專利名稱：硫氧還蛋白在治療膿毒血癥并預防其導致的mods藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用小分子蛋白質藥物治療疾病領域，更具體地說，涉及人源性硫氧還蛋白在發揮器官保護作用而治療或預防膿毒血癥導致的MODS的應用及其機制。
背景技術：
膿毒血癥是一種常見而且致命的疾病，其實質是一種被惡性擴大的炎癥反應。雖然人們認識炎癥反應已有數十年，但最初對于這種炎癥反應的定義千變萬化。直到1992 年，美國胸內科醫師學會(American College of Chest physicians, ACCP)和危癥監護醫學學會(Society for Critical Care Medicine, SCCM)將其統一定義為全身炎癥反應綜合癥(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，并在此基礎上衍生膿毒血癥(s印sis)、重癥膿毒血癥(severe sepsis)和膿毒癥性休克(Sepsis shock)。隨著膿毒血癥的進一步發展，往往會引起機體各個臟器的功能不全，出現多臟器功能障礙綜合征 (Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)。由于人口的老齡化，介入性治療及有創性監護增多，濫用抗生素使耐藥菌增多，腫瘤、糖尿病、化療、放療、免疫抑制劑的應用，以及醫院內感染增多等，使得膿毒血癥的發病率也逐年攀升。膿毒血癥是當今創傷外科和危重病醫學領域中研究的熱點課題。膿毒血癥是一類與休克和感染等應激打擊關系密切，很可能是由失控的全身炎癥和細胞氧化代謝障礙所致的急性器宮損傷。因此膿毒血癥和MODS密不可分，長久以來其發病率和死亡率一直居高不，尤其是在重癥監護室，膿毒血癥、MODS是引起死亡主要的原因之一，因此有關于膿毒血癥的研究成了醫學界一個挑戰。目前缺少非常有效治療膿毒癥尤其是伴有MODS的方法，主要是對膿毒癥發病機制還沒有完全了解，因此建立一個合理的動物膿毒血癥模型，有助于了解膿毒血癥的發生過程，以及發展成MODS的過程，并為臨床上解決膿毒血癥提供有力的幫助。正是由于膿毒血癥的高發病率、高死亡率，2002年10月歐美國家多個組織共同發起并簽署了“巴塞羅那宣言”，呼吁全球醫務人員、專業組織、政府、衛生機構甚至公眾對該行動的支持，力爭5年內將膿毒癥的病死率減少25%。因此，人們對于這種疾病治療的研究一直沒有停止過。近來出現許多干預措施來治療膿毒血癥，如早期目標導向治療(Early goal-directed therapy, EGDT)、激素(corticosteroid)以及重組人活化蛋白 C(recombinant human activated protein C，rhAPC)等等，但這些治療都存在一定的局限性。在E⑶T問世4年后，Reuben等人調查了英國173個急救部門的實施情況，結果發現只有18. 8%的急救部門才能完整采取EGDT措施。至于激素的使用，一直存在爭議，有研究者認為即使能短期改善患者的呼吸機使用天數或者減少ICU的天數，但這并不意味能夠降低死亡率。rhAPC用于膿毒血癥已有一段時間，雖然著名的PR0TOSS和ADDRESS臨床實驗證實能夠降低膿毒血癥的死亡率，但是亞組分析顯示，在低危人群中(APACHE II<20)rhAPC沒有治療上的益處。正是由于目前的治療還不足以解決膿毒血癥的一系列問題，所以迫切需要新的治療方法來干預疾病的進程，改善膿毒血癥的預后。之所以出現上述治療上的困難，主要由于目前對于膿毒血癥的發病機制還不是最明確，往往認為其和內毒素(多由革蘭氏陰性菌產生)相關。但臨床事實是，近一半的患者血培養陰性，因為膿毒血癥還可以繼發于各種創傷、燒傷、胰腺炎等。即，對于膿毒血癥導致的MODS，經過抗生素治療可在疾病前期搶的關鍵治療時間窗，而在病程發展中，細菌或病灶內細菌會釋放出大量內毒素至血液，而對于此部分的損傷，抗生素治療無效。細菌內毒素具有十分復雜的生物學活性，可引起一系列病理生理改變，包括休克、彌散性血管內凝血 (DIC)、引起或加重MODS至多器官衰竭(MFS)等。因此，拮抗內毒素及阻斷或減弱其介導的損傷對膿毒血癥及其導致的MODS具有重要臨床意義。脂多糖(LPQ是革蘭陰性細菌細胞壁的組成部分，包括脂質A(Lipid Α)、核心多糖、特異性多糖三個成分。習慣上即將LPS稱為內毒素，其中由脂質A發揮內毒素活性，氧化應激及其后的脂質過氧化反應被證實是LPS 致死的重要原因。到目前為止，由于MODS的復雜病因及LPS所導致的廣泛器官、組織損傷， 目前其治療主要以支持療法為主，包括抗生素和補液及升壓藥的使用。