選的誘導(dǎo)劑，其中所述誘導(dǎo)劑促進(jìn)所述PSC或 iPS分化成所需的細(xì)胞或祖細(xì)胞，從而形成組織或器官。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，另外包含賦形劑或藥學(xué)上可接受的載劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，所述組合物被配制成臺(tái)架、骨移植物、軟骨移植物、植入物或在植入式裝置上的涂層。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述植入式裝置是支架或縫線。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述誘導(dǎo)劑是Nell-1肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求3到12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述所需細(xì)胞是來(lái)自組織或器官的細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求3到12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述組織選自上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織或神經(jīng)組織，并且其中所述器官選自由以下各項(xiàng)組成的群組:骨骼器官、肌肉器官、循環(huán)器官、神經(jīng)器官、呼吸器官、消化器官、排泄器官、內(nèi)分泌器官、生殖器官、淋巴器官和免疫器官、皮膚、肝、基質(zhì)、半月板、牙周組織、視網(wǎng)膜、角膜、眼、面部器官、肢體以及任何其它身體部分。
15.一種治療或改善醫(yī)學(xué)病況的方法，包含對(duì)受檢者投予: 純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群， 包含純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群的組合物，或 包含干細(xì)胞上清液的組合物，所述上清液不含所述干細(xì)胞， 其中所述醫(yī)學(xué)病況與損傷或患病的組織或器官或者以其它方式受疾病或病原體損害的組織或器官有關(guān)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，所述醫(yī)學(xué)病況與損傷或患病的組織或器官有關(guān)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述醫(yī)學(xué)病況選自由以下各項(xiàng)組成的群組:CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))疾病；周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)疾病；皮膚瘢痕；纖維化；腫瘤；軟骨損傷、缺損或疾病；骨損傷、缺損或疾病；心臟病；腎病；運(yùn)動(dòng)損傷或病況；呼吸道疾病；和糖尿病。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述醫(yī)學(xué)病況選自由以下各項(xiàng)組成的群組:阿爾茨海默氏病(Alzheimer’ sdisease)、帕金森氏病(Parkinson’ sdisease)、肝纖維化、乳癌、骨質(zhì)疏松癥、心臟病發(fā)作、心臟缺血、腎缺血、中風(fēng)、腦缺血、脊髓損傷、半月板撕裂、哮喘、肺病、I型糖尿病，以及國(guó)際疾病分類(lèi)(ICD)和當(dāng)代操作術(shù)語(yǔ)集(CPT)版本中所列的病況。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中組合物是根據(jù)權(quán)利要求3到12中任一權(quán)利要求所述。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組織選自上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織或神經(jīng)組織，并且其中所述器官選自由以下各項(xiàng)組成的群組:骨骼器官、肌肉器官、循環(huán)器官、神經(jīng)器官、呼吸器官、消化器官、排泄器官、內(nèi)分泌器官、生殖器官、淋巴器官和免疫器官、皮膚、肝、基質(zhì)、半月板、牙周組織、視網(wǎng)膜、角膜、眼、面部器官、肢體以及任何其它身體部分。
21.—種制造組合物的方法，包含:提供純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群或者不含所述干細(xì)胞的干細(xì)胞上清液，和 形成包含所述純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或iPS群或者所述干細(xì)胞上清液的組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述組合物是根據(jù)權(quán)利要求3到12中任一權(quán)利要求所述。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施例提供一種純化的血管周干細(xì)胞(PSC)或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)群，以及不含所述干細(xì)胞的干細(xì)胞上清液，包含這些中任一者的組合物及其使用和制備方法。
文檔編號(hào)A61K35/12GK103080301SQ201180040200
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者B·嘉·蘇, 康·汀, 布魯諾·M·皮阿爾特 申請(qǐng)人:加州大學(xué)董事會(huì)