盡管近30年以來， 抗生素一代一代地更新，但膿毒血癥及其導致的MODS的病死率并無明顯下降。我們可以客觀地評價，應用抗生素殺菌抑菌，以及一切常規治療和支持治療，并不能改善膿毒血癥預后，我們必須探尋治療的新對策。多粘菌素B(polymyxin B, PMB)雖能夠滅活內毒素和抑制革蘭陰性細菌，但由于其對腎有毒副作用，以及難以從血液中清除，因此血液給PMB治療 MODS受到限制。因此，亟需開發一類效果可靠、副反應較少、應用簡單的藥物填補這一領域的空白。硫氧還蛋白(Trx)系統，包括Trx、Trx還原酶(TrxR)、NADPH和Trx過氧化物酶 (TrxP)，是一個控制細胞氧化/還原(redox)狀態和細胞增殖/生存的、在細胞內廣泛表達的氧化還原酶系統。在Trx的催化中心含有兩個氧化還原敏感的胱氨酸組成的保守序列 胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，即Trx的活性中心。Trx可以還原狀態(硫氫鍵)或氧化狀態(二硫鍵)存在，該活性中心硫氫鍵和二硫鍵的可逆轉換參與細胞內的氧化/還原過程。因此，Trx系統被認為是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)系統之外的另一內源性抗氧化系統。除了氧化/還原酶的活性之外，Trx可通過調節中性粒細胞活性及遷移而發揮抗炎作用。重組人源性硫氧還蛋白(rhTrx)可治療一些伴有白細胞浸潤的疾病，包括細胞因子或抗癌藥物誘導的肺損傷、短暫定位性腦缺血、自體免疫性心肌炎等。然而，rhTrx可否用于治療動物MODS在國內外卻鮮有報道。因此，本發明擬闡述的內容是確認rhTrx在治療或預防動物MODS時的療效并解釋其具體作用機制。

發明內容
本發明的目的在于確認人源性硫氧還蛋白對動物膿毒血癥的治療效果或預防效果、尤其是其對伴發MODS的動物的被損傷器官的修復作用，以及對可能伴發MODS的動物的器官的保護作用，并解釋其具體作用機制，以期為應用小分子蛋白質藥物治療或預防疾病領域，如膿毒血癥，提供直接依據。本發明公開了人源性硫氧還蛋白在制備治療動物膿毒血癥的藥物中的應用，特別是在制備治療動物膿毒血癥引發的MODS的藥物中的應用，所述藥物用于在患有膿毒血癥的動物中，可減輕動物的心臟損傷、肺損傷、肝臟損傷、腎損傷，其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動物體重。本發明還公開了人源性硫氧還蛋白在制備預防動物膿毒血癥引發的MODS的藥物中的應用，所述藥物保護可能患有膿毒血癥動物的器官免于受損，其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動物體重。上述應用中，所述動物為豬或人。本發明還公開了一種用于治療或預防動物膿毒血癥引發的MODS的藥物組合物或藥用制劑，其包含治療有效劑量的人源性硫氧還蛋白和藥學上可接受的載體。其中，用腹腔注射0. 5mg/Kg的人源性硫氧還蛋白治療動物膿毒血癥導致的MODS 時，顯著提高了危重膿毒血癥的生存率。人源性硫氧還蛋白治療動物膿毒血癥導致的MODS時，可顯著降低血清Trop I、 mb、CKmb含量，即減輕膿毒血癥模型的心臟損傷。人源性硫氧還蛋白治療動物膿毒血癥導致的MODS時，可顯著降低每分呼吸次數， 并減少肺部滲出，從而防止呼吸窘迫并降低肺損傷。人源性硫氧還蛋白治療動物膿毒血癥導致的MODS時，可顯著降低血清AST/ALT、 AST及血清總膽紅素濃度，從而減輕致死性膿毒血癥模型的肝臟損傷，提高危重膿毒血癥的生存率。人源性硫氧還蛋白治療動物膿毒血癥導致的MODS時，可顯著降低血清肌酐、尿素含量，即顯著降低腎損傷，可維護血液各細胞穩態，即降低血細胞損傷。本發明的研究表明，人重組硫氧還蛋白分子量小，生物學活性強，而且給藥后反應迅速，生物利用度好，有著很好的臨床應用前景。申請人:還發現1.在用腹腔注射2. 0mg/Kg的LPS制作豬膿毒血癥導致的MODS模型時，可使心、 肺、肝、腎等重要器官發生損傷，并出現功能障礙。且實驗動物在損傷后8小時內全部死亡。2. Trx可以治療豬膿毒血癥導致的MODS在于可以在在體情況下與LPS發生特異性
纟口口?？傊?，上述研究證實，硫氧還蛋白可以明顯減輕膿毒血癥癥狀，還可以保護膿毒血癥動物的器官，如減輕心臟損傷、防止呼吸窘迫、降低肺損傷、減輕肝臟損傷、降低腎損傷等。當可能導致膿毒血癥的感染源進入了動物體，給予該動物體硫氧還蛋白后，可以避免膿毒血癥及其導致的MODS的發生，提升動物的生存率。本發明的使用對象是發生膿毒血癥和/或伴發MODS、尤其是心肺損傷癥狀嚴重的患者。本發明簡單易行，且無特殊禁忌癥，可在大醫院、小診所等廣泛使用。


圖1腹腔注射2. 0mg/kg的LPS，可成功建立豬膿毒血癥導致的MODS模型，以心肺損傷最為明顯，并使實驗動物全部死亡；A 2. 0mg/kg的LPS使得實驗動物全部死亡；B 2. 0mg/kg的LPS可造成心臟損傷；C 2. 0mg/kg的LPS造成呼吸窘迫及肺部滲出；D 2. 0mg/kg的LPS造成肝功能受損；
E 2. Omg/kg的LPS造成腎功受損；實驗數據經統計學處理后，用均數士標準差表示，* control vs. 2. Omg/kg ；# control vs. 1. 5mg/kg ； Δ :1. 5mg/kg vs. 2. Omg/kg 氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。圖2給予Trx治療，可以減輕動物膿毒血癥損傷，以心肺保護作用最為明顯，并顯著提高動物生存率；A =Trx治療顯著模型生存率；B =Trx治療顯著減輕心臟損傷；C =Trx治療顯著環節呼吸窘迫并減少肺部滲出；D =Trx治療顯著減輕肝臟損傷；E =Trx治療顯著降低腎臟損傷；實驗數據經統計學處理后，用均數士標準差表示，* control vs. LPS ；# control vs. LPS+Trx ； Δ :LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001ο圖3給予Trx治療，可以減輕動物MODS時血細胞損傷；A =Trx維持嗜堿粒細胞絕對值；B =Trx穩定紅細胞計數；C =Trx穩定血細胞比容；D =Trx穩定血小板計數；E:Trx穩定白細胞計數；F =Trx穩定嗜堿粒細胞百分率；G =Trx穩定紅細胞分布寬度CV ；H =Trx 穩定紅細胞分布寬度 SD ；* :control vs. LPS ；# :control vs. LPS+Trx ； Δ LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。圖4豬MODS模型血清中，LPS可以與Trx特異性結合的免疫共沉淀檢測圖。以下結合附圖和發明人給出的實驗及其結果對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式1.建立動物MODS模型及研究方案用脂多糖(LPS，2. Omg/kg)處理成年小香豬，檢測機體多個器官的損傷情況，并觀察動物存活時間。其中，在給予LPS處理后全程采用床旁監護儀監測動物生命體征，并在 LPS后1、2、4、6小時，檢測心損三項、肝功七項、腎功兩項、血常規等血清學指標，每次抽取血液12ml，并在6小時時行X線平片觀察肺部損傷。1)豬MODS模型的建立及Trx治療體重為15到20公斤的雄性小香豬，隨機分組， 每組動物6-8只。動物禁食12h，自由飲水，肌肉注射戊巴比妥(3%，0.8ml/kg)予以鎮靜。 將實驗動物仰臥固定于手術臺上，消毒備皮，并使用小棉被為動物保暖。使用22G靜脈留置針建立耳緣靜脈通路，予鹽酸氯胺酮10mg/kg/h和芬太尼5 μ g/kg/h持續鎮靜麻醉，并隨時根據動物麻醉情況進行調整。使用微量注射泵輸注乳酸林格氏液補液，補液量按照每個時間點之間的血液損失量進行。動物監護及處理情況以臨床護理5歲兒童為參考進行。2)股動脈有創血壓監測消毒備皮股動脈搏動處，鈍性分離股動脈，結扎股動脈遠心端，置肝素化后的4FrPiCC0動脈導管穿刺入股動脈，供抽取動脈血標本用并縫線固定。肝素化生理鹽水浸潤Picco重癥監護儀上的血管能量轉換器，并連接動脈導管。觀察是否有隨脈搏一致的管內血液波動情況，如果沒有，說明并未連接成功，繼續調整或重新穿刺。3)檢測動物一般情況將Picco重癥監護儀數值調零，監測動物心率、血壓(收縮壓、舒張壓、平均動脈壓)、體溫、血氧飽和度、呼吸等各項生理指標。平衡15-30分鐘，待各項指標趨于平穩。4)使用LPS按2. Omg/kg劑量腹腔注射建立豬MODS模型LPS (Sigma, L28801)，使用生理鹽水稀釋到8ml，然后行腹腔注射。使用Trx進行治療時，在LPS腹腔注射后，立即在腹腔另一側按照0. 5mg/kg的劑量注射。5)血清樣本采集在LPS損傷后1、2、4、6小時，和/或給予1Trx治療后1、2、4、6、 12、24、48、72、120、168小時進行采集，對照組血清樣本采集時間同Trx治療組。樣本分別用于心損三項、肝功七項、腎功兩項、血常規、內毒素含量檢測、其他實驗室檢測所用的血清樣本量，每次約12ml。6)肺濕干比重處死動物后，用組織鉗夾住右肺中葉，取出整個右側肺葉。擦干凈表面血液后，稱重。放入80攝氏度烘箱內，烘干3天至重量不再變化。7) X線胸腹平片采集在處理后6小時時，將動物捆綁成仰臥位，并保持持續麻醉狀態，行X線胸腹部平片拍攝。8)統計學處理所有數據采用SPSS 11. 5統計軟件進行統計分析，測定結果均采用均數士標準差表示。組間統計采用雙因素方差分析結果腹腔注射2. Omg/kg的LPS，可成功建立豬MODS模型。如圖1所示，2. Omg/ kg的LPS使得實驗動物全部死亡。2. Omg/kg的LPS可造成心臟損傷、造成呼吸窘迫及肺部滲出、造成肝功能受損、造成腎功受損，其中，以心肺損傷最為明顯。2、對患有MODS的動物給予人源性硫氧還蛋白通過基因重組的方法獲得人源性硫氧還蛋白。對患有MODS的動物給予人源性硫氧還蛋白(0. 5mg/kg)，檢測機體多個器官的損傷情況，并觀察動物存活時間。在LPS腹腔注射后，立即使用0. 5mg/kg的Trx注射入腹腔。為確定Trx最低有效劑量的數值，我們采用了 0. 5mg/kg、2mg/kg兩種治療劑量，結果發現兩組治療結果之間無統計學差異(數據未顯示)。檢測方法及指標同上。從圖2中可以看出，給予人源性硫氧還蛋白治療后，可以減輕豬MODS損傷。人源性硫氧還蛋白治療顯著減輕心臟損傷，顯著緩解呼吸窘迫并減少肺部滲出，顯著減輕肝臟損傷，顯著降低腎臟損傷，其中，以心肺保護作用最為明顯，并顯著提高了動物生存率。3、進一步試驗，用免疫共沉淀檢測LPS與Trx的結合情況，發現Trx治療MODS時可與LPS發生結合。1)用預冷所需工具，準備干冰，切IOOmg組織；2)加入預冷的 RIPA Buffer ；3)將組織裂解并把懸液轉到1. 5EP管中，4°C，緩慢晃動15min (EP管插冰上，置水平搖床上)；
4) 40C，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中；5)準備ftOtein A agarose，用PBS洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；6)每 Iml 總蛋白中加入 100 μ 1 Protein A 瓊脂糖珠(50% )，4°C搖晃 IOmin (EP 管插冰上，置水平搖床上)，以去除非特異性雜蛋白，降低背景；7)4°C，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除ftx)tein A珠子；8)Bradf0rd法做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1 10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量，分裝后，可以在-20°C保存一個月)；9)用PBS將總蛋白稀釋到約1 μ g/μ 1，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高(如IOyg/μ 1)；10)加入一定體積的兔抗到500μ 1總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異；11)4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫池，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用 2h室溫孵育；12)加入ΙΟΟμΙ Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫lh，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μ 1 “過渡抗體”(兔抗鼠 IgG)；13) HOOOrpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的 RIPA buffer洗3遍，800 μ 1/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS;14)用60μ 1 2Χ上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μ 1足夠上三道)；15)將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20°C，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。16)行SDS-PAGE變性膠電泳，電泳后轉膜，并使用Trx抗體、LPS抗體進行檢測。4、Trx藥代動力學、一般藥理、動物急性毒性試驗、用藥部位刺激和注射用藥過敏試驗研究采用小鼠、大鼠、家兔作為實驗動物，進行毒性、過敏原、半衰期、藥物代謝途徑、 動物行為及一般情況等。其中小鼠、大鼠采用肌肉注射給藥方式，給藥量2. 0mg/kg;家兔采用肌肉注射給藥方式，給藥量同上。結果發現對Trx的藥代動力學研究采用雙抗體夾心ELISA法，代謝方式符合一室 (im)開放模型，呈一級動力學消除。肌注絕對生物利用度為70.0% (小鼠)；腎、肺組織中分布最高；半衰期在小鼠體內是1小時；藥物以降解產物形式主要通過尿液排泄。對Trx的一般藥理研究發現對大鼠自發性活動、平衡和一般行為無影響；對心率、 心電圖、血壓、呼吸頻率及幅度無影響。Trx動物急性毒性試驗發現小鼠、大鼠的最大耐受量分別為人臨床擬用量的675 和253倍，說明本品對小鼠、大鼠均不能引出急性毒性反應。rhTrx毒性太低，無法測得 LD50。Trx用藥部位刺激和注射用藥過敏試驗發現家兔肌肉注射無刺激性，組織大體解剖觀察及病檢均未見異常，不引起過敏反應。2.研究結果1)外源性給予動物2. Omg/kg的LPS處理，可機體重要器官發生損傷即誘發MODS， 并造成生存率急劇下降；2)給予Trx治療可以顯著降低心、肺、肝、腎等重要臟器的損傷，并提高動物生存率。綜上所述，申請人利用動物膿毒血癥誘導MODS模型研究發現，該模型小香豬心、 肺、肝、腎功能均受到嚴重損傷，并且使得動物生存率急劇降低。而給予Trx治療之后，不僅避免了膿毒血癥動物MODS的發生，而且使得動物生存率大大提升。Trx治療機制與內毒素通過糖基化反應和Trx結合有關，從而明顯減輕膿毒血癥及其引發的MODS癥狀，有潛在的臨床應用價值。膿毒血癥可以出現在多系統的多種疾病中，發生率也相對較高。除導致致死性休克、彌漫性血管內凝血等，膿毒血癥通常還會直接或間接損害心、肺、肝、腎等重要臟器，誘發MODS，病死率極高。因此膿毒血癥的主要治療原則之一減少內毒素的產生和吸收，申請人則在國際上首次發現硫氧還蛋白可通過糖基化反應中和內毒素，從而減輕機體重要臟器損傷，促進各個器官功能回復，在膿毒血癥中發揮器官保護作用；且人源性重組硫氧還蛋白分子量小，生物利用度好；相比于動物源性制劑，免疫原性小；腹腔注射，簡單方便。因此，它在膿毒血癥及其引發的MODS的治療方面有著良好的應用前景。
權利要求
1.人源性硫氧還蛋白在制備治療動物MODS(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)的藥物中的應用，所述藥物用于在患有MODS的動物中，可降低血清Trop I、mb、CKmb 含量，即減輕患有MODS疾病的動物的心臟損傷；可降低每分鐘呼吸次數，并減少肺部滲出， 從而防止呼吸窘迫并降低肺損傷；可降低血清AST/ALT、AST及血清總膽紅素濃度，從而減輕由致死性膿毒血癥引起的肝臟損傷，提高危重膿毒血癥的生存率；可降低血清肌酐、尿素含量，即降低腎損傷，可維護血液各細胞穩態，即降低血細胞損傷。
2.人源性硫氧還蛋白在制備預防動物MODS的藥物中的應用，所述藥物保護可能患有 MODS的動物的器官免于受損。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述器官為心臟、肺、肝臟、腎臟。
4.如權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于所述動物為豬。
5.如權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于所述動物為人。
6.如權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于其中人源性硫氧還蛋白的有效劑量為0. 5mg/kg動物體重。
全文摘要
本發明公開了一種人源性小分子抗氧化抗炎蛋白質一硫氧還蛋白(Trx)在制備治療膿毒血癥及預防其導致的多器官功能障礙(MODS)中的應用；硫氧還蛋白可以明顯減輕膿毒血癥癥狀，還可以保護患有膿毒血癥疾病動物的器官，防治MODS的發生，如減輕心臟損傷、防止呼吸窘迫、降低肺損傷、減輕肝臟損傷、降低腎損傷等。當可能導致膿毒血癥的感染源進入了動物體，給予該動物體硫氧還蛋白后，可以避免MODS的發生，提升動物的生存率。
文檔編號A61P7/00GK102552887SQ20121000673
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者劉靜祎, 屈延, 許愛斌, 陶凌 申請人:陶凌